CN108004334A - 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的引物，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.8所示。本发明属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对饮用水中上述四种致病菌的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于检测饮用水标准中的致病菌指标。

Description

检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试 剂盒及方法
技术领域
本发明属于基因工程检测技术领域，尤其涉及检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法。
背景技术
民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱，而饮用水质量安全更是重中之重。近年来，随着疾控预防的研究深入，国家标准、行业标准，各级监抽细则，均明确了饮用水中致病菌的检测指标。当前，针对普通饮用水，该类指标主要包括大肠菌群Coliformbacteria、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，针对饮用矿泉水，该类指标主要包括大肠菌群Coliform bacteria、粪链球菌Enterococcus faecalis、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、产气荚膜梭菌Clostridium perfringens，均要求零检出。
标准方法上，上述致病菌的检测均采用传统培养方法，存在试剂和培养基种类多达十多种、全程基本为手工操作、阴性检测时间至少2d和阳性检测时间可长达5至10d、菌落观察鉴别和生化反应鉴定受人为因素影响较大等情况。随着分子生物学在微生物学中的深入运用，使用PCR技术检测饮用水中致病菌也成为可选方法之一。
第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。
第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步。相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。
多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。
涉及致病菌检测的PCR技术，已有较广泛的报道，但多为普通PCR方法和单重荧光PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如专利申请200410091917.3《多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法》、200810071105.0《食源性致病菌的检测方法》、201410057135.1《一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法》等。这些专利申请在检测样品和检测对象上与饮用水标准要求相差较大，且存在试剂种类繁多、操作步骤复杂等问题。因此，提供一种适于标准要求和便于操作判定的饮用水中致病菌检测的多重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明对大肠菌群Coliform bacteria、粪链球菌E.faecalis、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、产气荚膜梭菌C.perfringens设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对饮用水中致病菌的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点。
首先明确检测对象Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens的分类学地位。由于大肠菌群是卫生学概念而非分类学概念，以学术报道和日常检测看，基本以大肠埃希氏菌Escherichia coli、费氏柠檬酸杆菌Citrobacterfreundii、产气肠杆菌Enterobacter aerogenes、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae为主要代表株，因此在设计鉴别大肠菌群的引物和探针时，以准确鉴别上述4种菌为准。另据伯杰氏系统细菌学手册(Taxonomic outline of the prokaryotes,Bergey’s manual ofsystematic bacteriology,second edition,release 5.0,May 2004)，E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens等在分类学上已有明确定位，可进行针对性鉴定。
其次建立前处理方法：参考GB 4789《食品安全国家标准食品微生物学检验》系列标准和GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》及日常检测经验，结合本方法检出限，设立两种前处理方法以供选用：若预计待测水样的污染程度较高，可选择滤膜洗脱法处理后直接检测，缩短总检测时间至1d；若预计待测水样的污染程度较低，可选择滤膜增菌法处理后再行检测，提高检出效率，总检测时间约2–3d。
进而确立检验方法：在细菌分类学领域，核糖体16S rRNA基因为细菌基因组的高度保守序列，普遍用于鉴定细菌属、种。首先进行大肠菌群的特异性引物探针设计，检索NCBI的Genbank后获得Escherichia coli、Citrobacter freundii、Enterobacteraerogenes、Enterobacter cloacae核糖体16S rRNA基因序列数十条，首先用Lasergene7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再通过Oligo 7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，发明人发现在特定位点可设计该4种菌的一对通用引物和一条通用探针，该探针选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，相对TAMRA、BHQ等特异性更强，能有效避免单碱基差异带来的非特异性扩增，确保鉴定结果准确。
