CN1687440A - 一种大量提取藻蓝蛋白的简便方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物提取藻蓝蛋白的方法，更具体地，本发明涉及一种用微生物的培养液从蓝藻、蓝绿藻中提取藻蓝蛋白的方法。与传统的藻蓝蛋白提取方法相比，本发明的方法具有成本低廉、操作简便，处理量大等优点，并且提取的蛋白纯度高，而且不破坏蛋白的生物活性，是一种非常适合于规模化生产藻蓝蛋白的方法。

Description

一种大量提取藻蓝蛋白的简便方法
技术领域
本发明涉及生物提取藻蓝蛋白的方法，更具体地，本发明涉及一种用微生物的培养液从蓝藻、蓝绿藻中提取藻蓝蛋白的方法。
背景技术
藻蓝蛋白具有很高的开发利用价值【1】。首先藻蓝蛋白是红藻和蓝藻特有的光合色素，色泽明亮鲜艳，是食品、高级眼影、唇膏的首选纯天然色素，可作为纯天然的色素，用于食品、化妆品和染料等工业【2】。再则可加工成保健食品和药品【3】。研究表明，藻蓝蛋白能显著减轻并逐渐消除辐射、化疗对造血功能的损伤【4】，还能提高淋巴细胞活性，积极清除细胞中氧自由基【5】，促进伤口愈合，动物实验证明能有效抑制癌细胞生长【6】，而且还可作为荧光试剂。高纯度的藻蓝蛋白带有很强的荧光，制成的纯天然荧光试剂，广泛应用于医学和生物工程等领域【7】。
藻蓝蛋白的提取分为蛋白溶出和蛋白提纯两个过程。蓝藻、蓝绿藻藻细胞外层具鞘，胞壁为革兰氏阴性菌典型构造，由四层组成，每层厚约10nm，要提取出蓝藻、蓝绿藻中的藻蓝蛋白，首先要破碎藻细胞的鞘和细胞壁、细胞膜，使之以水溶状态存在于提取液中，再采用适宜的方法将其进一步纯化，而且还要求全过程都能保持藻蓝蛋白的活性。目前提取方法大致可以总结为机械捣碎、反复冻融、化学处理、超声破碎的蛋白质析出方法，然后进一步采取硫酸铵沉淀、等电点沉淀、柱层析和凝胶层析法等进行纯化处理。往往上述方法都是联合运用，以求达到最好效果。
我国目前经济微藻，主要是蓝藻和蓝绿藻年生产能力超过1000吨，但大多是微藻初级产品。现在市场上已经有的10多种微藻藻片和胶囊，根据不同的功能通过卫生部批准为保健品，但还没有以微藻深加工产品藻蓝蛋白为主的功能性保健品，药品的研究开发几乎还是空白。这主要是由于蓝藻和蓝绿藻中藻蓝蛋白的提取还处于实验室研究阶段，没有适合于工业化生产的好的工艺方法，使藻蓝蛋白的商品价格昂贵而在应用上受到限制【8】。
目前最常运用的蓝藻、蓝绿藻细胞破碎提取方法如下【9】【10】【11】：取新鲜螺旋藻或者藻粉，用0.01 M K-磷酸盐缓冲液，pH 6.7，0.15 M NaCl的提取缓冲液漂洗干净后，重新悬浮于此缓冲液中，在-15℃状态下冻结，然后解冻并升温到30℃，保持一小时，并持续搅拌，之后置于4℃，过夜，次日18000×g超速离心30分钟，取上清，加入水相萃取液，混合后搅拌再次置于4℃过夜，次日再于8000×g高速离心30分钟后弃沉淀，取上清，加入水萃取液，重复上述离心步骤5次，获得的最后上浮物饱和于40％硫酸铵溶液中，再次离心，沉淀溶解于提取缓冲液中。此时即获得了食品纯和药品纯的藻蓝蛋白。如要获得高纯度的藻蓝蛋白，还需要凝胶层析、柱层析等纯化步骤，得到试剂纯藻蓝蛋白A620/A280＞4.0。
发明内容
针对上述研究背景，本发明人经过对藻蓝蛋白提取方法的深入研究，非常意外地发现某些种类的微生物的培养液可以使新鲜的蓝藻、蓝绿藻或其制成的藻粉自然破壁，将藻蓝蛋白释放到培养液中，进一步用常规方法纯化可以获得高纯度的藻蓝蛋白。
因此，本发明的一个目的是提供一种大量提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于将固氮菌中克氏杆菌属和肠细菌属固氮菌的培养液与螺旋藻或藻粉混合。在该过程中，螺旋藻或藻粉被快速降解，藻蓝蛋白被释放到培养液中，用常规方法进一步纯化可以获得高纯度的藻蓝蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述固氮菌是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)，或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，特别优选肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，日勾维肠杆菌CGMCCNo.0510，和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)，其中日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)是日勾维肠杆菌57-7(CGMCC No.0510，其已在中国专利号ZL00133626.6(第一发明人李永兴)中公布授权，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)由中科院植物所保存。
在本发明的另一个实施方案中，将上述释放到培养液中的藻蓝蛋白进一步用硫酸铵、凝胶层析、羟基磷灰石层析或Sephadex G-100柱层析纯化。
