CN110144379A - 一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法 - Google Patents
一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110144379A CN110144379A CN201810428077.7A CN201810428077A CN110144379A CN 110144379 A CN110144379 A CN 110144379A CN 201810428077 A CN201810428077 A CN 201810428077A CN 110144379 A CN110144379 A CN 110144379A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactose
- culture
- identification method
- nearly edge
- mass spectrum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 239000008101 lactose Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 64
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 48
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 30
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 claims abstract description 28
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 2
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 31
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N acibenzolar-S-methyl Chemical compound CSC(=O)C1=CC=CC2=C1SN=N2 UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108091031676 miR-254 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/245—Escherichia (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/25—Shigella (G)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,包括如下步骤:将试验细菌在添加乳糖的培养基中培养一预定时间,获得细菌试验样品;将细菌试验样品进行细菌蛋白前处理;采用质谱仪对处理后的细菌试验样品进行检测,并采集数据以进行处理与比对分析,以鉴定所述近缘微生物;其中所述近缘微生物具体为志贺菌和大肠埃希菌。本发明以志贺菌和大肠埃希菌为例进行试验,将生化鉴定法的原理与MALDI‑TOF MS技术相结合,采用差异条件培养改变细菌特征性蛋白表达,应用MALDI‑TOF MS技术快速检测差异蛋白,实现近亲缘性志贺菌和大肠埃希菌的快速鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及微生物质谱鉴定技术领域,尤其涉及一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法。
背景技术
微生物鉴定是食品、药品检验工作中的重要环节。快速、准确地鉴定食品、药品中的微生物种属可以有效溯源污染源、控制传播风险。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技术可以对细菌的完整蛋白进行检测,根据图谱中特征性质谱峰,对细菌种、属进行准确鉴定,具有一定的溯源能力。该技术具有鉴定速度快、检测低成本、操作简便、结果准确等优势,因而在细菌鉴定中得到很好的发展。
近缘微生物的核酸序列相近,蛋白表达也基本一致,因此近缘微生物的MALDI-TOFMS质谱图极为相似,仅在某些低丰度质谱峰或是质谱峰强度上存在细微差别,从而使近缘微生物的参考质谱图不可避免地出现最佳相似度的匹配。现有微生物MALDI-TOF MS鉴定技术基于样品质谱图和参考质谱图的匹配以及相似度排序,虽然具备一定的细菌分型能力,但尚无法解决近缘微生物鉴定结果混淆的弊端。
具体来说,以志贺菌和大肠埃希菌为例,所述2种细菌属于近缘微生物范畴,核酸序列相似,其中16S rRNA基因全长仅1-2个碱基的差别,从遗传角度来看,志贺菌可被定义为是大肠埃希菌不产气的生物型。然而,大肠埃希菌多数属于正常肠道菌群,而志贺菌为致病菌,从医学角度来说有必要将志贺菌和大肠埃希菌做出正确区别。常规鉴别手段是采用生化反应,利用微生物在不同的培养条件下发生不同的生化反应,再根据培养基颜色变化、产气等反应现象判断微生物种属,检测时长一般在8小时-3天不等(甚至需要耗时3-5天),该方法鉴定周期长,操作步骤复杂,结果受操作者主观判断影响,很难满足目前快速、准确鉴定细菌的需求。MALDI-TOF MS技术虽然检测速度快,但是由于志贺菌和大肠埃希菌的蛋白质谱图基本一致,MALDI-TOF MS技术只能鉴别到志贺菌属或大肠埃希菌属,无法正确鉴定二者,志贺菌常被错误地鉴定为大肠埃希菌,这一点是MALDI-TOF MS技术在细菌鉴定应用中公知的不足之处;再者目前,虽然MALDI-TOF MS技术是最快速的微生物鉴定方法,但是由于近缘微生物的鉴定策略牵涉到生化鉴定作为补充试验,这无疑抵消了MALDI-TOF MS技术检测速度快的优势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷,提供一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法。
