CN114349174A

CN114349174A - 一种基于藻-菌联合体去除四环素的方法

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Publication number: CN114349174A
Application number: CN202210058730.1A
Authority: CN
Inventors: 徐敬蕊; 穆罕默德·拉塞尔; 王静; 武文超; 曲一鹤
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-17
Also published as: CN114349174B

Abstract

本发明提供了一种基于藻‑菌联合体去除四环素的方法，尤其涉及一种藻‑菌联合体去除水体中四环素的方法。本发明藻‑菌联合体由克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae和链带藻Desmodesmus Sp.组成，将藻‑菌联合体(每毫升所含藻量约为7～9×10⁶cells，菌量约为0.7～1.0mg)接入含四环素的人工模拟污水中。其中，菌的浓度为0.023～0.035mg/mL，藻的浓度为2.3～3×10⁵cells/mL。在共培养的微生物之间建立协同作用，提高总体吸收效率。是一种由太阳能驱动的、生态全面的、可持续发展的方法。

Description

一种基于藻-菌联合体去除四环素的方法

技术领域

本发明涉及环境保护与新兴污染物的去除，尤其是涉及一种基于藻-菌联合体去除水体中的四环素的方法。

背景技术

随着畜牧业的不断发展，为了控制畜禽疾病以及促进畜禽的生长，抗生素被广泛用作饲料添加剂。抗生素大部分为水溶性，其使用后不能完全被动物吸收利用，约30％～90％的抗生素以粪便和尿液的形式排出，造成了很多负面影响。中国兽用抗生素使用情况年度报告中指出，2019年一年使用的兽用抗菌药总量高达3.09万吨。其中，四环素类抗生素使用量占比最大，约为1.13万吨，占总量的36.56％。

一般来说，含抗生素废水成分复杂，竞争性物质的存在降低了吸附剂对抗生素的吸附选择性，去除效率受到严重影响。物理法中膜处理法由于膜污染使得通量下降，降低处理效率。化学法中光催化或臭氧氧化处理可能会产生其他有害中间产物，存在二次污染的风险。物理法和化学法的缺点是都需要消耗能量，且不能产生高附加值。生物法去除抗生素如传统活性污泥法，其初衷是为了满足水质排放的要求，处理后废弃污泥的处理成本约占总成本的50％-60％，其他去除方法如人工湿地技术，目前还存在设计规范欠缺、湿地堵塞等问题。

因此，需要寻找一种绿色生态环保的新处理方法。而生物法是一种由太阳能驱动的、生态全面的、可持续发展的方法。其中微藻生物技术是处理含抗生素废水的潜在方法。基于此，建立一种藻-菌联合体的方法去除水体中的四环素。联合体之间可以建立协同作用，相互影响。藻可以为菌的生长提供氧气和养分，而菌通过呼吸代谢为藻提供CO₂和生长刺激因子，消耗藻产生的胞外聚合物和其他物质，并分解死亡的藻细胞。同时，微生物的分解产物可以被藻类吸收和利用。

发明内容

本发明建立了一种藻-细菌联合体，目的是建立一种生态可持续的去除四环素的方法。

从某养猪场的粪便中筛选出一株具有高效降解四环素能力的菌株，与耐受四环素的藻类组成联合体，形成良好的共生关系。

为实现上述目的，具体技术方案如下：

一种基于藻-菌联合体去除四环素的方法，包括如下步骤：

步骤一、将藻-菌联合体接入含四环素的污水中，充分混合，得到混合溶液；所述藻-菌联合体中的菌为克雷伯氏菌属菌株Klebsiella pneumoniae，藻为链带藻Desmodesmus Sp.；菌在混合溶液中的浓度为0.023～0.035mg/mL；藻在混合溶液中的浓度为2.3～3×10⁵cells/mL；混合溶液中四环素的浓度为50mg/L；

步骤二、调节混合溶液pH值为6.5～8(优选为7)，放入光照培养箱培养，设置光照培养温度25±2℃，光强3500～5000lx，光照与黑暗环境下培养的时间比为12h：12h；

所述的藻-菌联合体的制备过程如下：分别将藻和菌培养至生长对数期，初步获得藻液和菌液，无菌条件下，将藻液和菌液经冷冻离心机离心，在10～15℃，3500～8000rpm/min的条件下离心8～15min，去掉上清液，保留沉淀部分，用人工配置的模拟污水复溶；测量OD值，并调节OD值为1，菌OD₆₀₀＝1时，菌的浓度为0.35～0.5mg/mL；藻OD₆₈₆＝1时，藻的浓度为7～9×10⁶cells/mL；并按照藻液和菌液体积比为1:2配置藻-菌联合体，藻-菌联合体中每毫升所含藻量为7～9×10⁶cells，菌量为0.7～1.0mg。