因此，本发明提供了一种生物提取藻蓝蛋白的方法。与传统的藻蓝蛋白提取方法相比，本发明的方法具有成本低廉、操作简便等优点，并且提取的蛋白纯度高，而且不破坏蛋白的生物活性，是一种非常适合大规模生产藻蓝蛋白的方法。本发明避开了传统的物理化学法和溶菌酶法的苛刻条件和繁重操作，利用生物方法自然破壁一步即可提取较纯的藻蓝蛋白，大大简化了提取步骤，使藻蓝蛋白工业化生产成为可能。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。
图1.按照本发明方法利用日勾维肠杆菌培养液从螺旋藻中直接提取的提取液的吸收光谱，620nm处的吸收峰是藻蓝蛋白的吸收峰；
图2.按照本发明方法利用日勾维肠杆菌培养液从螺旋藻中直接提取的提取液的荧光光谱(室温)，最大发射峰位于650nm(580nm激发)；
图3.利用日勾维肠杆菌培养液最终纯化的藻蓝蛋白的吸收光谱，620nm处的吸收峰是藻蓝蛋白的吸收峰；
图4.利用日勾维肠杆菌培养液最终纯化的藻蓝蛋白的荧光光谱(室温)，最大发射峰位于650nm(580nm激发)；
图5.利用日勾维肠杆菌培养液最终纯化的藻蓝蛋白的SDS-PAGE电泳图(M，分子量标准；cpc：藻蓝蛋白)。
具体实施方式
实施例1  利用细菌培养液提取鲜藻的藻蓝蛋白
A)螺旋藻培养
将螺旋藻接种于Zarrouk培养基【12】中，该培养基包括(g/l)：NaHCO316.8，NaNO3 2.5，K2HPO4 0.5，K2SO4 1.0，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.04，FeSO47H2O 0.01，EDTA 0.08以及微量元素。130rpm/min振荡培养，30℃恒温，100μmol/m2/s连续光照，培养到藻液的OD值A560达到1.2左右，用0.45μm孔径大小的滤网过滤获得新鲜藻泥，无需清洗而用于以下步骤。
B)鱼腥藻、集胞藻培养
将鱼腥藻sp.595、集胞蓝藻PCC6803(藻种引自于中科院水生生物所)分别接种于BG-11培养基，成分见文献【13】中，(g/l)：NaNO3，1.5；K2HPO4·3H2O，0.04；MgSO4·7H2O，0.075；CaCl2·2H2O，0.036；柠檬酸0.006；柠檬酸铁0.006；Na2EDTA 0.001；Na2CO3，0.02；1ml微量元素(g/l)，包括H3BO3，2.86；MnCl2·4H2O，1.81；ZnSO4·7H2O，0.222；Na2MoO4·2H2O，0.39；CuSO4·5H2O，0.079；Co(NO3)2·6H2O，0.0494，调节pH＝7.4。130rpm/min振荡培养，30℃恒温，100μmol/m2/s连续光照培养，培养至对数生长后期，用滤网过滤获得新鲜藻泥，无需清洗。
C)微生物的培养
将肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC1.1734)，日勾维肠杆菌CGMCC No.0510，和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(IBCAS-ZY)分别接种于自配简化培养基中，该简化培养基包括(g/l)：蔗糖10，K2HPO4 10，KH2PO4 3，MgSO4 0.3，NH4Cl 0.4，CaCl20.02以及常规微量元素，调节PH值到8.0，130rpm/min振荡培养，30℃恒温，培养15小时至OD600nm值为2.000左右，自然沉淀后，倾倒出上清培养液。
D)藻蓝蛋白吸收光谱的测定方法
吸收光谱使用SHIMSDZU UV-2550紫外可见分光光度计于室温下测定，扫描速率为300nm/min，狭缝宽度为2nm，采用光径为1cm的样品池。620nm处的强吸收峰为藻蓝蛋白的特征峰。
E)藻蓝蛋白荧光光谱的测定方法
室温稳态荧光光谱用HITACHI F-4500荧光分光光度计测量，激发、发射光狭峰为5nm，扫描速率是120nm/min，时间常数为2s，光电倍增管增益为NORMAL。位于650nm(580nm激发)处的最大荧光发射峰是藻蓝蛋白的特征峰。
每一步提取纯化步骤之后，均取其澄清藻蓝蛋白液测定其室温荧光、吸收光谱。
F)藻蓝蛋白的纯度检测方法
使用SUNSUNG UV8500 II紫外可见分光光度计测定不同波长处的紫外和可见光吸收值，即分别在280nm、615nm、620nm、652nm处的吸光值，A620/A280的比值代表藻蓝蛋白的纯度：食品级：A620/A280＞0.7，药品级：A620/A280＞2.0，试剂级：A620/A280＞4.0。A为吸收值。藻蓝蛋白的浓度用如下公式计算【14】
PC(mg/ml)＝(A615-0.474(A652))/5.34
G)藻蓝蛋白的SDS-PAGE检测方法
