JPS59109178A - プラスミドｐＳＬ２及びその調製法 - Google Patents
プラスミドｐＳＬ２及びその調製法Info
- Publication number
- JPS59109178A JPS59109178A JP57219314A JP21931482A JPS59109178A JP S59109178 A JPS59109178 A JP S59109178A JP 57219314 A JP57219314 A JP 57219314A JP 21931482 A JP21931482 A JP 21931482A JP S59109178 A JPS59109178 A JP S59109178A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- psl2
- add
- minutes
- escherichia coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドｐＳＬ２に関する。石らに評しくけ
、乳酸菌ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ １ａｃｔｉｓｌから得られるプラスミ
ドｐ８Ｔ、１と大腸菌エシェリヒアーコリ（Ｂｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｌから得られるプラスミドｐＢ
Ｒ３２２とから作製される新規なプラスミドｐｓＬ２に
関する。
、乳酸菌ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ １ａｃｔｉｓｌから得られるプラスミ
ドｐ８Ｔ、１と大腸菌エシェリヒアーコリ（Ｂｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｌから得られるプラスミドｐＢ
Ｒ３２２とから作製される新規なプラスミドｐｓＬ２に
関する。
そして、本発明は、プラスミドｐｓＬ ２を太部に調製
する方法に関するものである。
する方法に関するものである。
一般に、乳酸菌は、チーズ、バター５ヨーグルト、乳酸
菌飲料５漬物、サイレージ、乳酸の製造、清酒や醤油の
醸造などに重要な役割を演じ、さらに乳酸菌製剤（整腸
剤１、デキストランの製造。
菌飲料５漬物、サイレージ、乳酸の製造、清酒や醤油の
醸造などに重要な役割を演じ、さらに乳酸菌製剤（整腸
剤１、デキストランの製造。
アミノ酸やビタミンの定量にも用いられる極めて重要な
菌である。
菌である。
それ故に乳酸菌の育種改良は産業上極めて重大な意義を
有するものであり５産業界において多大の努力が払われ
てきた。乳酸菌の育種改良のための目的に合致する優良
な菌株を広く自然界から検索したり、あるいは突然変異
を誘発塾せたシすることによって得るのが従来の方法で
あったが、近年目覚ましい発展を遂げているバイオテク
ノロジ−（生命工学）は、乳酸菌の育種改良にも新しい
可能性をもたらした。細胞融合技術や遺伝子組替え技術
の適用がそれである。
有するものであり５産業界において多大の努力が払われ
てきた。乳酸菌の育種改良のための目的に合致する優良
な菌株を広く自然界から検索したり、あるいは突然変異
を誘発塾せたシすることによって得るのが従来の方法で
あったが、近年目覚ましい発展を遂げているバイオテク
ノロジ−（生命工学）は、乳酸菌の育種改良にも新しい
可能性をもたらした。細胞融合技術や遺伝子組替え技術
の適用がそれである。
細胞融合はプロトシラスト融合とも呼ばれ、もともとは
動植物細胞において開発された技術であるが、その後微
生物にも応用され、その技術の適用は乳酸菌の＊種改良
の分野にも及ぼうとしている。しかし、細胞融合法の適
用は、同種あるいは近縁種に限られておシ、したがって
乳酸菌に筒等生物に由来する新しい能力を賦与するとい
う意味での育種改良においては、遺伝子組替え技術にま
さる技術はない。
動植物細胞において開発された技術であるが、その後微
生物にも応用され、その技術の適用は乳酸菌の＊種改良
の分野にも及ぼうとしている。しかし、細胞融合法の適
用は、同種あるいは近縁種に限られておシ、したがって
乳酸菌に筒等生物に由来する新しい能力を賦与するとい
う意味での育種改良においては、遺伝子組替え技術にま
さる技術はない。
一方、ストレプトコッカス・ラクチスは発酵乳製品に用
いられる産業上有用な乳酸菌であるが、長い間プラスミ
ドによる形質転換が不可能であったために遺伝子組替え
技術を用いての育種改良は制限されていた。ところが、
最近ミネソタ大学のマツケイ（Ｌ、 Ｌ、 Ｍｃｋａｙ
ｌらによって、該菌種の細胞をプロトプラスト化し、
ポリエチレングリコールで処理することにより、プラス
ミドを該菌種内に導入するｉＪ能性が示唆され（Ａｐｐ
ｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ。
いられる産業上有用な乳酸菌であるが、長い間プラスミ
ドによる形質転換が不可能であったために遺伝子組替え
技術を用いての育種改良は制限されていた。ところが、
最近ミネソタ大学のマツケイ（Ｌ、 Ｌ、 Ｍｃｋａｙ
ｌらによって、該菌種の細胞をプロトプラスト化し、
ポリエチレングリコールで処理することにより、プラス
ミドを該菌種内に導入するｉＪ能性が示唆され（Ａｐｐ
ｌ、 Ｅｎｖｉｒｏｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４３．１２１３〜１２１５．１９
８２１、該菌種において遺伝子組替え技術を用いた菌株
