CN112176096A - 基于多重pcr对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

基于多重pcr对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒可以直接在临床材料中检测有临床意义的曲霉菌种，包括烟曲霉和土曲霉。本发明的试剂盒还可以进一步检测烟曲霉中的两种多唑抗性机制。当与其他临床和实验室检查结合使用时，本发明的试剂盒检测结果有助于血液学和重症监护病房患者的侵袭性肺曲霉菌病的诊断。

Description

基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及曲霉菌检测领域，具体地涉及基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法。
背景技术
曲霉菌广泛分布于环境中。据不完全统计人体每天吸入的曲霉孢子可达数百个之多。对于免疫缺陷体，例如器官移植患者、癌症患者及艾滋病而言，没有及时清除吸入的孢子，易导致侵袭性肺曲霉病(IPA)。95％以上的IPA是由烟曲霉感染导致的，其次为土曲霉。IPA以肺部感染为主，病死率超过70％。其临床表现与他原因肺炎、结核相似，无特异性，病情重、治疗方案不统一，极易误诊漏诊。因此早期诊断是改善曲霉菌感染患者的预后、降低病死率的关键。
根据2016年美国感染病学会(IDSA)公布的曲霉病治疗指南，伏立康唑被推荐为治疗侵袭性曲霉病的首选药物，其他抗真菌如两素B和卡泊芬净等作为后备药物使用。但是由于全球范围内含唑类农药的大规模应用，以及临床上唑类抗真菌药物的长疗程使用，烟曲霉对伏立康等剂耐性呈逐年上升趋势。据文献显示，临床菌株耐药率在美国约为3.6％，中国为4％，日本为11％。
目前临床上的IPA检测方法包括直接镜、培养和血清免疫学，但存在主观性强、培养时间长且敏感不高、血清学法灵度低的缺点。目前虽然针对曲霉开发了许多基于PCR快速检测的方法，但这些方法主要针对食源、药源的曲霉。专门针对引发临床疾病的曲霉检测方法已知有例如CN109055502A公开的基于真菌游离DNA的侵袭性真菌感染快速多重PCR鉴定诊断检测方法。该方法可鉴定由临床常见和高发的白色念珠菌、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌及烟曲霉造成的侵袭性感染。再例如，CN105018575A公开的多重PCR在败血症真菌检测中的应用。其设计了一种多重PCR体系，能够弥补已有真菌检测方法的不足，为发病急、死亡率高的真菌性败血症及脓毒症临床治疗提供明确的用药信息，从而赢得宝贵的治疗时间。
综上所述，目前还没有专门用于同时检测烟曲霉、土曲霉和曲霉耐药的检测方法。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供能够快速检测IPA致病曲霉菌并分型的试剂盒及其使用方法。优选地，本发明进一步提供能够对IPA致病菌耐药性进行检测的试剂盒。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，其中，所述通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，所述特异性探针组包括能够与所述保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，所述第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，所述第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，第一探针包含对应于第一通道的荧光染料，第二探针包含对应于第二通道的荧光染料和第三探针包含对应于第三通道的荧光染料。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH4)2SO4、5-10mM MgSO4，且pH值为8.0-8.5。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒进一步包含内部质控和阳性质控。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，所述通用引物的序列如SEQ ID NO：1和2所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO：4所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒进一步包含针对烟曲霉耐药位点的引物和探针，且针对烟曲霉耐药位点的正向引物与反向引物的摩尔比为1:(8-10)，针对烟曲霉耐药位点的探针设计为与野生型探针的Tm差值为2。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其中，所述烟曲霉耐药位点选自CYP51A基因中的TR34、L98H、Y121F和T289A组成的组中的至少一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒进一步包括热启聚合酶。
