CN105368976A - 一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法 - Google Patents

一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法。该特征性核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。该核酸分子上游引物FCHS:5`-GCGTGAAAGGTAGGAAGC-3`和下游引物RCHS:5`-GGAGCACCGAGGGTTAGT-3`。试剂盒包括核酸引物FCHS和RCHS和PCR反应试剂。其鉴别方法是以待测样品基因组DNA为模板，以FCHS和RCHS为PCR引物，按照常规PCR方法进行扩增。经实验发现，仅白玉菇能够扩增到特异性片段，而其他样品，如真姬菇都没有扩增到任何片段，这表明本发明的核酸引物FCHS和RCHS具有极高的专一性，无需测序步骤，可以用于快速的鉴别白玉菇(菌丝体和子实体)及其相关制品的真伪。

Description

一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法鉴别食用菌真伪技术领域，具体涉及一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列、核酸分子引物、试剂盒和方法。
背景技术：
白玉菇(whiteHypsizigusmarmoreus)又名白色斑玉蕈、白色真姬菇、白色蟹味菇，在日本则称之为御菇或者称为御茸，是斑玉蕈(真姬菇)(Hypsizygusmarmoreus)的白色品系。白玉菇的菇体洁白如玉，质地细腻，口感特佳，其多糖、总黄酮、SOD等活性成分含量均高于真姬菇，倍受国内外市场青睐，是食用菌中的“金枝玉叶”和上乘山珍佳品。因此，白玉菇产业发展较快，日产量已达到鲜菇200吨以上，成为我国工厂化生产的主要品种之一。因此，建立快速鉴别白玉菇的方法非常重要。
目前，对白玉菇的鉴别需要将白玉菇菌种接种于培养基中形成菌丝体并培育成子实体后，再利用子实体的形态特征进行鉴别，即目前白玉菇和真姬菇在菌丝体阶段时无法从根据形态特征进行区分，它们的不同之处是白玉菇子实体通体白色而真姬菇则呈深褐色。显然，利用形态特征鉴别的方法从菌丝体到子实体所需时间至少需要85天，鉴别时间相当长。现有的研究主要集中于：利用不同菌株的拮抗性及部分同工酶、ITSrDNA、RAPD、SRAP和mtDNA技术对真姬菇和白玉菇的种内聚类分析和鉴定研究。然而拮抗性和同工酶技术操作复杂耗时长，白玉菇与真姬菇的ITSrDNA序列一致，难于通过ITS序列鉴定，而RFLP、RAPD、SRAP等因不能很好地与目标性状连锁而应用受到限制，mtDNA则存在遗传稳定性的问题，因此，白玉菇的快速鉴别难于实现(张永杰，2015；牛屹东，2001)。以目标起始密码子多态性(startcodontargetedpolymorphism，SCoT)分子标记是一种基于翻译起始位点的目的基因分子标记新技术，依据基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增。具有重复性好，引物设计简单，可以在物种间通用的特点，能有效产生和性状连锁的标记，可用于分子标记辅助育种、遗传多样性分析、QTL定位和集群分离分析等诸多领域研究(CollardBCY，2009)。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种利用分子生物学手段，从遗传本质上鉴别白玉菇，尤其是提供针对白玉菇菌丝体及其他白玉菇相关制品真假的鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列。
本发明用于鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列来源于目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记中的31号引物(即序列为5`-CCATGGCTACCACCGCCT-3`的非特异性引物)，扩增白玉菇的基因组DNA，得到的三条基因片段，再经克隆、测序，并筛选特异性分子片段的序列。所述的鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的第二个目的是提供以白玉菇的特征性核苷酸序列(SEQIDNO.1)为基础的，设计用于鉴别白玉菇的核酸分子引物，该核酸分子引物序列如下：
FCHS:5`-GCGTGAAAGGTAGGAAGC-3`；
RCHS:5`-GGAGCACCGAGGGTTAGT-3`。