の育種改良を行い得る技術的可能性は、にわかに高まっ
て米た。
８２１、該菌種において遺伝子組替え技術を用いた菌株
の育種改良を行い得る技術的可能性は、にわかに高まっ
て米た。
マツケイらの形質転換法を用いて異種ＤＮＡを宿主であ
るストレプトコッカス・ラクチス内に導入するためには
、プラスミドベクターが必要であり、宿主内での安定性
を考慮すれば、宿主と同じストレプトコッカス・ラクチ
スに由来するプラスミドをベクターとして用いることが
望ましいこととなる。
るストレプトコッカス・ラクチス内に導入するためには
、プラスミドベクターが必要であり、宿主内での安定性
を考慮すれば、宿主と同じストレプトコッカス・ラクチ
スに由来するプラスミドをベクターとして用いることが
望ましいこととなる。
そこで、本発明者らは、ストレプトコッカスΦラクチス
に属する多くの菌株からすぐれたプラスミドを得るため
に検索を行った結果、新たな分離株、ストレプトコッカ
スφラクチスＮ［１１２８よυベクターとして好ましい
性質を持った２本鎖域状の新規なプラスミドを得、これ
をプラスミドｐｓＬ１と命名した。また、プラスミドｐ
８Ｌ １を含有するストレプトコッカス・ラクチスＮ１
１２８は、微工研にＦＢＲＭＰ−６６６６として寄託さ
れている。
に属する多くの菌株からすぐれたプラスミドを得るため
に検索を行った結果、新たな分離株、ストレプトコッカ
スφラクチスＮ［１１２８よυベクターとして好ましい
性質を持った２本鎖域状の新規なプラスミドを得、これ
をプラスミドｐｓＬ１と命名した。また、プラスミドｐ
８Ｌ １を含有するストレプトコッカス・ラクチスＮ１
１２８は、微工研にＦＢＲＭＰ−６６６６として寄託さ
れている。
プラスミドｐ８Ｌ １は、極めてコンパクトでかつコヒ
ー数が太さいため、ストレプトコッカス・ラクチスを宿
主とする遺伝子組替え技術に使用するベクターとして実
用に供することが可能で１、その含有菌株とともに既に
出願されている。（特願昭５７−１４４６１４号） 次に、プラスミドｐ８Ｌ １とストレプトコッカス・ラ
クチスＮｎ１２８について述べる。
ー数が太さいため、ストレプトコッカス・ラクチスを宿
主とする遺伝子組替え技術に使用するベクターとして実
用に供することが可能で１、その含有菌株とともに既に
出願されている。（特願昭５７−１４４６１４号） 次に、プラスミドｐ８Ｌ １とストレプトコッカス・ラ
クチスＮｎ１２８について述べる。
プラスミドｐ８Ｌ １を有するストレプトコッカス・ラ
クチス阻１２８．ＩＲＭＰ−６６６６の開学的性質は次
のとお如である。
クチス阻１２８．ＩＲＭＰ−６６６６の開学的性質は次
のとお如である。
（１）発育温度
ラクチツクープロースに接種し、１０℃、２０℃、４０
°０，４５℃、５０°０でそれぞれ培養し、６日、７日
、１４日培養後に発育の有無を肉眼的に観察したところ
、１０°０では生育するが４５℃ではほとんど生育しな
かった。なお、ラフチック・ブロースの組成は次のとお
シであり、Ｐｌｌを６．８に調整後１１５°０で１５分
間殺菌する。
°０，４５℃、５０°０でそれぞれ培養し、６日、７日
、１４日培養後に発育の有無を肉眼的に観察したところ
、１０°０では生育するが４５℃ではほとんど生育しな
かった。なお、ラフチック・ブロースの組成は次のとお
シであり、Ｐｌｌを６．８に調整後１１５°０で１５分
間殺菌する。
トリプトン ２％
酵母エキス ０５％
ゼラチン ０．２５％
デキストロース ０５％
ラクトース ０，５％
スクロース ０５％
塩化ナトリウム ０，４チ
酢酸ナトリウム ０．１５％
アスコルビン酸 ０．０５％
（２）塩化ナトリウム抵抗性
２％、４％、６．５％の塩化ナトリウムを含むラフチッ
ク・ブロースに接種し、６０°Ｃで７日培養後に混濁お
よび酸生成で判定したところ、２％。
ク・ブロースに接種し、６０°Ｃで７日培養後に混濁お
よび酸生成で判定したところ、２％。
４％では生育したが、６．５％塩化ナトリウムブロース
では生育がほとんど認められなかった。
では生育がほとんど認められなかった。
（６） メチレンブルー抵抗性
０．１％のメチレンブルーを添加した１０％脱脂粉乳培
地に接種し１．６０°Ｃで１４日培養後還元の有無を観
察したところ、メチレンブルーの還元が認められた。
地に接種し１．６０°Ｃで１４日培養後還元の有無を観
察したところ、メチレンブルーの還元が認められた。
（４）銅熱性（６０”０．３０分）
予め６０°０に保持したリドマス牛乳に接種し。
３０分保持した後、直ちに冷却り、、３０’０で７日培
養後増殖の有無を比較検査したところ、耐熱性は認めら
れなかった。
養後増殖の有無を比較検査したところ、耐熱性は認めら
れなかった。
（５） リドマス牛乳の還元
ＩＪ ）マス牛乳に接種し、３０ ’０で培養してその
還元状態を観察したところ、ＩＪ ｌ−マス牛乳の還元
が認められた。
還元状態を観察したところ、ＩＪ ｌ−マス牛乳の還元
が認められた。
（６）糖の資化性
ラフチック・ブロースより糖類を除いたブロースを基本
培地として、糖の貧化性を調べたところ、表−１の結果
を得た。
培地として、糖の貧化性を調べたところ、表−１の結果
を得た。
表−１糖の資化性
・ （７）抗生吻實ナイシンを生理する。
（８）プラスミドｐＳＩ、１を官有する。
プラスミドｐ Ｓ Ｌ ｉは５上Ｈ己のストレプトコッ
カス・ラクチスＮｎ１２Ｂの培養画体から富法のクリア
ート−ライゼート法［Ｃ１ｅａｒｅｄ ＬｙｓａｌｅＭ
ｅｔｈｏｄｌ で単離される。
カス・ラクチスＮｎ１２Ｂの培養画体から富法のクリア
ート−ライゼート法［Ｃ１ｅａｒｅｄ ＬｙｓａｌｅＭ
ｅｔｈｏｄｌ で単離される。
