CN108507845A - 一种飞行时间质谱系统微生物样本前处理的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于飞行时间质谱系统微生物样本前处理的试剂组合物，该组合物能有效地裂解细菌，并以总蛋白作为靶体进行质谱检测。该试剂组合物能够得到信号强、区分度高的特征峰谱图，并对于最终鉴定分数具有更为稳定可靠的准确度。本发明还包含试剂组合物的质谱试剂盒，以及检测微生物样本的预处理方法以及检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于飞行时间质谱系统给微生物样本前处理的试剂盒及检测产品。
背景技术
时间质谱，Time of Flight Mass Spectrometer(TOF)，是一种很常用的质谱仪，这种质谱仪的质量分析器是一个离子漂移管(ion dirft tube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。飞行时间质谱仪可检测的分子量范围大，扫描速度快，仪器结构简单。
飞行时间质谱完成微生物样本检测的准确率可达99.9％，除了准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短等优势外，最有吸引力的应该还是它的性价比。飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)是国际通用的基因单核苷酸多态性(SNP)的研究平台，该方法凭借其科学性和准确性已经成为该领域的金标准。
微生物种类繁多，组成复杂，并且其鉴定结果随着生长部位、生长条件和检测手段的不同而异：根据微生物的生长特性，需要进行不同方式和条件的培养，依据菌落形态和革兰染色进行初步鉴定；微生物的变异又会引起生化反应的不断变化，生化反应不典型的细菌难以鉴定；作为金标准的核酸检测方法结果准确可靠，但其技术要求高，费时，需要专门操作人员，这些方法步骤繁琐，检测周期较长，不能及时、有效地指导抗生素的应用治疗。广泛的临床经验性用药导致耐药菌株增多，进一步增加临床治疗的难度。快速鉴定临床微生物已成为亟待解决的问题。随着科学技术的发展，微生物鉴定中的染色、接种培养、生化、血清学及药敏实验等过程在不同程度上实现了自动化，大大提高了鉴定效率。此外，基于分子生物学技术的发展，出现许多快速鉴定病原微生物的方法，如:实时定量聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性分析、焦磷酸测序技术、荧光原位杂交、基因芯片等，例如李晓霞等人(参考文献1：《医学综述》第17卷第13期，2011年7月)报道了在临床病原菌快速鉴定技术的应用研究进展中介绍了各种检测技术在临床应用中的优缺点，这些方法无需对临床微生物进行培养分离和生化鉴定的复杂操作，具有特异性强、敏感度高、重复性好、高通量、多样性、微型化和自动化等特点，也因其检测不同细菌所需的片段特异性和长度限制及技术要求高，在临床微生物日常工作中的推广受到限制。
利用质谱技术进行微生物鉴定有着明显的优点：(1)样本前期处理简单；(2)操作简单、快速、通量高；(3)灵敏度高；(4)准确度好。样本仅通过简单的蛋白提取步骤即可直接上样，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间获得图谱，然后与数据库中不同微生物家族的种/属特定图谱相比对，即可得出鉴定结果，高效迅速，且价格低廉，有着很好的临床应用潜能。然而，李晓霞等人(2011)也指出，虽然TOF MS质谱技术便能准确鉴定病原菌，为感染性疾病提供关键的治疗信息，但也存在假阴性情况，该结果可能与血培养液中细菌含量太低，不能形成特异的可识别峰有关，而且血液中的蛋白质成分对质谱的形成亦有一定的干扰，影响鉴定结果的正确性。
此外，在TOF MS技术中，基质的选择直接影响样品的分析结果。迄今,有效基质的选择并没有完整的理论作为依据,只能通过对大量化合物进行试验筛选得到。通常,TOF MS采用的基质是有机酸性化合物,如用于分析多肽和蛋白质的高效基质肉桂酸衍生物HCCA和SA、芳香羧酸衍生物2,5-二羟基苯甲酸(DHB)以及测定DNA的常用基质3-羟基吡啶甲酸(3-HPA)和吡啶甲酸(PA)等，例如徐昕荣等(参考文献2：《分析科学学报》，第27卷第3期，2011)报道了分别以α-氰基-4-羟基肉桂酸、2,5-二羟基苯甲酸和芥子酸为基质，在正离子模式下对水解胶原蛋白粉分子质量分布进行测定。分析结果显示：芥子酸为最适宜基质，分析条件为线性方式和反射方式相结合，可准确、快速确定水解胶原蛋白粉的分子量分布。该方法优于其它传统的分子量测定方法。
再如用于分析糖的基质有2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、芥子酸(SA)、T-CN-4羟基肉桂酸(ACHC)等，例如郝春雁等(参考文献3：《高等学校化学学报》，1998年7月)通过糖类化合物3种常用基质MALDI-MS分析效果的比较以及寡糖和多糖正、负离子MALDI-MS谱的对比,找到了适合糖分析的基质2,5-DHB,探讨了糖类化合物激光解吸/电离条件下形成离子的过程,指出了N a+、K+离子在寡糖分子量测定中的重要作用,借助柱层析分离手段,成功地测出了分子量大于10000的葡聚糖的分子量。然而化合物具有酸性并不一定能作为有效基质的必要条件,某些碱性化合物也可作为基质。例如，周丽华等(参考文献4：《高等学校化学学报》，2004年12月)已报道的能用于分析多肽、蛋白质及DNA的碱性基质有2-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶、2-氨基-5-硝基吡啶、对硝基苯胺和9-氨基吖啶等。碱性基质的使用能进一步扩大TOF MS的应用范围,特别是对酸敏感物质的测定。
目前，用于检测微生物的TOF MS技术中，常用的基质有：α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2，5-二羟基苯甲酸(2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB)、2-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶(2-amino-4-methyl-5-nitropyridine，2a4m5n)、反式-3-吲哚丙烯酸(trans-3-indoleacrylic acid，IAA)、2-巯基苯并噻(2-mercaptobenzothiazole，MBT)、2-(4-羟基亚胺)苯甲酸[2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid,HABA]、2，6-二羟乙酰苯(2，6-dihydroxyacetophenone，DHAP)、芥子酸(Sinapinic acid,3，5-dimenthoxy-4-hydroxycinnamic acid,SA)、5-氯-2-巯基苯丙噻唑(5-chloro-2-mercaptobenzothiazole，CMBT)等，例如王晔茹等(参考文献5：《卫生研究》第37卷第6期，2008)利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对从门诊腹泻病人粪便分离的88株沙门菌进行检测分型中使用的是CHCA基质；李凤琴等(参考文献6：《中国食品卫生杂志》第19卷第5期，2007)对MALDI-TOF-MS检测食品真菌所用基质、基质与样品比例、上样方法等进行筛选,获得优化的实验条件，并对方法的重现性和实际应用进行研究。结果MALDI-TOF-MS分析不同属真菌所需的最适基质各异,红曲霉属与镰孢菌属最适基质均是MBT；曲霉属、青霉属与酵母菌的最适基质均是IAA；上样的最适基/样品比例为1：1；混合液滴干燥法为最佳上样方法。而用于配置上述基质的溶剂通常是乙腈、三氟乙酸(TFA)(王晔茹、李凤琴)，例如，为乙腈+0.1％TFA水溶液(70+30，体积分数)，或乙腈∶TFA∶水＝50：2.5：47.5或50：0.1：49.9。
