KR102667539B1 - 미세조류 클로렐라 글로리오사 mabik lp119의 염분 스트레스 조건에 따른 색소 생산성 증대 방법 - Google Patents
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Abstract
본원은 신규한 미세조류인 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주 및 이를 이용한 염분 스트레스 조건에 따른 카로티노이드 계열의 항산화 색소 생산성 증대 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 방법은 고농도의 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴 생산능을 향상시켜 천연색소, 의약용물질, 사료 및 화장품 등의 개발에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 독도 유래의 미세조류(Chlorella gloriosa MABIK LP119)를 이용한 염분 스트레스 유도에 따른 카로티노이드 계열의 항산화 색소 생산성 증대 방법에 관한 것이다.
카로티노이드는 40개의 탄소 원소로 이루어진 파이토엔(phytoene)으로부터 합성되는 터페노이드(Terpenoid) 계열의 색소로 여러 박테리아와 균류뿐만 아니라, 식물과 조류에 의해 광범위하게 합성되며, 긴 이중결합 사슬과 케톤기(C=O) 또는 수산화기(-OH)를 가지고 있기 때문에 강한 항산화제 효과로 면역기능을 향상시키며, 노화 방지의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 특유의 색과 어류 및 가금류의 착색효과를 통한 품질향상 등의 효과 때문에 사료나 식품 첨가물로도 많이 이용되고 있다. 카르티노이드는 인간을 포함한 포유류는 합성하는 능력이 없으므로 음식 등을 통해 섭취해야 한다.
구조적으로, 카로티노이드는 산소 원자의 결합 여부에 따라 산소가 없는 카로틴(Carotene)과 산소가 없는 잔토필(Xanthophyll)로 나눌 수 있다. 카로티노이드는 1800년대에 화학구조가 밝혀졌고, 1900년대에 스위스의 로슈사에 의해 공업적 합성을 시작으로 다양한 카로티노이드가 화학 합성을 하여 각종 가공식품, 음료류 등과 축육, 계란, 연어 및 송어 등의 착색제로 사용되어 왔으나 최근 FDA의 식품착색제의 표시 의무화와 건강 예방에 대한 사회적 욕구 및 합성품에 대한 소비자들의 거부감, 유해 가능성 등으로 카로티노이드를 생산하기 위한 새롭고 환경 친화적인 방법이 요구되고 있으며, 생물을 활용한 천연 카로티노이드의 생산 연구가 많이 이루어지고 있다.
세계 카로티노이드 시장은 총 10개의 제품군으로 분류할 수 있으며 이는 베타카로틴(Beta-carotene), 루테인(Lutein), 아스타잔틴(Astaxanthin), 캡산틴(Capsanthin), 아나토(Annatto), 칸타잔틴(Canthaxanthin), 라이코펜(Lycopene), 베타-아포-8-카로테날(Beta-apo-8-carotenal), 제아잔틴(Zeaxanthin), 베타-아포-8-카로테날-에스터(Beta-apo-8-carotenal-ester)이다. 이 중 베타카로틴, 루테인과 아스타잔틴의 경우 2억 달러 이상의 시장 가치를 지니고 있어 주로 많은 연구가 이루어지고 있다. 현재 베타카로틴이나 아스타잔틴과 같은 주요 카로티노이드 상품들은 화학적인 합성법이 개발되었으나, 시간이 지남에 따라 화학적 합성으로 생산된 이 상품들의 가격은 지속적으로 하락하고 있다. 그러나 이러한 카로티노이드 상품의 시장 가치가 지속적으로 증가하는 이유는 기존의 포화된 사료, 식료품 시장과 차별화된 천연 카로티노이드를 이용한 의약품이나 화장품의 고부가 가치 시장이 새롭게 생성되었기 때문이다. 이러한 천연 카로티노이드를 생산하는 주된 플랫폼으로 현재 사용되고 있는 것이 미세조류이다. 천연 카로티노이드에 관해서는 미세조류의 광합성 관련 조직과 밀접한 관계가 있고, 특히 미세조류의 경우 광합성이 가능하여 이산화탄소의 저감 효과가 우수하고 식량자원과 관련된 정치·사회적 문제도 발생하지 않으며, 생산수율도 높아 육상식물과 달리 최적의 친환경적 소재라는 장점이 있다. 현재 미세조류에서 주로 생산되고 있는 카로티노이드 상품으로는 베타카로틴, 루테인, 아스타잔틴 등이 있다.