上述核酸分子引物序列FCHS和RCHS，它们的退火温度相近(53℃～54℃)，GC含量相当(55％～62％)，均不能形成引物二聚体，具有极高的专一性，仅能与白玉菇发生反应，而不与真姬菇或其他食用菌扩增生成PCR条带。因此，利用该核酸分子引物通过PCR扩增可以快速的对白玉菇(菌丝体、子实体)进行鉴别。
本发明的第三个目的是提供一种白玉菇快速鉴定试剂盒，包括上述的白玉菇的核酸分子引物FCHS、RCHS和PCR反应试剂。
所述的白玉菇快速鉴定试剂盒优选还包括真姬菇子实体DNA或真姬菇菌丝体DNA，该DNA可以作为鉴定白玉菇的阴性对照，以及白玉菇菌丝体DNA或白玉菇子实体DNA，该DNA可以作为鉴定白玉菇的阳性对照。
本发明的第四个目的是提供一种鉴别白玉菇的方法，其特征在于，采用上述核酸分子引物FCHS和RCHS作为扩增引物，以待测样品基因组DNA为模板，利用PCR的方法鉴定待测样品是否是白玉菇。具体是经PCR扩增，电泳检测，可以直接获得清晰的白玉菇特异性条带，无需测序步骤，实现对白玉菇菌丝体无需培养成子实体，直接鉴别其品种的快速鉴别。
优选，利用真姬菇菌丝体DNA或真姬菇子实体DNA作为PCR模板，以白玉菇的核酸分子引物FCHS和RCHS作为PCR引物，进行常规的PCR，以作为阴性对照(如图3)。
本发明基于SCoT分子标记中第31号引物扩增白玉菇基因组DNA，经克隆测序，获得白玉菇的特征性核苷酸序列，该特征性核苷酸序列如SEQIDNO.1，并根据该序列设计特异性的核酸分子引物FCHS和RCHS。用该核酸分子引物，以白玉菇基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行扩增，获得的DNA片段，经测序其具体序列为序列SEQIDNO.1中第27～476位碱基所示，长度为450bp(如图1)。利用本发明的核酸分子引物FCHS和RCHS进行PCR扩增，仅有白玉菇能够扩增获得该特异性片段，而其他样品没有扩增到任何片段(如图3)，而利用真姬菇DNA作为PCR模板，以白玉菇的核酸分子引物FCHS和RCHS作为PCR引物，进行常规的PCR，作为阴性对照(如图3)。本发明的核酸分子引物FCHS和RCHS具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别白玉菇(菌丝体和子实体)及其相关制品的真伪。
本发明采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅20mg就足够，方法简单，特异性好，用时短，3h内即可完成。
附图说明：
图1是本发明所述的鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列，左侧为5`端，右侧为3`端，其中黑色部分为核酸分子引物FCHS和RCHS扩增的片段大小及位置。
图2是利用SCoT分子标记中第31号引物作为PCR引物按照常规的PCR方法对不同样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、白玉菇菌丝体DNA，2、白玉菇子实体DNA，3、真姬菇菌丝体DNA，4、真姬菇子实体DNA，M为2Kb的DNA分子量标准，从上到下分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图3是利用白玉菇的核酸分子引物FCHS和RCHS作为PCR引物按照常规的PCR方法对不同样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、白玉菇菌丝体DNA，2、白玉菇子实体DNA，3、真姬菇菌丝体DNA，4、真姬菇子实体DNA，M为2Kb的DNA分子量标准，从上到下分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
白玉菇基因组DNA的提取和SCoT特异性片段的获得：
取20mg白玉菇菌丝体样品置于无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，选用DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，货号BA19KA1329]提取白玉菇菌丝体基因组DNA。白玉菇子实体、真姬菇菌丝体、真姬菇子实体基因组DNA参照上述方法提取。