取50μl提纯后的藻蓝蛋白，加入等体积的增溶液(含5％SDS、2％巯基乙醇和10％甘油的50mM Tris溶液，pH＝6.8)，混匀后静置30分钟，沸水煮5分钟，10000g离心5分钟，取上清上样。电泳使用硼酸缓冲体系，浓缩胶、分离胶浓度分别为6％(pH＝6.1)和13.5％(pH＝9.18)。电泳仪为DYCZ-24D型电泳仪(北京市六一仪器厂)。标准蛋白为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白(购自上海西巴斯生物技术开发公司)。
H)利用细菌培养液提取鲜藻的藻蓝蛋白
以下以日勾维肠杆菌CGMCC No.0510为例举例说明本发明的藻蓝蛋白提取方法。
将上述各种菌的上清液分别冲洗藻泥至容器中，并加至菌液和藻泥大约为2∶1的体积比，密封(只为防止水分蒸发，不必很严格)，静置，最好避光，24小时后，藻蓝蛋白析出，细胞壁、细胞膜等非水溶性蛋白沉淀于容器底部，上部即为清亮鲜艳的蓝色藻蓝蛋白粗提物，此时如表1所示，纯度(A620/280)达到0.9。吸收光谱和荧光发射光谱分别如图1和图2所示，分别显示620nm处的藻蓝蛋白特征吸收峰和650nm(580nm激发)处的藻蓝蛋白最大荧光发射峰。附图所示为用日勾维肠杆菌菌液提取螺旋藻鲜藻泥的藻蓝蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱，用上述提到的菌作用于藻后，只是在蛋白析出时间和蛋白析出率上稍有差异，但每一步骤所得样品的光谱特性均是与藻蓝蛋白相同的。所得粗提物用HITACHI 20PR-520离心机5000g离心后，取上清，此时藻蓝蛋白的纯度(A620/280)可达到1.3-1.5，远高于食品级纯度。
之后用60％饱和度的硫酸铵沉淀，余后流程与目前通行方法无太大差别，参照胡一兵【15】等的方法流程将上清液通过羟基磷灰石层析和Sephadex G-100柱层析，最后可得到纯度4.8-5.2的试剂纯藻蓝蛋白，其吸收光谱和荧光发射光谱分别如图3和图4所示。与图1和图2相同，分别显示620nm处的藻蓝蛋白特征吸收峰和650nm(580nm激发)处的藻蓝蛋白最大荧光发射峰，但是峰形更明显，表明纯度更高。
为了检测最终纯化的藻蓝蛋白的纯度，如上使用SDS-PAGE方法检测所得藻蓝蛋白已经达到电泳纯。结果如图5所示，在SDS-PAGE电泳图谱中与标准蛋白相比，显示了藻蓝蛋白的亚单位结构，两条带分别是藻蓝蛋白的α亚基和β亚基，与藻蓝蛋白结构相符合。以上利用光谱特性和电泳结果证明用本发明方法提取的上清的蓝色液体含有高纯度的藻蓝蛋白。
实施例2  利用细菌培养液提取螺旋藻藻粉中的藻蓝蛋白
以与实施例1中相同的方法进行藻蓝蛋白的提取。不同之处在于，用藻粉代替鲜藻。具体步骤如下：称取云南产香峰牌(北京阳光雨虹峰产品技术开发公司)100％藻粉500g置于容器中，加入实施例1中培养的各种菌液5000ml混合，静置于室温25℃左右，半小时后，藻蓝蛋白析出，上清液清亮湛蓝，倾倒出上清。余下步骤与实施例1相同，得出类似的结果。需要说明的是，利用藻粉获得的藻蓝蛋白粗提液的纯度没有利用鲜藻泥的高，但藻蓝蛋白析出时间藻粉成倍加快，分析可能是藻粉在制备过程中由于处理流程使得螺旋藻的胞壁组构发生变化，导致藻蓝蛋白更易析出。但由于藻粉制备过程中，藻蓝蛋白因为高温干燥等原因，导致藻蓝蛋白部分变性，因此藻蓝蛋白的纯度和浓度都受影响。因此，用鲜藻提取藻蓝蛋白是最佳选择。
实施例3  藻蓝蛋白的不同粗提取方法的对比
为了比较本发明的方法和常规的藻蓝蛋白的提取法，在对照条件下按照文献中记载的各种藻蓝蛋白提取方法对鲜藻泥和/或藻粉进行提取，结果如表1所示。
表1  用不同方法粗提鲜藻泥(螺旋藻)中藻蓝蛋白的对照图
提取方法       藻蓝蛋白浓度      藻蓝蛋白纯度      规模和设备
                 (μg/ml)         (A620/A280)
4℃超声破碎      300±12            0.30           设备要求严
                                                   格，每次量小
                                                   温度难控制
室温25℃压       369±15            0.40           特殊设备，处
轧破碎                                             理量小，耗力
室温0℃0.5cm     800±10            0.80           设备温控难，
玻璃珠机械破                                       时间长，耗能
碎
-20℃冰冻30℃    950±12            0.66           耗时耗能
融化
2mg溶菌酶/g      280±10            0.37           耗时，成本高，
湿重                                               得率低
本发明的方法     1205±10           0.90           无温度和设备