本发明以麦康凯培养基为基础进行研究,发现麦康凯培养基诸多成分中乳糖是关键因素,因此发明人设计了在普通细菌培养基中加入乳糖以缩短培养时间的方法,并将该方法进行验证。通过上述方法,本发明将生化鉴定原理与MALDI-TOF MS技术相结合,将志贺菌和大肠埃希菌培养于含有乳糖或者不含乳糖的培养条件下,诱导大肠埃希菌在不同生长条件下产生差异蛋白,再通过MALDI-TOF MS技术检测差异蛋白,根据差异蛋白检测结果判断是否为大肠埃希菌或志贺菌,实现近亲缘性志贺菌和大肠埃希菌的快速鉴别。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其包括以下步骤:包括如下步骤:
步骤1)将试验细菌以菌液的方式在上述添加乳糖的培养基中培养一预定时间,获得细菌试验样品;
步骤2)对步骤1)中获得的细菌试验样品进行细菌蛋白前处理;
步骤3)采用质谱仪对步骤2)中处理后的细菌试验样品进行检测,并采集数据;
步骤4)对步骤3)采集的数据进行处理与比对分析,以鉴定所述近缘微生物。
为了进一步优化上述质谱鉴定方法,本发明所采取的技术措施还包括:
进一步地,所述近缘微生物为志贺菌和大肠埃希菌。
进一步地,所述培养基为适于添加乳糖的细菌培养基,包括TSA培养基或液体TSB培养基。
进一步地,所述培养基中乳糖的浓度为1%~6%,所述细菌在培养基中的培养时间为2h~24h;更进一步地,所述培养基中乳糖的浓度为6%,细菌在培养基中的培养时间为2h,其中,乳糖的浓度为质量体积比。
进一步地,步骤1)中细菌培养的具体步骤如下:试验前,取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中,恒温静置培养一定时间,制得菌液。将菌液加入添加乳糖的培养基中,恒温静置培养一定时间,挑取单个菌落,悬浮于装有纯水的离心管中,获得细菌试验样品。更具体地说,试验用细菌工作代菌株储存于-80℃低温冰箱;试验前,取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中,于35℃恒温静置培养24h,制得菌液;将菌液均匀加至不同条件(乳糖的浓度不同)培养基表面,35℃恒温静置培养一定时间,在生物安全柜中挑取单个菌落,悬浮于装有300μL纯水的1.5mL离心管中,获得细菌试验样品。
进一步地,所述步骤2)细菌蛋白前处理的具体如下:将细菌试验样品进行离心,弃上清,加入甲酸水溶液,涡旋混合,再加入乙腈,离心,去上清液,点于样品板上;待样品点干燥后再滴加基质,放置干燥后进样。具体来说,将装有细菌试验样品的1.5mL离心管置于离心机中,12000g/min离心3min,弃上清,加入50μL 70%甲酸水溶液,涡旋混合3min,再加入50μL乙腈,12000g/min离心3min,去上清液1μL点于样品板上;待样品点干燥后再滴加1μL基质,放置干燥后进样。
进一步地,所述步骤3)中质谱仪的检测条件如下:样品板载入质谱仪后激活激光系统,稳定30min,采用标准蛋白校正仪器,设置激光强度为3200。
进一步地,所述步骤4)中数据的处理及分析步骤如下:采用采样软件对采集的数据进行处理,在分析软件中同时打开试验细菌的待比对图谱,校正图谱基线,去除图谱噪音,对比图谱。具体来说,采用采样软件对质谱仪采集的数据进行对比分析,在分析软件中同时打开待比对图谱,选择Advanced baselinecorrection,设置参数为2.0,校正图谱基线;选择Noise filter去除图谱噪音,对比图谱,缺少或增加特征质谱峰的为大肠埃希菌,否则为志贺菌。
进一步地,所述质谱仪为MALDI-TOF MS高分辨质谱仪,采样软件为4000SeriesExplorer4.0数据处理系统,分析软件为Data Explorer V4.5。上述设备也可采用其他合适的同类型设备。
进一步地,比对分析中所得出的所述特征质谱峰(差异蛋白的质荷比)为m/z2370.72±10、m/z 2401.04±10、m/z 3824.84±10、m/z 5757.15±10。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明是利用微生物在不同培养条件下蛋白表达存在差异,采用MALDI-TOF MS检测差异蛋白来实现近缘微生物的鉴定,不依赖于基于参考质谱图库的质谱图匹配方法。因此,本发明所述近缘微生物鉴定技术可以弥补现有微生物MALDI-TOF MS鉴定方法中因质谱图匹配所引起的近缘微生物鉴定结果混淆的不足之处。
在本发明所述的质谱鉴定方法中,由于微生物培养与差异培养同时进行,并不需要额外的实验时间,相比传统MALDI-TOF MS鉴定方法,本发明鉴定准确度更好,适用于传统MALDI-TOF MS方法不能鉴别的近缘微生物。本发明与传统生化鉴定相比,本发明只需要一个实验,在数分钟内完成,而传统生化鉴定方法需要耗时数小时甚至数日,并且需要多项实验组合验证得出鉴定结果,相比而言,本发明更加快速、简便易行;
具体来说,以志贺菌和大肠埃希菌为例,根据本发明的指导思想,在微生物培养时增加一组含有乳糖的培养基组,与常规培养组一起做MALDI-TOF MS质谱分析,或者是在怀疑志贺菌和大肠埃希菌鉴别结果准确性时,将样品菌落置于含有乳糖的TSB液体培养基中进一步短暂培养数小时,再用MALDI-TOF MS质谱分析,比对图谱,缺少或增加本发明所述特征质谱峰的即为大肠埃希菌,否则为志贺菌。上述方法能正确进一步提高志贺菌和大肠埃希菌的鉴别准确性。
附图说明
图1为本发明一实施例中志贺菌(CMCC 51252)在大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA培养基)中培养以及在添加1%乳糖的TSA培养基中培养的图谱差异对比图;
图2为本发明一实施例中大肠埃希菌(CMCC 44102)在大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA培养基)中培养以及在添加1%乳糖的TSA培养基中培养的图谱差异对比图;
图3为本发明一实施例中志贺菌(CMCC 51252)在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(液体TSB培养基)中培养以及在添加6%乳糖的液体TSB培养基中培养的图谱差异对比图;
图4为本发明一实施例中大肠埃希菌(CMCC 44102)在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(液体TSB培养基)中培养以及在添加6%乳糖的液体TSB培养基中培养的图谱差异对比图。