取SCoT通用引物31号，序列为5’-CCATGGCTACCACCGCCT-3’的非特异性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用PCRMasterMix试剂盒[全式金Transgen生物技术有限公司的2×EasyTaqPCRSuperMix货号：J30630]，进行PCR反应。总反应体系为25.0μL，PCRMasterMix10.0μL、ddH2O14.0μL、SCoT31号引物0.5μL、模板DNA(白玉菇菌丝体、白玉菇子实体、真姬菇菌丝体或真姬菇子实体的基因组DNA)0.5μL。反应程序为94℃5min预变性；94℃50s、50℃1min、72℃2min、35个循环；72℃8min，22℃停止。白玉菇的SCoT31号引物电泳图如图2所示。由图2可以看出，SCoT31号引物从白玉菇菌丝体(条带1)、白玉菇子实体(条带2)、真姬菇菌丝体(条带3)、真姬菇子实体(条带4)的基因组DNA中扩增出多条序列。经1％琼脂糖胶120V，20min电泳、选取特异性条带切胶(800bp左右)回收(上海生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，货号：SK8132)、克隆(TaKaRapMD-19T货号：K3501BA)等步骤，含有特异性片段的菌液送华大基因测序。该800bp左右的特异性条带的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其即为白玉菇的特征性核苷酸序列，其含有838bp的碱基。
实施例2：
白玉菇特异性引物的设计和PCR扩增：
根据白玉菇的特征性核苷酸序列的测序结果，其序列如SEQIDNO.1所示，利用primerpremier5.0软件对筛选出的特异性分子片段序列进行引物设计，如第27至476位碱基所示，片段长度为450bp(如图1)。核酸分子引物包括上游引物FCHS:5`-GCGTGAAAGGTAGGAAGC-3`和下游引物RCHS:5`-GGAGCACCGAGGGTTAGT-3`。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以不同样品的基因组DNA为模板，总反应体系为25.0μL，PCRSuperMix10.0μL、ddH2O13.5μL、上游引物FCHS和下游引物RCHS各0.5μL、模板DNA(白玉菇菌丝体、白玉菇子实体、真姬菇菌丝体或真姬菇子实体的基因组DNA)0.5μL。反应程序为94℃5min预变性；94℃40s、52℃40s、72℃1min、35个循环；72℃8min，22℃停止。电泳检测PCR结果，电泳图如图3所示，从图3可以看出，仅白玉菇能够扩增出特异性片段(条带1和2)，而真姬菇菌丝体(条带3)、真姬菇子实体(条带4)没有扩增出任何片段，这表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，特异性好，因此可以用于快速的鉴别白玉菇。经测序该特异性片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第27至476位碱基所示，即图1中的黑色部分。
实施例3：
白玉菇快速鉴别试剂盒的制备：
白玉菇快速鉴别试剂盒，包括上述的白玉菇的核酸分子引物：上游引物FCHS和下游引物RCHS、PCR反应试剂、白玉菇菌丝体基因组DNA和/或白玉菇子实体基因组DNA、以及真姬菇菌丝体基因组DNA和/或真姬菇子实体基因组DNA。按上述实施例进行操作，可实现对白玉菇及其相关制品真伪的快速鉴别。

Claims (6)

1.一种鉴别白玉菇的特征性核苷酸序列，其特征在于，该特征性核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种用于鉴别白玉菇的核酸分子引物，其特征在于，该核酸分子引物包括：
FCHS:5`-GCGTGAAAGGTAGGAAGC-3`；
RCHS:5`-GGAGCACCGAGGGTTAGT-3`。
3.一种白玉菇快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的用于鉴别白玉菇的核酸分子引物FCHS和RCHS，以及PCR反应试剂。
4.根据权利要求3所述的白玉菇快速鉴定试剂盒，其特征在于，还包括白玉菇菌丝体DNA或白玉菇子实体DNA，以及真姬菇菌丝体DNA或真姬菇子实体DNA。
5.一种鉴别白玉菇的方法，其特征在于，采用权利要求2所述的用于鉴别白玉菇的核酸分子引物FCHS和RCHS作为扩增引物，以待测样品基因组DNA为模板，利用PCR的方法鉴定待测样品是否是白玉菇。
6.根据权利要求5所述的鉴别白玉菇的方法，其特征在于，利用真姬菇菌丝体DNA或真姬菇子实体DNA作为PCR模板，以核酸分子引物FCHS和RCHS作为PCR引物，进行常规的PCR，以作为阴性对照。
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