CN116626147A - 一种奥默柯达菌的检测方法及其蛋白指纹图谱的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种奥默柯达菌的检测方法及其蛋白指纹图谱的构建，涉及临床医学检测技术领域，本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，挑选符合要求的谱图，并按照特定的筛选原则，比如最小信噪比≥10，质量偏差≤500ppm，最小出峰权重≥50％，特征峰的数量≤70，提取特征峰，构建奥默柯达菌标准指纹图谱。在实际检测过程中，采集的实时图谱与标准谱比对后快速实现属种鉴定，采集和鉴定的整个过程仅需几分钟。检测结果可广泛应用于临床检验、疾病预防、流行病筛查、进出口检验检疫等领域。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学检测技术领域，具体而言，涉及一种奥默柯达菌的检测方法及其蛋白指纹图谱的构建。
背景技术
在过去的二十多年中，由罕见真菌引起的感染显著增加。奥默柯达菌(Kodamaeaohmeri)是一种子囊菌酵母，属于酵母科，广泛用于水果、泡菜和果皮的食品工业发酵。1998年首次从患者的血液中分离出来奥默柯达菌，几十年后，它已成为一种重要的新兴人类病原体，主要引起真菌血症、心内膜炎、蜂窝织炎、腹膜炎以及导管相关血流感染、皮肤感染等，特别是在免疫功能低下的患者中，该菌种已成为真菌病重要的机会性病原体。奥默柯达酵母菌主要传播途径以性交为主，由长期使用抗生素破坏酵母和细菌在阴道内的正常平衡导致，少数由接触到被霉菌污染的物品引起感染。据报道，由奥默柯达菌引起的侵袭性感染死亡率高达50％，作为柯达属中唯一一种可以在37℃以下生长并感染人类的菌种，近年来奥默柯达菌感染病患数量持续增加且死亡率高，世界各地几乎都有相关侵袭性感染的临床案例，尽早识别病原体和适当有效的用药是治疗该罕见真菌感染的重要考虑因素。
早期，作为一种在临床环境中分离的罕见病原体，奥默柯达菌在临床鉴定上存在诸多问题。以往根据菌落形态鉴定法，由于和念珠菌属形态相似，其经常被误认为是白色假丝酵母、光滑假丝酵母或热带假丝酵母。在大多数临床微生物实验中，根据不同颜色的菌落鉴定念珠菌菌种的显色生长培养基是一种有用工具。奥默柯达菌可以在显色培养基上生长酵母样菌落，其颜色在2-3天内从粉红色/淡紫色变为蓝色，可以与光滑假丝酵母(丁香色)和热带假丝酵母(蓝色)区分开来。然而这种颜色变化需要时间，并且需要连续观察。因此，如果在日常工作中仅进行一次观察，显色培养基在识别奥默柯达菌方面的错误识别率可能高达100％。API 20C AUX、VITEK 2Compact等生化方法能很可靠地鉴定念珠菌属，但其有一定概率将奥默柯达菌错误鉴定为光滑假丝酵母、白色假丝酵母、季也蒙假丝酵母等。基因测序作为鉴定奥默柯达菌的金标准但其存在操作复杂、成本较高、测序结果需由专业技术人员处理判读的弊端，尚无法在临床微生物实验室普及和开展常规检测。因此，急需开发一种操作简单、准确性高、通量大、经济可靠的检测方法，以满足临床诊断中快速、准确鉴定需求，为奥默柯达菌临床快速诊断和及时治疗提供支持。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种奥默柯达菌的检测方法及其蛋白指纹图谱的构建。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种奥默柯达菌蛋白指纹图谱的构建方法，其包括：获取至少一种目标奥默柯达菌作为代表菌株；对每种代表菌株进行质谱检测，获得每种代表菌株对应的原始图谱，根据提取标准从代表菌株的原始图谱中提取特征峰，以获得奥默柯达菌蛋白指纹图谱；所述提取标准包括：最小信噪比≥10，质量偏差≤500ppm，最小出峰权重≥50％，特征峰的数量≤70。
第二方面，本发明实施例提供了一种奥默柯达菌的鉴定或检测方法，其包括：对待测样本进行质谱检测，获得质荷比峰图；将所述质荷比峰图与奥默柯达菌蛋白指纹图谱对比，鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌；其中，所述奥默柯达菌蛋白指纹图谱为前述实施例所述的构建方法构建获得；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第三方面，本发明实施例提供了一种奥默柯达菌的鉴定或检测方法，其包括：对待测样本进行质谱检测，获得质荷比峰图；将所述质荷比峰图与奥默柯达菌蛋白指纹图谱对比，鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌；
所述奥默柯达菌蛋白指纹图谱中的特征峰包括：分子量3000～6000有25个特征峰，质荷比分别为：(3005～3007)，(3023～3025)，(3105～3017)，(3110～3112)，(3172～30174)，(3176～3178)，(3253～3255)，(3273～3275)，(3342～3344)，(3365～3367)，(3382～3384)，(3426～3428)，(3449～3451)，(3498～3500)，(3644～3646)，(3807～3809)，(3848～3850)，(3892～3894)，(4420～4422)，(4915～4917)，(5513～5515)，(5789～5791)，(5815～5817)，(5954～5956)，(5996～5998)；分子量6000～9000有19个特征峰，质荷比分别为：(6031～6033)，(6069～6071)，(6133～6135)，(6210～6212)，(6339～6341)，(6369～6371)，(6380～6382)，(6495～6497)，(6595～6597)，(6709～6711)，(6770～6772)，(6800～6802)，(6842～6844)，(6888～6890)，(6926～6928)，(7157～7159)，(7283～7285)，(7290～7292)，(8840～8842)；分子量9000～12000的有2个特征峰，质荷比分别为：(9603～9605)，(11028～11030)；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
第四方面，本发明实施例提供了特征蛋白在制备用于检测或鉴定奥默柯达菌的产品中的应用，所述特征蛋白的数量与如前述实施例中所述的特征峰的数量相同，所述特征蛋白的质荷比与如前述实施例中所述的特征峰的质荷比一一对应。
第五方面，本发明实施例提供了一种检测或鉴定奥默柯达菌的试剂或试剂盒，其包括：前述实施例所述的构建方法构建的奥默柯达菌蛋白指纹图谱或前述实施例中所述的奥默柯达菌蛋白指纹图谱。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，挑选符合要求的谱图，并按照特定的筛选原则提取特征峰，构建奥默柯达菌标准指纹图谱。在实际检测过程中，采集的实时图谱与标准谱比对后快速实现属种鉴定，采集和鉴定的整个过程仅需几分钟。检测结果可广泛应用于临床检验、疾病预防、流行病筛查、进出口检验检疫等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为奥默柯达菌特征峰提取示意图；
图2为奥默柯达菌特征峰提取示意图；
图3为待测图谱与特征谱对比示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
MALDI-TOF MS应用于微生物检测，其鉴定结果的准确性很大程度取决于数据库中对应蛋白指纹图谱及特征峰。由于奥默柯达菌临床感染相对少见，目前利用MALDI直接鉴定奥默柯达菌的相关研究较少，缺乏具有代表性的标准蛋白指纹图谱，奥默柯达菌错误识别率高，临床使用质谱鉴定较少，缺乏规范的指纹图谱，或因仪器性能导致采集到的图谱包含信息不足(分辨率、灵敏度较低等)，这大大制约了其在临床上的应用。对此，本发明提供一种标准蛋白指纹图谱及其构建方法，为奥默柯达菌的鉴定提供快捷、有效的途径。
首先，本发明实施例提供了一种奥默柯达菌蛋白指纹图谱的构建方法，其包括：
获取至少一种目标奥默柯达菌作为代表菌株；对每种代表菌株进行质谱检测，获得每种代表菌株对应的原始图谱，根据提取标准从代表菌株的原始图谱中提取特征峰，以获得奥默柯达菌蛋白指纹图谱；
所述提取标准包括：最小信噪比≥10，质量偏差≤500ppm，最小出峰权重≥50％，特征峰的数量≤70。
在一些实施例中，所述目标奥默柯达菌可来源于现有的菌株资源库或自行采集的方式。
在一些实施例中，所述代表菌株选自：MCCC 2E00862、JC 32993、ATCC 46051、ATCC52822、ATCC 20282和CBS 5367中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述代表菌株的菌种数量≥2，具体可以为2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述质谱包括：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。
在一些实施例中，在进行质谱检测前，所述构建方法还包括：对每种代表菌株进行前处理，所述前处理的方法包括：甲酸裂解法和蛋白提取法中的至少一种。奥默柯达菌属于酵母样真菌，细胞壁相比于细菌更厚，简单的直接涂抹难以获得完整良好的蛋白图谱，影响鉴定结果的可信度。而甲酸破壁法和蛋白提取法等前处理的方式可解决该问题。其中蛋白提取法能较大限度的获得完整的核糖体蛋白，最有利于菌种鉴定。甲酸破壁法(甲酸裂解法)相比于蛋白提取法，操作简单，鉴定的准确性也相差无几，更符合临床上鉴定的需求与操作习惯。
在一些实施例中，当所述处理方法≥2种时，所述根据提取标准从代表菌株的原始图谱中提取特征峰，以获得奥默柯达菌蛋白指纹图谱的步骤包括：根据提取标准分别从代表菌株每种处理方法对应的原始图谱中提取特征峰，以获得每种处理方法对应的奥默柯达菌蛋白指纹图谱。
在一些实施例中，所述构建方法还包括将每种代表菌株每种处理方式对应获得的奥默柯达菌蛋白指纹图谱集合，形成奥默柯达菌蛋白指纹图谱数据库。需要说明的是，不同代表菌株之间以及相同代表菌株的不同处理方法之间提取的特征峰是相同或相似的(不同菌株和/或处理方法对应的特征峰之间的差异不会导致比对结果出现决定性的不同)，待测样本的图谱可以与数据库中的任意一种或多种进行对比。
在一些实施例中，所述甲酸裂解法的具体步骤可基于现有技术获得。
可选地，所述甲酸裂解法包括：将代表菌株的菌落与甲酸水溶液混合；单菌落滴加0.1～5μL体积分数为60％～80％的甲酸水溶液。甲酸的体积分数具体可以为60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％和80％中的任意一种或任意两种之间的范围。单菌落滴加的甲酸水溶液的体积具体可以为0.1μL、0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL、3.5μL、4μL、4.5μL和5μL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述甲酸裂解法包括：将代表菌株的单菌落进行点靶，每个靶点滴加0.1～2μL体积分数为60％～80％的甲酸水溶液。干燥后在靶点上滴加基质溶液，干燥后上机检测。
在一些实施例中，所述蛋白提取法包括：获取代表菌株的单菌落与水混合后的菌液，将所述菌液与色谱级无水乙醇混合，离心后取沉淀物依次与甲酸水、乙腈混合，离心后取上清液用于点靶。
在一些实施例中，所述甲酸水为体积分数为60％～80％的甲酸水溶液。甲酸的体积分数具体可以为60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％和80％中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，单菌落与水的混合比例为：单菌落添加100～500μL水溶液(可以为蒸馏水)；水溶液的体积具体可以为100μL、200μL、300μL、400μL和500μL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述菌液与色谱级无水乙醇的混合体积比为：(1～5)：(8～10)；具体可以为1:8、1:9、1:10、2:8、2:9、2:10、3:8、3:9、3:10、4:8、4:9、4:10、5:8、5:9和5:10中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，与所述沉淀物混合的甲酸水或乙腈的体积为10～100μL；具体可以为10μL、20μL、40μL、60μL、80μL和100μL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，进行质谱检测时，每种代表菌株的每种处理方式制备的样本分别点6～8个靶点，每个靶点采集4～6张原始图谱。可选地，每种代表菌株的每种处理方式制备的样本点靶的靶点具体可以为6个、7个和8个中的任意一种或任意两种之间的范围。每个靶点采集的原始图谱的数量可以为4、5和6中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，在提取特征峰前，所述构建方法还包括：对代表菌株的原始图谱进行过滤。按照一定的规则过滤原始图谱有利于后期筛选出稳定且具有代表性的特征峰。
在一些实施例中，每株菌株收集不少于24张有效的原始图谱。有效的原始图谱可以理解为经过滤后的原始图谱。
在一些实施例中，所述过滤的规则包括：去除出峰个数较少、峰强度较低、明显不出峰和出峰异常的图谱。其中的“较少”、“较低”和“异常”等程度的判断是本领域技术人员可基于实际情况判断的。在一些实施例中，所述过滤的规则包括：去除有效峰个数≤20个、峰强度≤1000mV和/或不出峰的原始图谱。
在一些实施例中，所述过滤的规则包括保留符合以下a～d中至少一种特征的原始图谱：a、主次峰分明，峰分布错落有致，分辨率(m/Δm)达到800～1200以上，峰呈细长形；b、基线平滑、S/N大于500；c、主峰信号强度适当(1000～10000)；d、峰数目较多(100～200)。
本发明实施例提供的构建方法能识别并提取稳定可靠的、具有代表性的特征峰，进而有效将奥默柯达菌、白色假丝酵母、热带假丝酵母和光滑假丝酵母区分，具有灵敏度高、检测时间快，通量大，能大批量低成本筛选等优势。
另一方面，本发明实施例提供了一种奥默柯达菌的鉴定或检测方法，其包括：对待测样本进行质谱检测，获得质荷比峰图；将所述质荷比峰图与奥默柯达菌蛋白指纹图谱对比，鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌；
其中，所述奥默柯达菌蛋白指纹图谱为前述任意实施例所述的构建方法构建获得；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
需要说明的是，不以疾病的诊断或治疗为直接目的的情况有很多，比如，当待测样本为人工样本(比如阳性样本或阴性样本)或环境样本时，所述方法的直接目的是为了获知检测方法的性能(有效性、准确性和稳定性等参数)或获知样本中是否含有奥默柯达菌。
在一些实施例中，所述质谱检测采用的质谱仪可以为：广州禾信康源医疗科技有限公司CMI系列产品，如CMI-1600/3000/3800。
需要说明的是，待测样本的质检检测条件可基于本领域常规技术知识获取。
另一方面，本发明实施例提供了一种奥默柯达菌的鉴定或检测方法，其包括：对待测样本进行质谱检测，获得质荷比峰图；将所述质荷比峰图与奥默柯达菌蛋白指纹图谱对比，鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌；
所述奥默柯达菌蛋白指纹图谱中的特征峰包括：
分子量3000～6000有25个特征峰，质荷比分别为：(3005～3007)，(3023～3025)，(3105～3017)，(3110～3112)，(3172～30174)，(3176～3178)，(3253～3255)，(3273～3275)，(3342～3344)，(3365～3367)，(3382～3384)，(3426～3428)，(3449～3451)，(3498～3500)，(3644～3646)，(3807～3809)，(3848～3850)，(3892～3894)，(4420～4422)，(4915～4917)，(5513～5515)，(5789～5791)，(5815～5817)，(5954～5956)，(5996～5998)；
分子量6000～9000有19个特征峰，质荷比分别为：(6031～6033)，(6069～6071)，(6133～6135)，(6210～6212)，(6339～6341)，(6369～6371)，(6380～6382)，(6495～6497)，(6595～6597)，(6709～6711)，(6770～6772)，(6800～6802)，(6842～6844)，(6888～6890)，(6926～6928)，(7157～7159)，(7283～7285)，(7290～7292)，(8840～8842)；
分子量9000～12000的有2个特征峰，质荷比分别为：(9603～9605)，(11028～11030)。
所述鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌的方法可以通过比对软件进行，比如，可采用CMI-TOF软件进行数据鉴定，对比分数≥设定阈值，则判断为阳性；反之则判断为阴性。软件会自动计算出可选阈值，并按照标准划分结果可信度，技术人员可基于结果可信度选择设定阈值。可选地，设定阈值包括但不限于2.0。
上述46个特征峰为稳定可靠且具有代表性的特征峰，能有效鉴定或检测出奥默柯达菌，并且能将其与白色假丝酵母、热带假丝酵母和光滑假丝酵母进行有效区分。
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施例中，所述特征峰包括：
分子量3000～6000有25个特征峰，质荷比分别为：3006.7131，3024.3735，3106.5569，3111.3513，3173.5884，3177.1816，3254.9758，3274.0894，3343.042，3366.7893，3383.8992，3427.106，3450.2815，3499.0938，3645.4954，3808.5876，3849.0627，3893.2029，4421.8921，4916.8359，5514.459，5790.292，5816.0029，5955.438，5997.478；
分子量6000～9000有19个特征峰，质荷比分别为：6032.7617，6070.3564，6134.2988，6211.8911，6340.4536，6370.5713，6381.4502，6496.9751，6596.1465，6710.7642，6771.1929，6801.3413，6843.083，6889.127，6927.3252，7158.4033，7284.2178，7291.084，8841.9102；