检索NCBI的Genbank后获得E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens核糖体16SrRNA基因序列数十条，首先用Lasergene 7.1.0中的MegAlign软件比对出保守序列，再通过Oligo7.0.1和NCBI的Primer-Blast验算后进行筛选，发明人发现其不适用于一对通用引物和三条特异探针的设计方式，可通过设计三对通用引物和三条特异探针的方式进行检测，并同样选用NFQ-MGB荧光淬灭基团，最终通过实践进行验证。
上述引物和探针的检测位点，以NCBI的Genbank中相应核糖体16S rRNA序列举例如下：
(1)Escherichia coli序列MF784285.1的715bp至793bp；
(2)Citrobacter freundii序列M59291.1的773bp至851bp；
(3)Enterobacter aerogenes序列AB099402.1的741bp至819bp；
(4)Enterobacter cloacae序列AF157695.1的727bp至805bp；
(5)E.faecalis序列AB012212.1的748bp至829bp；
(6)P.aeruginosa序列AF157689.1的927bp至1023bp；
(7)C.perfringens序列M59103.1的713bp至794bp。
相对当前的标准方法GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》存在试剂和培养基种类多达十多种、全程基本为手工操作、阴性检测时间至少2d和阳性检测时间可长达5至10d、菌落观察鉴别和生化反应鉴定受人为因素影响较大等情况，本发明提供的方法具有试剂种类单一、人工操作时间仅0.5–1h、检测时间短至1d(滤膜洗脱检测法)或2–3d(增菌培养检测法)、通过仪器进行鉴定等优点。
相对当前的标准普通PCR方法和荧光PCR方法，以SN/T 2206.12-2014《化妆品微生物检验方法第12部分：绿脓杆菌PCR法》(其中绿脓杆菌即铜绿假单胞菌)、SN/T 1869-2007《食品中多种致病菌快速检测方法PCR法》、SN/T 1870-2016《出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法》为例，本发明提供的方法具有如下特点：①检测对象不同：目前对于饮用水中这四种致病菌的并无标准的PCR检测方法，本方法提供了一定支撑；②检测方法不同，多重荧光PCR相对普通PCR和荧光PCR，具有检出限低、效率更高、环境友好等优点，具体可见背景技术中相关描述。③细节优化不同，SN/T 1870-2016中探针大部分在25至30bp、最长至34bp，荧光淬灭基团为TAMRA；本方法中探针均为20bp以下，荧光淬灭基团为NFQ-MGB；其中，探针序列在15–20bp时，相对25bp以上长度，其错配率较低；NFQ-MGB本身无荧光信号，相对本身具有荧光信号的TAMRA，其灵敏度更高。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组及探针组如表1和表2。
表1 检测基因的引物及探针组
表2 探针修饰基团
进一步地，本发明提供检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，包括上述的PCR引物组、上述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照。所述荧光PCR试剂为常规市售产品。
优选地，所述阳性对照为用所述的引物组进行扩增，并用所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为105copies/μL级。所述阴性对照为所述四种致病菌以外的细菌DNA。所述PCR试剂盒还可以进一步包括空白对照，空白对照为三蒸水。
优选地，所述Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens的上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/L。
此外，本发明还提供检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR方法，包括如下步骤：
①将水样(至少1L体积)过0.22μm滤膜；若预判样品致病菌污染较重，直接用1mL磷酸缓冲液或3d H2O洗脱滤膜上富集微生物，提取DNA；若预判样品致病菌污染较轻，将滤膜置于相应致病菌选择性液体培养基，增菌后提取DNA；
②建立包括权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2所述的PCR探针组的四重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃20-120s或10-15min；95℃5-60s，60℃20-120s；40 cycle并收集荧光信号。
多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50μL体系进行反应体系的配制，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定。
优选地，所述判断条件包括：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行②的致病菌检测。
②结果判定：水样的FAM或/和VIC或/和NED或/和Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的大肠菌群或/和粪链球菌或/和铜绿假单胞菌或/和产气荚膜梭菌；若上述一种或多种荧光无信号及对数增长，且Ct值≥40.0，则不含相应的致病菌；若30.0<Ct值<40.0时，增加模板量复检，如果Ct值≥40.0，则检测结果为阴性，如果Ct值<40.0，则判定检测结果为阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明对Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，特异性好，检测灵敏度高，可满足饮用水的致病菌检测要求。
(2)本发明提供的检测方法有利于饮用水中上述四种致病菌的充分检出，相对现有多重PCR方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为105级时，定量标准误差在104级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μL级)的优点；相对荧光PCR方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通PCR方法，兼具上述两种优点。