(鲜藻泥加入                                        限制，省力省
菌液)                                              能，规模不受
                                                   限制
本专利发明方        600±15          0.56            同上
法
(藻粉加入菌
液)
从表1中可以看出，与各种传统藻蓝蛋白提取方法相比，本发明的微生物培养液提取方法提取的藻蓝蛋白不仅产率高，而且提取的藻蓝蛋白的纯度也优于其他各种方法。本发明的方法不仅具有成本低廉、操作简便等优点，并且提取的蛋白纯度高，而且不破坏蛋白的生物活性，是一种非常适合于规模化生产藻蓝蛋白的方法。由于本发明避开了传统的物理化学法和溶菌酶法的苛刻条件和繁重操作，利用生物方法自然破壁一步即可提取较纯的藻蓝蛋白，大大简化了提取步骤，因而使藻蓝蛋白工业化生产成为可能。
实施例4  不同固氮菌提取藻蓝蛋白的对比
为了比较本发明中不同固氮菌提取藻蓝蛋白的优劣，在对照条件下按照实施例1中的方法对螺旋藻藻粉云南产香峰牌(北京阳光雨虹峰产品技术开发公司)100％藻粉500g进行提取，菌液均培养15小时，OD600为2，结果如表2所示。
                表2  不同细菌提取藻粉中藻蓝蛋白的对比图
                日勾维肠杆菌     肺炎克雷伯氏菌     产酸克雷伯氏菌
破碎时间(分)       30±8          30±5                40±5
粗提液藻蓝蛋白     0.50±0.20     0.60±0.15           0.55±0.15
纯度(A620/A280)
粗提液藻蓝蛋白     1300±10       1350±10             1300±15
浓度(μg/ml)
从表2可以看出，分别使用日勾维肠杆菌CGMCC No.0510，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)进行实施例1中的实验可以容易地得出类似的结果，都可以在很短时间破碎藻细胞，释放出藻蓝蛋白。藻蓝蛋白纯度和总藻蓝蛋白浓度都很理想。三种菌株都是不错的选择。其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS1.1734(＝CGCMCC 1.1734)略有优势，说明这些菌属都适用于本发明。
实施例5  按照本发明的方法提取各种蓝藻、蓝绿藻中的藻蓝蛋白
为了比较本发明中固氮菌液是否能很好适用于其他蓝藻、蓝绿藻的藻蓝蛋白提取，在对照条件下按照实施例1中的方法，样品为螺旋藻、鱼腥藻、集胞藻的鲜藻泥，湿重为200g，菌液用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，培养15小时，OD600为2，结果如表3所示。
表3  按照本发明的方法提取各种蓝藻、蓝绿藻中的藻蓝蛋白
                  螺旋藻            鱼腥藻            集胞藻
蛋白析出后显微    未见藻丝，未见    未见藻丝和任何    未见任何完整细
镜下观察          任何完整细胞，    完整细胞，细胞    胞，破碎效果很
                  破碎效果很好      破碎效果很好      好
藻蓝蛋白析出时    12                15                18
间(小时)
粗提液藻蓝蛋白    0.90              0.70              0.68
纯度(A620/A280)
盐析、层析后藻    5.12              4.83              4.15
蓝蛋白纯度
(A620/A280)
粗提液藻蓝蛋白    1350              650               620
浓度(μg/ml)
从表3可以看出，螺旋藻、鱼腥藻、集胞藻中的藻蓝蛋白均可以用本发明的方法简单提取出来，由于螺旋藻中藻胆蛋白含量高达鲜重的15-20％，且不含藻红蛋白，因此纯度和总蛋白提取都处于明显优势。目前国内最多养殖的也是螺旋藻，因此原材料供应充足，很适宜于提取藻蓝蛋白。本发明同样适用于其他蓝藻，其中集胞藻6803是蓝藻的模式植物，也能在菌液中很快破壁，析出蛋白。但也可以看出，由于鱼腥藻、集胞藻的本身蛋白含量不高，所以藻蓝蛋白提取量不够高，并非因为破壁不完全，而是由于其品系的缘故。所用显微镜是CARL ZEISS JENA，400×。
实施例6  不同藻和不同菌的反应结果对照
为了充分了解不同材料之间相互反应是否有特异性差别，设计了如下试验，将不同藻和不同菌分别作用。在对照条件下按照实施例1中的方法，样品为螺旋藻、鱼腥藻、集胞藻的鲜藻泥，湿重为100g，菌液用以上的肺炎克雷伯氏菌、日勾维肠杆菌、产酸克雷伯氏菌，培养15小时，OD600为2，结果如表4所示。