所述人工配置的模拟污水配方为：每升水溶液中包括：0.05g四环素，0.6g葡萄糖，1.215gNaNO₃，0.0295gK₂HPO₄·3H₂O，0.273g(NH₄)₂SO₄，0.02gMgSO₄·7H₂O，0.027gCaCl₂，0.02gNaCl，0.024gNaCO₃，0.06g柠檬酸，0.06gFeC₆H₅O₇·NH₄OH，0.001gEDTA-Na₂，0.1mL微量元素溶液；微量元素每升溶液中含：2.86gH₃BO₃，1.81gMnCl₂·4H₂O，0.22gZnSO₄·7H₂O，0.39gNa₂MoO₄·2H₂O，0.08gCuSO₄·5H₂O，0.04gCoCl₂·6H₂O，人工配置的模拟污水需要调节pH至7。

本发明包含的有益效果如下：

本发明的方法四环素的去除率可达到82％以上。

本发明人经实验发现，藻-菌联合体在特定的培养条件下形成共生状态，发现藻-菌比例为1:2(每毫升所含藻量约为7～9×10⁶cells，菌量约为0.7～1.0mg)时，去除水体中的四环素的效果最好。

利用藻-菌联合体在共培养的微生物之间建立协同作用，提高总体吸收效率。藻类和细菌之间相互作用的化学物质也可以通过激活或抑制基因表达或生物活性从而改变藻类的行为和生长，这种关系也对不利因素具有抵抗力。藻-菌联合体间的氧气与二氧化碳循环是有益的。细菌降解污染物的代谢产物可以作为藻类生长的促进剂。藻类分泌物是细菌的主要碳源(碳水化合物、蛋白质和脂肪)。此外，微藻的细胞表面可以为细菌提供稳定的栖息地。在这个过程中，一些细菌可以释放胞外酶，包括淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，这些酶可以将高分子量的有机物转化为低分子量的有机物，并且这些微藻更容易吸收低分子量的物质。一些细菌可以释放维生素，维生素是藻类的生长促进因子。

附图说明

图1为实施方式中单藻、单菌和藻-菌联合体对50mg/L四环素去除效果图。

其中，Alg表示藻，Bt表示菌。

具体实施方式

结合实例对本发明进行进一步的详细说明。

一、四环素降解菌的筛选分离纯化。

将5g猪粪样品加入装有40mL无菌水的离心管中，涡旋5min，静置2h。然后将5mL上清液加入到装有LB培养基的锥形瓶中(100mL且已灭菌)，置于摇床中培养，设置条件30℃，150rpm/min。1天后取5mL上清液加入以四环素为唯一碳源的MSM培养基中，用来筛选四环素降解菌。四环素初始添加量为50mg/L，以7天为一个周期，依次增加10mg/L，在相同条件下培养。当四环素含量加至100mg/L时，停止实验。收集悬浮液并稀释成不同浓度，将不同浓度的悬浮液均匀涂布在含有四环素(50mg/L/)的固体LB培养基上，用来分离不同菌株。然后将其置于恒温培养箱(30℃)中。培养2天后，采用平板划线法进一步分离纯化菌株。将纯化后的克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae接入LB培养基中富集，培养至生长对数期用于下一步的实验。

LB培养基配方：每升水溶液中蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，调节pH至7。MSM培养基配方：每升水溶液中EDTA15.0mg，ZnSO₄·7H₂O4.5mg，CaCl₂·2H₂O4.5mg，FeSO₄·7H₂O3.0mg，MnCl₂·4H₂O1.0mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.4mg，CuSO₄·5H₂O0.3mg，KI0.1mg，(NH₄)₂ZnSO₄5.0g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄0.5mg，使用NaOH调节pH为7.0。

二、藻的选择。

选择耐受含四环素水溶液环境的且快速生长的藻。选择几种藻进行急性毒性实验。首先确定初始藻浓度为5×10⁵cells/mL。将空白培养基作为对照组，设置四环素浓度为5、10、20、40、80、100mg/L，对照组及实验组均设置3个平行。实验前先取处于对数生长期且生长状况良好的藻液，使用血球计数板对藻细胞浓度进行计算，确定需添加藻液的体积。然后，在经高压灭菌后的10mL玻璃小瓶中依次加入BG11培养基、藻液、四环素母液，使实验溶液最终体积为5mL，使用灭菌过的封口膜及橡皮筋封住玻璃小瓶，置于光照培养箱中培养96h，每日早晚各摇动一次，防止贴壁生长。96h后使用血球计数板对不同四环素浓度下的藻细胞进行计数。最终选择链带藻Desmodesmus Sp.用于下一步的实验。

将藻(Desmodesmus Sp.)在BG11培养基中培养至生长对数期。BG11培养基配方：每升水溶液中NaNO₃30.0g，K₂HPO₄·3H₂O 1.05g，MgSO4·7H2O 1.5g，柠檬酸0.30g，FeC₆H₅O₇·NH₄OH 0.30g，Na2EDTA·2H2O 0.055g，CaCl2·2H2O 18.0g，Na2CO3 20g，H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.81g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，CoCl₂·6H₂O 0.04g，调节pH至7。

三、配置人工模拟污水中(模拟污水按照在养猪厂取得的水样配制)，并在污水中添加四环素。人工模拟污水配方为：每升水溶液中四环素0.05g，葡萄糖0.6g，NaNO₃1.215g，K₂HPO₄·3H₂O0.0295g，(NH₄)₂SO₄ 0.273g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，CaCl₂ 0.027g，NaCl0.02g，NaCO₃ 0.024g，柠檬酸0.06g，FeC₆H₅O₇·NH₄OH0.06g，EDTA-Na₂0.001g，0.1mL微量元素溶液。微量元素每升中溶液中含H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.81g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，CoCl₂·6H₂O 0.04g，并调节pH至7。

四、取藻液并使用冷冻离心机离心，去除上清液，保留沉淀部分，用人工模拟污水复溶。测量OD值，并调节OD值为1。菌使用同样的方法调节OD值至1。

五、添加不同比例的藻和菌(藻-菌比例为1：1，1：2，2：1)，并且同单藻体系和单菌体系作对比，同时设置不添加藻和菌的空白对照组(每组实验设置三个平行组)，每种体系的接种量占混合溶液的体积的十分之一。在光照恒温培养箱中培养，设置温度为25℃，光强4000lx，光照与黑暗环境下培养时间比为12h：12h。

五、检测分析。

每两天取一次样，使用高效液相色谱测量四环素的浓度。取4mL样品并离心(4℃，8000rpm/min/)10分钟。然后取1mL上清液，加入等体积的EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，混合均匀。然后样品通过0.22μm过滤器过滤并储存在液相小瓶中以检测四环素的含量。高效液相的方法为：C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相是85％(v/v)0.1％甲酸的高纯水、15％(v/v)乙腈，流速为1.0mL/min，温度35℃，进样量20μL，波长355nm。EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：取2.84g NaHPO₄稀释至100mL，取2.1g柠檬酸稀释至100mL，取62.5mL NaHPO₄溶液和100mL柠檬酸溶液，调节pH至4.0，加入混合溶液6.05g EDTA-Na₂。

如图1所示，是实例中不同比例的藻-菌联合体和单藻、单菌对水溶液中四环素的去除效果图。Alg表示藻，Bt表示菌。可以明显看出藻-菌联合体的比例为1:2时，去除效果最好，可达到82.11％。

Claims

1.一种基于藻-菌联合体去除四环素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将藻-菌联合体接入含四环素的污水中，充分混合，得到混合溶液；所述藻-菌联合体中的菌为克雷伯氏菌属菌株Klebsiella pneumoniae，藻为链带藻DesmodesmusSp.；菌在混合溶液中的浓度为0.023～0.035mg/mL；藻在混合溶液中的浓度为2.3～3×10⁵cells/mL；混合溶液中四环素的浓度为50mg/L；

步骤二、调节混合溶液pH值为6.5～8，放入光照培养箱培养，设置光照培养温度25±2℃，光强3500～5000lx，光照与黑暗环境下培养的时间比为12h：12h；

2.根据权利要求1所述的一种基于藻-菌联合体去除四环素的方法，其特征在于，步骤二中所述调节混合溶液pH值为7。

3.根据权利要求1所述的一种基于藻-菌联合体去除四环素的方法，所述人工配置的模拟污水配方为：每升水溶液中包括：0.05g四环素，0.6g葡萄糖，1.215gNaNO₃，0.0295gK₂HPO₄·3H₂O，0.273g(NH₄)₂SO₄，0.02gMgSO₄·7H₂O，0.027gCaCl₂，0.02gNaCl，0.024gNaCO₃，0.06g柠檬酸，0.06gFeC₆H₅O₇·NH₄OH，0.001gEDTA-Na₂，0.1mL微量元素溶液；微量元素每升溶液中含：2.86gH₃BO₃，1.81gMnCl₂·4H₂O，0.22gZnSO₄·7H₂O，0.39gNa₂MoO₄·2H₂O，0.08gCuSO₄·5H₂O，0.04gCoCl₂·6H₂O，人工配置的模拟污水需要调节pH至7。