本发明的第二方面，提供试剂盒的使用方法，其包括使用所述通用引物和所述特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明的使用方法，其中，所述PCR扩增包括：
(1)预变性步骤，条件为2分钟、95℃；
(2)循环反应步骤，条件为15秒、94℃变性，60秒、58℃退火、延伸，共30-50个循环；
(3)熔解步骤：45℃、90秒，然后由45℃梯度升温至85℃。
本发明的试剂盒可以直接在临床材料(如BAL，血清)中检测有临床意义的曲霉菌种，包括烟曲霉和土曲霉。优选地，本发明的试剂盒还可以进一步检测烟曲霉中的两种多唑抗性机制。当与其他临床和实验室检查结合使用时，本发明的试剂盒检测结果有助于血液学和重症监护病房(ICU)患者的侵袭性肺曲霉菌病(IPA)的诊断。
附图说明
图1不同聚合酶对于扩增结果的影响。Takara热启酶(A)，Omni Klentaq(B)，LC480mix(C)。
图2L98(A)、TR34(B)、T289(C)和Y121(D)4个位点发生突变和野生型的烟曲霉熔解曲线峰图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的试剂盒不仅能够一次性检测出样本中是否存在曲霉属微生物，而且还能区别是烟曲霉，还是土曲霉。优选地，本发明的试剂盒还能够进一步鉴定烟曲霉是否存在耐药性突变。
本发明的试剂盒可构建多重实时荧光PCR反应的反应体系。试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组。其中，通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，特异性探针组包括能够与保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。在一种示例性实施方式中，本发明的所有引物和探针以干燥粉末的混合物形式存在于容器，如小瓶。在另一示例性实施方案中，所有引物和探针溶解于缓冲液以形成混合物的形式存在于容器，如小瓶。本发明中，为了能够实现同时检测的目的，本发明的缓冲液可包含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4和MgSO4。优选使缓冲液具有较低的离子强度，从而能够提高检测的特异性。离子强度越高，则非特异性结合越强，从而容易产生假阳性。在示例性实施方案中，缓冲液能够确保得到包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH4)2SO4、5-10mM MgSO4，且pH值为8.0-8.5的反应体系。缓冲液优选包含200mM Tris-HCl pH8.3、200mM KCl、100mM(NH4)2SO4、8mMMgSO4。由此可使反应体系中的离子强度适于特异性扩增。
本发明的特异性探针组中不同探针之间具有不同的荧光染料，从而使不同的探针对应于多重PCR的不同通道。本发明中烟曲霉的不同耐药突变位点也对应于多重PCR的不同通道。可选地，分型检测和耐药检测的不同探针共用相同的通道。例如，用于烟曲霉检测的探针和用于L98H检测的探针共用同一通道，用于土曲霉检测的探针和用于TR34检测的探针共用同一通道，用于曲霉属检测的探针和用于T289A检测的探针共用同一通道，用于IC检测的探针和用于Y121F检测的探针共用同一通道。
本发明的试剂盒中，通用引物中正向引物和反向引物的量优选实质上相等。而用于烟曲霉耐药位点检测的引物中正向引物需小于反向引物的量，优选地，正向引物与反向引物的摩尔比为1:(8-10)，例如为1:9。反向引物的量大于正向引物的量，由此可确保同时实现两种反应及检测。在某一具体实施方案中，本发明的正向引物的量能够使其在反应体系中的最终浓度为0.1-0.4μM，优选0.2-0.3μM，反向引物的量能够使其在反应体系中的最终浓度为1.7-2.0μM，优选1.8-1.9μM。由此，能够增加熔解曲线的荧光峰值，提高PCR反应的灵敏度。为了进一步增加突变与野生型的区分度，本发明中用于耐药检测的探针设计为具有比野生型更高的Tm值，优选高2℃以上。例如，对于L98位点，突变的Tm值为65.5-68.5，而野生型为61.0-64.0。对于TR34位点，突变的Tm值为66.5-69.0，而野生型为64.0-66.5。对于T289位点而言，突变的Tm值为67.0-70.0，野生型为63.0-66.0。对于Y121位点而言，突变的Tm值为68.0-71.0，野生型为63.0-66.0。
除了通用引物、特异性探针组以及耐药性检测的引物和探针外，，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸组)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。
本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
实施例1
本实施例为曲霉菌分型检测试剂盒，其包含以多个试管包装的以下成分。
表1分型试剂盒组成
组份名称 规格(μl) 管盖颜色
分型反应液 >500 黄色
热启聚合酶 >50 紫色
稀释液 >950 透明
内部质控 >500 黑色
分型阳性质控 >125 白色
其中，分型反应液包含200mM Tris-HCl(pH8.3)、200mM KCl、90mM(NH4)2SO4、8mMMgSO4，引物和探针具体信息如下表所示。