具体实施方式
本发明提供一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其包括如下步骤:步骤1)将试验细菌以菌液的方式在添加乳糖的培养基中培养一预定时间,获得细菌试验样品;步骤2)对步骤1)中获得的细菌试验样品进行细菌蛋白前处理;步骤3)采用质谱仪对步骤2)中处理后的细菌试验样品进行检测,并采集数据;步骤4)对步骤3)采集的数据进行处理与比对分析,以鉴定所述近缘微生物。
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为一较佳形式的基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法。
在本实施例所述的质谱鉴定方法中,采用的仪器及原材料如下所示:
1.实验仪器
AB 4800MALDI-TOF MS高分辨质谱仪,采样软件为4000Series Explorer4.0数据处理系统,分析软件为Data Explorer V4.5,均购自美国AB-SCIEX公司;Eppendorf5424R台式高速冷冻离心机购自德国艾本德公司;三洋MIR-254型号恒温培养箱,购自日本三洋公司。
2.化学试剂
甲醇、乙腈为美国Merck公司生产的色谱纯试剂,甲酸为Sigma的色谱纯试剂,纯水为Millipore系统纯化去离子水。
在本实施例中,所述质谱鉴定方法的具体步骤如下:
(1)细菌培养
试验用细菌工作代菌株储存于-80℃低温冰箱。试验前,取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中,于35℃恒温静置培养24h,制得菌液。将菌液均匀置于不同条件(乳糖浓度不同)培养基中,35℃恒温静置培养一定时间,在生物安全柜中挑取单个菌落,悬浮于装有300μL纯水的1.5mL离心管中,获得细菌试验样品。
(2)细菌蛋白前处理
将装有细菌试验样品的1.5mL离心管置于离心机中,12000g/min离心3min,弃上清,加入50μL 70%甲酸水溶液,涡旋混合3min,再加入50μL乙腈,12000g/min离心3min,去上清液1μL点于MALDI-TOF样品板上。待样品点干燥后再滴加1μL基质,放置干燥后进样。
(3)MALDI-TOF MS检测条件
样品板载入质谱仪后激活激光系统,稳定30min,采用标准蛋白校正仪器,设置激光强度为3200,检测样品点。
(4)数据处理与分析
采用AB公司的4000Series Explorer V4.5软件对MALDI-TOF MS采集的数据进行对比分析。具体步骤如下:在Data Explorer V4.5软件中同时打开待比对图谱,选择Advanced baseline correction,设置参数为2.0,校正图谱基线。选择Noise filter去除图谱噪音,对比图谱。
实施例2
本实施例采用豆酪蛋白琼脂培养基(TSA培养基)作为实验对象,具体为采用的为不含乳糖的TSA培养基以及含乳糖1%的TSA培养基,其鉴定方法如实施例1所述,谱图的对比分析结果如下:
志贺菌(CMCC 51252)经过含乳糖1%的TSA培养基培养24h后,MALDI-TOF MS质谱图与不含乳糖的TSA培养基中培养24h的质谱图无显著差异(图1)。大肠埃希菌(CMCC44102)经过含乳糖1%的TSA培养基培养24h后,MALDI-TOF MS图谱中m/z 2370.72、m/z2401.04、m/z 5757.15的质谱峰强度显著加强(图2)。
实施例3
本实施例采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(液体TSB培养基)作为实验对象,具体为采用的为不含乳糖的液体TSB培养基以及含乳糖6%的液体TSB培养基,其鉴定方法如实施例1所述,谱图的对比分析结果如下::
志贺菌(CMCC 51252)经过含乳糖6%的液体TSB培养基培养2h后,MALDI-TOF MS质谱图与不含乳糖的液体TSB培养基中培养2h的质谱图无显著差异(图3)。大肠埃希菌(CMCC44102)经过含乳糖6%的液体TSB培养基培养2h后,MALDI-TOF MS图谱中m/z 3824.84的质谱峰强度显著加强(图4)。
通过上述实施例可知,志贺菌(CMCC 51252)和大肠埃希菌(CMCC 44102)在不同条件下培养,志贺菌的MALDI-TOF MS图谱均无显著变化,大肠埃希菌的MALDI-TOF MS图谱则在含乳糖的培养基的处理下4个质谱峰强度上调,说明发生4种蛋白表达显著上升,可理解的是这4种蛋白的分子量可能会因为校正因素、仪器自身因素发生偏移,其分子量为检测值的±5~10Da左右;志贺菌(CMCC 51252)和大肠埃希菌(CMCC 44102)在同浓度含乳糖的培养基处理24h或2h后,志贺菌的MALDI-TOF MS图谱无显著变化,大肠埃希菌的MALDI-TOF MS图谱中m/z 2370.72、m/z 2401.04、m/z 3824.84、m/z 5757.15中的至少1个的质谱峰强度显著加强,这表明本发明所述的培养基及鉴定方法为差异图谱鉴别志贺菌和大肠埃希菌提供了实验依据。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1)将试验细菌以菌液的方式在添加乳糖的培养基中培养一预定时间,获得细菌试验样品;
步骤2)对步骤1)中获得的细菌试验样品进行细菌蛋白前处理;
步骤3)采用质谱仪对步骤2)中处理后的细菌试验样品进行检测,并采集数据;
步骤4)对步骤3)采集的数据进行处理与比对分析,以鉴定所述近缘微生物。
2.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,所述近缘微生物为志贺菌和大肠埃希菌。
3.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,所述培养基为适于添加乳糖的细菌培养基,包括TSA培养基或液体TSB培养基。
4.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,所述培养基中乳糖的浓度为1%~6%,所述细菌在培养基中的培养时间为2h~24h。