ストレプトコッカス・ラクチスＮ［１１２Ｂは一般乳酸
菌の培地、培養によって増殖芒せることかできる。培地
としては、グルコース、スクロース。
菌の培地、培養によって増殖芒せることかできる。培地
としては、グルコース、スクロース。
グリセロール、澱粉、乳糖、糖蜜等の炭素源、乳蛋白、
ペプトン、酵母エキス、セラチン、ジステイラースソル
ブルスなどの屋素詠％イの他釜属塩、ビタミン等を官有
させた液体培地が用いられる。
ペプトン、酵母エキス、セラチン、ジステイラースソル
ブルスなどの屋素詠％イの他釜属塩、ビタミン等を官有
させた液体培地が用いられる。
培賛は２０〜４０゛Ｃで１５〜６０時間靜置して装なわ
れる。
れる。
得られた培養物は遠心分離によって集菌される。
得られた囲体は、洗滌、溶菌、精製を行って、プラスミ
ドｐ８Ｌ １を得ることができる。
ドｐ８Ｌ １を得ることができる。
プラスミドｐｓＬ１を制限酵系ＥｃｏＲ４で切断し直鎖
状とした後λファージＴ）ＮＡを制限＃素ｉ（ｉ ｎｄ
Ｉで処理して得られる切断片を移動マーカーとしたアガ
ロース電気泳動を行ない、その結果、プラスミドｐｓＬ
１は分子量１．７４±０゜２×１０６ダルトンで約２
，６ｏｏｒ＝基対からなるコンパクトなシラスミドであ
ることが判明する。
状とした後λファージＴ）ＮＡを制限＃素ｉ（ｉ ｎｄ
Ｉで処理して得られる切断片を移動マーカーとしたアガ
ロース電気泳動を行ない、その結果、プラスミドｐｓＬ
１は分子量１．７４±０゜２×１０６ダルトンで約２
，６ｏｏｒ＝基対からなるコンパクトなシラスミドであ
ることが判明する。
次に、プラスミドｐｓＬ１の理化学的性質を示す。
１） 分子量１．７４±０．２Ｘ１０ タルトン（約
２，６キロベース）の２本鎖環状ＤＮＡ ２）制限酵素による切断個所および得られる切断片の分
子量は表２のとおりである。
２，６キロベース）の２本鎖環状ＤＮＡ ２）制限酵素による切断個所および得られる切断片の分
子量は表２のとおりである。
表 ２
つつく
シラスミドｐ Ｓ Ｌ １ のストレプトコッカス・
ラクチスの導入法は、概路次の通りである。すなわち、
ストレプトコッカス・ラクチスの個主菌株を一夜槁養し
、５０ ｍｌのＭ−１７培地ｆＵ、５％ポリヘソトン、
０５％ファイトンベゾトン、０２５％６ｆＪエギス、０
．５％ビーフェキス、０５％ラクトース、（１，０５％
アスコルビン酸、１．９％β−ジンジウムグリセロリン
酸、１ ｍ Ｍｉ酸マダイ、シウム）に１％接種し、６
０゛０で数時間培養し、培養後の菌体を遠心分離によっ
て集Ｉ罰シて４ｍｌの（Ｊ、 ５ Ｍスクロース液に８
懸濁し、［Ｊ、’０２ Ｍ ｌ−ＩＪス塩酸級側液（ｐ
ｉ−１７，０１中に０．５ Ｍとなるようにスクロース
を溶解した浴液４ｍｌを加え、Ｎ−アセチルムラミダー
ゼ８０（大日本製朶）を０４〜添加して３７°０で２０
分間インキュベートして宿主Ａ（１１胞をプロトプラス
ト化芒せ、２，６００ＸＰで１０分間理６してプロトシ
ラストを集めてＩＪ、 ５ ｍｌのｓＭＭ緩衝＃（［Ｊ
、５Ｍスクロース、００２Ｍマレイン酸、０、０２ Ｍ
塩化マグネンウム、ｐｉ（６，５１に再懸濁し、８０μ
！の８ＭＭ緩衝液に懸濁したプラスミドｐ８Ｌ １を加
え、ｓＭＭ＝を両液に４０％濃度となるように溶かした
ポリエチレングリコール浴液６ｕ＋ｌをその後ただちに
加え、２分間静置した後に１０ｍ１の５ＭＭ１ｉ衝液を
追加し、４，５００Ｘ４で１０分間遠心してゾロドプラ
ストを果めてｉ ｍｅの８ＭＭ緩衝液に再懸濁し、プロ
トプラストの安定化のために０．５ Ｍスクロースを補
ったＭ−１７寒天プレート上に３０′Ｃで１〜Ｓ Ｅ１
間培養し、形質転換したコロニーを選別するものである
。
ラクチスの導入法は、概路次の通りである。すなわち、
ストレプトコッカス・ラクチスの個主菌株を一夜槁養し
、５０ ｍｌのＭ−１７培地ｆＵ、５％ポリヘソトン、
０５％ファイトンベゾトン、０２５％６ｆＪエギス、０
．５％ビーフェキス、０５％ラクトース、（１，０５％
アスコルビン酸、１．９％β−ジンジウムグリセロリン
酸、１ ｍ Ｍｉ酸マダイ、シウム）に１％接種し、６
０゛０で数時間培養し、培養後の菌体を遠心分離によっ
て集Ｉ罰シて４ｍｌの（Ｊ、 ５ Ｍスクロース液に８
懸濁し、［Ｊ、’０２ Ｍ ｌ−ＩＪス塩酸級側液（ｐ
ｉ−１７，０１中に０．５ Ｍとなるようにスクロース
を溶解した浴液４ｍｌを加え、Ｎ−アセチルムラミダー
ゼ８０（大日本製朶）を０４〜添加して３７°０で２０
分間インキュベートして宿主Ａ（１１胞をプロトプラス
ト化芒せ、２，６００ＸＰで１０分間理６してプロトシ
ラストを集めてＩＪ、 ５ ｍｌのｓＭＭ緩衝＃（［Ｊ
、５Ｍスクロース、００２Ｍマレイン酸、０、０２ Ｍ
塩化マグネンウム、ｐｉ（６，５１に再懸濁し、８０μ
！の８ＭＭ緩衝液に懸濁したプラスミドｐ８Ｌ １を加
え、ｓＭＭ＝を両液に４０％濃度となるように溶かした
ポリエチレングリコール浴液６ｕ＋ｌをその後ただちに
加え、２分間静置した後に１０ｍ１の５ＭＭ１ｉ衝液を
追加し、４，５００Ｘ４で１０分間遠心してゾロドプラ
ストを果めてｉ ｍｅの８ＭＭ緩衝液に再懸濁し、プロ
トプラストの安定化のために０．５ Ｍスクロースを補
ったＭ−１７寒天プレート上に３０′Ｃで１〜Ｓ Ｅ１
間培養し、形質転換したコロニーを選別するものである
。
そして形質転換体の選別は１通常、導入されるプラスミ
ド上の選択マーカーに基いて行われる。
ド上の選択マーカーに基いて行われる。
たとえは、アンピシリン耐性というマーカーをもつシラ
スミドでアンピシリン感受性の宿主を形質転換した場合
、形質転換体の選別はアンピシリン添加の寒天培地を使
