CN116622864A - 一种快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒及方法。首先针对塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌三种病原菌设计出系列引物探针组合，再从中经过多轮筛选，找到检测灵敏度最高的三重扩增引物探针组；同时还对扩增体系进行优化，通过在A Buffer中添加低聚肽和DMSO，显著提升扩增效率，提高检测灵敏度和特异性，最低可检测出0.5copies/μL的样本，特异性好且检测时间仅需10～20分钟。对塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的快速检测，切断传播途径，降低工厂化养殖方斑东风螺的风险具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒及方法。
背景技术
弧菌病为目前危害海南省方斑东风螺养殖的最主要病害类型。每年4-5月份以及10-11月份期间，工厂化养殖方斑东风螺易发生由塔式弧菌、地中海弧菌或者哈维氏弧菌引起的“急性死亡症”，引发养殖方斑东风螺大规模死亡，导致年产量减少40％以上。为了能够及时、有效诊断发病原因以便于及早采取措施，急需建立一种具有高特异性，高灵敏度，耗时短且操作简单的，同时快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌三种病原菌的检测方法。
重组酶介导链置换核酸扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术。从细菌或真菌中获得的重组酶在常温下与引物DNA紧密结合，形成重组酶/引物复合体，侵入DNA双链核酸模板，在侵入位点重组酶将双链打开，同时单链结合蛋白结合到被重组酶打开的单链上，维持双链模板处于开链状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描，当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时，重组酶/引物复合体解体，DNA聚合酶结合到引物的3’端，开始合成新链。合成的新链又可以作为模板，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。经过荧光标记的探针与扩增产物结合，当探针被核酸外切酶酶切后发出荧光信号，可对扩增过程进行实时监控。因此可以考虑通过多重RAA扩增来实现塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌三种病原菌的快速检测。
但是多重RAA非常依赖于扩增核酸的目标序列、引物设计和扩增体系的配方设计，因此还需找到最合适的引物和扩增体系设计，从而实现对同时针对塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌三种病原菌的高特异性、高灵敏度的检测。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒及方法。首先针对塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌三种病原菌设计出几百种引物探针组合，再从中经过多轮筛选，找到检测灵敏度最高的三重扩增引物探针组；同时还对扩增体系进行优化，通过在A Buffer中添加低聚肽和DMSO，显著提升扩增效率，进一步提高检测灵敏度和特异性，最低可检测出0.5copies/μL的样本，特异性好，检测时间仅需10～20分钟。对塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的快速检测，切断传播途径，降低工厂化养殖方斑东风螺的风险具有重大意义。
PCR多重扩增跟单重扩增的灵敏度几乎没有差别，但是RAA单重反应灵敏度高，双重反应灵敏度下降，三重反应灵敏度急剧下降，因此要进行RAA三重反应，同时还要保持较高的检测灵敏度，不仅要选到合适的引物探针组，还要从RAA扩增体系上做文章。本发明通过挑选到最佳的引物探针组，并改进了A Buffer的组成，显著提升了RAA三重扩增的检测灵敏度，同时还能保持非常好的特异性。
一方面，本发明提供了一种三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的引物探针组合，包括如下的上游引物、下游引物和探针：
| 菌种 | 上游引物 | 下游引物 | 探针 |
| 塔式弧菌 | Seq ID NO.1 | Seq ID NO.2 | Seq ID NO.3 |
| 地中海弧菌 | Seq ID NO.4 | Seq ID NO.5 | Seq ID NO.6 |
| 哈维氏弧菌 | Seq ID NO.7 | Seq ID NO.8 | Seq ID NO.9 |
本发明通过选取地中海弧菌pyrH基因、塔氏弧菌gyrB基因、哈维氏弧菌hemolysin基因中的特异性高、且相互之间不易造成影响的片段作为目的扩增区域，其中地中海弧菌pyrH基因的扩增区域的核苷酸序列如Seq ID NO.10所示，塔氏弧菌gyrB基因的扩增区域的核苷酸序列如Seq ID NO.11所示，哈维氏弧菌hemolysin基因的扩增区域的核苷酸序列如Seq ID NO.12所示；分别针对这三种目的扩增区域，设计系列引物探针序列，获得几百种引物探针组合，再从中经过多轮筛选，找到如上表所示的检测灵敏度最高的三重扩增引物探针组。