미세조류를 이용한 대표적인 카로티노이드 계통의 유용생산물 예로는 녹조류에 속하는 Haematococcus pluvialis를 이용한 항산화성 카로티노이드 생산을 들 수 있다. 특히 Haematococcus pluvialis가 생산하는 아스타잔틴은 양식산업에서 천연색소의 중요한 첨가제 역할을 하며, 상업적으로 아주 유용한 물질로 주목받고 있다. 또한 녹조류에 속하는 Scenedesmus almeriensis, Chlorella protothecoides 및 Chlorella zofingiensis를 이용한 루테인의 상업적 생산이 이루어지고 있고, 루테인은 안구로 들어온 유해한 광선을 흡수하는 항산화 역할을 하여 망막을 보호하고, 노화로 인한 시력 저하 및 노인성 황반변성에 예방적 효과가 인정받아 상업적 활용이 기대되고 있다. 이러한 상업적 이용가능성 때문에, 카로티노이드 함유량을 증가시키고자 UV, 청색광 LED 등 단파장 빛에 의한 스트레스, 질소원 고갈에 의한 스트레스, 염분에 의한 스트레스 등 관련 연구가 증가하고 있고, 생산량을 늘리기 위한 생물 공학적 생산기술 연구도 지속해서 이루어지고 있다.
이와 같은 산업적인 중요성과 연구에도 불구하고, 카로티노이드 계통의 생산 기작이나 영향을 미치는 요인에 대한 기본적인 이해는 크게 미흡한 실정이다.
본 발명은 기탁번호 KCTC 13751BP로 기탁된 독도 유래의 미세조류(Chlorella gloriosa MABIK LP119)를 이용한 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴 생산성을 증대시키고자 한다.
한 양태에서 본원은 기탁번호 KCTC 13751BP로 기탁된 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주를 특정 염분 농도에서 배양하여 루테인, 베타카로틴 또는 비올라크산틴를 포함하는 카르티노이드 성분의 생산성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 방법은 상기 균주를 염분 농도 45psu (practical salinity unit)를 포함하는 배지에 접종하고 배양하는 단계; 상기 균주의 배양물로부터 색소를 추출하는 단계; 및 상기 색소로부터 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴을 분리하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법에 의한 균주의 루테인, 베타카로틴 및 상기 베타카로틴의 생산능은 염분 구간 45 psu에서 루테인 483 ng/mL, 베타카로틴 48 ng/mL 및 비올라크산틴 79 ng/mL이며, 배지의 염분 농도를 45psu로 이 농도를 벋어나는 경우, 상기 생산능이 달성되지 않는다.
일 구현예에서 본원에 따른 균주는 배양하는 단계에서 배양시간은 최소 30시간이다.
다른 양태에서는 본원에 따른 방법에 의해 배양된 미세조류 및/또는 이의 배양액을 포함하는 루테인, 베타카로틴 또는 비올라크산틴의 생산용 미생물 제제가 제공된다.
또 다른 양태에서는 본원에 따른 방법에 의해 배양된 미세조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강기능 식품이 제공된다.
또 다른 양태에서는 본원에 따른 방법에 의해 배양된 미세조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류 사료가 제공된다.
본원에 따른 방법에 의해 배양된 미세조류 (Chlorella gloriosa MABIKLP119)는 45psu를 포함하는 염분 스트레스 조건에서 카로티노이드 계열의 항산화 색소의 생산성이 증대되어 이들의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 염분 농도는 특히 증발이 일어나 염분의 농도가 증가하는 옥외 배양시 특히 유리하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIKLP119의 광학현미경 사진이다.
도 2은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIKLP119의 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIKLP119의 투과전자현미경 사진이다.
도 4은 본원에 따른 18S rRNA 염기서열 데이터로부터 해석된 MABIK LP119 균주와 근연종들 간의 계통적관계로, 계통수는 최대우도법을 이용하여 1,000회의 부트스트랩 반복을 거쳐 만들어졌다. 축척 막대는 염기서열에서 1% 차이를 의미한다
도 5은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 세포 농도에 따른 흡광도 값과 검량선 사진이다.