用することによって容易に行われ得る。従って、遺伝子
組替え技術に使用するプラスミドには何らかの選択マー
カーが心安とされるのである。
スミドでアンピシリン感受性の宿主を形質転換した場合
、形質転換体の選別はアンピシリン添加の寒天培地を使
用することによって容易に行われ得る。従って、遺伝子
組替え技術に使用するプラスミドには何らかの選択マー
カーが心安とされるのである。
しかるにプラスミドｐｓＬ１は、ストレプトコッカス・
ラクチスの甲で安定的に増殖し且つコピー数も多いとい
う利点を有しているにも拘らず、潜在性であり１選択マ
ーカーを有していないため、遺伝子組替え技術のベクタ
ーとしての使用に適しておらず、これを改善するために
は適当な修飾を行い選択マーカーを導入することが必侠
であることが分った。
ラクチスの甲で安定的に増殖し且つコピー数も多いとい
う利点を有しているにも拘らず、潜在性であり１選択マ
ーカーを有していないため、遺伝子組替え技術のベクタ
ーとしての使用に適しておらず、これを改善するために
は適当な修飾を行い選択マーカーを導入することが必侠
であることが分った。
そこで本発明者らはかかる固難を拐開すべく鋭意研究を
行い、ｐｓＬｌと大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２とを
酵素処理し、キメラプラスミドｐｓＬ ２を作製するこ
とによって解決したのである。キメラプラスミドｐｓＬ
２の作製系統図は第２図に示される。ここに得られる
キメラプラスミドｐｓＬ ２は新規なプラスミドである
。
行い、ｐｓＬｌと大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２とを
酵素処理し、キメラプラスミドｐｓＬ ２を作製するこ
とによって解決したのである。キメラプラスミドｐｓＬ
２の作製系統図は第２図に示される。ここに得られる
キメラプラスミドｐｓＬ ２は新規なプラスミドである
。
すなわち本発明者らは、乳酸菌白米のプラスミドｐｓＬ
１および市販のプラスミドｐＢＲ３２２（ベーリンガー
ーマンハイム社販売）のＩ、ｑスレモが制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩによる切向点が１箇所であることに着目し、両者を
ＥｃｏＲ■で切断した後Ｔ４ＤＮＡ連結酵素で再結合さ
せてプラスミドｐ ８ Ｌ２を得、本発明に至ったもの
である。
１および市販のプラスミドｐＢＲ３２２（ベーリンガー
ーマンハイム社販売）のＩ、ｑスレモが制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩによる切向点が１箇所であることに着目し、両者を
ＥｃｏＲ■で切断した後Ｔ４ＤＮＡ連結酵素で再結合さ
せてプラスミドｐ ８ Ｌ２を得、本発明に至ったもの
である。
本発明にかかるシラスミドｐｓＬ ２は、ｐ８Ｉｊ１の
部分、ｐＢＲろ２２の部分にそれぞれのドライブユニッ
トを有しておシ、乳酸菌の中でも大腸菌の中でも自律的
に増殖することができるため、乳を波間と大腸菌の間を
往復するシャトルベクターとしての使用かり能である。
部分、ｐＢＲろ２２の部分にそれぞれのドライブユニッ
トを有しておシ、乳酸菌の中でも大腸菌の中でも自律的
に増殖することができるため、乳を波間と大腸菌の間を
往復するシャトルベクターとしての使用かり能である。
現状では、遺伝子組替え技術の適用に関する研９℃が最
も進んでいる宿主は大腸菌であり、既に大腸菌の中にク
ローニングされている遺伝子は、インシュリン、ソマト
スフチン、セクレチン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホ
ルモン、インターフェロン、エンドルフィン、凝乳酵素
、レンニ／、ヒト血清アルブミン、ＢＷ肝炎のＩＩ ｎ
ｓ Ｙｊｌ’、原タンノξり、免疫グロブリン等々で
枚挙ｖＣ辿がないが、大腸菌を宿主とする遺伝子組替え
技術で最も繁用されているプラスミドベクターがｐＢＨ
，３２２である点を考庫すれば、本発明のプラスミドｐ
８Ｌ２は大腸菌での成果を乳酸菌へ適用塾せる道を開く
ものであって、丸い伯米産業の発展に及は′す〃ノ果は
極めて甚大である。
も進んでいる宿主は大腸菌であり、既に大腸菌の中にク
ローニングされている遺伝子は、インシュリン、ソマト
スフチン、セクレチン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホ
ルモン、インターフェロン、エンドルフィン、凝乳酵素
、レンニ／、ヒト血清アルブミン、ＢＷ肝炎のＩＩ ｎ
ｓ Ｙｊｌ’、原タンノξり、免疫グロブリン等々で
枚挙ｖＣ辿がないが、大腸菌を宿主とする遺伝子組替え
技術で最も繁用されているプラスミドベクターがｐＢＨ
，３２２である点を考庫すれば、本発明のプラスミドｐ
８Ｌ２は大腸菌での成果を乳酸菌へ適用塾せる道を開く
ものであって、丸い伯米産業の発展に及は′す〃ノ果は
極めて甚大である。
本発明プラスミドｐｓＴ、２中のｐｓＩ看に由来する部
分の６瑞基配列を認識するｔｌｆｌｌ隅師索に対する反
応性は先述した表２に示したフ１ｕりでめり、Ｐｓｔｌ
、Ｄａｍｎ ｌ 、 １ｉｉｎｄ ｉｌｌ 、 Ｓａｌ
ＩなどｐＢＩＬ３２２に由来する部分をそれぞれただ
１箇所切断する制限酵素に対しては１つたく切曲を受け
ないため、プラスミドｐＳＬ ２においてもシラスミド
ｐＢＲ３２２と同様にＰｓｔｌ切断点、ＢａｍＨｌ切断
点、Ｈｉｎｄ１１１９Ｊｌｆｆｉ点、８ａｌ ｌ切断
点を異２ｇ Ｄ Ｎ Ａのクローニング部位とすること
が可能となったものである。