              表4  不同菌与不同鲜藻泥的作用对照图
                螺旋藻            鱼腥藻              集胞藻
日勾维肠杆菌    13小时破碎，粗    17小时破碎，        粗18小时破碎，
                提液A620/A280＝  提液A620/A280＝    粗提液
                0.9，粗提液蛋白   0.7，粗提液蛋白     A620/A280＝0.68，粗
                浓度(μg/ml)＝    浓度(μg/ml)＝700   提液蛋白浓度
                1300                                  (μg/ml)＝690
肺炎克雷伯氏菌  12小时破碎，粗    15小时破碎，粗      18小时破碎，
                提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝    粗提液
                0.9，粗提液藻蓝   0.7，粗提液藻蓝     A620/A280＝0.68，粗
                蛋白浓度          蛋白浓度            提液藻蓝蛋白浓
                (μg/ml)＝1350    (μg/ml)＝650       度(μg/ml)＝630
产酸克雷伯氏菌  12小时破碎，粗    16小时破碎，粗      17小时破碎，
                提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝    粗提液
                0.9，粗提液藻蓝   0.7，粗提液藻蓝     A620/A280＝0.68，粗
                蛋白浓度          蛋白浓度            提液藻蓝蛋白浓
                (μg/ml)＝1300    (μg/ml)＝670       度(μg/ml)＝650
从表4可以看出，以上各种螺旋藻、鱼腥藻、集胞藻与肺炎克雷伯氏菌、日勾维肠杆菌、产酸克雷伯氏菌两两相互交叉，没有显著性差异，作用基本相同，纯度、浓度和时间主要取决于藻本身。
应当理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。
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【12】Zarrouk C.Contribution a letude d′une cyanophycee.Influence dedivers factours physiques.et chimiques sur la croissance et laphytosynthese do Spirulina maxima，Ph.D Thesis，University of Paris.
【13】Allen MM，Simple conditions for growth of unicellular blue-greenalgae on plates，J.Phycol，1968 4：1-4
【14】A.Bennett.L.Bogorad，Complimentary chromatic adaptation in afilamentous blue-green alga，J.Cell Biol.58(1973)419-435
【15】胡一兵，胡鸿钧等，从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究，武汉植物学研究，2002，20(4)：299-302.

Claims (4)

1.一种提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于将特定固氮菌的培养液与蓝藻、蓝绿藻的藻泥或藻粉混合。
2.按照权利要求1的方法，其中所述固氮菌是日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
3.按照权利要求1或2的方法，其中所述固氮菌是日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)CGMCC No.0510，或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)。
4.按照权利要求1至3中任何一项的方法，其另外包含将藻蓝蛋白粗提物进一步用硫酸铵、凝胶层析、羟基磷灰石层析或Sephadex G-200柱层析纯化的步骤。
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