도 6은 본원에 따른 각 염분 농도 구간별 배양 기간에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 세포 농도 변화 사진이다.
도 7은 본원에 따른 실험 종료 후 각 염분 농도 구간별 배양액 사진이다.
도 8은 본원에 따른 각 염분 농도 구간별 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 비성장속도(specific growth rate) 값 사진이다.
도 9은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 15 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 10은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 30 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 11은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 45 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 12은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 60 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 2은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIKLP119의 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIKLP119의 투과전자현미경 사진이다.
도 4은 본원에 따른 18S rRNA 염기서열 데이터로부터 해석된 MABIK LP119 균주와 근연종들 간의 계통적관계로, 계통수는 최대우도법을 이용하여 1,000회의 부트스트랩 반복을 거쳐 만들어졌다. 축척 막대는 염기서열에서 1% 차이를 의미한다
도 5은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 세포 농도에 따른 흡광도 값과 검량선 사진이다.
도 6은 본원에 따른 각 염분 농도 구간별 배양 기간에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 세포 농도 변화 사진이다.
도 7은 본원에 따른 실험 종료 후 각 염분 농도 구간별 배양액 사진이다.
도 8은 본원에 따른 각 염분 농도 구간별 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 비성장속도(specific growth rate) 값 사진이다.
도 9은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 15 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 10은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 30 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 11은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 45 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
도 12은 본원에 따른 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119의 60 psu 염분 구간의 HPLC 광합성 색소 검출 사진이다.
본원은 독도 유래의 미세조류 Chlorella gloriosa MABIK LP119를 특정 염분 스트레스 조건하에서 배양하여 카로티노이드 생산성을 증대시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이에 한 양태에서 본원은 기탁번호 KCTC 13751BP로 기탁된 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주를 염분 농도 15 내지 60 psu를 포함하는 배지에 접종하여 배양하는 단계; 상기 균주의 배양물로부터 색소를 추출하는 단계; 및 상기 색소로부터 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴을 분리하는 단계를 포함하는, 루테인, 베타카로틴 또는 비올라크산틴의 생산 향상 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 녹조류는 해양생태계의 1차 생산자로서 지구의 탄소, 질소 및 인 순환에 중요한 역할을 담당하고 있다. 미세조류는 광합성을 통해 이산화탄소를 고정하여 다양한 고부가가치 유기물질로 전환시킬 수 있어 근래 들어 미세조류는 상당한 주목을 받고 있다.
본원에 개시된 미세조류(microalgae) 클로렐라 글로리오사는 Chlorellaceae(family)에 속하는 녹조류이다. 본원에 개시된 미세조류의 형태적, 분자적, 및 생화학적 특성을 분석한 결과, 본 균주는 Chlorella 속에 속하며, 우리나라에서 최초로 발견된 균주이자 독도의 바다에서 공식 기록이 없는 미기록종임을 밝혀, 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주라 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2018년 11월 30일자로 기탁번호 KCTC 13751BP 기탁되었다.
본원에 따른 미세조류는 광학현미경 및 전자현미경 검경 결과 분리 균주는 둥근 모양 형태, 얇은 세포벽, 컵 모양 엽록체 모양, 피레노이드 존재 여부와 같이 클로렐라 글로리오사와 매우 유사한 형태적 특징을 나타낸다(도 1, 도 2, 도 3). 또한 본원에 따른 미세조류는 분자생물학적 분석 결과도 클로렐라 글로리오사에 속하는 것으로 나타났다.
본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 미세조류는 광범위한 염분 범위(10-60 psu)에서 생존할 수 있으며 30 psu에서 최대 성장률을 보이고, 고염 염분 농도인 45 psu 농도에서도 높은 성장률을 보인다.
본원에 따른 미세조류는 특히 45 psu 농도에서 고함량의 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴을 포함하는 카로티노이드 생산능을 가져 이러한 조건에서 유용물질 생산에 효과적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 균주의 루테인, 베타카로틴 및 상기 베타카로틴의 생산능은 염분 구간 45 psu에서 루테인 483 ng/mL, 베타카로틴 48 ng/mL 및 비올라크산틴 79 ng/mL이다.
본원에서 "생산능" 이란 미세조류 단위 개체수 당 총 루테인 양의 증가, 베타카로틴 양의 증가, 비올라크산틴 양의 증가를 포함한다. 상술한 것 중 어느 하나라도 목적하는 유용 물질의 생산증가는 물론, 농도가 높아지게 되어, 분리가 용이해질 수 있다.
본원에 따른 균주는 미세조류의 광합성 색소조성을 분석한 결과 항산화 카로티노이드계 색소, 특히 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴을 고농도로 함유하고 있다. 현재 베타카로틴과 같은 주요 항산화 카르티노이드 물질 및 루테인은 주로 화학적 합성법으로 생산이 되나, 고부가가치를 갖는 의약품, 건강기능식품이나 화장품에 천연 카로티노이드의 수요가 증가하여, 이러한 천연 카로티노이드를 생산하는 주 플랫폼으로 사용될 수 있다. 최근에는 사람의 눈을 보호하는 기능으로 인해 더욱 관심을 받고 있는 루테인과 베타카로틴의 생산에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한 비올라크산틴은 천연소재로 활용으로 안정성이 뛰어나며, 염증을 저해하는 효과와 노화방지 효과가 우수하다. 이에 본원에 따른 상기 미세조류는 기능성식품, 천연색소, 화장품, 의약용물질 등의 원료로 이용될 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 본원에 개시된 균주 및/또는 이의 배양액을 포함하는, 미생물제제에 관한 것으로, 이러한 미생물제제는 베타카로틴 생산, 루테인 생산, 비올라크산틴 생산을 효과적으로 사용될 수 있다
본원에 따른 균주의 배양액은 본원에 따른 미세조류가 목적하는 적절한 조건에서 배양된 배지로, 상기 배지는 상기 미세조류의 배양에 필요한 영양물질 및/또는 특수한 목적을 위한 물질을 포함한 액체 조성물이며, 배양액은 미세조류가 배양된 후 제거된 것, 또는 미세조류를 포함한 것을 모두 포함한다.
본원에 따른 균주는 일반적으로 미세조류가 잘 성장할 수 있는 배지이면서도 배지 조성이 단순하고 제조가 간단한 대표적인 배지인 f/2-si 배지가 사용된다.(Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA 참조). 본 발명에서 이용되는 배지는 이에 한정되는 것은 아니나 질산염류, 인산염류, 금속염류, 비타민류 및 해수 등을 포함하는 배지에서 수행되는 것이 바람직하다.
본원에 따른 미세조류는 광범위한 염분 범위(10-60 psu)에서 생존할 수 있다. 이러한 광염성(廣鹽性, euryhaline)의 특성으로 인해 옥외 배양시설에서 대량배양 시 염분 농도에 따른 계절과 수질의 영향을 적게 받는 장점이 있어, 유용물질 생산에 효과적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 미세조류는 f/2-si 배지에서 백색 형광등을 이용하여 약 20 μE m-2s-1의 조도로 20℃에서 160 rpm으로 교반시키면서 14시간:10시간(낮:밤) 주기로 20일간 배양된다.
본원에 따른 카르티노이드 색소의 분리 또는 추출은 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 용매추출법, 초음파추출법, 여과법, 환류추출법, 초임계추출법 등 기존에 알려진 통상적인 추출법을 모두 활용할 수 있으며 상기한 여러 추출과정은 수율을 향상시키기 위해 수 회 반복할 수 있다. 또한 농축 혹은 동결건조 등의 과정을 통해 고농도의 추출물을 제조할 수 있다. 일 구현예에서 카로티노이드 추출을 위해 사용한 용매는 아세톤 혹은 클로로포름-메탄올 혼합용매이나 이들 용매에 한정되는 것은 아니며 탄소수 1에서 5까지의 알코올, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 헥산, 디클로로메탄, 에틸에테르 등의 유기용매 및 이들의 혼합물의 사용이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 균주(균체) 또는 이의 배양액 또는 균주 및 배양액을 포함하는 배양물을 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 혹은 사료 첨가제를 제공한다. 상기 균주의 배양체는 그 자체로 혹은 건조 등의 처리를 거쳐 사료로 사용될 수 있으며 다른 기초사료의 첨가제로 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주(균체) 또는 이의 배양액 또는 균주 및 배양액을 포함하는 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성식품 조성물을 제공한다. 상기 균주의 배양체는 통상적인 식품공정의 처리를 거쳐 분말 등의 상태로 기능성 건강보조식품으로 사용될 수 있다. 상기 균주의 배양체 혹은 추출물은 또한 다른 식품에 첨가물로 사용될 수 있으며 다른 식품의 종류에 특별한 제한은 없다.
또한, 본원은 본원에 따른 미세조류 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성식품 조성물을 제공한다. 본원이 미세조류를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 또한 본원은 건강 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분 예를 들면 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다. 본원에 따른 건강 기능성 식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 목적에 따라 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 성인기준 1일 0.01g 내지 10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강 기능성 식품을 섭취함으로써 항산화 효과를 얻을 수 있다
또한, 본원은 상기 균주 또는 이의 배양액 또는 균주 및 배양액을 포함하는 배양물을 유효성분으로 포함하는 동물용 특히 어류용 사료 첨가제에 관한 것이다. 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 재료 및 방법
시료 채집 및 미세조류 독도 유래 미세조류 Chlorella gloriosa 분리
해수시료는 2018년 7월에 동해 독도 에서 채수되었다. 당시 해수의 수온은 18℃였고 염도는 37.5였다 (표 1). 시료는 즉시 실험실로 옮겨 f/2 한천배지가 담긴 페트리 디쉬에 현장 해수를 1 mL 접종하였다. 세균의 생장을 억제하기 위하여 광범위 항생제인 이미페넴을 100 μg mL-1의 농도로 첨가하였다. 현장 해수를 접종한 페트리 디쉬는 18℃에서 형광등을 이용하여 약 40 μmole m-2 s-1의 광량을 주어 14시간:10시간(낮:밤) 조건으로 미세조류의 녹색 콜로니(colony)가 확연할 때까지 정치(靜置)배양을 실시하였다. 단일 군락 (single colony)는 20 μg mL-1 농도의 이미페넴을 함유한 새로운 f/2 한천배지 상에 무균적으로 획선분획(streaking)하였으며, 무균적 배양체가 얻어질 때까지 이 과정을 되풀이 하였다.
[표 1] 채집 위치
형태적 동정
순수분리한 미세조류 배양체는 f/2 액체배지에서 궤도형 쉐이커를 이용하여 160rpm 속도로 4주간 배양되었고, 배양 온도는 18℃였다. 살아있는 세포의 일반적인 형태적 특징은 Nikon Eclipse Ni 광학현미경을 이용하여 1,000×배율로 관찰 및 촬영하여 분석하였다. 주사전자현미경 관찰을 위해 mL 당 약 ~2X106 세포의 농도로 10mL의 배양액을 준비하여 최종농도 1% (v/v) 사산화오스뮴으로 10분간 고정하였다. 고정된 세포는 3μm의 공극 크기를 가진 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 수집하여 증류수로 세 차례 세척하고, 배지의 성분 및 염분을 제거하였다. 멤브레인 필터는 에탄올을 단계별(10, 30, 50, 70, 100% 및 100% 2회)로 각 2분씩 처리하여 탈수과정을 진행하였으며, 초임계건조기로 건조한 시료를 알루미늄 스터브에 올려놓고 저진공 coater를 이용하여 금-팔라듐 코팅을 실시하여 주사전자현미경으로(S-4800; Hitachi, Hitachinaka, Japan) 세포 표면의 형태적 특성을 관찰하였다. 투과전자현미경 관찰을 위해 10mL의 배양액을 준비하여 최종농도 2.5% (v/v) 글루타르알데하이드로 1.5시간 동안 고정하였다. 고정된 세포는 10mL 용량의 원심분리용 시험관으로 옮겨져 1,610xg에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리된 미세조류 펠릿은 1.5mL 용량의 미량 원심분리기용 시험관으로 옮겨져 0.2 M 농도의 pH 7.4의 카코딜산나트륨 완충용액으로 수차례 세척한 후 최종농도 1% (v/v) 사산화오스뮴으로 1.5시간 2차 고정하였다. 고정된 펠릿은 한천 사이에 embed 시켜 에탄올을 단계별(50, 60, 70, 80, 90%, 100% 및 100% 2회)로 처리하여 탈수과정을 진행하였다. 탈수한 펠릿은 Spurr’resin에 embed 시킨 후 초박절편기를 이용하여 박막을 준비한 후 3% (w/v) uranyl acetate과 lead citrate로 이중 염색한 다음 H-7650 투과전자현미경으로 (JEOL-1010 TEM; JEOL, Tokyo, Japan) 100kV에서 관찰하였다.