分の６瑞基配列を認識するｔｌｆｌｌ隅師索に対する反
応性は先述した表２に示したフ１ｕりでめり、Ｐｓｔｌ
、Ｄａｍｎ ｌ 、 １ｉｉｎｄ ｉｌｌ 、 Ｓａｌ
ＩなどｐＢＩＬ３２２に由来する部分をそれぞれただ
１箇所切断する制限酵素に対しては１つたく切曲を受け
ないため、プラスミドｐＳＬ ２においてもシラスミド
ｐＢＲ３２２と同様にＰｓｔｌ切断点、ＢａｍＨｌ切断
点、Ｈｉｎｄ１１１９Ｊｌｆｆｉ点、８ａｌ ｌ切断
点を異２ｇ Ｄ Ｎ Ａのクローニング部位とすること
が可能となったものである。
第２図の方法で作製された本発明のシラスミドｐ８Ｌ２
の調Ｈは、細胞を塩化カルシウム溶成で処理するマンテ
ル（Ｍａｎｄｅｌｌとヒガ（山ｇａｌらの形質転換法（
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ５５．１５９ （１９
７０１で大腸菌にクローニングし、クロラムフェニコー
ルを加えて−Ｈコピー数を増幅させた後、通常のシラス
ミド調製法を用いて行うものである。
の調Ｈは、細胞を塩化カルシウム溶成で処理するマンテ
ル（Ｍａｎｄｅｌｌとヒガ（山ｇａｌらの形質転換法（
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ５５．１５９ （１９
７０１で大腸菌にクローニングし、クロラムフェニコー
ルを加えて−Ｈコピー数を増幅させた後、通常のシラス
ミド調製法を用いて行うものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
（１）プラスミドｐ ｓ ｒ、 １の調製ストレプトコ
ッカス・ラクチス階１２８ＦＩＩＭＦ −６６６６をト
リプトン０５％、酵母エギス［］、２５％、ゼラチン［
Ｊ、２５％、塩化ナトリウム０４％、酪酸ナトリウム［
Ｊ、１５％、グルコース１．０％より成るエリカー培地
ｉｏｏｍ／、で６０°０％１８時間静置培養し、これを
集菌して菌体を洗浄した陵２５襲スクロース、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む５０ ｍ Ｍ ）リス１ｍ ｆａｔ 緩衝
液（ｐＨ８，Ｏ＋ ２．５ ｍ１Ｖ（Ｊｔ。
ッカス・ラクチス階１２８ＦＩＩＭＦ −６６６６をト
リプトン０５％、酵母エギス［］、２５％、ゼラチン［
Ｊ、２５％、塩化ナトリウム０４％、酪酸ナトリウム［
Ｊ、１５％、グルコース１．０％より成るエリカー培地
ｉｏｏｍ／、で６０°０％１８時間静置培養し、これを
集菌して菌体を洗浄した陵２５襲スクロース、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む５０ ｍ Ｍ ）リス１ｍ ｆａｔ 緩衝
液（ｐＨ８，Ｏ＋ ２．５ ｍ１Ｖ（Ｊｔ。
濁し、卵白リゾチーム（３回結晶、シグマ社製）’ｅ
Ｏ，２５Ｍ トリス塩酸緩（ｍｉ液（ｐｌｔ ｓ、 ０
）に１０ｍｙ／ａの磯度となるように俗解した液１．
６ ｍｌを加え、６７”Ｃで２０分間インキュベートし
た後Ｓ Ｄ Ｓ（ドテシル硫酸ソーダ）を１％加えて溶
菌し、ｓＭ ＬＭ化ナナトリウム１７５ａ加えて４゛０
で一夜放ｒｔｅこれを４°Ｃ下３０，００ Ｏｒｐｍで
６０分間遠心し、上清をリボヌクレアーゼ（５回結晶、
シグマ社製）で処理（３７“（コ、２時間）し、フェノ
ールで除タンパクを行なった後ニーデルでフェノールを
除去した水層に５Ｍ鳩化すトリウムｉｉ、、’ｉ。
Ｏ，２５Ｍ トリス塩酸緩（ｍｉ液（ｐｌｔ ｓ、 ０
）に１０ｍｙ／ａの磯度となるように俗解した液１．
６ ｍｌを加え、６７”Ｃで２０分間インキュベートし
た後Ｓ Ｄ Ｓ（ドテシル硫酸ソーダ）を１％加えて溶
菌し、ｓＭ ＬＭ化ナナトリウム１７５ａ加えて４゛０
で一夜放ｒｔｅこれを４°Ｃ下３０，００ Ｏｒｐｍで
６０分間遠心し、上清をリボヌクレアーゼ（５回結晶、
シグマ社製）で処理（３７“（コ、２時間）し、フェノ
ールで除タンパクを行なった後ニーデルでフェノールを
除去した水層に５Ｍ鳩化すトリウムｉｉ、、’ｉ。
谷量加え、２倍谷値の冷エタノールを加えて一２０°Ｃ
下に一晩〆ｆ４’ ｒＭ ｔ、、これを１２．［） ［
］ Ｏｒｐｍで運心して得られた沈殿をＴＥＳ緩衝液（
３０ｍ Ｍ） ’Ｊス塩酸、５ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、５
０ ｍ Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８，０１，１００μ！
に忠濁し、低融点アガロース（半片化学薬品に、 Ｋ、
販売）を用いた電気泳動を行ってプラスミドｐ Ｓ Ｌ
１ を単離した。
下に一晩〆ｆ４’ ｒＭ ｔ、、これを１２．［） ［
］ Ｏｒｐｍで運心して得られた沈殿をＴＥＳ緩衝液（
３０ｍ Ｍ） ’Ｊス塩酸、５ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、５
０ ｍ Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８，０１，１００μ！
に忠濁し、低融点アガロース（半片化学薬品に、 Ｋ、
販売）を用いた電気泳動を行ってプラスミドｐ Ｓ Ｌ
１ を単離した。
（２）プラスミドｐ ８ Ｌ ２の作製シラスミドｐ
８ ＴＪ １及び市販のシラスミドｐＢＲ５２２（ベー
リンガーーマンノヘイム社）を１００ｍ Ｍ トリス塩
酸ｊ ｐ１１７．５１７ ｍＭＭ化マグネシウム、５０
ｍＭｊ品化ナトリウム、７ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルより成る反応液中でそれぞれ谷別別に制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造に、、に、販売）で消化（３７’０．１時
間）し、一旦エタノール沈殿させて脚状となったＤＮＡ
を回収した後、［Ｊ、 １ ｍ ＭのＥＤＴＡ を含む
１ ｍ Ｍ トＩＪス塩酸緩衝液２０μｅにそれぞれ懸
濁させ、０．６６ ｍ Ｍ Ａ、ＴＰ （オＩＪ エン
タル酵母工業に、 Ｋ、販売１６６ ｍ Ｍ層化マグネ
シウム、１００ｍＭジチオスレイトール（）ｆｌｌ光純
薬に、に、、販売）を言む６６０ ｍ ｈ（） ’）ス
堪酸綾備液１０μ！を加え、円蒸Ｗイ水を６０μｅ ／
Ｊｕ＋えた陵Ｔ４ＤＮＡ連結酵素（宝γ西造に、、 Ｋ
、販売）を０．２ユニット加えて１Ｄ”０で一晩静置し
てシラスミドｐｓＬ ２を作製した。
８ ＴＪ １及び市販のシラスミドｐＢＲ５２２（ベー
リンガーーマンノヘイム社）を１００ｍ Ｍ トリス塩
酸ｊ ｐ１１７．５１７ ｍＭＭ化マグネシウム、５０
ｍＭｊ品化ナトリウム、７ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルより成る反応液中でそれぞれ谷別別に制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（宝酒造に、、に、販売）で消化（３７’０．１時
間）し、一旦エタノール沈殿させて脚状となったＤＮＡ
を回収した後、［Ｊ、 １ ｍ ＭのＥＤＴＡ を含む
１ ｍ Ｍ トＩＪス塩酸緩衝液２０μｅにそれぞれ懸
濁させ、０．６６ ｍ Ｍ Ａ、ＴＰ （オＩＪ エン
タル酵母工業に、 Ｋ、販売１６６ ｍ Ｍ層化マグネ
シウム、１００ｍＭジチオスレイトール（）ｆｌｌ光純
薬に、に、、販売）を言む６６０ ｍ ｈ（） ’）ス
堪酸綾備液１０μ！を加え、円蒸Ｗイ水を６０μｅ ／
Ｊｕ＋えた陵Ｔ４ＤＮＡ連結酵素（宝γ西造に、、 Ｋ
、販売）を０．２ユニット加えて１Ｄ”０で一晩静置し
てシラスミドｐｓＬ ２を作製した。
（６）シラスミドＩ）ＳＬ２の調製
エシェリヒア・コリＣ−６００株（Ａ ｉ” ＣＣ３３
５２５１をトリプトン１％、酵母エキス０５チ、塩化ナ
トリウム０５％より成るり、Ｔ’ｆＡ地ＣＰ１１７．２
＋４０ｆｆｌＪで振とり培養し、対数増殖中期まで生育
させた後水冷下で以下の操作を行った。
５２５１をトリプトン１％、酵母エキス０５チ、塩化ナ
トリウム０５％より成るり、Ｔ’ｆＡ地ＣＰ１１７．２
＋４０ｆｆｌＪで振とり培養し、対数増殖中期まで生育
させた後水冷下で以下の操作を行った。
３．００ Ｏｒｐｍで１０分間遠心して集菌し、０．１
Ｍ塩化カルシウム、０２５Ｍｎ化カリウム、５ｍＭ塩化
マグイシウムを含む５ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液Ａ （ｐ
Ｈ７、６＋ ２３ａｕに懸濁し、３．００ Ｏｒｐｍで
１０分間遠心して集菌し、Ｕ、ＩＭｍ化ナトナトリウム
ｍ Ｍ塩化マグネシウムを含む５ ｍ Ｍ ）リス塩
酸緩衝液Ｂ （Ｐ”７．６１２０ｍ１Ｋ書懸濁し、ろ、
０００ｒｐｍで１０分間遠心して集関し、５ｍＭ）！Ｊ
ス塩酸緩衝液Ａ１６ａＪに再懸濁し、０ ”Ｏで３００
分間静置た後３．０００ ｒｐｍで５分間迷心して集菌
し。
Ｍ塩化カルシウム、０２５Ｍｎ化カリウム、５ｍＭ塩化
マグイシウムを含む５ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液Ａ （ｐ
Ｈ７、６＋ ２３ａｕに懸濁し、３．００ Ｏｒｐｍで
１０分間遠心して集菌し、Ｕ、ＩＭｍ化ナトナトリウム
ｍ Ｍ塩化マグネシウムを含む５ ｍ Ｍ ）リス塩
酸緩衝液Ｂ （Ｐ”７．６１２０ｍ１Ｋ書懸濁し、ろ、
０００ｒｐｍで１０分間遠心して集関し、５ｍＭ）！Ｊ
ス塩酸緩衝液Ａ１６ａＪに再懸濁し、０ ”Ｏで３００
分間静置た後３．０００ ｒｐｍで５分間迷心して集菌
し。
５ ｍ Ｍ ト！Ｊス塩酸緩衝液Ａ ［Ｊ、 ４ ｍｌ
に再懸濁してコンピテントセルとし、その［Ｊ、 ２
ｍｌと実施例１の（２）で作製したシラスミドｐｓＬ
２含有液２０μ！を混合し、０ ’Ｏ下で６０分間靜直
置後７℃で２分間静置し、Ｌ培地４ｍｌを添加して３７
°０で６００分間静置、アンピシリン５０μｆ ／ ｍ
ｅを含むＬ寒天用地上で６７°Ｃで培養を行うことによ
って形質転換体を得、プラスミドｐ８Ｌ ２をクローニ
ングしたエシェリヒア・コリＣ−６００株を得、該菌株
をＭ９−カザミｙ酸培地（０，４％グルコース、０１％
塩化アンモニウム、０６％リン酸二ナトリウム、０６９
ｂリン酸−カリウム、０５％塩化ナトリウム、ｔｍＭｔ
＆酸マグネシウム、０．５％カザミノ酸、ｐＨ７，２１
に接抽し１．Ｉ＠養液の濁度がＬｌ、 ５ Ａ６５０と
なるまで振とり培養し、１５０μｙ７ｙのクロラムフェ
ニコールを添加して更に６７°０で１５時間振とり培養
し、これを集菌して菌体を洗浄した後’ｒＢ緩衝液（２
５ｍ Ｍ ）リス塩酸、５ ｍ ＭＥＤＴＡ、 ｐ）ｉ
１３．Ｑ ｌに懸濁し、−８０℃のディープフリーザー
中に２０分間静ｗ後１０°０の水浴中に２００分間静置
、２Ｍ塩化カリウムを含むＴＥ緩衝液０．４ ｍを加え
、卵白リゾチーム（３回結晶、シグマ社製）をＴＥ緩衝
液に１５ ｍ９／ ｍｔの良度とガるように溶解した液
Ｑ、 ｉ ｍ、ｌを加え、Ｄ”Ｃ下に３００分間静置、
−８０℃のディープフリーザー中に２０分間靜直置後０
°０の水浴中に２００分間静置た後４′Ｃ下３５．００
０ ｒｐｍで６０分間遠心し、上ｆｐｔをリボヌクレア
ーゼ（５回結晶、シグマ社製）テ処理（３７°０．２時