表2引物及探针序列及浓度
Figure BDA0002765574570000081
本试剂盒使用三种不同酶进行试验。结果如图1所示，当使用热启Taq聚合酶时，试剂盒具有优异效果。
曲霉分型检测试剂盒的储存条件为-15℃到-30℃避光保存；尽量避免反复冻融(不超过15次)；有效期见产品标签。为了避免交叉污染，建议在PCR实验室操作，并且单独储存阳性质控。
本实施例的曲霉分型检测试剂盒适用的仪器包括
Figure BDA0002765574570000083
480II(Roche)、
Figure BDA0002765574570000084
Q(QIAGEN)、CFX96(Biorad)、Mic qPCR(Bio Molecular Systems)、Quantstudio 5(Thermo Fisher Scientific)。
实施例2
本实施例为用于检测烟曲霉耐药性突变的试剂盒例，其可以设计为在实施例1的试剂盒基础上进一步包括以下成分，也可以设计为单独的试剂盒。
表3
组份名称 规格(μl) 管盖颜色
耐药反应液 >500 红色
Taq反应酶 >50 紫色
稀释液 >950 透明
内部质控 >500 黑色
耐药阳性质控 >125 蓝色
用于检测耐药性的引物和探针的信息如下表所示。
表4
Figure BDA0002765574570000082
Figure BDA0002765574570000091
注：内部质控为M13噬菌体。
本实施例的试剂盒适用的仪器及储存条件与实施例1相同，结果如图2所示。
实施例3
本实施例试剂盒的使用例。可具体包括以下步骤。
1、样本
试剂盒的样本种类不限，可为真菌培养物、BAL样本、血清和活检组织。临床样本需快速转移至实验室进行实验，也可于-20℃或者-70℃长期保存，避免反复冻融。
2、核酸提取
【BAL样本】
使用自动化平台或核酸提取试剂提取样本核酸，样本体积为1mL，洗脱体积为50μL。建议首先使用BAL上清液提取核酸，若出现以下情况，使用BAL样本沉淀重复提取步骤：
与临床结果和其它实验室检测结果相悖；
曲霉菌分型检测阳性扩增曲线的Ct值<36，但在烟曲霉耐药检测中未出现扩增。
【真菌菌株】
使用5mL含有0.5％吐温80的1×tris-EDTA(pH为8.0)孵育真菌培养物，15分钟后收集上清液用于核酸提取。提取的DNA避免反复冻融，若提取当天使用则建议4℃保存DNA，也可于-20℃长期保存。
【血清】
自动化平台可用于提取血清样本中的曲霉属真菌。血清样本不适用于烟曲霉耐药试剂盒。
【组织】
组织样本的DNA提取步骤可参照BAL样本沉淀物的提取方法。确保将组织样本添加到含有裂解液的离心管中。组织样本中的人类DNA可以抑制PCR反应，因此组织体积不可过大，不能超过豌豆大小。
3、操作步骤
3.1配制反应体系
取出样本DNA和试剂盒组份，室温下融化后置于冰上。按照表5和表6配制两种反应混合液。配制完成后，充分混匀，分装至PCR反应孔中，反应板需置于冰上。
表5曲霉菌分型的反应混合液
组份 体积(1×) 体积(10×)
分型反应液 10μl 100μl
热启聚合酶 1μl 10μl
稀释液 9μl 90μl
总体积 20μl 200μl
表6烟曲霉耐药的反应混合液
组份 体积(1×) 体积(10×)
耐药反应液 10μl 100μl
Taq反应酶 2μl 20μl
稀释液 3μl 30μl
总体积 15μl 150μl
3.2加样
样本孔：加5μl样本DNA(包含IC)至分型反应混合液中，或加10μl样本DNA(包含IC)至耐药反应混合液中；
NTC反应孔：加5μl稀释液至分型反应混合液中，或加10μl稀释液至耐药反应混合液中；
阳性对照反应孔：加5μl Species PC照至分型反应混合液中，或加5μlResistance PC(混合5μl稀释液)至耐药反应混合液中；
将反应孔封好，短暂离心。尽量避免反应孔中有气泡。
3.3上机
按照表7设置荧光通道，按照表8设置PCR反应程序。
将封好的反应板放入PCR仪中，运行PCR程序。
表7不同PCR仪器的荧光通道设置
Figure BDA0002765574570000111
*由于不同染料的发射光谱的重叠，可能发生检测通道之间的串扰。在LC480Ⅱ上，使用荧光补偿文件补偿干扰。
表8 PCR程序
Figure BDA0002765574570000112
对于LC480II，熔解程序为1次/℃，对于RGQ，熔解程序为每步1℃、5秒。
3.4数据分析
以罗氏LC480为例：程序运行结束以后，首先选择2nd derivative分析方法，可以自动确定Ct值，然后，通过Tm calling分析方法，来读取Tm值。
(1)分型结果分析
根据表10对曲霉菌分型试剂盒的结果进行判读，若未观察到任何荧光信号，则说明DNA降解或者样本被抑制或者操作失误。
表9曲霉菌分型扩增信号
Figure BDA0002765574570000113
Figure BDA0002765574570000121
(2)耐药结果分析
使用烟曲霉耐药检测烟曲霉CYP51A基因上的耐药位点，判读方法见表10。烟曲霉菌分型检测的Ct值恒小于耐药位点的Ct值，因此，当分型检测的Ct值>36，耐药位点可无阳性信号。
表10烟曲霉耐药的判读方法
Figure BDA0002765574570000122
本发明的探针中不同耐药位点野生型和突变型基因的Tm值范围见表11。
表11在LC480上检测野生型和突变型位点的溶解曲线范围
Figure BDA0002765574570000123
3.5质控
在分析临床样本的检测结果之前，须首先分析所有质控的检测结果，从而保证数据的可靠性。要确认DNA提取(IC)和PCR程序(IC和PC)，所有质控的Ct值必须在规定的可接受范围内(见表12)。IC的Ct值很大程度上取决于样本的基质、DNA提取过程以及多种病原体的存在。因此在阴性样本中必须检测到IC的阳性信号。
表12质控的Ct值范围
Figure BDA0002765574570000124
Figure BDA0002765574570000131
实施例4
本实施例为试剂盒性能测试例。
1.最低检测限
通过20个重复检测中，检出率≥95％作为最低检测限的确定依据。
类别 LOD(copies/μL)
烟曲霉 2
土曲霉 3
L98H 2
TR34 3
2.特异性
选择29种真菌及细菌进行交叉反应试验，结果如下。仅黄青霉出现交叉反应。但黄青霉极少引起人类干扰，并且检测限远高于曲霉，因此不会对结果分析造成较大影响。
Figure BDA0002765574570000132
Figure BDA0002765574570000141
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒及其使用方法
<130> BH2000434-1
<141> 2020-11-06
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agtgaagcgg caagagc 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
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tttaccaccc atttagagc 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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Claims (10)

1.一种基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的通用引物和特异性探针组，其中，所述通用引物能够结合至曲霉属真菌的基因保守区，从而能够在实时荧光PCR中扩增源自曲霉属真菌的保守片段，所述特异性探针组包括能够与所述保守片段的部分序列互补结合的第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针能够与源自烟曲霉的序列特异性互补结合，所述第二探针能够与源自土曲霉的序列特异性互补结合，所述第三探针能够与源自曲霉属真菌的保守序列特异性互补结合。
2.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，第一探针包含对应于第一通道的荧光染料，第二探针包含对应于第二通道的荧光染料和第三探针包含对应于第三通道的荧光染料。
3.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH4)2SO4、5-10mM MgSO4，且pH值为8.0-8.5。
4.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包含内部质控和阳性质控。
5.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQ ID NO：1和2所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO：4所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO：5所示。
6.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包含针对烟曲霉耐药位点的引物和探针，且针对烟曲霉耐药位点的正向引物与反向引物的摩尔比为1:(8-10)，针对烟曲霉耐药位点的探针设计为与野生型探针的Tm差值为2。
7.根据权利要求6所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，所述烟曲霉耐药位点选自TR34、L98H、Y121F和T289A组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的基于多重PCR对曲霉菌分型的试剂盒，其特征在于，进一步包括热启聚合酶。
9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括使用所述通用引物和所述特异性探针组构建反应体系的步骤，和对所述反应体系进行PCR扩增的步骤。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述PCR扩增包括：
(1)预变性步骤，条件为2分钟、95℃；
(2)循环反应步骤，条件为15秒、94℃变性，60秒、58℃退火、延伸，共30-50个循环；
(3)熔解步骤：45℃、90秒，然后由45℃梯度升温至85℃。
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