(3)本发明的试剂盒在选用适于四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装时，选择带热敏Taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；所述荧光PCR试剂中包括ROX染料，对于需要ROX染料的多重荧光PCR仪可提升检测准确性。
(4)本发明提供的引物、探针、试剂盒和方法已应用于贵州省产品质量监督检验院日常相关检测中(检出限103CFU/L水样)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间3/4以上、节约试剂成本3/4以上，具有较好的实用价值。
附图说明
图1：本发明实施例一的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。
实施例一 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒的构建及验证
①引物组及探针组：如表1和表2所示，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，将引物和探针干粉稀释至100μmol/L作为储备液，按照表3配制成10μmol/L作为使用液。
表3 100μmol/L储备液配制为10μmol/L使用液
②荧光PCR试剂：常见市售荧光PCR试剂，本实施例选择Path-IDTM qPCRMaster Mix。
③阳性对照：取全部引物储备液，分别稀释至10μmol/L。分别接种Coliformbacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens至BGLB液体培养基、KF链球菌液体培养基、CN液体培养基、SPS液体培养基等增菌，待菌液浑浊后提取DNA，用稀释好的引物和普通PCR试剂在普通PCR仪上进行扩增，将目的条带切胶回收后转入TaKaRa T-vector pMDTM20载体，用感受态E.coli细胞JM109复制，提取pMD-20T质粒，稀释至105copies/μL级浓度。
④阴性对照：选择上述四种致病菌以外的细菌源性的DNA。
⑤空白对照：3d H2O。
⑥荧光PCR试剂选用Path-IDTM qPCR Master Mix、多通道荧光PCR仪选用ABI Quantstudio 5，验证样品特征如表4、按表5进行反应液配制、按表6进行反应。
表4 样品特征
表5 反应体系
表6 反应条件
注*：检测荧光信号。
⑦反应结果如表7所示：
表7 样品检测结果
⑧验证结果：将本实施例的增菌液按照GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》进行检验，实验结果一致；本试剂盒送至省内同行业检测单位，实验结果一致。通过阳性对照、加标对照、阴性对照、空白对照的设置，表明试剂盒成分有效，且特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本。
实施例二 省级环境监测风险样品——地表水样品的检测
从贵州省环科院获赠一份地表水样品，肉眼可见其较为浑浊，略有少许沉淀。取1L样品用外购DNA提取试剂盒(MobioDNA Isolation Kit及其0.22μm滤膜)提取DNA，DNA纯度为OD260/OD280＝1.75、浓度为5.13ng/μL，-20℃保存。之后将DNA用柱膜浓缩管(Millipore Microcon DNA fast flow(PCR grade))浓缩至50ng/μL进行检测，引物组、探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，荧光试剂选择ABITaqManTM Environmental Master Mix 2.0，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。
检测结果见表8：①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行饮用水致病菌检测。②样品FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品中含有Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens。③比对结果：按照GB8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》检验样品，结果一致。
表8 实验结果(实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线)
实施例三 省级食品监抽样品——桶装饮用水和瓶装饮用天然矿泉水样品的检测
调取省级食品监抽中一个桶装饮用水样品(设为#1样品)和一个瓶装饮用天然矿泉水样品(设为#2样品)，各取1L样品过0.22μm滤膜，将滤膜片剪成4份，分别接种至BGLB液体培养基、KF链球菌液体培养基、CN液体培养基、SPS液体培养基，按培养基说明书要求温度和时间进行增菌。各取250μL菌液混合成1mL样品，使用外购DNA提取试剂盒(QiagenMagAttract Hmw DNA kit)在小型磁力架(Qiagen MagAttract Magnetic Rack)上提取样品DNA，#1样品和#2样品DNA纯度均为OD260/OD280＝1.79、浓度分别为379.40ng/μL和324.01ng/μL，-20℃保存。引物组、探针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光PCR试剂为Multiplex PCR Kit，上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。
检测结果见图1和表9：
图1中曲线1至4、曲线5至8、曲线9至12分别为阳性对照、阴性对照、空白对照的FAM、VIC、NED、Cy5荧光信号，曲线13至16、曲线17至20分别为#2样品和1#样品的FAM、VIC、NED、Cy5荧光信号。
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行饮用水致病菌检测。
②#1样品FAM、VIC、NED、Cy5均无荧光对数增长，且Ct值≥40.0，表明该样品中不含Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens。
③#2样品FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品中含有Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens。
