CN110484472A - 一种克雷伯氏菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种克雷伯氏菌及其应用，克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU‑S1，保藏号为CGMCC No.18075，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于溶解并杀死水体中的蓝藻。本发明菌株最适宜的溶藻条件为：接种量10％，pH为7.0，温度为25℃，外加10g/L葡萄糖作为补充碳源，在此条件下，克雷伯氏菌对蓝藻的溶解率达到100％。

Description

一种克雷伯氏菌及其应用
技术领域
本发明属于水体净化及治理领域，特别涉及一种克雷伯氏菌及其应用。
背景技术
近年来，由于工业、农业中投入使用的化工产品用量日益加大，生产、生活废水排放进入河道、湖泊等自然水体中，导致水体中氮、磷营养元素含量超标，造成了严峻水体环境问题，典型的如水体富营养化。富营养化水体中藻类大量繁殖，有害藻类大都能分泌藻毒素，藻毒素是一种毒性很强的毒物，在自然条件下不易降解，最终会累积达到致死剂量。水中藻类过度繁殖还会与其它水生生物争夺游离氧。最终导致水生生物死亡，生物体死亡后的有机体经过分解释放出有毒物质，经食物链、食物网累积等生物途径最终对人产生危害。由此可见，水质恶化不仅对工农业生产具有严重的负面影响，还会影响饮用水水质，危害人体健康。因此，针对有害藻类大量爆发所引发的生态环境问题是近年来关注的热点。寻找高效、稳定、实用性强的除藻手段对于控制有害藻类大量爆发，遏制水体富营养化等污染现象扩散具有重要意义。
目前采用的除藻措施主要有三种。一是采用絮凝剂为主的化学方法。这种方法的机理是利用絮凝剂与水体中的磷酸盐生成不溶性沉淀物的方式沉积到水体底层，从而降低水体中磷元素的浓度。藻类失去营养源随即死亡。然而这种方法只能起到暂时性作用，且絮凝剂价格较高，不适用于藻类爆发面积较大的水体。絮凝剂的大量投加可能造成二次污染，引发新的生态问题。其次是工程性措施，主要以挖掘底泥、深层抱曝气为主。不定期向湖底曝气而补充氧，使得水体与底泥之间不出现厌氧层，保持有氧状态。有氧状态有助于抑制底泥中磷的释放，起到遏制藻类繁殖的作用。同样，这种方法操作成本较高，对于藻类频繁爆发的水域的长期治理效果不甚理想。也可采用在水中种植水生植物的方法来去除水中的氮、磷等营养元素，达到净化效果。但生物法也存在着植物生长周期长，见效缓慢等问题。
传统的化学、物理、生物性治理措施都不能很好地满足快速、有效、廉价地去清除水体中有害藻类的要求。因此，找到一种安全高效且成本低的杀藻剂正成为目前治理水体环境中亟待解决的问题。微生物是一种在自然环境中广泛存在的一类生物统称。微生物具有不同的自身属性，通过基因工程等手段操控改良微生物性质的手段也相对成熟。微生物制剂的生产成本相对较低，作为一种新的生物除藻方法对于环境产生副作用小。微生物易获得，相对表面积大，繁殖速度快的特点满足作为一种天然环保杀藻剂的要求。因此，使用微生物制剂除藻对于解决日益严重的水体富营养化问题具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种克雷伯氏菌及其应用，提供了微生物溶藻及治理富营养化水体的新方法。
本发明的一种克雷伯氏菌，其特征在于，所述克雷伯氏菌为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1，保藏号为CGMCC No.18075，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年7月4日，保藏号为CGMCC No.18075。
本发明的一种所述克雷伯氏菌的生长培养基，培养基为无机盐培养基，组成为：K2HPO4·3H2O 2.00g、NaCl 0.9g、MgSO4·7H2O 0.3g、(NH4)2SO4 0.2g、CaCl2 0.03g、葡萄糖10g，微量元素溶液0.5ml，1000ml蒸馏水，pH为7.0±0.2；其中所述微量元素的组成为：MnSO4 1.2311g、ZnSO4 0.356g、FeSO4 0.256g、CuSO4·5H2O 0.3217g，去离子水定容至1000mL，pH＝7.0。本发明的一种溶解蓝藻的方法，将所述克雷伯氏菌接种于蓝藻繁殖的BG11培养基中，在25℃条件下共同培养。
所述蓝藻为微囊藻属、铜绿微囊藻、念珠藻、颤藻属、鱼腥藻属中的一种或几种。
所述BG11培养基组成为NaNO3 1.5g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·2H20 0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、EDTA 0.001g、NaCO3 0.02g、H3BO30.00286g、MnCl2·H2O 0.00181g、ZnSO4·7H2O 0.000222g、CuSO4·5H2O 0.000079g、Na2MoO40.00039g、Co(NO3)2·6H2O 0.000049g，去离子水定容至1000mL，pH＝7.1±0.1。
所述克雷伯氏菌DHU-S1的接种量为10％体积分数。
所述培养的条件为：25℃，光照：黑暗＝12h：12h，培养24h。
本发明的一种包含所述克雷伯氏菌的微生物制剂。
本发明的一种所述克雷伯氏菌在治理富营养化水体并控制藻华爆发中的应用。
本发明的一种所述克雷伯氏菌在溶解蓝藻中的应用。
本发明的一种所述生长培养基在溶解蓝藻中的应用。
本发明的一种所述生长培养基在溶解并杀死蓝藻细胞中的应用。
本发明的一种所述微生物制剂在水体净化中的应用。
有益效果
本发明的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1，该菌能够在以葡萄糖为碳源的无机盐培养基中生长。该菌最适宜的生长条件为：pH＝7.0，温度＝35℃。在此条件下，针对以铜绿微囊藻为代表的蓝藻细菌的24h溶藻率达到100％；
本发明相比于化学除藻法和物理除藻法，该菌可使藻类絮凝沉淀，同时彻底破坏藻细胞结构，最终达到彻底杀死藻细胞的效果。
附图说明
图1为克雷伯氏菌DHU-S1菌株24小时溶藻率；
图2为经克雷伯氏菌DHU-S1菌株处理的实验组水样与对照组水样比较；
图3为不同初始藻浓度下克雷伯氏菌DHU-S1菌株的溶藻率；
图4为克雷伯氏菌DHU-S1菌株16SrDNA基因序列所属种群系统进化树；
图5为克雷伯氏菌DHU-S1菌株的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1、培养基：
(1)LB培养基购自于生工生物工程上海股份有限公司。
(2)无机盐培养基(MSM)：K2HPO4·3H2O 2.00g、NaCl 0.9g、MgSO4·7H20 0.3g、(NH4)2SO4 0.2g、CaCl2 0.03g、葡萄糖10g，微量元素溶液0.5ml，1000ml蒸馏水，pH为7.0±0.2，121℃灭菌20min后使用。
(3)微量元素：MnSO4 1.2311g、ZnSO4 0.356g、FeSO4 0.256g、CuSO4·5H2O0.3217g，去离子水定容至1000mL，pH＝7.0。
(4)铜绿微囊藻无菌平板培养基：在无机盐培养基(MSM)中加入15g/L琼脂粉，121℃灭菌后冷却至40-60℃时，加入30％(v/v)的铜绿微囊藻藻液(藻细胞密度约为1×107CFU/mL)，混匀后迅速倒入无菌培养皿中，置于光照培养箱中培养。培养温度为25℃，时间7-10d，光照：黑暗周期比为12h:12h。
(5)BG11培养基：NaNO3 1.5g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·2H2O 0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、EDTA 0.001g、NaCO3 0.02g、H3BO30.00286g、MnCl2·H2O 0.00181g、ZnSO4·7H2O 0.000222g、CuSO4·5H2O 0.000079g、Na2MoO40.00039g、Co(NO3)2·6H2O 0.000049g，去离子水定容至1000mL，pH＝7.1±0.1。
2、溶藻率计算：采用丙酮法测定克雷伯氏菌DHU-S1处理后实验组与对照组叶绿素a的含量来表征溶藻率。
(1)丙酮法测叶绿素a含量：取5mL待测铜绿微囊藻液，8000r/min离心5min，去除上清后用1mL无菌水悬浮藻细胞，沸水浴3min后于黑暗处自然冷却，待冷却后加入4mL丙酮，在黑暗处静置30min后以8000r/min离心5min，取上清液用于测定吸光度值；用1mL无菌水与4mL丙酮的混合液作为空白对照，分别测定OD750、OD663、OD645、OD630值，利用公式计算叶绿素a的含量。
计算公式为：ρ(Chla)/(μg/L)＝11.64×(OD663-OD750)-2.16×(OD645-OD750)+0.1×(OD630-OD750)。
(2)
式中：Chla1为对照组样品提取的叶绿素a含量，Chla2为实验组样品提取的叶绿素a含量。
3、铜绿微囊藻购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库；用于分离克雷伯氏菌DHU-S1的水样来自东华大学松江校区境月湖。
实施例1
1、菌株分离
(1)采集东华大学松江校区夏季藻华大量爆发繁殖的境月湖水样。采集水样保存至无菌锥形瓶中，将锥形瓶放置于装满冰块的保温箱中，立即转移至无菌实验室，进行菌落的富集培养。
(2)将上述采集水样经过10-1,10-2,10-3,10-4,10-5五个梯度稀释，稀释后在无菌操作条件下将溶液分别涂布于铜绿微囊藻无菌平板培养基，置于37℃恒温箱中富集培养，培养24小时后获得单菌落。
(3)观察长成的菌落形态，用接种环挑取单菌落，在灭菌过的LB固体培养基平板中划线分离。反复分离纯化5-7次，并在显微镜下观察，确保选取的是单一菌株。将获得的菌株命名为DHU-S1，用30&甘油保存于-83℃冰箱中。
2、菌落形态特征
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1的菌落为圆形，白色，边缘整齐，光滑，湿润，凸起。
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示；其16SrDNA基因序列所属种群系统进化树如图4所示。
该克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)如下：
ACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCAAGCCTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATCACTAAGGTTATTAACCTTAATGCCTTCCTCCTCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTA
3、菌株生长曲线的测定
将菌株DHU-S1接种到LB固体培养基上扩大培养后，再接种于灭菌后的LB液体培养基中，于35℃，150rpm条件下恒温摇床培养，每隔2h取样，用紫外分光光度计在600nm处测定吸光度(OD600)，测定克雷伯氏菌DHU-S1的生长曲线如图5所示，将克雷伯氏菌DHU-S1培养在LB培养基中，连续使用分光光度计测定OD600处的数值，数值大小可定量表示细菌生长状况。将测定值绘制成细菌生长曲线图表示细菌生长的不同阶段。可见克雷伯氏菌菌株DHU-S1在0-4小时为迟缓期，4-16小时为对数期，16-24小时为稳定期，之后为衰亡期。处于稳定期的克雷伯氏菌菌株DHU-S1具有最佳生物活性并能稳定释放代谢产物，适宜作为实验菌株。
实施例2
克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1对铜绿微囊藻的溶藻试验
具体实施如下：
1、将上述获得的菌株DHU-S1接种于100mL无机盐液体培养基中，培养至对数期；
2、将铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)FACHB905培养在无菌BG11培养基中，培养至对数期；铜绿微囊藻培养条件：25℃的恒温光照培养箱中，光照：黑暗周期比＝12h：12h。
3、取上述培养至对数期的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1菌液，以10％的体积分数加入培养至对数期的铜绿微囊藻藻液中，放置于25℃光照培养箱中，以光：暗周期比12h：12h共同培养。另取加入相同体积分数无机盐培养基(MSM)的铜绿微囊藻藻液作为对照组，与实验组同时放入相同条件下培养。
4、将实验组与对照组培养24小时，每2小时取样计算溶藻率。通过测定实验组与对照组铜绿微囊藻藻液中叶绿素a的含量，计算克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1菌液的溶藻率。克雷伯氏菌DHU-S1菌株24小时溶藻率如图1。将处于对数期克雷伯氏菌DHU-S1菌液加入铜绿微囊藻藻液后，使用测定叶绿素a含量的方法定性表示铜绿微囊藻细胞存活率。通过取样测定铜绿微囊藻藻液中叶绿素a的含量与对照组中叶绿素a含量的比值，可定量表示克雷伯氏菌菌株DHU-S1的溶藻率。如图1所示，克雷伯氏菌菌株DHU-S1可在24小时之内将铜绿微囊藻细胞全部杀死。
5、经克雷伯氏菌DHU-S1菌株处理的实验组水样与对照组水样比较如图2所示。经过克雷伯氏菌DHU-S1处理的铜绿微囊藻藻液(实验组)中漂浮大量白色絮状体，为藻细胞被溶解之后的残留物。而未经克雷伯氏菌DHU-S1处理的铜绿微囊藻藻液(对照组)呈深绿色，藻细胞均匀漂浮分布。实验组和对照组可直观说明克雷伯氏菌DHU-S1的溶藻作用。
实施例3
初始藻浓度对于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1溶藻效率的影响。
具体实施如下：
1、将克雷伯氏菌DHU-S1接种于100mL无机盐液体培养基中，培养至对数期；
2、将培养至对数期的铜绿微囊藻藻液分别取不同量加入到无菌BG11培养基中，获得四组不同藻细胞浓度的铜绿微囊藻藻液，每组三个重复。实验组1浓度：1×105CFU/mL。实验组2浓度：1×106CFU/mL。实验组3浓度：1×107CFU/mL。实验组4：1×108CFU/mL。
3、取培养至对数期的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1的菌液，以10％体积分数加入到实验组1、实验组2、实验组3、实验组4的铜绿微囊藻藻液中。另取加入相同体积分数无机盐培养基(MSM)的铜绿微囊藻藻液作为对照组。
4、将实验组1、实验组2、实验组3、实验组4与对照组同时放入25℃，光照：黑暗＝12h：12h的光照培养箱中培养。24小时后测定各各实验组3组铜绿微囊藻藻液叶绿素a含量平均值和对照组铜绿微囊藻藻液中叶绿素a的含量，计算不同初始藻浓度对于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1溶藻效率的影响。不同初始藻浓度下克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)DHU-S1的溶藻率如图3所示。实验组1、实验组2、实验组3、实验组4按照铜绿微囊藻藻细胞浓度逐渐增大的顺序排列。通过取样测定每组铜绿微囊藻藻液中叶绿素a的含量与对照组中叶绿素a含量的比值，可定量表示每组克雷伯氏菌DHU-S1的溶藻率。可见克雷伯氏菌DHU-S1在前三个实验组中的溶藻率均能达到100％，在浓度最大的实验组4中溶藻率可达99.3％。一般水华爆发时的铜绿微囊藻浓度为1×104CFU/mL—1×106CFU/mL，说明克雷伯氏菌DHU-S1在治理水华爆发的水体中能发挥显著作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
<120> 一种克雷伯氏菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1289
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgta gcattctgat ctacgattac 60
tagcgattcc gacttcatgg agtcgagttg cagactccaa tccggactac gacatacttt 120
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ccattacccc acctactagc taatcccatc tgggcacatc tgatggcatg aggcccgaag 1200
gtcccccact ttggtcttgc gacgttatgc ggtattagct accgtttcca gtagttatcc 1260
ccctccatca ggcagtttcc cagacatta 1289

Claims (10)

1.一种保藏号为CGMCC No.18075的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)DHU-S1。
2.根据权利要求1所述的克雷伯氏菌，其特征在于，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.一种克雷伯氏菌的生长培养基，其特征在于，所述培养基为无机盐培养基，组成为：K2HPO4·3H2O 2.00g、NaCl 0.9g、MgSO4·7H2O 0.3g、(NH4)2SO4 0.2g、CaCl2 0.03g、葡萄糖10g，微量元素溶液0.5ml，1000ml蒸馏水，pH为7.0±0.2；其中所述微量元素的组成为：MnSO4 1.2311g、ZnSO4 0.356g、FeSO4 0.256g、CuSO4·5H2O 0.3217g，去离子水定容至1000mL，pH＝7.0。
4.一种溶解蓝藻的方法，其特征在于，将权利要求1所述克雷伯氏菌接种于蓝藻繁殖的BG11培养基中，在25℃条件下共同培养。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述蓝藻为微囊藻属、铜绿微囊藻、念珠藻、颤藻属、鱼腥藻属中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述BG11培养基组成为NaNO3 1.5g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·2H20 0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、EDTA 0.001g、NaCO3 0.02g、H3BO3 0.00286g、MnCl2·H2O 0.00181g、ZnSO4·7H2O0.000222g、CuSO4·5H2O 0.000079g、Na2MoO4 0.00039g、Co(NO3)2·6H2O 0.000049g，去离子水定容至1000mL，pH＝7.1±0.1。
7.一种包含权利要求1所述克雷伯氏菌的微生物制剂。
8.一种权利要求1所述克雷伯氏菌在控制藻华爆发中的应用。
9.一种权利要求3所述培养基在溶解蓝藻中的应用。
10.一种权利要求7所述微生物制剂在水体净化中的应用。
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