5.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,步骤1)中细菌培养的具体步骤如下:试验前,取适量黏附有冻存菌株的橡胶圈置于增菌液中,恒温静置培养一定时间,制得菌液;将菌液加入添加乳糖的培养基中,恒温静置培养一定时间,挑取单个菌落,悬浮于装有纯水的离心管中,获得细菌试验样品。
6.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,所述步骤2)细菌蛋白前处理的具体如下:将细菌试验样品进行离心,弃上清,加入甲酸水溶液,涡旋混合,再加入乙腈,离心,去上清液,点于样品板上;待样品点干燥后再滴加基质,放置干燥后进样。
7.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,所述步骤3)中质谱仪的检测条件如下:样品载入质谱仪后激活激光系统,稳定30min,采用标准蛋白校正仪器,设置激光强度为3200。
8.根据权利要求1所述的一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法,其特征在于,所述步骤4)中数据的处理及分析步骤如下:采用采样软件对采集的数据进行处理,在分析软件中打开试验细菌的待比对图谱,校正图谱基线,去除图谱噪音,对比图谱,缺少或增加特征质谱峰的为大肠埃希菌,否则为志贺菌。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2018101433249 | 2018-02-11 | ||
CN201810143324 | 2018-02-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110144379A true CN110144379A (zh) | 2019-08-20 |
Family
ID=67589072
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810428077.7A Pending CN110144379A (zh) | 2018-02-11 | 2018-05-07 | 一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110144379A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111735871A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-10-02 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于大肠杆菌与志贺菌甄别的试剂盒 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103421879A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-12-04 | 新疆农业大学 | 一种酶底物法制备大肠杆菌群快速检测试纸 |
-
2018
- 2018-05-07 CN CN201810428077.7A patent/CN110144379A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103421879A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-12-04 | 新疆农业大学 | 一种酶底物法制备大肠杆菌群快速检测试纸 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PRASANNA D. KHOT 等: "Novel Approach for Differentiating Shigella Species and Escherichia coli by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
饶名祯 等: "MALDI-TOF MS 技术在食品微生物领域的应用研究", 《上海师范大学学报( 自然科学版)》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111735871A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-10-02 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于大肠杆菌与志贺菌甄别的试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Thorn et al. | Multivariate analysis of bacterial volatile compound profiles for discrimination between selected species and strains in vitro | |
Cuénod et al. | Factors associated with MALDI-TOF mass spectral quality of species identification in clinical routine diagnostics | |
Bessède et al. | Identification of Campylobacter species and related organisms by matrix assisted laser desorption ionization–time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry | |
Vaidyanathan et al. | Flow-injection electrospray ionization mass spectrometry of crude cell extracts for high-throughput bacterial identification | |
Veloo et al. | The influence of incubation time, sample preparation and exposure to oxygen on the quality of the MALDI-TOF MS spectrum of anaerobic bacteria | |