分子量9000～12000的有2个特征峰，质荷比分别为：9604.5303，11029.9404。
在一些实施例中，上述46个特征峰由前述任意实施例所述的构建方法构建获得。
在一些实施例中，所述质谱包括：基质辅助激光解析飞行时间质谱。
在一些实施例中，进行质谱前，所述方法包括对所述待测样本进行预处理；所述预处理的方法包括：甲酸裂解法和蛋白提取法中的任意一种或两种。
在一些实施例中，所述甲酸裂解法如前述任意实施例中所述的甲酸裂解法。
在一些实施例中，所述蛋白提取法如前述任意实施例中所述的蛋白提取法。
另一方面，本发明实施例还提供了特征蛋白在制备用于检测或鉴定奥默柯达菌的产品中的应用，所述特征蛋白的数量与前述任意实施例中所述的特征峰的数量相同，所述特征蛋白的质荷比与如前述任意实施例中所述的特征峰的质荷比一一对应。
此外，本发明实施例还提供了一种检测或鉴定奥默柯达菌的试剂或试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的构建方法构建的奥默柯达菌蛋白指纹图谱或前述任意实施例中所述的奥默柯达菌蛋白指纹图谱。
在一些实施例中，所述试剂或试剂盒还包括：用于质谱检测特征蛋白的试剂，所述特征蛋白的数量与如前述任意实施例中所述的特征峰的数量相同，所述特征蛋白的质荷比与如前述任意实施例中所述的特征峰的质荷比一一对应。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种奥默柯达菌的检测方法，具体包括如下步骤。
一、奥默柯达菌代表株的选择、培养及前处理
(1)菌株选择：中国国家菌种资源库、标准品信息网，美国ATCC菌种资源库，荷兰CBS菌种库均有标准菌种收藏，选择非模式菌MCCC 2E00862、JC 32993，模式菌ATCC 46051、ATCC 52822、ATCC 20282、CBS 5367作为代表菌株；
(2)菌株培养：按照说明书在麦芽糖琼脂、沙氏葡萄糖琼脂或YM琼脂等合适的培养基上培养16-24小时获得单菌落，为保障菌株活性达到理想水平，首次复苏的菌株应传代2-3次；
(3)菌株的前处理：分别采用甲酸裂解法和蛋白提取法进行前处理，具体操作如下：
甲酸裂解法：
①取洁净的靶板，用接种环或牙签等挑取新鲜培养的单菌落；
②将单菌落涂于洁净的靶点上，使菌落尽可能在靶点上均匀铺开成薄层；
③每个样本滴加覆盖1μL 70％甲酸水溶液，室温下自然晾干；
④再将1μL CHCA基质覆盖滴加到样品上，完全干燥后上机检测。
蛋白提取法：
①向1.5mL离心管中加入300μL蒸馏水；
②使用接种环挑取适量单菌落到装有蒸馏水的离心管中，涡旋混匀；
③向离心管中加入900μL色谱级无水乙醇，涡旋混匀，室温静置5min，12000rpm离心2min；
④弃上清，12000rpm离心1min，用微量移液器吸去其中上清；
⑤向离心管中加入50μL新鲜配置的70％甲酸，涡旋混匀，室温静置5min；
⑥加入等量50μL乙腈，涡旋混匀，12000rpm离心2min；
⑦取1μL提取蛋白(上清液)均匀点入对应靶孔，室温自然干燥；
⑧每个样品覆盖1μL CHCA基质，室温自然干燥，上机检测。
二、奥默柯达菌点样、图谱采集和挑选
每株奥默柯达菌每种前处理方法制备的样本各点8个靶点，仪器校准后，手动或自动模式每个靶点；
采集5张原始图谱，共40张。去除有效峰个数较少(20个以下)、峰强度较低(1000mv以下)或不出峰的谱图，从中选出质量最佳的原始图谱，每个菌株收集不少于24张有效谱图。对于低质量的样本点，采用手动模式进行数据补采。
采用的质谱仪为禾信康源医疗科技有限公司的CMI-1600，质谱检测条件为：加速电压为22100V，聚焦电压为5000V，探测电压为1600V；脉冲1为1100V，脉冲2为700V，离子筛除477Da，离子延迟为500ns，采样率为2000MH，质谱范围为2000Da～20000Da；激光能量20％-70％，激光频率50-200Hz，累加次数100-500，峰型平滑程度50％-95％，底噪平滑20％-60％，允许最小信噪比3.0。
三、奥默柯达菌蛋白指纹图谱的提取
利用特征峰提取软件(HXKY.MicroCreate.exe)导入符合建库要求的原始图谱(特征包括：a、主次峰分明，峰分布错落有致，分辨率(m/Δm)达到800～1200以上，峰呈细长形；b、基线平滑、S/N大于500；c、主峰信号强度适当(1000～10000)；d、峰数目较多(100～200))，设置最小信噪比不小于10，质量偏差不超过±500ppm，最小出峰权重不低于50％，特征峰数量最大不超过70个进行提取。如图1所示，X轴上半部分为奥默柯达菌原始图谱，X轴下半部分为按照设定规则提取的奥默柯达菌特征图谱。
奥默柯达菌特征图谱包含分子量3000～20000的多肽或蛋白特征峰，所述特征图谱由不同特征峰及其相对强度绘制而成：