此外，对于市场上商售的最常见微生物前处理试剂盒VITEK Kit(MS-CHCA Matrixfor use with VITEK MS)，其中VITEK MS-CHCA基质(黄盖)试剂主要成份(细菌、真菌均需要)：α-氰基-4-羟基肉桂酸，VITEK MS-FA(红盖)试剂主要成份：70％甲酸，当针对真菌需要加此试剂处理后再使用VITEK MS-CHCA基质。该测试剂盒缺点是使用飞行时间质谱系统鉴定菌种前，不确定是真菌还是细菌的时候，不能明确是选择直接使用VITEK MS-CHCA基质，还是使用VITEK MS-FA与VITEK MS-CHCA基质的组合。
再例如，购买常规的微生物鉴定质谱仪Autoflex speed TOF/TOF(以下简称TOF质谱仪)或者microflex LT的研究者，该产品有两种微生物前处理方法，一种是直接涂靶板的方法，将菌直接涂在靶板上，再覆盖使用者自配微生物样本前处理试剂，其中试剂主要成分及浓度：10mg/ml的CHCA基质、50％乙腈，47.5％水和2.5％三氟乙酸。然而，该方法对一些真菌处理不够，不能有效的裂解真菌细胞壁，因此对部分病原真菌不适用。另一种甲酸乙腈提取法处理菌种，步骤多(需3次离心)，耗时长(大概需要30min)。为此，高晶晶等(参考文献10：《中华临床实验室管理电子杂志》第3卷第1期，2015年)评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对临床细菌的鉴定能力中采用的甲酸乙腈提取法：取单个菌落置1.5mlEppendorf管中，加300μl去离子水和900μl无水乙醇，充分混匀后，13000r/min离心2min，弃上清液；再13000r/min离心2min，吸弃残余液体；加70％甲酸50μl，振荡混匀后加等量乙腈，振荡混匀，13000r/min离心2min，取1μl上清液滴加于MALDI靶板上，室温干燥后，将1μl基质液涂敷于样品点上，室温干燥；上机检测。该系统对于常见细菌检出率略低于传统仪器的检出率，并且其鉴定菌种库更全，能有利于检测特殊、少见的细菌。虽然该方法选取≥1.7000分作为待测菌株的判定分值，但由于该方法步骤多，且仍然存在部分结果落入略低于1.7000分、2.000等端点值，该结果难以确信或需要重复验证，因此增加了人为不可控因素，实验结果就会因检测者的经验而存在差异，因此鉴定分值并非完全稳定。
TOF质谱检测微生物的结果不能达到100％准确率或鉴定分值存在一定的变动，缘由是质谱检测蛋白原理所带来的。其中，
原核微生物中的细菌中蛋白质分布：
(1)细胞壁上含少量的外膜蛋白、孔蛋白、脂蛋白等，周质空间中含有水解酶类，如蛋白酶、核酸酶等；合成酶类，如肽聚糖合成酶；结合蛋白；受体蛋白。
(2)细胞膜上含有50％～70％的蛋白质，这些蛋白主要是起运输作用的整合蛋白、具有酶促作用的周边蛋白。
(3)细胞质中羧酶体，内含1，5-二磷酸核酮糖羧化酶；核糖体中含有34种大亚基蛋白质、21种小亚基蛋白质。
真核微生物中真菌蛋白质分布：
(1)细胞壁上含有少量的蛋白质，镶嵌在葡聚糖和甘露糖中间的结构蛋白；起催化作用的酶，如葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蔗糖酶、碱性磷脂酶和酯酶等。
(2)细胞质膜上蛋白质含量很低，普遍含有甾醇
(3)细胞核的核被膜中含有纤维层蛋白；染色质中含有组蛋白；与DNA复制转录有关酶的非组蛋白。
(4)细胞基质中含有丰富的酶等蛋白质，占细胞总蛋白的25％～50％；细胞骨架中间丝有角蛋白等数种蛋白组成，具有支持和运动功能。
(5)核糖体约有40％的蛋白质和60％的RNA组成，含有49种大亚基蛋白和33种小亚基蛋白。
(6)溶酶体中含有40种以上的酸性水解酶，这些酶也都是蛋白质。
(7)微体的一种称为过氧化物酶体，是一种由单层膜包裹的含有一种或几种氧化酶类的细胞器。
(8)线粒体内膜上含有ATP合成酶复合体、4种脂蛋白复合体。
(9)其他细胞器如叶绿体、液泡、几丁质酶体、氢化酶体等菌含有一些蛋白质。
由于微生物的飞行质谱鉴定物种，一般使用的大小范围，正好处于核糖体蛋白质离子化高效果的范围内，这样可以提供精确的图谱，同时极少受到微生物生长条件的影响(参考文献7：《检验医学与临床》，第9卷第14期，刘新海，2012)。因此，目前使用飞行时间质谱成功检测细菌和真菌的实践中，均是以检测菌体内稳定表达的核糖体蛋白，AbdessalamC.等人(参考文献8：JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Apr.2010,p.1169–1175)提到飞行时间质谱鉴定大肠埃希氏杆菌是来自核糖体蛋白的特征，王沛(参考文献9：《临床检验杂志》2013年9月第31卷第9期)进一步指出，在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在快速检测病原菌中的研究进展中提到样品的制备方法对于样品的质谱信息有明显的影响，大多数情况下，可利用培养基生长的纯菌落直接鉴定，但菌落的生长时间不得超过48h，否则菌体内的核糖体蛋白质会发生降解，导致无法得到信号强的特征峰而出现错误鉴定。某些细胞壁坚韧的病原菌如真菌，需借助蛋白质提取技术得到足量的核糖体蛋白质，从而有助于提高鉴定的准确度。其中，Abdessalam C.和王沛所用的市售的两种质谱检测前处理产品，都是为了有效的提取菌体内的核糖体蛋白，且在市售质谱仪配套的分析软件上，细菌菌属判断标准I：2.300～3.000分为完全可靠鉴定到种水平；判断标准II：2.000～2.299分为可靠鉴定到属水平，有可能鉴定到种水平；判断标准III：1.700～1.999分为有可能鉴定到属水平；判断标准IV：0.000～1.699分为无可信的鉴定结果(参考文献10；参考文献11：Giovanna Pulcrano，Journal of Microbiological Methods 94(2013)262–266)，鉴定分数接近但在1.7分建议临床医生需要重新做实验以确定微生物鉴定结果。由此可见，对于飞行时间质谱检测技术而言，其鉴定的微生物能否得到稳定和准确的鉴定分数，对于临床上高通量和快速的鉴定微生物而言至关重要。
然而，为了保证飞行时间质谱检测微生物蛋白的鉴定分数的准确性，现有的研究都集中在如何改善微生物核糖体蛋白的分离提取中报道了使用的菌落生长时间不得超过48小时，否则会导致核糖体蛋白的降解，影响鉴定准确度。因此，现有的相关改进思路在于如何快速和高效提取待测菌的核糖体蛋白质以及避免核糖体蛋白的降解，从而准确用于飞行时间质谱(王沛，2013)。然而，发明人发现，以核糖体蛋白为靶标的质谱检测技术及其改进技术，其鉴定分数有时会在上述4个判断标准中产生波动，尤其是当理论鉴定分数应当落入可信区间(判断标准III)，而实际鉴定分数落入不可信区间(判断标准IV)时，出于稳定性的缘故，有时不得不进行重复检测，这对于面临大规模疫情爆发时需要进行高通量且快速检测而言，无疑是难以接受的。
因此，针对在临床上鉴定病原微生物的样本量大，且使用方法简单，耗时少，效果好的需要，需要一种临床上快速鉴定病原微生物且重复性的新的飞行时间质谱检测技术。