④比对结果：按照GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》检验样品，结果一致。
表9 实验结果(实测Ct值及有无荧光信号对数增长曲线)
注：按产品标准和监抽细则，普通饮用水无需检测E.faecalis和C.perfringens。
综上所述，本发明提供的四重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法仅对饮用水中Coliform bacteria、E.faecalis、P.aeruginosa、C.perfringens目的基因进行特异性扩增，并在扩增中产生荧光信号，可有效适用于饮用水产品中致病菌检测，与相关标准检测方法的结果相符，节约了检测时间，降低了检测成本，具有较好的实用价值。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 贵州省产品质量监督检验院
<120> 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法
<130> /
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 1
tggggagcaa acaggattag a 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 2
acgcctcaag ggcacaac 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 3
tctggtctgt aactgacgct ga 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
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tcgtttacgg cgtggactac 20
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<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 5
gtggagcatg tggtttaatt cg 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 6
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<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(RenGongXuLie)
<400> 12
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Claims (8)

1.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四对引物：大肠菌群的上游引物为Seq.ID No.1，下游引物为Seq.ID No.2；粪链球菌的上游引物为Seq.ID No.3；下游引物为Seq.ID No.4；铜绿假单胞菌的上游引物为Seq.ID No.5；下游引物为Seq.ID No.6；产气荚膜梭菌的上游引物为Seq.ID No.7；下游引物为Seq.ID No.8。
2.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR探针组，其特征在于：包括针对大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的四重荧光PCR探针组：大肠菌群的探针为Seq.IDNo.9，5’端用FAM荧光激发基团修饰；粪链球菌的探针为Seq.ID No.10，5’端用VIC荧光激发基团修饰；铜绿假单胞菌的探针为Seq.ID No.11，5’端用NED荧光激发基团修饰；产气荚膜梭菌的探针为Seq.ID No.12，5’端用Cy5荧光激发基团修饰，所述探针3’端分别用NFQ-MGB荧光淬灭基团修饰。
3.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照、阴性对照。
4.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为用权利要求1所述的引物组进行扩增，并用权利要求2所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为105copies/μL级。
5.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为所述四种致病菌以外的细菌DNA。
6.根据权利要求3所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌的上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/L。
7.检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：
①将水样过0.22μm滤膜，洗脱滤膜富集微生物并提取DNA，或将滤膜置于待测致病菌选择培养基增菌后提取DNA；
②建立包括权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2所述的PCR探针组的四重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃ 20s–2min或10–15min；95℃ 5–60s，60℃ 20s–2min；40cycle并收集荧光信号。
8.根据权利要求7所述的检测饮用水中四种致病菌的四重荧光PCR方法，其特征在于：所述检测结果的判断包括：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、NED、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，Ct值≥40.0，可进行②的致病菌检测；
②结果判定：水样的FAM或/和VIC或/和NED或/和Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的大肠菌群或/和粪链球菌或/和铜绿假单胞菌或/和产气荚膜梭菌；若上述一种或多种荧光无信号及对数增长，且Ct值≥40.0，则不含相应的致病菌；若30.0<Ct值<40.0时，增加模板量复检，如果Ct值≥40.0，则检测结果为阴性，如果Ct值<40.0，则检测结果为阳性。
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