間）シ、フェノールで除タンパクを行った後エーテルで
フェノールを除去した水層に５ Ｍ ｊ；＝化す） Ｉ
Ｊウムを１／１０谷前加え、２倍容量の冷エタノールを
加えて、−２０−０下に一晩静置し、これを１２．［］
００ ｒｐｍで遠心して得られた沈殿をＴＦ３Ｓ緩衝液
（３０ｍ Ｍ ト’）ス堪酸、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、ｐ１４８．０１１００μｋに懸濁し
、低融点アガロース（牛丼化学楽品に、 Ｋ、販売）を
用いた電気泳動を行ってプラスミドｐ８Ｌ ２を調製し
た。
に再懸濁してコンピテントセルとし、その［Ｊ、 ２
ｍｌと実施例１の（２）で作製したシラスミドｐｓＬ
２含有液２０μ！を混合し、０ ’Ｏ下で６０分間靜直
置後７℃で２分間静置し、Ｌ培地４ｍｌを添加して３７
°０で６００分間静置、アンピシリン５０μｆ ／ ｍ
ｅを含むＬ寒天用地上で６７°Ｃで培養を行うことによ
って形質転換体を得、プラスミドｐ８Ｌ ２をクローニ
ングしたエシェリヒア・コリＣ−６００株を得、該菌株
をＭ９−カザミｙ酸培地（０，４％グルコース、０１％
塩化アンモニウム、０６％リン酸二ナトリウム、０６９
ｂリン酸−カリウム、０５％塩化ナトリウム、ｔｍＭｔ
＆酸マグネシウム、０．５％カザミノ酸、ｐＨ７，２１
に接抽し１．Ｉ＠養液の濁度がＬｌ、 ５ Ａ６５０と
なるまで振とり培養し、１５０μｙ７ｙのクロラムフェ
ニコールを添加して更に６７°０で１５時間振とり培養
し、これを集菌して菌体を洗浄した後’ｒＢ緩衝液（２
５ｍ Ｍ ）リス塩酸、５ ｍ ＭＥＤＴＡ、 ｐ）ｉ
１３．Ｑ ｌに懸濁し、−８０℃のディープフリーザー
中に２０分間静ｗ後１０°０の水浴中に２００分間静置
、２Ｍ塩化カリウムを含むＴＥ緩衝液０．４ ｍを加え
、卵白リゾチーム（３回結晶、シグマ社製）をＴＥ緩衝
液に１５ ｍ９／ ｍｔの良度とガるように溶解した液
Ｑ、 ｉ ｍ、ｌを加え、Ｄ”Ｃ下に３００分間静置、
−８０℃のディープフリーザー中に２０分間靜直置後０
°０の水浴中に２００分間静置た後４′Ｃ下３５．００
０ ｒｐｍで６０分間遠心し、上ｆｐｔをリボヌクレア
ーゼ（５回結晶、シグマ社製）テ処理（３７°０．２時
間）シ、フェノールで除タンパクを行った後エーテルで
フェノールを除去した水層に５ Ｍ ｊ；＝化す） Ｉ
Ｊウムを１／１０谷前加え、２倍容量の冷エタノールを
加えて、−２０−０下に一晩静置し、これを１２．［］
００ ｒｐｍで遠心して得られた沈殿をＴＦ３Ｓ緩衝液
（３０ｍ Ｍ ト’）ス堪酸、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、ｐ１４８．０１１００μｋに懸濁し
、低融点アガロース（牛丼化学楽品に、 Ｋ、販売）を
用いた電気泳動を行ってプラスミドｐ８Ｌ ２を調製し
た。
第１図は本発明のプラスミドｐｓＬ ２の制限酵素によ
る切断箇所を示す図で、第２図は本発明のプラスミドｐ
ｓｒ、２の作製系統図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男
る切断箇所を示す図で、第２図は本発明のプラスミドｐ
ｓｒ、２の作製系統図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）分子量が約４．４Ｘ１０タルトンで、２本鎖壊状
ＤＮＡであって５分子内にアンピシリン剛性遺伝子及び
テトラザイクリン耐性遺伝子を壱し、制限酵素による切
断箇所が第１図に示されるとおりであるプラスミドｐ
Ｓ Ｌ ２゜ （２） プラスミドｐ８Ｌ ２を大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ
にクローニングし、該大腸菌ヲクロラムフエニコール存
在下で培養することによって、プラスミドｐｓＬ２の細
胞内宮量を＾めることを特徴とするプラスミドｐ８Ｌ２
の調製法。 （６）大腸ｉ％ｌＢ、ｃａｌｉがＥ、ｃｏ目Ｃ６００株
であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のプ
ラスミドｐ８Ｌ２の調製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57219314A JPS59109178A (ja) | 1982-12-16 | 1982-12-16 | プラスミドｐＳＬ２及びその調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57219314A JPS59109178A (ja) | 1982-12-16 | 1982-12-16 | プラスミドｐＳＬ２及びその調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59109178A true JPS59109178A (ja) | 1984-06-23 |
Family
ID=16733539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57219314A Pending JPS59109178A (ja) | 1982-12-16 | 1982-12-16 | プラスミドｐＳＬ２及びその調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59109178A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107164505A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-15 | 苏州乔纳森新材料科技有限公司 | 一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用 |
-
1982
- 1982-12-16 JP JP57219314A patent/JPS59109178A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107164505A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-15 | 苏州乔纳森新材料科技有限公司 | 一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0057976B1 (en) | a process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| CN102181469A (zh) | 枯草芽孢杆菌表面展示人血清白蛋白重组芽孢及其制备方法 | |
| GB2033905A (en) | Bacterial preparation of proteins | |
| CN116333957A (zh) | 一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| SU1431681A3 (ru) | Способ получени @ -галактозидазы и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI-продуцент @ -галактозидазы | |
| JPH10503643A (ja) | 微生物中に遺伝物質を導入する方法およびその方法によってえられる形質転換体 | |
| KR910001807B1 (ko) | 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법 | |
| FR2559781A1 (fr) | Nouveau vecteur plasmidique hybride de e. coli conferant le pouvoir de faire fermenter le saccharose et son procede de preparation | |
| CN111117942B (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| EP0037273B1 (en) | Modification of micro-organisms | |
| CN114703117B (zh) | 一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶 | |
| CN107805620B (zh) | 一株基因工程菌乳酸乳球菌及其应用 | |
| JPS59109178A (ja) | プラスミドｐＳＬ２及びその調製法 | |
| US20040014221A1 (en) | Plasmid originated from bifidobacterium, recombinant expression vector using the plasmid and transformation method | |
| CN109628366B (zh) | 一种提高乳酸菌抗酸胁迫能力的方法 | |
| US4376164A (en) | Process for preparing broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| US4690897A (en) | Method for transformation of anaerobic microorganisms | |
| JPH02312590A (ja) | プラスミドｐＴＹ１ | |
| Wang et al. | Analysis of the physical and functional characteristics of cell clumping in lactose-positive transconjugants of Lactococcus lactis ssp. lactis ML3 | |
| JPS5936697A (ja) | プラスミドｐＳＬ１及びその含有菌株 | |
| NL7907345A (nl) | Werkwijze voor het bereiden van glucose isomerase. | |
| RU1770359C (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК pJDB (MSIL), обеспечивающа синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей SасснаRомUсеS ceReUISIaL, способ ее получени и штамм дрожжей SасснаRомYсеS ceReUISIaL - продуцент интерлейкина-2 человека | |
| KR900004942B1 (ko) | 펩티드(peptide)의 제조방법 | |
| JPH0530967A (ja) | ヒト・リゾチームの製造法 | |
| CN117721054A (zh) | 一种提高乳酸菌在盐胁迫下生物膜产量的方法 |