CN107338294A - 一种检测4种致病菌的四重实时荧光pcr方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测4种致病菌的四重荧光PCR方法，4种致病菌是金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌；该方法具有样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照4要素；根据4种菌的16S rRNA基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体做法包括：建立检测4种菌的四重荧光PCR引物体系；建立检测4种菌的四重荧光PCR试剂盒；确定检测4种菌的四重荧光PCR鉴定方法。本发明具有标准误差小、检测时间短、可同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点，适用于食品和化妆品的致病菌检测。

Description

一种检测4种致病菌的四重实时荧光PCR方法
技术领域
本发明涉及包括基因的鉴定方法、食品和化妆品中致病菌的检测方法，特别涉及即食性食品中致病菌的检测方法。
背景技术
民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱之一。在食品和化妆品方面，尤其在即食性食品领域，致病菌检测是食品安全重要指标之一。参考疾控防治数十年来的经验积累，当前在各种产品执行标准和各级食药监监抽细则中，即食性食品的致病菌检测项目，大多为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌两种；主要成分为畜禽产品的增加单核细胞增生李斯特菌检测；主要成分为水产品的增加副溶血性弧菌检测。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在环境中普遍存在，对食品的污染几率较大，人感染后表现为局部化脓感染，也可引起肠炎、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。在我国引发的食物中毒事件有2001年4月12日无锡市锡山区所辖小学和幼儿园因课间加餐饮用了被St.aureus污染的袋装牛奶饮料导致食物中毒事件等。
肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)为沙门氏菌属主要种，包括多种常见的致病血清型(Sa.enterica serovar Choleraesuis,Enteritidis,Paratyphi,Typhi,andTyphimurium,etc.)，多见于粪便、土壤、食品、水中，存活周期5个月至2年，人感染后表现为恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻等症状，平均致死率4.1％。由于饮食习惯差异，沙门氏菌在欧美导致的食物中毒事件较多，2008年6月、2010年8月、2013年10月，在美国均有上百例以上的大规模疫情，起因有食用生西红柿、未熟鸡蛋、未熟鸡肉等。
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)在土壤、水体、植物(饲料)中广泛存在，不易被冻融，能耐受较高的渗透压；人感染后表现为轻微流感症状、呼吸急促，也可引起呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。1999年底和2011年9月分别在美国密歇根州和科罗拉多州导致了两起食物中毒事件，均有十余人死亡。
副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品，感染途径通常为食用了生鲜、未熟透或腌制的水产品，表现为食源性疾病散发病例，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。2017年5月在我国浙江检验检疫局就已确诊两例因食用生鲜海鲜导致的感染病例。
在利用分子生物学技术鉴定食品和化妆品中致病菌的方法研究中，通过PCR技术扩增并检测致病菌特异性基因，是近十余年来新兴方法之一，在学术、检测和临床上得到广泛应用。常规PCR技术在该领域具有如下几个特点：①大多数待测微生物可以提取到DNA；②设计合理的引物对可特异性地识别目的致病菌基因；③核心设备为PCR仪。
常规PCR为第一代PCR技术，而第二代PCR技术为实时定量荧光PCR(以下简称荧光PCR)。荧光PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。相对常规PCR具有如下特点：①特异性探针的加入，进一步提升了整个PCR扩增的特异性；②PCR扩增过程即检测过程，反应结束即可获得检测结果，整体检测时间更短；③核心设备为实时定量荧光PCR仪。
多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于实时定量荧光PCR的一种，首先针对多个目的基因，逐项设计特异性的引物对和探针序列；接着在多个探针上分别标记不同波长的荧光基团及淬灭基团，从而可以对一个PCR反应管内的DNA模板同时进行多个目的基因的荧光PCR扩增并发出不同波长的荧光信号，被多通道实时定量荧光PCR仪中的多波长检测器捕获，达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通的荧光PCR有如下优点：①每增加一套引物对和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍；②核心设备为多通道实时定量荧光PCR仪。
中国专利数据库中涉及致病菌检测的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如200410091917.3《多重荧光PCR-改良分子信标检测食源性致病菌的方法》、200810071105.0《食源性致病菌的检测方法》、201410057135.1《一种基于多色上转换荧光标记同时检测三种食源性致病菌的方法》等。这些专利类似于学术文章，其试剂种类繁多、操作步骤复杂、对实验人员技能要求高，更适于科研领域；对于普通检测单位来说，每年食品中致病菌检测批次数以万计、检测人员能力参差不齐，对试剂成本、操作简便化、方法标准化等方面提出了更高要求。
发明内容
本发明旨在提供一种检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)4种致病菌的四重荧光PCR方法，以解决食品和化妆品，尤其是即食性食品中上述致病菌的检测问题。
发明人提供的检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR方法，具有如下4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；发明特点是根据St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的16S rRNA基因设计引物和探针，仅能对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体的做法包括：
第一步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物和探针体系；
第二步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒；
第三步，确定检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品DNA为模板，利用所述的四重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光激发基团和MGB荧光淬灭基团的四通道及以上的多重荧光PCR仪上进行扩增和检测。
上述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系见附录：序列1为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用上游引物，序列2为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用下游引物，序列3为St.aureus特异性探针，序列4为Sa.enterica特异性探针，序列5为L.monocytogenes特异性探针，序列6为V.parahemolyticus特异性探针。序列3、4、5、6在5’端分别用FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。
上述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒成分如下所示：
①引物溶液：包括序列1、2所示引物，浓度均为20μmol/L，使用1.5mL无色透明离心管封装；
②探针溶液：包括序列3、4、5、6所示探针，浓度均为10μmol/L，使用1.5mL棕色不透明离心管封装；
③荧光PCR试剂：经验证可适用于所述的四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装，包括荧光PCR预混液、ROX染料、三蒸水；
④阳性对照：包括含有序列1和序列2所示引物扩增目的片段的St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus源性DNA，浓度均为105拷贝/μL左右，使用1.5mL无色透明离心管封装。
上述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品DNA来源：对于待测食品样品，可先取样进行增菌，然后对增菌培养物通过裂解法、试剂法、柱膜法、磁珠法等分子生物学DNA提取方法或外购商品化试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50μL体系进行反应液配制，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。
②阳性样品：当①成立时，FAM或/和VIC或/和TARMA或/和Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤35.0，表明该样品检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus。
③阴性样品：当①成立时，FAM或/和VIC或/和TARMA或/和Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus。
④疑似样品：当①成立时，FAM或/和VIC或/和TARMA或/和Cy5有荧光对数增长，且35.0<Ct值<40.0，重复检测一次。复检结果Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus；复检结果Ct值<40.0，表明该样品检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus。
上述反应液配制如表1所示：
表1反应液配方
注1：当荧光PCR仪需要ROX染料校准时加入相应浓度，否则不应添加，具体要求见荧光PCR仪说明书。
注2：阳性对照为所述试剂盒成分“阳性对照”，阴性对照为非St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus源性DNA或三蒸水，空白对照为三蒸水。
上述设置的反应条件如表2所示：
表2反应条件
注1：生物热敏抗体为20–120s；化学热敏抗体为10–15min。
注2：检测荧光信号。
本发明相对多重PCR方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为105级时，定量标准误差在104级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μL级)的优点；相对荧光PCR方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通PCR方法，兼具上述两种优点。
本发明的试剂盒在选用适于四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装时，选择带热敏Taq抗体的型号，抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；外购的试剂套装中包括ROX染料，对于需要ROX染料的多重荧光PCR仪可提升检测准确性。
本发明方法已应用于贵州省产品质量监督检验院日常相关检测中(检出限104CFU/mL)，在省内同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间3/4以上、节约试剂成本3/4以上，具有一定实用价值。
具体实施方式
实施例1自制样品
制样：在本地大型超市购买奶粉，按其说明书所示，取适量奶粉溶于100mL已灭菌的超纯水中制成复原乳，分别制作3份。
①将第1份作为检测样品：对该复原乳依次接种St.aureus(CICC21648)、Sa.enterica(CICC 21490)、L.monocytogenes(CICC 21633)、V.parahemolyticus(CICC21617)等标准菌株并均质。
②将第2份作为阴性对照：对该复原乳依次接种出血性大肠埃希氏菌O157:H7(Enterohemorrhage E.coli O157:H7,CICC 21530)、宋氏志贺氏菌(Shigella Sonnei,CICC 21535)、阪崎肠杆菌(Bntorobatersakazakii,CICC21560)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus,CICC 10876)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,CICC 33291)等标准菌株并均质。
③将第3份作为加标对照：对该复原乳依次接种St.aureus(CICC21648)、Sa.enterica(CICC 21490)、L.monocytogenes(CICC 21633)、V.parahemolyticus(CICC21617)，EHEC O157:H7(CICC 21530)、Sh.Sonnei(CICC 21535)、Bn.sakazakii(21560)、Ba.cereus(CICC 10876)、C.jejuni(CICC 33291)等标准菌株并均质。
增菌：对上述检测样品、阴性对照、加标对照进行增菌。
①将检测样品分取25mL至均为225mL的7.5％氯化钠肉汤(St.aureus增菌培养基，下同)、缓冲蛋白胨水(Sa.enterica增菌培养基，下同)、李氏增菌肉汤LB1(L.monocytogenes增菌培养基，下同)、氯化钠碱性蛋白胨水(V.parahemolyticus增菌培养基，下同)中，分别于36℃培养18h、36℃培养8h、30℃培养24h、36℃培养8h进行增菌，时间先到者放4℃冰箱暂存，全部培养结束后将4种增菌液混合均质。
②将阴性对照、加标对照按照①中增菌方法进行增菌及混合均质。
DNA提取流程：使用外购DNA提取试剂盒(ABI MagMAXTM DNA Isolation Kit)，在ABI MagMAXTM Express-96磁珠抽提仪上提取样品DNA，并于-20℃保存。
①检测样品的DNA纯度为OD260/OD280＝1.80、DNA浓度为350.51ng/μL。
②阴性对照的DNA纯度为OD260/OD280＝1.79、DNA浓度为384.08ng/μL。
③加标对照的DNA纯度为OD260/OD280＝1.81、DNA浓度为309.08ng/μL。
之后将检测样品、阴性对照、加标对照的DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为ABI Path-IDTM qPCR MasterMix，按表3进行配制，按表4设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为QuantStudio 5)。
表3反应体系
表4反应条件
注*：检测荧光信号。
检测结果见表5：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。
②检测样品：FAM、VIC、TARMA、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤35.0，表明该样品检出St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus。
③加标对照：FAM、VIC、TARMA、Cy5均有荧光对数增长，且Ct值≤35.0；结合阴性对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0的结果，表明了本申请件方法的特异性和抗干扰性。
④比对结果：与按照GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》(下同)、GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》(下同)、GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验》(下同)、GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》(下同)对样品进行St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus检测的结果相符。
表5实验结果
实施例2国家监督抽查风险监测样品---生牛乳的检测
将待测生牛乳分取25mL至均为225mL的7.5％氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水、李氏增菌肉汤LB1、氯化钠碱性蛋白胨水中，分别于36℃培养18h、36℃培养8h、30℃培养24h、36℃培养8h进行增菌，时间先到者放4℃冰箱暂存，全部培养结束后将4种增菌液混合均质。
使用外购DNA提取试剂盒(天根细菌DNA提取试剂盒)提取混合增菌液DNA，DNA纯度为OD260/OD280＝1.79、DNA浓度为262.45ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为动物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为天根Super Real PreMix(Probe)，按表6进行配制，按表7设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。
表6反应体系
表7反应条件
注*：检测荧光信号。
检测结果见表8：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。
②检测样品：FAM有荧光对数增长，且Ct值≤35.0，表明该样品检出St.aureus。VIC、TARMA、Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus。
③比对结果：与按照GB 4789.10-2016、GB 4789.4-2016、GB4789.30-2016、GB4789.7-2013对样品进行St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus检测的结果相符。
表8实验结果
实施例3省级监督抽查检测样品---冷冻鸡肉的检测
将待测鸡肉绞碎并分取25g至均为225mL的7.5％氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水、李氏增菌肉汤LB1、氯化钠碱性蛋白胨水中，分别于36℃培养18h、36℃培养8h、30℃培养24h、36℃培养8h进行增菌，时间先到者放4℃冰箱暂存，全部培养结束后将4种增菌液混合均质。
使用外购DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0)提取混合增菌液DNA，DNA纯度为OD260/OD280＝1.80、DNA浓度为280.03ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为动物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为TaKaRa Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，按表9进行配制，按表10设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。
表9反应体系
表10反应条件
注*：检测荧光信号。
检测结果见表11：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。
②检测样品：VIC有荧光对数增长，且Ct值≤35.0，表明该样品检出Sa.enterica。FAM、TARMA、Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus、L.monocytogenes、V.Parahemolyticus。
③比对结果：与按照GB 4789.10-2016、GB 4789.4-2016、GB4789.30-2016、GB4789.7-2013对样品进行St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus检测的结果相符。
表11实验结果
实施例4企业委托样品---速冻饺子的检测
配料表包括：小麦粉、水、猪肉、木耳、香菇、洋葱、大豆蛋白、酱油、虾米、芝麻油、精炼植物油、食盐、白砂糖、淀粉、香辛料、味精。将待测饺子绞碎并分取25g至均为225mL的7.5％氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水、李氏增菌肉汤LB1、氯化钠碱性蛋白胨水中，分别于36℃培养18h、36℃培养8h、30℃培养24h、36℃培养8h进行增菌，时间先到者放4℃冰箱暂存，全部培养结束后将4种增菌液混合均质。
使用外购DNA提取试剂盒(TOYOBO-Genome-)提取混合增菌液DNA，DNA纯度为OD260/OD280＝1.81、DNA浓度为263.29ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液试剂和阳性对照为本发明所述的试剂盒主要成分，阴性对照为植物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为TOYOBO ThunderbirdqPCRMix，按表12进行配制，按表13设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。
表12反应体系
表13反应条件
注*：检测荧光信号。
检测结果见表14：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。
②检测样品：TARMA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出L.monocytogenes。FAM、VIC、Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus、Sa.enterica、V.parahemolyticus。
③比对结果：与按照GB 4789.10-2016、GB 4789.4-2016、GB4789.30-2016、GB4789.7-2013对样品进行St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的检测结果相符。
表14实验结果
实施例5个人委托样品---生蚝的检测
将待测生蚝肉剪碎并分取25g至均为225mL的7.5％氯化钠肉汤、缓冲蛋白胨水、李氏增菌肉汤LB1、氯化钠碱性蛋白胨水中，分别于36℃培养18h、36℃培养8h、30℃培养24h、36℃培养8h进行增菌，时间先到者放4℃冰箱暂存，全部培养结束后将4种增菌液混合均质。
使用外购DNA提取试剂盒(名称：上海生工细菌基因组DNA快速抽提试剂盒)提取混合增菌液DNA，DNA纯度为OD260/OD280＝1.81、DNA浓度为277.27ng/μL，-20℃保存。之后将DNA稀释至100ng/μL进行检测，引物溶液、探针溶液试剂和阳性对照为本专利所述的试剂盒主要成分，阴性对照为植物源性DNA、空白对照为三蒸水，外购的荧光PCR试剂为上海生工SGExcel GoldStarTaqMan Mixture，按表15进行配制，按表16设置相关参数上机检测(ABI荧光PCR仪，型号为7500Fast)。
表15反应体系
表16反应条件
注*：检测荧光信号。
检测结果见表17：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0。
②检测样品：Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出V.parahemolyticus。的FAM、VIC、TARMA无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes。
③比对结果：与按照GB 4789.10-2016、GB 4789.4-2016、GB4789.30-2016、GB4789.7-2013对样品进行St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的检测结果相符。
表17实验结果
根据5个实施例可见，本发明的四重荧光PCR引物体系及鉴定方法和试剂盒仅对St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的目标基因进行特异性扩增，并在扩增中产生相应的荧光信号，适用于食品和化妆品中的St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus检测，具有一定实用价值。
序列表SEQUENCE LISTING
<110> 贵州省产品质量监督检验院
<120> 一种检测4种致病菌的四重实时荧光PCR方法
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes,and Vibrio parahaemolyticus
<400> 1
gtagtccacg ccgtaaacga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes,and Vibrio parahemolyticus
<400> 2
gaattaaacc acatgctcca cc 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
aattgacggg gacccg 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Salmonella enterica
<400> 4
tctacttgga ggttgtgccc 20
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Listeria monocytogenes
<400> 5
aggaattgac gggggc 16
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 6
cggtcgcaag attaaaactc 20

Claims (6)

1.一种检测4种致病菌的四重荧光PCR方法，具有四重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；其特征在于：根据4种致病菌的16S rRNA基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；所述4种致病菌是：金黄色葡萄球菌，学名Staphylococcus aureus，简称St.aureus；肠道沙门氏菌，学名Salmonella enterica，简称Sa.enterica；单核细胞增生李斯特菌，学名Listeria monocytogenes，简称L.monocytogenes；副溶血性弧菌，学名Vibrioparahemolyticus，简称V.parahemolyticus。
具体的做法包括：
第一步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系；
第二步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒；
第三步，确定检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的四重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、VIC、TARMA、Cy5等激发荧光基团和MGB淬灭荧光基团的四通道及以上的荧光PCR仪上进行扩增和检测。
2.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系：序列1为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用上游引物，序列2为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用下游引物，序列3为St.aureus特异性探针，序列4为Sa.enterica特异性探针，序列5为L.monocytogenes特异性探针，序列6为V.parahemolyticus特异性探针。序列3、4、5、6在5’端分别用FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。
3.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒成分如下所示：
①引物：包括序列1、2所示引物，浓度均为20μmol/L，使用1.5mL无色透明离心管封装；
②探针：包括序列3、4、5、6所示探针，浓度均为10μmol/L，使用1.5mL棕色不透明离心管封装；
③荧光PCR试剂：经验证可适用于所述的四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装，包括荧光PCR预混液、ROX染料、三蒸水；
④阳性对照：包括含有序列1和序列2所示引物扩增目的片段的St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus源性DNA，浓度均为105拷贝/μL左右，使用1.5mL无色透明离心管封装。
4.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品总DNA来源：对于待测食品样品，可先取样进行增菌，然后对增菌培养物通过裂解法、试剂法、柱膜法、磁珠法等分子生物学DNA提取方法或外购商品化试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50μL体系进行反应液配制，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：
①质控标准：阳性对照的FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥40.0；
②阳性样品：当①成立时，FAM或/和VIC或/和TARMA或/和Cy5有荧光对数增长，且Ct值≤35.0，表明该样品检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus；
③阴性样品：当①成立时，FAM或/和VIC或/和TARMA或/和Cy5无荧光对数增长，Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus；
④疑似样品：当①成立时，FAM或/和VIC或/和TARMA或/和Cy5有荧光对数增长，且35.0<Ct值<40.0，重复检测一次；复检结果Ct值≥40.0，表明该样品未检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus；复检结果Ct值<40.0，表明该样品检出St.aureus或/和Sa.enterica或/和L.monocytogenes或/和V.parahemolyticus。
5.按照权利要求4所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述反应液配制如下表所示：
反应液配方
注1：当荧光PCR仪需要ROXreferenceDye校准时加入相应浓度，否则不应添加，具体要求见荧光PCR仪说明书。
注2：阳性对照为所述试剂盒成分“阳性对照”，阴性对照为非St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus源性DNA或三蒸水，空白对照为三蒸水。
6.按照权利要求4所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述反应条件如下表所示：
反应条件
注*1：生物热敏抗体为20–120s；化学热敏抗体为10–15min。
注*2：检测荧光信号。
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