分子量3000～6000有25个特征峰，质荷比分别为：3006.7131，3024.3735，3106.5569，3111.3513，3173.5884，3177.1816，3254.9758，3274.0894，3343.042，3366.7893，3383.8992，3427.106，3450.2815，3499.0938，3645.4954，3808.5876，3849.0627，3893.2029，4421.8921，4916.8359，5514.459，5790.292，5816.0029，5955.438，5997.478；
分子量6000～9000有19个特征峰，质荷比分别为：6032.7617，6070.3564，6134.2988，6211.8911，6340.4536，6370.5713，6381.4502，6496.9751，6596.1465，6710.7642，6771.1929，6801.3413，6843.083，6889.127，6927.3252，7158.4033，7284.2178，7291.084，8841.9102；
分子量9000～12000的有2个特征峰，质荷比分别为：9604.5303，11029.9404。
需要说明的是，上述47个特征峰为各株奥默柯达菌都会出现的特征峰。
四、奥默柯达菌蛋白指纹图谱入库及验证鉴定
将奥默柯达菌蛋白指纹图谱录入数据库，按照建议的前处理方法采集奥默柯达菌分离株图谱，与数据库中标准进行比对和验证性鉴定。鉴定流程包括：数据采集后实时鉴定，即采集的数据会自动与本地数据库进行比对，计算出匹配分值，再按照标准划分结果可信度。在本实施例中，分值≥2.0，则判断为阳性；反之则判断为阴性。
如下图2为奥默柯达菌的分离菌待测图谱，图3为待测图谱与特征谱对比示意图，结果显示主要特征峰匹配良好，鉴定结果准确。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种奥默柯达菌蛋白指纹图谱的构建方法，其特征在于，其包括：
获取至少一种目标奥默柯达菌作为代表菌株；对每种代表菌株进行质谱检测，获得每种代表菌株对应的原始图谱，根据提取标准从代表菌株的原始图谱中提取特征峰，以获得奥默柯达菌蛋白指纹图谱；
所述提取标准包括：最小信噪比≥10，质量偏差≤500ppm，最小出峰权重≥50％，特征峰的数量≤70。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述质谱包括：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；
可选地，在进行质谱检测前，所述构建方法还包括：对每种代表菌株进行前处理，所述前处理的方法包括：甲酸裂解法和蛋白提取法中的至少一种；
可选地，当所述处理方法≥2种时，所述根据提取标准从代表菌株的原始图谱中提取特征峰，以获得奥默柯达菌蛋白指纹图谱的步骤包括：根据提取标准分别从代表菌株每种处理方法对应的原始图谱种提取特征峰，以获得每种处理方法对应的奥默柯达菌蛋白指纹图谱；
可选地，所述甲酸裂解法包括：将代表菌株的菌落与甲酸水溶液混合；单菌落滴加0.1～5μL体积分数为60％～80％的甲酸水溶液；
可选地，所述蛋白提取法包括：获取代表菌株的单菌落与水混合后的菌液，将所述菌液与色谱级无水乙醇混合，离心后取沉淀物依次与甲酸水、乙腈混合，离心后取上清液用于点靶；
可选地，所述甲酸水为体积分数为60％～80％的甲酸水溶液。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行质谱检测时，每种代表菌株的每种处理方式制备的样本点6～8个靶点，每个靶点采集4～6张原始图谱；
可选地，在提取特征峰前，所述构建方法还包括：对代表菌株的原始图谱进行过滤；
可选地，所述过滤的标准包括如下：去除有效峰个数≤20个、峰强度≤1000mV和/或不出峰的原始图谱。
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述代表菌株选自：MCCC2E00862、JC 32993、ATCC 46051、ATCC 52822、ATCC 20282和CBS 5367中的任意一种或多种；
可选地，所述代表菌株的菌种数量≥2。
5.一种奥默柯达菌的鉴定或检测方法，其特征在于，其包括：对待测样本进行质谱检测，获得质荷比峰图；将所述质荷比峰图与奥默柯达菌蛋白指纹图谱对比，鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌；
其中，所述奥默柯达菌蛋白指纹图谱为权利要求1～4任一项所述的构建方法构建获得；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