Schulthess et al. | Identification of Gram-positive cocci by use of matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry: comparison of different preparation methods and implementation of a practical algorithm for routine diagnostics | |
US10774361B2 (en) | Microbe identification by mass spectrometry and infrared spectrometry | |
CN106199003A (zh) | 基于飞行时间质谱原理的微生物肽质量指纹图谱库的构建方法 | |
Szabados et al. | Evaluation of species-specific score cutoff values of routinely isolated clinically relevant bacteria using a direct smear preparation for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry-based bacterial identification | |
Dekker et al. | MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory | |
Luo et al. | Performance of the VITEK MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid bacterial identification in two diagnostic centres in China | |
Bourassa et al. | MALDI-TOF mass spectrometry for microorganism identification | |
CN107024530A (zh) | 通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品 | |
CN113777209B (zh) | 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用 | |
CN111239235A (zh) | 一种巴尔通体菌株maldi-tof ms的数据库建立方法和鉴定方法 | |
Gutteridge | 6 characterization of microorganisms by pyrolysis mass spectrometry | |
CN110904250A (zh) | 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法 | |
US20200010870A1 (en) | Device, Method, And System For Identifying Organisms And Determining Their Sensitivity To Toxic Substances Using The Changes In The Concentrations Of Metabolites Present In Growth Medium | |
Lay et al. | Rapid identification of bacteria based on spectral patterns using MALDI-TOFMS | |
CN110144379A (zh) | 一种基于乳糖差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法 | |
US20150186754A1 (en) | Classification method for spectral data | |
CN110144378A (zh) | 一种基于抗菌药物差异培养的近缘微生物质谱鉴定方法 | |
WO2022057943A1 (zh) | 一种基于maldi-tof ms的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法 | |
US11661620B2 (en) | Method for the spectrometric characterization of microorganisms | |
Assaf et al. | Evaluation of the impact of buffered peptone water composition on the discrimination between Salmonella enterica and Escherichia coli by Raman spectroscopy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 200120 No. 1500 Zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai Applicant after: Shanghai Institute for food and drug control Address before: No.1500, zhangheng Road, Pudong New Area, Shanghai, 201200 Applicant before: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL |
|
CB02 | Change of applicant information | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190820 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |