CN112063733A - 用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法 - Google Patents

用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法。本发明的试剂盒包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15‑25，且第二探针的Tm值为73‑76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。本发明不仅可以检测样品是否存在肺孢子菌，并且还可通过熔解曲线分析检测真菌样本对例如磺胺类药物的耐药性。

Description

用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法
技术领域
本发明涉及肺孢子菌检测领域，具体地涉及用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法。
背景技术
肺孢子菌病(Pneumocystis pneumonia)是由肺孢子菌(P.jirovecii)引起的原虫病，多见于免疫功能低下或缺陷者。目前，广泛的磺胺药物预防法和高效抗逆转录病毒疗法(HAART)减少了肺孢子菌病的发病率，但其仍然成为HIV/AIDS患者以及非HIV免疫功能低下患者发病和死亡的重要原因。
临床上肺孢子菌的诊断方法是支气管肺泡灌洗液(BAL)样本的直接镜检，通过标准染色技术和免疫荧光法显色。当样本中真菌载量低时，该方法诊断困难并且需要较高的技术水平。目前，实时PCR法开始被用于肺孢子菌病的检测，其灵敏度高于直接镜检。
例如，在《中国病原生物学杂志》第12卷第10期公开了多重定量PCR在肺孢子菌肺炎诊断中的应用，具体公开了提取PCP患者呼吸道标本DNA，分别以Pj线粒体大亚基rRNA(mtLSUrRNA)、主要表面糖蛋白(Msg)、二氢叶酸合成酶为靶基因进行定量PCR检测，以临床诊断为金标准评价Mt-qPCR、Msg-qPCR和DHPS-qPCR 3种方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。由此证明以临床诊断为金标准，Mt-qPCR方法优于Msg-qPCR和DHPS-qPCR，联合使用含有Mt-qPCR在内的2种以上qPCR方法能提高PCP诊断的符合率。
综上所述，目前可以基于实时PCR法，通过检测例如多拷贝mtLSU，从而确定肺孢子菌的感染，通过LSU标准曲线定量检测样本中肺孢子菌浓度。并且目前临床上对肺孢子菌耐药株的重视程度较低，仍没有建立同时标准化且有效的耐药检测方法。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供能够同时检测肺孢子菌及其耐药性的方案。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药性相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH4)2SO4、15-25mM MgSO4，且pH值为8.0-8.5。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒进一步包含LSU标准样品和对照样品。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，所述第一靶基因为mtLSU，所述第二靶基因为DHPS。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:1和2所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:3和4所示，所述第三引物的序列如SEQ ID NO:7和8所示。所述第一探针的序列如SEQ ID NO:5所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:6所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO:9所示。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒进一步包含内部质控样品，且所述用于第一靶基因检测的染料为ATTO Rho101，用于第二靶基因检测的染料为MAX，和用于内部质控检测的染料为ATTO 647N。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒中，控制所述内部质控样品的Ct值在28.0-35.0范围内。
本发明的第二方面，提供一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的反应体系，其包含溶解于缓冲液的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的反应体系，其中，所述第一引物与第二引物的摩尔比2-3.5:1。
本发明的第三方面，提供一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的方法，其包括使用第一方面所述的试剂盒的步骤。
本发明不仅可以检测样品是否存在肺孢子菌，并且还可通过熔解曲线分析检测例如DHPS基因中可引起氨基酸改变的55和57位点的突变，从而检测真菌样本对例如磺胺类药物的耐药性。
附图说明
图1用于染料筛选的mtLSU的扩增曲线。其中，1、2、3为AttoRho101染料，4、5、6为ROX染料。
图2用于染料筛选的内部质控的扩增曲线。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的试剂盒用于同时检测肺孢子菌及其耐药性，而无需分别单独进行检测。同时检测是指在能够在同一反应体系中一次性检测出样品中是否含有肺孢子菌以及该菌是否包含耐药性突变。
本发明的试剂盒能够构建用于多重实时荧光PCR反应的反应体系。试剂盒包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针。在一种示例性实施方式中，所有引物和探针以干燥粉末混合物的形式存在于容器，如小瓶。在另一示例性实施方案中，所有引物和探针溶解于缓冲液以形成混合物的形式存在于容器，如小瓶。本发明中，为了能够实现同时检测的目的，本发明的缓冲液可包含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4和MgSO4等。优选使缓冲液具有较低的离子强度，从而能够同时确保第一通道和第三通道的荧光PCR反应和第二通道的熔解曲线分析。在示例性实施方案中，缓冲液能够确保得到包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH4)2SO4、15-25mM MgSO4，且pH值为8.0-8.5的反应体系。缓冲液优选包含200mM Tris-HCl pH8.3,200mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4。
本发明中，第一引物和第一探针组合用于通过多重PCR的第一通道检测第一靶基因。本发明的靶基因优选为多拷贝基因，由此可以提高检测灵敏度。第二引物和第二探针的组合用于通过多重PCR的第二通道检测第二靶基因。第二靶基因优选为单拷贝基因。在多重PCR反应中，不同染料之间存在相互影响，为了能够得到较好的区分，本发明发现，当用于第一靶基因检测的染料使用ATTO Rho101，用于第二靶基因检测的染料使用MAX时，能够得到更优的检测结果。在本发明的试剂盒进一步包含内部质控时，用于内部质控检测的染料优选为ATTO 647N。
本发明的试剂盒中，第一引物的量一般大于第二引物的量，由此可确保同时实现两种反应及检测。优选地，第一引物的总量与第二引物的总量的摩尔比2-3.5:1，优选2-3:1。在某一具体实施方案中，本发明的第一引物的总量能够使其在反应体系中的最终浓度为0.6-1μM，优选0.7-0.8μM。本发明中第一引物中正向引物和反向引物为等摩尔量，即正向引物和反向引物的摩尔比为1:1，或实质上为1:1。本发明中第二引物的总量能够使其在反应体系中的最终浓度为0.15-0.4μM，优选，0.2-0.35μM。第二引物中正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，例如1:18、1:20、1:22、1:24等。由此，能够增加熔解曲线的荧光峰值，提高PCR反应的灵敏度。为了进一步增加突变与野生型的区分度，本发明的第二探针设计为具有更高的Tm值，例如73-76℃，优选74-75℃的Tm值。
本发明中，耐药性突变包括点突变。本发明的一条探针可覆盖的点突变的数量可以是一个位点，也可以是多个位点。优选地，本发明的一条探针可覆盖的耐药性突变位点为1-5个，更优选1-3个。如果位点数过多，则结合特异性变差，不利于第二通道中熔解曲线分析，从而不能得到具有区别的Tm值。优选地，本发明的耐药性突变为位于DHPS基因的点突变。例如，该基因55位点的苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，57位点的脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)。
除了上述第一寡核苷酸组和第二寡核苷酸且外，本发明的试剂盒还可进一步包含质控组分。例如，阳性质控和内部质控等。优选地，内部质控的Ct值在28.0-35.0范围内。还优选地，本发明进一步包含LSU标准样品。本发明的试剂盒中，阳性质控、内部质控和LSU标准样品等优选以单独存放，而在使用前将三者或至少之一与反应体系混合的方式设置。
除了寡核苷酸组之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸组)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。
本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
本发明的反应体系是指包含溶解于缓冲液的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第二三探针的混合物，其用于多重荧光PCR反应。其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。
本发明的用于检测肺孢子菌及其耐药性的方法包括使用试剂盒的步骤。在某一示例性实施方案中，本发明的方法包括：
1.配制反应体系的步骤
将反应液母液、聚合酶、稀释液按10:(0.5-1.5):(6-10)的体积比混合得到反应混合液。根据需要按反应体积进行分装。例如，分装为20μl体积、30μl体积或50μl体积等。
其中母液包含溶解于缓冲液中的第一引物、第二引物、第一探针和第二探针。示例性缓冲液的组成包含200mM Tris-HCl pH8.3,200mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4。
2.加样步骤，包括：
样本孔：向反应混合液中添加样本DNA；
阴性对照：向反应混合液中添加稀释液；
阳性对照：向反应混合液中添加PC；
LSU标准曲线：向反应混合液中添加LSU样本。
优选地，将反应孔封好，短暂离心。尽量避免反应孔中有气泡。
3.上机
根据不同的仪器选用不同的检测波长。对于Rotor-Gene，第一通道使用585nm激发波长和610nm发射波长，第二通道使用530nm激发波长和555nm发射波长，第三通道使用625nm激发波长和660nm发射波长。对于LC480II，第一通道使用533nm激发波长和610nm发射波长，第二通道使用533nm激发波长和580nm发射波长，第三通道使用618nm激发波长和660nm发射波长。
PCR反应程序一般包括高温(90-98℃)活化30秒-5分钟，优选1-3分钟。90-95℃且低于活化温度的温度进行变性10-20秒、55-65℃退火并延伸30秒-2分钟、90-95℃且低于活化温度的温度再次变性10-20秒，并由此循环20-50个循环，优选30-45个循环。接下来在40-50℃保持80-100秒。然后在45-85℃进行熔融曲线分析。
本发明的方法优选还可包括核酸处理步骤，其包括例如使用DTT预处理样本的步骤。优选地，在核酸提取前在样本中加入内部质控IC。
实施例1
本实施例为用于肺孢子菌及耐药检测的试剂盒例。本实施例的试剂盒组分见表1，规格为25测试/盒。
表1肺孢子菌及耐药检测试剂盒组成
Figure BDA0002692860700000081
Figure BDA0002692860700000091
本实施例的试剂盒适用于下述仪器：
Figure BDA0002692860700000092
480II(Roche)
Figure BDA0002692860700000093
Q(QIAGEN)
CFX96(Biorad)
Mic qPCR(Bio Molecular Systems)
Quantstudio 5(Thermo Fisher Scientific)
肺孢子菌及耐药检测试剂盒的储存条件为-15℃到-30℃避光保存；尽量避免反复冻融(不超过10次)；有效期见产品标签。为了避免交叉污染，建议在PCR实验室操作，并且单独储存阳性质控。
试剂盒中Mastermix包含表2所示的组成：
Figure BDA0002692860700000094
注：内部质控为M13噬菌体
实施例2
1、核酸提取
若样本呈粘稠状，使用DTT预处理样本。在样本中加入10％1M DTT，37℃孵育15分钟。使用
Figure BDA0002692860700000095
Blood minikit(QIAGEN)或
Figure BDA0002692860700000096
Figure BDA0002692860700000101
提取样本核酸，详见说明书。注：核酸提取前在样本中加入IC。
提取的核酸避免反复冻融，若提取当天使用则建议4℃保存DNA，也可于-20℃长期保存。
2、操作步骤
2.1配制反应体系
按照表3配制PCR反应体系。配制完成后，充分混匀，分装20μl至PCR反应孔中，反应板需置于冰上。
表3肺孢子菌及耐药检测试剂盒反应混合液的配制
组分名称 体积(1×) 体积(10×)
反应液 10 100
Taq酶 1 10
稀释液 9 90
总体积 20 200
2.2加样
向含20μl反应混合液的反应孔中，添加5μl的核酸。
样本孔：向反应混合液中添加5μl样本DNA；
阴性对照：向反应混合液中添加5μl稀释液；
阳性对照：向反应混合液中添加5μl PC；
LSU标准曲线：向反应混合液中添加5μl LSU标准品。
将反应孔封好，短暂离心。尽量避免反应孔中有气泡。
2.3上机
按照表4设置荧光通道，按照表5设置PCR反应程序。将封好的反应板放入PCR仪中，运行PCR程序。
表4不同PCR仪的荧光通道设置
Figure BDA0002692860700000102
Figure BDA0002692860700000111
表5 PCR反应程序设置
Figure BDA0002692860700000112
注：不同的PCR仪需设置不同的升/降温速率；在黄色荧光通道收集荧光。
2.4数据分析
以罗氏LC480为例：程序运行结束以后，首先选择二阶求导分析方法，可以自动确定Ct值，然后，通过Tm calling分析方法，来读取Tm值。
要确认DNA提取(IC)和PCR程序(IC和PC)，所有质控的Ct值必须在规定的可接受范围内(表6)。
表6质控的Ct值范围
Figure BDA0002692860700000113
对样本结果的解释，根据表7对肺孢子菌及耐药检测试剂盒的结果进行判读，若未观察到任何荧光信号，则说明DNA降解或者样本被抑制或者操作失误。
表7对样本结果的解释
Figure BDA0002692860700000114
Figure BDA0002692860700000121
本实施例的试剂盒同时提供了四种不同浓度的LSU标准样本，用于定量检测卡氏肺孢子菌的mtLSU DNA(10000-10copies/μl)。LC480Ⅱ软件可自动生成标准曲线，根据阳性样本的mtLSU基因的Ct计算样本中卡氏肺孢子菌的浓度。
通过熔解曲线分析来区分DHPS的突变类型。Tm值范围见表8。
表8不同DHPS类型的Tm值范围
Figure BDA0002692860700000122
实施例3
本实施例为试剂盒性能测试例。
1.最低检测限
采用包含mtLSU和DHPS序列的DNA片段作为模板进行PCR扩增。将模板按照10倍梯度稀释，浓度分别为1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL、0.1copies/μL，通过20个重复检测中检出率≥95％来确定最低检测限。
类别 LOD(copies/μL)
DHPS 1
mtLSU 1
2.特异性
本实施例中使用21株不同类型的真菌样本，利用实施例1中试剂盒检测上述真菌样本，仅肺孢子菌样本检测为阳性，特异性达到100％。
真菌类型 mtSLU DHPS
肺孢子菌 + +
新型隐球菌 - -
酿酒酵母 - -
白念 - -
近平滑念珠菌 - -
烟曲霉 - -
腐皮镰刀菌 - -
黄青霉 - -
马尔尼菲青霉 - -
米根霉 - -
金黄色葡萄球菌 - -
假单胞菌 - -
大肠杆菌 - -
百日咳杆菌 - -
流感嗜血杆菌 - -
莫拉克斯氏菌 - -
肺炎链球菌 - -
肺炎克雷伯菌 - -
嗜肺军团菌 - -
肺炎支原体 - -
结核杆菌 - -
3.临床样本检测结果