6.一种奥默柯达菌的鉴定或检测方法，其特征在于，其包括：对待测样本进行质谱检测，获得质荷比峰图；将所述质荷比峰图与奥默柯达菌蛋白指纹图谱对比，鉴定待测样本是否为或是否含有奥默柯达菌；
所述奥默柯达菌蛋白指纹图谱中的特征峰包括：
分子量3000～6000有25个特征峰，质荷比分别为：(3005～3007)，(3023～3025)，(3105～3017)，(3110～3112)，(3172～30174)，(3176～3178)，(3253～3255)，(3273～3275)，(3342～3344)，(3365～3367)，(3382～3384)，(3426～3428)，(3449～3451)，(3498～3500)，(3644～3646)，(3807～3809)，(3848～3850)，(3892～3894)，(4420～4422)，(4915～4917)，(5513～5515)，(5789～5791)，(5815～5817)，(5954～5956)，(5996～5998)；
分子量6000～9000有19个特征峰，质荷比分别为：(6031～6033)，(6069～6071)，(6133～6135)，(6210～6212)，(6339～6341)，(6369～6371)，(6380～6382)，(6495～6497)，(6595～6597)，(6709～6711)，(6770～6772)，(6800～6802)，(6842～6844)，(6888～6890)，(6926～6928)，(7157～7159)，(7283～7285)，(7290～7292)，(8840～8842)；
分子量9000～12000的有2个特征峰，质荷比分别为：(9603～9605)，(11028～11030)；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述特征峰包括：
分子量3000～6000有25个特征峰，质荷比分别为：3006.7131，3024.3735，3106.5569，3111.3513，3173.5884，3177.1816，3254.9758，3274.0894，3343.042，3366.7893，3383.8992，3427.106，3450.2815，3499.0938，3645.4954，3808.5876，3849.0627，3893.2029，4421.8921，4916.8359，5514.459，5790.292，5816.0029，5955.438，5997.478；
分子量6000～9000有19个特征峰，质荷比分别为：6032.7617，6070.3564，6134.2988，6211.8911，6340.4536，6370.5713，6381.4502，6496.9751，6596.1465，6710.7642，6771.1929，6801.3413，6843.083，6889.127，6927.3252，7158.4033，7284.2178，7291.084，8841.9102；
分子量9000～12000的有2个特征峰，质荷比分别为：9604.5303，11029.9404。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述质谱包括：基质辅助激光解析飞行时间质谱；
可选地，进行质谱前，所述方法包括对待测样本进行预处理；所述预处理的方法包括：甲酸裂解法和蛋白提取法中的任意一种或两种；
可选地，所述甲酸裂解法如权利要求3中所述的甲酸裂解法；
可选地，所述蛋白提取法如权利要求3中所述的蛋白提取法。
9.特征蛋白在制备用于检测或鉴定奥默柯达菌的产品中的应用，其特征在于，所述特征蛋白的数量与如权利要求5～7任一项中所述的特征峰的数量相同，所述特征蛋白的质荷比与如权利要求5～7任一项中所述的特征峰的质荷比一一对应。
10.一种检测或鉴定奥默柯达菌的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1～4任一项所述的构建方法构建的奥默柯达菌蛋白指纹图谱或权利要求5～7任一项中所述的奥默柯达菌蛋白指纹图谱；
可选地，所述试剂或试剂盒还包括：用于质谱检测特征蛋白的试剂，所述特征蛋白的数量与如权利要求5～7任一项中所述的特征峰的数量相同，所述特征蛋白的质荷比与如权利要求5～7任一项中所述的特征峰的质荷比一一对应。
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|---|---|---|---|---|
| CN117849159A (zh) * | 2024-01-09 | 2024-04-09 | 融智生物科技（青岛）有限公司 | M蛋白的检测方法、电子设备及存储介质 |
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