发明内容
如上所述，现有技术一直认为，如果将微生物总蛋白作为待检物进行质谱，其中部分非核糖体蛋白在质谱分数中占一部分比例，会提高了质谱评价分数，这将出现相当比例的假阳性，从而影响结果判定。但发明人令人惊讶地发现，如果选择合适的细胞壁裂解试剂和质谱基质的组合，以及选择裂解时间，那么对微生物总蛋白进行质谱检测，在不影响判断标准I、II结果的情况下，能够使得在判定区间III-IV波动的鉴定分数的相当部分出现正向提高，并使得原来需要二次鉴定的不可信结果提高到可信区间，从而避免了假阴性的可能。
因此，本发明原理在于：基于现有市售产品和判定标准的基础上，根据上述不同的蛋白鉴定原理，提供一种步骤少、耗时短且能高效提取病原菌体的全蛋白来取代核糖体蛋白，并通过优化实验参数和试剂，从而提供质谱检测微生物样本前处理的试剂组合物及其试剂盒。该试剂盒能够得到信号强、区分度高的特征峰谱图，并对于最终鉴定分数具有更为稳定可靠的准确度。
基于以上原理，本试剂盒对于现有试剂的改进在于：选用组分I来用于高效破碎细胞和释放总蛋白，组分II用于破碎细胞和释放总蛋白，并同时作为质谱基质进行质谱前预处理。具体而言，组分I中的甲酸主要用于破碎细胞；组分I和组分II中的乙腈作为有机溶剂能够渗入细胞内，促进细胞中的多肽释放，能有效的提取总蛋白。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于飞行时间质谱微生物样本前处理的试剂组合物，其主要成分包括：组分I：乙腈和甲酸；组分II：乙腈，三氟乙酸和α-氰基-4-羟基肉桂酸。
在一个实施方案中，其中组分I包括：
50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水。
组分II包括：
52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水。
在一个实施方案中，所述乙腈的初始浓度为体积分数为99.7％(Alfa.Co.Ltd.)，所述甲酸的初始浓度为体积分数98％(Sigma.Co.Ltd.,NO:94318-250ml-F)，所述三氟乙酸的初始浓度为体积分数≥99％(Sigma.Co.Ltd.)，所述α-氰基-4-羟基肉桂酸初始状态为黄色粉末(Sigma.Co.Ltd..,NO:70990-1G-F，配制成浓度为过饱和，有黄色粉末析出)
本发明的第二个目的是提供了上述试剂组合物用于制备鉴定未知微生物的检测产品。
在一个实施方案中，该产品为飞行时间质谱检测微生物的试剂盒，包括：
(1)微生物样本前处理的试剂组合物
(2)其他质谱试剂；
在一个实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，点样及质谱检测用靶片。
本发明的第三个目的是通过上述试剂组合物或检测产品来检测微生物的方法，提高峰图质量并提高飞行时间质谱系统鉴定微生物的正确率，包括如下步骤：
(1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
(2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
(3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
(4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
(5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在一个实施方案中，所述微生物检测是确定微生物的属、种、亚种或亚型。在一个具体实施方案中，所述微生物检测是非诊断目的地检测致病菌、污染菌、耐药菌等。
在另一个实施方案中，上述任一方案中的微生物是环境污染中的微生物、食品检疫中的微生物、进出口商品中的微生物、药物研究中耐药性微生物等。
在一个实施方案中，上述任一方案中的微生物是原核微生物、真核微生物。在一个具体实施方案中，所述原核微生物包括细菌。所述真核微生物为真菌包括酵母菌、霉菌等。
技术效果
组分II中三氟乙酸也是用于破碎细胞，能与组分I中的甲酸协同作用，充分破碎细胞，并充分释放包括核糖体蛋白在内的总蛋白。
组分II中基质α-氰基-4-羟基肉桂酸，主要作用是在生物分子表面形成共结晶薄膜，经飞行时间质谱系统产生的激光照射后，基质从激光中吸收能量，传递给生物分子，从而使生物分子电离。经电离的生物分子，经飞行时间质谱系统进行检测分析。
该试剂盒处理后提取的是全细胞蛋白(包括菌体内所有蛋白及细胞壁细胞膜的蛋白)，有效提高菌种的特征峰峰强，从而提高飞行时间质谱仪的鉴定正确率。
样本前期处理简单、便捷，相比于仅仅处理和释放核糖体蛋白，并未产生明显的时间和成本劣势；
由实施例结果可知，与对照相比，由于所述对照质谱基质试剂，在有限的细菌容纳的空间内和短暂的干燥时间，所述基质仅仅部分破解了细胞壁并释放出部分的核糖体蛋白，而细胞壁蛋白(如外膜蛋白、孔蛋白、脂蛋白)以及细胞基质中的酶蛋白等，来不及分离释放，因此该基质中只有部分的核糖体蛋白被有效激光激发，从而完成质谱。
然而，由于本发明中，待测微生物在组分I的环境下，通过充分裂解(10μl组分I的离心管中，裂解5分钟)，使得完全释放出细胞内总蛋白。因此吸取部分样品在基质中进行检测，可以完全预测该基质中所有的总蛋白被有效激光激发，从而完成质谱。
因此，通过前处理微生物，充分提取总蛋白质，其检测效果具有高通量、准确度稳定，相比于仅检测核糖体蛋白质，具有出乎预料的稳定性。
原理与定义
在飞行时间质谱系统质谱检测物质过程中，待检测物质在基质的辅助下，在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器，不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。检测器根据到达它的时间(可转换为分子量)及强度便能给出一个谱图。不同的微生物，其含有的蛋白质有差异，微生物样本经处理后，提取其全蛋白，不同的蛋白质在飞行时间质谱仪上检测出不同的谱峰图，即不同微生物，含有不同的特征指纹谱，经过飞行时间质谱系统分析软件与数据库中已知病原微生物的特征谱图进行比对，便可区分不同种微生物，即给出微生物的鉴定结果。
术语“基质”：基质α-氰基-4-羟基肉桂酸主要作用是在生物分子表面形成共结晶薄膜，经飞行时间质谱系统产生的激光照射后，基质从激光中吸收能量，传递给生物分子，从而使生物分子电离。经电离的生物分子，经飞行时间质谱系统进行检测分析。
附图说明
图1 2B表皮葡萄球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图2 2B表皮葡萄球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图3 3B人葡萄球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图4 3B人葡萄球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图5 5B粪肠球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图6 5B粪肠球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图7 7B肺炎链球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图8 7B肺炎链球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图9 8B无乳链球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图10 8B无乳链球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图11 9B大肠杆菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图12 9B大肠杆菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接抹板方法，下图为本发明方法及试剂)
图13 10B阴沟肠杆菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图14 10B阴沟肠杆菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图15 11A肺炎克雷伯菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图16 11A肺炎克雷伯菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图17 13B铜绿假单胞菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图18 13B铜绿假单胞菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图19 14A粘质沙雷菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图20 14A粘质沙雷菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图21 17A嗜水气单胞菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图22 17A嗜水气单胞菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图23 38产酸克雷伯菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图24 38产酸克雷伯菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图25 140变异链球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图26 140变异链球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图27 159变异链球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图28 159变异链球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图29 SLT鼠李糖乳杆菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图30 SLT鼠李糖乳杆菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图31 30956副溶血弧菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图32 30956副溶血弧菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图33 1A金黄色葡萄球菌使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-M直接涂板法，下图为本发明方法及试剂)
图34 1A金黄色葡萄球菌使用两种方法处理后出峰情况差异(上图为CK-M直接涂板法，下图为本发明方法及试剂)
图35 E35克鲁斯假丝酵母使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图36 E35克鲁斯假丝酵母使用两种方法处理后处理后出峰情况差异(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图37 E39季也蒙假丝酵母使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图38 E39季也蒙假丝酵母使用两种方法处理后出峰差异情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图39 E53皱褶假丝酵母使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图40 E53皱褶假丝酵母使用两种方法处理后出峰差异情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图41 E55拟郎比可假丝酵母使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图42 E55拟郎比可假丝酵母使用两种方法处理后出峰差异情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图43 E58拟郎比可假丝酵母使用两种方法处理后出峰情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
图44 E58拟郎比可假丝酵母使用两种方法处理后出峰差异情况(上图为CK-T甲酸乙腈提取法，下图为本发明方法及试剂)
具体实施方式
为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细的阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上作出任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。
实施例一：利用本发明方法和传统质谱方法中的直接涂靶板的方法(简称CK-M)前处理细菌后进行质谱检测
(一)微生物样本取样：
菌种详细信息，其中孵育条件均为5％C02培养箱，孵育24h。如表1。菌种全部来自北京协和医院检验科，传代时间均为2015.11.2。
表1 实施例一中细菌菌种详细信息(含培养基、孵育时间、培养条件)
| 菌种编号 | 实验编号 | 菌种中文名称 | 菌种拉丁名称 | 培养基 | 前处理试剂和实验方法 |
| 2B | 2B-CK-M | 表皮葡萄球菌 | Staphylococcus epidermidis | BAP | CK的直接抹板方法 |
| 2B | 2B-Y | 表皮葡萄球菌 | Staphylococcus epidermidis | BAP | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 3B | 3B-CK-M | 人葡萄球菌 | Staphylococcus hominis | BAP | CK的直接抹板方法 |
| 3B | 3B-Y | 人葡萄球菌 | Staphylococcus hominis | BAP | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 5B | 5B-CK-M | 粪肠球菌 | Enterococcus faecalis | BAP | CK的直接抹板方法 |