进一步地，所述塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的探针分别标记有不同的荧光基团。
在一些方式中，所述塔式弧菌的探针标记有FAM荧光基团；地中海弧菌的探针标记有ROX荧光基团；哈维氏弧菌的探针标记有CY5荧光基团。
其中，具体的引物探针序列见下表：
另一方面，本发明提供了一种三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒，包括如上所述的引物探针组合。
进一步地，还包括A Buffer；所述A Buffer中含有低聚肽，所述低聚肽的氨基酸序列为选自Seq ID NO.13～Seq ID NO.17中的任意一种或多种。
低聚肽是指由小于20个氨基酸组成的多肽。本发明经研究证明，在RAA扩增体系中添加低聚肽，能显著提高检测灵敏度，其原因可能是低聚肽能帮助维持体系稳定，从而提升检测灵敏度。
在一些方式中，低聚肽可以采用低聚肽一(Seq ID NO.13)、低聚肽二(Seq IDNO.14)、低聚肽三(Seq ID NO.15)、低聚肽四(Seq ID NO.16)、低聚肽五(Seq ID NO.17)。
进一步地，所述低聚肽的氨基酸序列为Seq ID NO.13。
不同序列的低聚肽，对提高检测灵敏度的效果存在区别，最优先的低聚肽具有如Seq IDNO.13所示的氨基酸序列。
进一步地，所述A Buffer中还含有DMSO(二甲基亚砜)。
DMSO具有促进低聚肽溶解的效果，因此在A Buffer中含有低聚肽的基础上，进一步添加DMSO，有助于进一步提高检测灵敏度。
进一步地，所述A Buffer含有聚乙二醇，Tris-HCl，DMSO，和低聚肽；所述试剂盒还包括B Buffer，所述B Buffer含有醋酸镁、氯化镁和氯化锰。
进一步地，所述试剂盒还包括RAA反应干粉、阳性对照品和阴性对照品；所述RAA的扩增条件为：39～42℃，时间10～20min。
在一些方式中，其中RAA反应干粉中的成分包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶、ATP、dNTPs、肌酸激酶、磷酸肌酸二钠盐、海藻糖、甘露醇等。
在一些方式中，所述阳性对照品为含有塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌目的扩增区域序列的阳性质粒，所述阳性质粒中包含了Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq IDNO.12所示的核苷酸序列。
在一些方式中，所述阴性对照品为纯化水。
再一方面，本发明提供一种三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的方法，所述方法采用如上所述的引物探针组合，或采用如上所述的试剂盒对样本进行RAA扩增后检测。
在一些方式中，所述方法包括如下步骤：①以待测样本的核酸为模板；②采用本发明所述的试剂盒进行RAA反应；③根据实时荧光扩增结果分析待测样本，确定待测样本是否存在塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌。
具体如下：①使用核酸提取试剂盒提取待测样品的核酸，或用样本释放剂处理样本，或用煮沸法将样本中的核酸释放出来；②以待测样品的核酸为模板，在RAA反应干粉(包含塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌检测引物探针)、ABuffer、B Buffer存在下进行RAA反应；③实时荧光扩增结果分析，适用的仪器设备包括各种型号的荧光PCR仪、实时荧光恒温仪等。其中所述引物探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示。作为优选，所述RAA反应条件为：39～42℃，时间10～20min。
再一方面，本发明提供了低聚肽用于制备三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的RAA扩增试剂的用途，所述低聚肽的氨基酸序列为选自Seq ID NO.13～SeqIDNO.17中的任意一种或多种。
本发明所提供的试剂盒及其检测方法可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌，适宜于临床的鉴别检测、动物疫病检测，还可对环境中(如动物排泄场所等)是否存在塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌进行监测。
本发明的有益效果为：
(1)选取地中海弧菌pyrH基因、塔氏弧菌gyrB基因、哈维氏弧菌hemolysin基因中的特异性高、且相互之间不易造成影响的片段作为目的扩增区域，设计系列引物探针序列，获得几百种引物探针组合，再从中经过多轮筛选，找到检测灵敏度最高的三重扩增引物探针组；
(2)在RAA扩增体系的A Buffer中添加低聚肽，能帮助维持体系稳定，从而提升检测灵敏度，同时筛选了低聚肽的序列，找到了最佳的低聚肽序列；
(3)在A Buffer中含有低聚肽的基础上，进一步添加DMSO，有助于进一步提高检测灵敏度；
(4)省时、方便、快捷，检测周期短，每轮检测仅需10～20min；可同时使用3个荧光通道分别检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌，检测效率高；
(5)最低可检测出0.5copies/μL的样本，同时还具有非常好的特异性；
(6)适应性广，鉴定简单：适用的仪器设备包括各种型号的荧光PCR仪、实时荧光恒温仪等，出现特异性扩增曲线即为阳性；
(7)对塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的快速检测，切断传播途径，降低工厂化养殖方斑东风螺的风险具有重大意义。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用，本发明的实施例中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均能够以任何方式组合。
实施例1：本发明提供的快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒、检测方法及检测结果验证
1、本实施例提供了一种快速检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的检测试剂盒，该试剂盒包括引物探针组、RAA反应干粉、A Buffer、B Buffer、阳性对照品和阴性对照品。
引物探针组：塔式弧菌引物探针(0.13μL，50mM)、地中海弧菌引物探针(0.13μL，50mM)、哈维氏弧菌引物探针(0.13μL，50mM)，引物探针序列如表1所示；
表1、引物探针组序列
RAA反应干粉：重组酶(6.5μg/管)、单链结合蛋白(40μg/管)、DNA聚合酶(3.5μg/管)、核酸外切酶(5.0μg/管)、ATP(0.075mg/管)、dNTPs(13.2ng/管)、肌酸激酶(5.0μg/管)、磷酸肌酸二钠盐(0.65mg/管)、海藻糖(1.3mg/管)、甘露醇(1.25mg/管)；
A Buffer成分为：聚乙二醇(PEG)(0.2mg/μL)，Tris-HCl(6.05μg/μL)，DMSO(15μg/μL)，低聚肽(SEQ ID NO.13)(1.5μg/μL)；
B Buffer成分为：四水合醋酸镁(MgAc2)(60μg/μL)、氯化镁(MgCl2)(2.66μg/μL)、氯化锰(MnCl2)(3.78μg/μL)；
本实施例提供的阳性对照品为含有塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌目的扩增区域序列的阳性质粒(所述阳性质粒中包含了Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq ID NO.12所示的核苷酸序列)，阴性对照品为纯化水。
2、应用本实施例的试剂盒对样本进行检测，具体步骤如下：
2.1样品核酸的提取
方法1：采用组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。
方法2：采用核酸释放剂处理样本，不提取核酸，裂解物直接作为模板。
2.2RAA反应体系的配制：每个检测样品对应一个RAA反应干粉管，每个RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。
表2、RAA反应体系配制表
| RAA反应体系组分 | 使用量 |
| RAA反应干粉 | 1管 |
| 上游引物(50μM) | 0.4μL |
| 下游引物(50μM) | 0.4μL |
| 探针(50μM) | 0.12μL |
| A Buffer | 35.5μL |
| B Buffer | 2.5μL |
| 模板 | 10μL |
| 总体积 | 50μL |
为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品(阳性对照是含有3种扩增区域的质粒，阴性对照是水，作为模板加入体系，用量见表2)，阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
2.3将配制好RAA反应体系的反应管上下颠倒6-8次，充分混匀反应液，低速离心数秒使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光PCR仪或恒温荧光仪中，设置反应温度为39℃，反应时间20min，根据是否出现特异性扩增曲线来进行判别。
3、检测结果验证分析：
3.1准确性验证
为验证本实施例所述引物探针和试剂在实际情况下能正常使用，使用本实施例提供的试剂盒对实际样本进行检测。海南海洋与渔业科学院提供已经PCR检测确认的水产样品25份。设置反应温度为42℃，反应时间10min。检测结果见表3。本实施例提供的试剂盒检测结果与样本的阴阳性一致，符合率100％。
表3、本实施例提供的试剂盒进行实际样本检测的结果
3.2灵敏度试验
培养并提取含塔式弧菌、地中海弧菌、哈维氏弧菌扩增区域的质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并分别按比例稀释到100copies/μL、10copies/μL、1copies/μL、0.5copies/μL、0.3copies/μL、0.1copies/μL等6个浓度梯度进行灵敏度试验。在每个浓度进行20次重复检测，结果如表4：