利用实施例1的试剂盒初步验证待测试剂对已知信息的临床样本检测结果的准确性和特异性，以及在患者治疗效果监测用途上的有效性。
实验仪器为Roche LightCycler480Ⅱ。样本为肺孢子菌痰液样本，共77例，经已有PCR检测方法确认肺孢子虫阳性。
在共计77个肺孢子菌样本痰液样本中，有9个样本IC不合格，为无效样本。不合格的原因可能在于提取效率过低。另外，68个有效样本中，检测出68个阳性，阳性符合率为100％。其中，检测出一例P53S突变，为磺胺类药物耐药样本。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒、反应体系和方法
<130> BH2000320-1
<141> 2020-09-21
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atcagactat gtgcgataag g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tcttcacccg aaccttt 17
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<212> DNA
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cgaaagggaa acagcccaga acagc 25
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agtctacacg gcctggttca catg 24
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cagtgttacg gtacatgggt 20
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gcgattagga ttaggaagag 20
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<400> 9
cggttctgag ggtggcggta ctaacc 26

Claims (10)

1.一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，包含能够以混合物形式存在的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃。第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。
2.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，所述混合物溶解于缓冲液中，且所述缓冲液包含190-210mM Tris-HCl、190-210mM KCl、90-110mM(NH4)2SO4、15-25mM MgSO4，且pH值为8.0-8.5。
3.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，进一步包含LSU标准样品和对照样品。
4.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，所述第一靶基因为肺孢子菌线粒体核糖体大亚基rRNA基因mtLSU，所述第二靶基因为二氢叶酸合成酶基因DHPS。
5.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，所述第一引物的序列如SEQ ID NO:1和2所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO:3和4所示，所述第三引物的序列如SEQ ID NO:7和8所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO:5所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:6所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO:9所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，进一步包含内部质控样品，且所述用于第一靶基因检测的染料为ATTO Rho101，用于第二靶基因检测的染料为MAX，和用于内部质控检测的染料为ATTO 647N。
7.根据权利要求1所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的试剂盒，其特征在于，控制所述内部质控样品的Ct值在28.0-35.0范围内。
8.一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的反应体系，其特征在于，包含溶解于缓冲液的第一引物、第一探针、第二引物、第二探针、第三引物和第三探针，其中，第一引物和第一探针用于在实时荧光PCR第一通道中检测以多拷贝存在的第一靶基因，第二引物和第二探针用于在实时荧光PCR第二通道中检测以单拷贝存在的第二靶基因是否存在耐药相关突变，第二引物中的正向引物和反向引物的摩尔比为1:15-25，且第二探针的Tm值为73-76℃，第三引物和第三探针用于在实时荧光PCR第三通道中检测内部质控。
9.根据权利要求8所述的用于检测肺孢子菌及其耐药性的反应体系，其特征在于，所述第一引物与第二引物的摩尔比2-3.5:1。
10.一种用于检测肺孢子菌及其耐药性的方法，其特征在于，包括使用根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒的步骤。
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