| 5B | 5B-Y | 粪肠球菌 | Enterococcus faecalis | BAP | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 7B | 7B-CK-M | 肺炎链球菌 | Streptococcus penumoniae | BAP | CK的直接抹板方法 |
| 7B | 7B-Y | 肺炎链球菌 | Streptococcus penumoniae | BAP | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 8B | 8B-CK-M | 无乳链球菌 | Streptococcus agalactiae | BAP | CK的直接抹板方法 |
| 8B | 8B-Y | 无乳链球菌 | Streptococcus agalactiae | BAP | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 9B | 9B-CK-M | 大肠杆菌 | Escherichia coli | CBA/R | CK的直接抹板方法 |
| 9B | 9B-Y | 大肠杆菌 | Escherichia coli | CBA/R | 本发明中的试剂盒及方法 |
(二)样本前处理及点样：
使用市售TOF仪器上，采用传统质谱方法前处理方法中的直接涂靶板的方法(CK-M)，再覆盖CK-M的质谱基质试剂(50％(v/v)的乙腈，2.5％(v/v)三氟乙酸，10mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水)，在TOF仪器上进行菌种的鉴定，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用牙签挑取单克隆菌落并薄薄的涂在靶板上。
3)覆盖1ul CK-M的质谱基质试剂，室温干燥。
4)将靶板放入TOF仪器中进行质谱检测。
5)将检测的数据放入TOF的biotyper中进行鉴定。
使用本发明的前处理方法(即北京毅新博创生物科技有限公司的飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂)，在TOF上检测，根据判定区间I-IV的鉴定打分，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在本实施例中，使用不同试剂及方法处理微生物样本，在TOF仪器上靶单示意图如表2：TOF仪器的靶板是16*24＝384靶板，示意图中是按照同一菌种分别采用两种方法处理后点靶，表中的菌种编号对应的处理方法(参见表1)。由于质谱仪检测的是蛋白质，有蛋白质的地方就会有出峰，查看两种方法处理后峰图(如图1～图12)即可以知道总蛋白(本发明)与核糖体蛋白(传统方法)种类的差异。
表2 实施例一中TOF仪器上靶单示意图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | … | 24 | |
| A | 2B-CK-M | 2B-Y | 3B-CK-M | 3B-Y | 5B-CK-M | 5B-Y | ||
| B | … | … | … | … | … | … | ||
| C | ||||||||
| D | ||||||||
| E | ||||||||
| … | ||||||||
| P |
(三)在Autoflex speed TOF/TOF进行质谱检测并在软件biotyper上鉴定
从出峰情况看(如图1～图12)，本发明方法及试剂处理细菌出峰峰数比传统的直接涂靶板的方法，出峰多，也就是非核糖体蛋白的峰，从而打分高(打分情况如表3)。例如：
①图2中可以看出，编号为2B的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为4440.518Da和6547.576Da；打分由传统方法的小于1.7分IV无鉴定结果区间(不可信区间)提高到1.8分III可能的属，本发明的方法结果具有鉴定意义。
②图6中可以看出，编号为5B的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为6231.249Da、6677.828Da、6863.325、8887.616、9535.425Da；打分由1.99分III可能的属提高到2.134分II可靠的属、可能的种区间。提高了一个判断标准区间。
③图12中可以看出，编号为9B的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为4188.513Da、4767.497Da、5148.902Da；打分由1.84分IV可能的属区间提高到2.497分I确定的种区间，其显著提高了检测可信度和准确度。
表3 本发明及传统方法中的直接涂靶板的方法处理菌后的鉴定结果
实施例二：利用本发明方法和传统质谱方法中的甲酸乙腈提取方法(简称CK-T)前处理细菌后进行质谱检测
(一)微生物样本取样：
菌种详细信息如表4，其中培养条件同实施例一。菌种全部来自北京协和医院检验科，传代时间均为2015.11.2。
表4 实施例二中细菌菌种详细信息(含培养基、孵育时间、培养条件)
(二)样本前处理及点样：
使用市售仪器Autoflex speed TOF/TOF，采用传统质谱方法前处理方法中的甲酸乙腈提取法(简称CK-T)，再覆盖CK-T的质谱基质试剂{50％(v/v)的乙腈，2.5％(v/v)三氟乙酸，10mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水}，在TOF仪器上进行菌种的鉴定，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)取单个菌落置1.5ml Eppendorf管中，加300μl去离子水和900μl无水乙醇，充分混匀后，13000r/min离心2min，弃上清液；
2)再13000r/min离心2min，吸弃残余液体；
3)加70％甲酸50μl，振荡混匀后加等量乙腈，振荡混匀，13000r/min离心2min；
4)取1μl上清液滴加于MALDI靶板上，室温干燥；
5)将1μl基质液涂敷于样品点上，室温干燥；
6)上机检测。
使用本发明的前处理方法(即北京毅新博创生物科技有限公司的飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂)，在Autoflex speed TOF/TOF上进行检测并鉴定打分，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在本实施例中，使用不同试剂及方法处理微生物样本，在TOF仪器上靶单示意图如表5：TOF仪器的靶板是16*24＝384靶板，示意图中是按照同一菌种分别采用两种方法处理后点靶，表中的菌种编号对应的处理方法(参见表4)。由于质谱仪检测的是蛋白质，有蛋白质的地方就会有出峰，查看两种方法处理后峰图(如图13～图24)即可以知道总蛋白(本发明)与核糖体蛋白(传统方法)种类的差异。
表5 实施例二中布鲁克仪器上靶单示意图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | … | 24 | |
| A | 10B-CK-T | 10B-Y | 11A-CK-T | 11A-Y | 13B-CK-T | 13B-Y | ||
| B | … | … | … | … | … | … | ||