表4、本实施例提供的试剂盒灵敏度实验结果
检测结果显示，本实施例提供的三重荧光检测试剂盒检测灵敏度可达0.5copies/μL，即500copies/mL，表明本实施例提供的检测试剂盒和检测方法对鉴别诊断塔式弧菌、地中海弧菌、哈维氏弧菌具有高度的灵敏性。
3.3特异性试验
为了检测本实施例提供的试剂盒的特异性，分别对其他菌株样本进行检测。检测结果如表5所示，特异性测试样本的检测结果均为阴性，说明本实施例提供的方法及试剂盒具有高特异性。
表5、本实施例提供的试剂盒特异性实验结果
由表5可以看出，本实施例提供的试剂盒与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)、鮸鱼弧菌(Vibrioponticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、麦氏交替单胞菌(Alteromonasmacleodii)、印度微小杆菌(Exiguobacterium indicum)、龙虾弧菌(Vibrio panuliri)、徐氏弧菌(Vibrio xuii)、欧文斯氏弧菌(Vibrio owensii)等均无交叉反应，具有非常好的特异性。
实施例2：引物探针组的筛选
本实施例参考GenBank上已公布的地中海弧菌pyrH基因序列、塔氏弧菌gyrB基因序列、哈维氏弧菌hemolysin基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对。选取3种弧菌的特异性高、且相互之间不易造成影响的片段作为目的扩增区域，其中地中海弧菌pyrH基因的扩增区域的核苷酸序列如Seq ID NO.10所示，塔氏弧菌gyrB基因的扩增区域的核苷酸序列如Seq ID NO.11所示，哈维氏弧菌hemolysin基因的核苷酸序列如Seq IDNO.12所示。
大量实验表明，不同的引物对RAA荧光扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本实施例分别针对上述三种目的扩增基因片段初步各设计了以下待筛选引物。
1、地中海弧菌的引物和探针：
地中海弧菌探针VM-Probe，标记ROX荧光，一共4个修饰点：ROX-dT、BHQ1-dT、THF、C3 Spacer，具体序列为：
GTGTTTGCGACGATTACAACTGGGC[ROX-dT][THF]A[BHQ1-dT]GCTATTCGTGAA TTAC-C3Spacer
地中海弧菌的上下游引物各设计并筛选获得如表6所示的10种上游引物和10种下游引物：
表6、地中海弧菌的上下游引物设计
2、塔氏弧菌的引物和探针：
塔式弧菌探针gyrB-Probe，标记FAM荧光，一共4个修饰点：FAM-dT、BHQ1-dT、THF、C3 Spacer，具体序列为：
TTCAGCAGTACAACGCGGGTATTAAGC[FAM-dT][THF]G[BHQ1-dT]GGATCGCAT GAG-C3Spacer
塔式弧菌的上下游引物各设计并筛选获得如表7所示的11种上游引物和9种下游引物：
表7、塔式弧菌的上下游引物设计
3、哈维氏弧菌的引物和探针：
哈维氏弧菌探针VHV-Probe，标记FAM荧光，一共4个修饰点：CY5-dT、BHQ2-dT、THF、C3 Spacer，具体序列为：
GCGGATCTTGTTGATTTCTTCT[Cy5-dt]G[THF]G[BHQ2-dT]CGAGTAGGTAAAC-C3 Spacer
哈维氏弧菌的上下游引物各设计并筛选获得如表8所示的8种上游引物和7种下游引物：
表8、哈维氏弧菌的上下游引物设计
第一轮引物筛选：
按表9配制反应体系，用于第一轮引物筛选。
表9、RAA反应体系配制表
| RAA反应体系组分 | 使用量 |
| RAA反应干粉 | 1管 |
| 上游引物(50μM) | 0.4μL |
| 下游引物(50μM) | 0.4μL |
| 探针(50μM) | 0.12μL |
| A Buffer | 36.58μL |
| B Buffer | 2.5μL |
| 模板 | 10μL |
| 总体积 | 50μL |
将配制好RAA反应体系的反应管上下颠倒6-8次，充分混匀反应液，低速离心数秒使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光PCR仪，设置反应温度为39℃，反应时间20min。
第一轮引物筛选方法：3种弧菌，各自取上游引物与下游引物配对组合，各优选出2组灵敏度最高的引物组合：
地中海弧菌上游10条引物(VM-F1至VM-F10)，下游10条引物(VM-R1至VM-R10)，一共100种组合方式，其中灵敏度最高的组合为VM-F5+VM-R9、VM-F10+VM-R10；
塔氏弧菌上游11条引物(gyrB-F1至gyrB-F11)，下游9条引物(gyrB-R1至gyrB-R9)，一共99种组合方式，其中灵敏度最高的组合为gyrB-F5+gyrB-R1、gyrB-F10+gyrB-R9；
哈维氏弧菌上游8条引物(VHV-F1至VHV-F8)，下游7条引物(VHV-R1至VHV-R7)，一共56种组合方式，其中灵敏度最高的组合为VHV-F3+VHV-R1、VHV-F6+VHV-R6；
第二轮引物筛选：
分别采用第一轮筛选获得的3种弧菌的各2组灵敏度最高的引物组合(共计8种组合方式)，按表10配制反应体系，用于第二轮引物筛选。
表10、RAA反应体系配制表