| C | ||||||||
| D | ||||||||
| E | ||||||||
| … | ||||||||
| P |
(三)在TOF仪器上进行质谱检测在软件biotyper上鉴定
从出峰情况看(如图13～图24)，本发明方法及试剂处理细菌出峰峰数比传统的甲酸乙腈提取方法，出峰多，也就是非核糖体蛋白的峰，从而打分高(打分情况如表6)。例如：
①图14中可以看出，编号为10B的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为2860.400Da、3051.481Da、3150.515Da、3714.672Da、3857.321Da、4159.197Da、4744.479Da、4923.594Da；打分由传统方法2.123分II可靠的属可能的种区间提高到2.497分I可靠的种区间。提高了一个判断标准区间。
②图16中可以看出，编号为11A的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为8884.181Da、9147.496Da；打分由1.989分III可能的属区间提高到2.225分II可靠的属，可能的种区间。提高了一个判断标准区间。
③图22中可以看出，编号为17A的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为4713.251Da；打分由1.744分IV可能的属区间提高到2.032分II确定的种区间，其显著提高了检测可信度和准确度。
表6 本发明及传统方法中的甲酸乙腈提取法处理菌后的鉴定结果
实施例三：利用本发明方法和传统质谱方法中的甲酸乙腈提取方法(简称CK-T)处理口腔致病菌进行质谱检测
(一)微生物样本取样
从北大口腔医院取样3株(保存样品来自牙体牙髓科龋病就诊的病人)。分别接种到BHI培养基上划线传代。详细信息见表7，其中孵育条件均为5％C02培养箱，孵育18h。
表7 口腔致病菌取样信息
| 菌种编号 | 实验编号 | 菌种名称 | 菌种拉丁名 | 前处理试剂和实验方法 |
| 159 | 159-M-T | 变异链球菌 | streptococcus mutans | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| 159 | 159-Y | 变异链球菌 | streptococcus mutans | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 140 | 140-M-T | 变异链球菌 | streptococcus mutans | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| 140 | 140-Y | 变异链球菌 | streptococcus mutans | 本发明中的试剂盒及方法 |
| 741 | 741-M-T | 唾液乳杆菌 | lactobacillus salivarius | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| 741 | 741-Y | 唾液乳杆菌 | lactobacillus salivarius | 本发明中的试剂盒及方法 |
| SLT | SLT-M-T | 鼠李糖乳杆菌 | lactobacillus rhamnosus | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| SLT | SLT-Y | 鼠李糖乳杆菌 | lactobacillus rhamnosus | 本发明中的试剂盒及方法 |
(二)样本前处理及点样：
使用市售仪器Autoflex speed TOF/TOF，采用传统质谱方法前处理方法中的甲酸乙腈提取法(简称CK-T)，再覆盖CK-T的质谱基质试剂{50％(v/v)的乙腈，2.5％(v/v)三氟乙酸，10mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水}，在TOF仪器上进行菌种的鉴定，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)取单个菌落置1.5ml Eppendorf管中，加300μl去离子水和900μl无水乙醇，充分混匀后，13000r/min离心2min，弃上清液；
2)再13000r/min离心2min，吸弃残余液体；
3)加70％甲酸50μl，振荡混匀后加等量乙腈，振荡混匀，13000r/min离心2min；
4)取1μl上清液滴加于MALDI靶板上，室温干燥；
5)将1μl基质液涂敷于样品点上，室温干燥；
6)上机检测。
使用本发明的前处理方法(即北京毅新博创生物科技有限公司的飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂)，在TOF仪器上进行菌的鉴定打分，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在本实施例中，使用不同试剂及方法处理微生物样本，在TOF仪器上靶单示意图如表8：TOF仪器的靶板是16*24＝384靶板，示意图中是按照同一菌种分别采用两种方法处理后点靶，表中的菌种编号对应的处理方法(参见表7)。由于质谱仪检测的是蛋白质，有蛋白质的地方就会有出峰，查看两种方法处理后峰图(如图25～图30)即可以知道总蛋白(本发明)与核糖体蛋白(传统方法)种类的差异。表8 实施例三中布鲁克仪器上靶单示意图
(三)在市售仪器Autoflex speed TOF/TOF上进行质谱检测并在软件biotyper上鉴定
实验菌种谱图如图25～图30所示，从峰图上看，本发明方法及试剂处理细菌出峰峰数比传统的甲酸乙腈提取方法，出峰多，也就是非核糖体蛋白的峰，从而打分高(打分情况如表9)。例如：
①图27、28中可以看出，编号为159的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为5020.137Da；打分由传统方法1.991分III可能的属区间提高到2.011分II可靠的属，可能的种区间。提高了一个判断标准区间。
②图29、30中可以看出，编号为SLT的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为7209.869Da；打分由2.011分II可靠的属可能的种区间提高到2.34分I可靠的种区间，提高了一个判断标准区间，显著提高了可信度及准确性。
表9 口腔致病菌鉴定结果详细情况
实施例四：利用本发明方法和传统质谱方法中的甲酸乙腈提取方法(简称CK-T)对食品中致病菌-副溶血弧菌进行质谱检测
(一)微生物样本准备
1)将待测扇贝的贝肉和体液，以无菌操作取样品25g，加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min，或拍击式均质器拍击2min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。
2)样品匀液于36℃±1℃培养8h～18h。
3)对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。于36℃±1℃培养18h～24h。
4)从平板上挑取单克隆菌落，编号为30956。
5)分别使用本发明方法和传统质谱方法中的甲酸乙腈提取方法(简称CK-T)处理编号为30956的菌。菌种信息如表10。
表10 扇贝的贝肉和体液中培养出的菌种信息
| 菌种编号 | 实验编号 | 菌种名称 | 菌种拉丁名 | 前处理试剂和实验方法 |
| 30956 | 30956-CK-T | 副溶血弧菌 | Vibrio Parahemolyticus | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| 30956 | 30956-Y | 副溶血弧菌 | Vibrio Parahemolyticus | 本发明中的试剂盒及方法 |
(二)样本前处理及点样：
使用市售仪器Autoflex speed TOF/TOF，采用传统质谱方法前处理方法中的甲酸乙腈提取法(简称CK-T)，再覆盖CK-T的质谱基质试剂{50％(v/v)的乙腈，2.5％(v/v)三氟乙酸，10mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水}，在TOF仪器上进行菌种的鉴定，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)取单个菌落置1.5ml Eppendorf管中，加300μl去离子水和900μl无水乙醇，充分混匀后，13000r/min离心2min，弃上清液；
2)再13000r/min离心2min，吸弃残余液体；
3)加70％甲酸50μl，振荡混匀后加等量乙腈，振荡混匀，13000r/min离心2min；
4)取1μl上清液滴加于MALDI靶板上，室温干燥；
5)将1μl基质液涂敷于样品点上，室温干燥；
6)上机检测。
使用本发明的前处理方法(即北京毅新博创生物科技有限公司的飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂)，在TOF仪器上进行菌的鉴定打分，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在本实施例中，使用不同试剂及方法处理微生物样本，在TOF仪器上靶单示意图如表11：TOF仪器的靶板是16*24＝384靶板，示意图中是按照同一菌种分别采用两种方法处理后点靶，表中的菌种编号对应的处理方法(参见表10)。由于质谱仪检测的是蛋白质，有蛋白质的地方就会有出峰，查看两种方法处理后峰图(如图31～图32)即可以知道总蛋白(本发明)与核糖体蛋白(传统方法)种类的差异。
表11 实例四TOF仪器上靶单示意图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | … | 24 | |
| A | 30956-CK-T | 30956-Y | ||||||
| B | ||||||||
| C | ||||||||
| D | ||||||||
| E | ||||||||
| … | ||||||||
| P |
(三)在市售仪器Autoflex speed TOF/TOF上进行质谱检测并在软件biotyper上鉴定
实验菌种谱图如图31～图32所示，从峰图上看，本发明方法及试剂处理细菌出峰峰数比传统的甲酸乙腈提取方法，出峰多，也就是非核糖体蛋白的峰，从而打分高(打分情况如表12)。例如：
①图31、32中可以看出，编号为30956的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为5775.785Da；打分由传统方法1.995分III可能的属区间提高到2.007分II可靠的属，可能的种区间。提高了一个判断标准区间，提高了可信度及准确性
表12 食品中致病菌使用两种方法处理后的鉴定结果
实施例五：利用本发明方法和传统质谱方法中的直接涂靶板的方法(简称CK-M)对猪舍排水沟里金黄色葡萄球菌的检测
(一)微生物样本准备
1)吸取25mL排水沟里的液体至盛有225mL 7.5％氯化钠肉汤或10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
2)将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。
3)将上述培养物，划线接种到哥伦比亚血平板上于36℃±1℃培养18h～24h。
4)从平板上挑取单克隆菌落，编号为1A。
5)分别使用本发明方法和传统质谱方法中的甲酸乙腈提取方法(简称CK-M)处理编号为1A的菌。菌种信息如表13。
表13 猪舍排水沟里菌种信息
| 菌种编号 | 实验编号 | 菌种名称 | 菌种拉丁名 | 前处理试剂和实验方法 |
| 1A | 1A-CK-M | 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus | CK的直接抹板方法 |
| 1A | 1A-Y | 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus | 本发明中的试剂盒及方法 |
(二)样本前处理及点样：
使用市售仪器Autoflex speed TOF/TOF，采用传统质谱方法前处理方法中的直接涂靶板的方法(CK-M)，再覆盖CK-M的质谱基质试剂{50％(v/v)的乙腈，2.5％(v/v)三氟乙酸，10mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水}，在TOF仪器上进行菌种的鉴定，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用牙签挑取单克隆菌落并薄薄的涂在靶板上。
3)覆盖1ul CK-M的质谱基质试剂，室温干燥。
4)将靶板放入布鲁克公司仪器中进行质谱检测。
5)将检测的数据放入布鲁克的biotyper中进行鉴定。
使用本发明的前处理方法(即北京毅新博创生物科技有限公司的飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂)，在TOF仪器上进行菌的鉴定打分，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在本实施例中，使用不同试剂及方法处理微生物样本，在TOF仪器上靶单示意图如表14：TOF仪器的靶板是16*24＝384靶板，示意图中是按照同一菌种分别采用两种方法处理后点靶，表中的菌种编号对应的处理方法，参见表13。由于质谱仪检测的是蛋白质，有蛋白质的地方就会有出峰，查看两种方法处理后峰图(图33～图34)即可以知道总蛋白(本发明)与核糖体蛋白(传统方法)种类的差异。
表14 布鲁克仪器上靶单示意图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | … | 24 | |
| A | 1A-CK-M | 1A-Y | ||||||
| B | ||||||||
| C | ||||||||
| D | ||||||||
| E | ||||||||
| … | ||||||||
| P |
(三)在市售仪器Autoflex speed TOF/TOF上进行质谱检测并在软件biotyper上鉴定
实验菌种谱图如图33～图34所示，从峰图上看，本发明方法及试剂处理细菌出峰峰数比传统的甲酸乙腈提取方法，出峰多，也就是非核糖体蛋白的峰，从而打分高(打分情况如表15)。例如：
①图33、34中可以看出，编号为1A的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为2637.299Da、2665.975Da、3322.036Da、3447.747Da、3550.657Da、4081.480Da、4235.034Da、4451.015Da、4819.054Da；打分由传统方法1.835分III可能的属区间提高到2.226分II可靠的属，可能的种区间。提高了一个判断标准区间，提高了可信度及准确性