| RAA反应体系组分 | 使用量 |
| RAA反应干粉 | 1管 |
| 地中海弧菌上游引物(50μM) | 0.4μL |
| 地中海弧菌下游引物(50μM) | 0.4μL |
| 地中海弧菌探针(50μM) | 0.12μL |
| 塔式弧菌上游引物(50μM) | 0.4μL |
| 塔式弧菌下游引物(50μM) | 0.4μL |
| 塔式弧菌探针(50μM) | 0.12μL |
| 哈维氏弧菌上游引物(50μM) | 0.4μL |
| 哈维氏弧菌下游引物(50μM) | 0.4μL |
| 哈维氏弧菌探针(50μM) | 0.12μL |
| A Buffer | 34.74μL |
| B Buffer | 2.5μL |
| 模板 | 10μL |
| 总体积 | 50μL |
将配制好RAA反应体系的反应管上下颠倒6-8次，充分混匀反应液，低速离心数秒使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光PCR仪，设置反应温度为39℃，反应时间20min。
第二轮引物的具体筛选过程和结果见表11。
表11、第二轮引物的具体组合方式和灵敏度检测结果
从中优选出第七组引物组合方式最佳，具体为：地中海弧菌VM-F10+VM-R10、塔氏弧菌gyrB-F10+gyrB-R9、哈维氏弧菌VHV-F3+VHV-R1的引物组合，灵敏度可达500copies/mL。
实施例3：低聚肽对检测结果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行塔式弧菌、地中海弧菌、哈维氏弧菌的三重扩增检测，其中根据RAA中的A Buffer是否含有低聚肽分成7种情况：1、不含低聚肽；2、含有低聚肽一Seq ID NO.13；3、含有低聚肽二Seq ID NO.14；4、含有低聚肽三Seq IDNO.15；5、含有低聚肽四Seq ID NO.16；6、含有低聚肽五Seq ID NO.17；7、不含低聚肽，含有牛血清白蛋白，具体如表12，7种情况的A Buffer中都含有DMSO。采用不同的A Buffer进行RAA扩增反应后，检测三种菌的含量，考察其检测灵敏度结果如表12所示。
表12、A Buffer中的低聚肽对检测灵敏度的影响
由表12可以看出，A Buffer中含有低聚肽(第2～6种情况)时，相比于第1种情况，可以显著提高检测灵敏度，其中最优选的是采用第2种情况(含有低聚肽Seq ID NO.13)时，检测灵敏度最高，三种菌的检测灵敏度都能达到0.5copies/μL。
实施例4：DMSO对检测结果的影响
本实施例采用实施例1提供的方法进行塔式弧菌、地中海弧菌、哈维氏弧菌的三重扩增检测，其中根据RAA中的A Buffer中含有低聚肽Seq ID NO.13，同时根据是否含有DMSO分为两组，考察DMSO对检测结果的影响，结果如表13所示。
表13、DMSO对检测灵敏度的影响
由表13可以看出，A Buffer中含有DMSO时，可以显著提高检测灵敏度，其原因可能是DMSO能提高低聚肽Seq ID NO.13的溶解性，从而提高了RAA体系的稳定性，提高了检测灵敏度。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的引物探针组合，其特征在于，包括如下的上游引物、下游引物和探针：
。
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的探针分别标记有不同的荧光基团。
3.一种三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物探针组合。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括A Buffer；所述A Buffer中含有低聚肽，所述低聚肽的氨基酸序列为选自Seq ID NO.13～Seq ID NO.17中的任意一种或多种。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述低聚肽的氨基酸序列为Seq IDNO.13。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述A Buffer中还含有DMSO。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述A Buffer含有聚乙二醇，Tris-HCl，DMSO，和低聚肽；还包括B Buffer，所述B Buffer含有醋酸镁、氯化镁和氯化锰。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括RAA反应干粉、阳性对照品和阴性对照品；所述RAA的扩增条件为：39～42℃，时间10～20min。
9.一种三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的引物探针组合，或采用如权利要求3～8任一项所述的试剂盒对样本进行RAA扩增后检测。
10.低聚肽用于制备三重扩增检测塔式弧菌、地中海弧菌和哈维氏弧菌的RAA扩增试剂的用途，其特征在于，所述低聚肽的氨基酸序列为选自Seq ID NO.13～Seq ID NO.17中的任意一种或多种。
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