表15 猪舍外排水沟里致病菌使用两种方法处理后的鉴定结果
实施例六：利用本发明方法和传统质谱方法中的甲酸乙腈提取方法(简称CK-T)前处理真菌后进行质谱检测
(一)微生物样本取样：
菌种详细信息，其中所用培养基均为YPD培养基，培养箱条件均为37℃。如表16。菌种来自中国科学院微生物所真菌实验室，传代时间均为2015.11.2。
表16 实施例六真菌菌种详细信息(含培养基、孵育时间、培养条件)
| 菌种编号 | 实验编号 | 菌种名称 | 菌种拉丁名 | 前处理试剂和实验方法 |
| E35 | E35-CK-T | 克鲁斯假丝酵母 | Candidia krusei | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| E35 | E35-Y | 克鲁斯假丝酵母 | Candidia krusei | 本发明中的试剂盒及方法 |
| E39 | E39-CK-T | 季也蒙假丝酵母 | Candida guilliermondii | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| E39 | E39-Y | 季也蒙假丝酵母 | Candida guilliermondii | 本发明中的试剂盒及方法 |
| E53 | E53-CK-T | 皱褶假丝酵母 | Candida rugosa | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| E53 | E53-Y | 皱褶假丝酵母 | Candida rugosa | 本发明中的试剂盒及方法 |
| E55 | E55-CK-T | 拟郎比可假丝酵母 | Candida pseudolambica | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| E55 | E55-Y | 拟郎比可假丝酵母 | Candida pseudolambica | 本发明中的试剂盒及方法 |
| E58 | E58-CK-T | 拟郎比可假丝酵母 | Candida pseudolambica | CK的甲酸乙腈提取方法 |
| E58 | E58-Y | 拟郎比可假丝酵母 | Candida pseudolambica | 本发明中的试剂盒及方法 |
(二)样本前处理及点样：
使用市售仪器Autoflex speed TOF/TOF上，采用传统质谱方法前处理方法中的直接涂靶板的方法(CK-M)，再覆盖CK-M的质谱基质试剂{50％(v/v)的乙腈，2.5％(v/v)三氟乙酸，10mg/ml(m/v)α-氰基-4-羟基肉桂酸，余量为水}，在Autoflex speed TOF/TOF仪器上进行菌种的鉴定，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)取单个菌落置1.5ml Eppendorf管中，加300μl去离子水和900μl无水乙醇，充分混匀后，13000r/min离心2min，弃上清液；
2)再13000r/min离心2min，吸弃残余液体；
3)加70％甲酸50μl，振荡混匀后加等量乙腈，振荡混匀，13000r/min离心2min；
4)取1μl上清液滴加于MALDI靶板上，室温干燥；
5)将1μl基质液涂敷于样品点上，室温干燥；
6)上机检测。
使用本发明的前处理方法(即北京毅新博创生物科技有限公司的飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂)，在Autoflex speed TOF/TOF上检测，根据判定区间I-IV的鉴定打分，一株菌采集一个点。具体步骤如下：
1)在合适的培养基中分离待鉴定的微生物，获得单菌落。
2)用灭菌牙签(或者1μl接种环)挑取部分合适的单菌落于装有10μl组分I的离心管中，进行细胞破碎，蛋白及多肽释放，裂解5分钟。
3)取上述溶液1μl加到靶板的孔位上，室温干燥。
4)打开组分II的微管，移取1μl组分II加到同一孔位上，室温干燥。
5)靶板放入飞行时间质谱系统中进行检测。
在本实施例中，使用不同试剂及方法处理微生物样本，在TOF仪器上靶单示意图如表17：TOF仪器的靶板是16*24＝384靶板，示意图中是按照同一菌种分别采用两种方法处理后点靶，表中的菌种编号对应的处理方法(参见表16)。由于质谱仪检测的是蛋白质，有蛋白质的地方就会有出峰，查看两种方法处理后峰图(如图35～图42)即可以知道总蛋白(本发明)与核糖体蛋白(传统方法)种类的差异。
表17 实施例一中TOF仪器上靶单示意图
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | … | 24 | |
| A | E35-CK-T | E35-Y | E39-CK-T | E39-Y | E53-CK-T | E53-Y | ||
| B | E55-CK-T | E55-Y | E58-CK-T | E58-Y | … | |||
| C | ||||||||
| D | ||||||||
| E | ||||||||
| … | ||||||||
| P |
(三)在Autoflex speed TOF/TOF进行质谱检测在软件biotyper上鉴定
从出峰情况看(如图35～图42)，本发明方法及试剂处理细菌出峰峰数比传统的甲酸乙腈方法，出峰多，也就是非核糖体蛋白的峰，从而打分高(打分情况如表18)。例如：
①图35-图36中可以看出，编号为E35的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为5906.755Da、6278.609Da、6942.736Da；打分由传统方法的2.015分II确定属可能种区间提高到2.39分I完全可信种区间，本发明的方法结果其显著提高了检测可信度和准确度。
②图41-图42中可以看出，编号为E58的菌种，使用本发明比传统方法多出的峰值为4325.176Da、4637.467Da，打分由1.832分III可能的属提高到2.084分II可靠的属、可能的种区间。提高了一个判断标准区间，本发明有鉴定意义。
表18 本发明及传统方法中的甲酸乙腈提取法处理菌后的鉴定结果
Claims (4)
1.一种用于飞行时间质谱微生物样本前处理的试剂组合物，其包括组分I和组分II，其中，
组分I由以下组成：50.0％(v/v)的乙腈、35.0％(v/v)的甲酸，余量为水；
组分II由以下组成：52.5％(v/v)的乙腈、2.5％(v/v)的三氟乙酸、15mg/ml(m/v)α‐氰基‐4‐羟基肉桂酸，余量为水，并且
该组合物可将理论上落入可信区间的鉴定分数，实际上落入不可信区间、原来需要二次鉴定的不可信结果提高到可信区间，从而避免了假阴性的可能，其中可信区间即判断标准III：1.700‐1.999分，不可信区间即判断标准IV：0.000‐1.699分。
2.通过权利要求1的试剂组合物所制备鉴定未知微生物的检测产品。
3.权利要求2的检测产品，其中检测产品为飞行时间质谱检测微生物的试剂盒，包括：
(1)微生物样本前处理的试剂组合物
(2)其他质谱试剂。
4.权利要求3的检测产品，其中试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，点样及质谱检测用靶片。
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