분자생물학적 동정
분자생물학적 분석을 위해, genomic DNA를 DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 추출하였고 Wizard Genomic DNA Clean-Up System으로 추가적인 정제를 실시하였다. White 등에 의해 보고된 NS1 프라이머와 새롭게 디자인한 Chlorella_gloriosa_1768R 프라이머가 18S rRNA을 중합효소연쇄반응 (PCR) 증폭하기 위하여 사용되었다. ITS1/ITS4 범용프라이머가 ITS 단편을 증폭하기 위하여 사용되었고, NL1/NL4 프라이머을 이용하여 D1-D2 부분의 LSU rRNA 단편을 증폭하여 사용하였다. rRNA 염기서열의 높은 보존성 때문에 RuBisCO rbcL 엽록체 유전자를 Verbruggen (Verbruggen et al. Mol. Phylogenet. Evol. 50:642-653.2009) 등이 제안한 rbcL 7F 및 rbcL 1391R 프라이머와 Fama (Fama et al. gene. J. Phycol. 38:1040-1050. 2002; Vieira et al. Algae 31:155-165. 2016) 등이 제안한 tufA F/tufA R 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물을 정제한 후 pGEM-T Easy 벡터 (Promega)를 이용하여 대장균 DH5α로 형질전환하여 염기서열 분석을 실시하였다.
MABIK LP119 균주의 18S rRNA 유전자를 이용한 계통관계분석은 MEGA ver. 7.0 소프트웨어 패키지를 사용하여 실시하였다. MABIK LP119 근연종들의 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI) 데이터 베이스에서 다운로드하여 ClustalW를 이용하여 정렬하였다. 베이시안 정보 기준에 근거하여 best-fit nucleotide substitution model인 Kimura 2-parameter + Gamma distributed를 18S rRNA에 계통 관계 분석을 위하여 선택하였다. 이 모델을 사용하여 1,000회의 부트스트랩 반복을 거쳐 최우도 계통수를 작성하였다. Pseudendoclonium spp.을 계통수에서 외집단으로 사용하였다. 모든 유전자 분석은 3회반복으로 실시하였으며 본 연구를 통해 얻어진 염기서열 정보는 미국 국립생물정보센터 데이터베이스에 MK182466, MN513335, MN513337, MN519695 및 MN519696으로 등록하였다 (표 2). 하기 표 2는 본 연구를 통해 얻어진 유전자의 서열을 이용한 BLAST 검색 결과를 나타낸 것이다.
[표 2]
염분 구간별 배양조건
배양배지는 일반적으로 미세조류가 잘 성장할 수 있는 배지이면서도 배지 조성이 단순하고 제조가 간단한 대표적인 배지인 f/2-si 배지를 사용하였다 (Guillard, R.R.L. 1975 Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp.26-60. In Culture of Marine Invertebrate Animals (Smith WL and MH Chanley eds.). Plenum Press, New York, USA). 배지의 pH는 8.0으로 조절하였으며 해수는 0, 10, 30, 45, 60, 75 psu로 염분을 조절하기 위해 질소와 인 성분이 제거된 해염(Red Sea, Israel)를 사용하였다. 염분은 SK-10S digital saltdensimeter (SATO, JPN) 장비를 활용하여 정확하게 측정하여 실험을 진행하였다. 염분을 맞춘 각각의 배지는 일반적인 미세조류의 배양 최적 조건인 25℃로 조절된 multi-plant growth chamber (JEIO TECH, Korea)에서 배양하였으며 광주기는 14:10의 L/D cycle로, 광도는 20 μmol m-2 s-1으로 유지하였다. 초기 세포 농도는 약 1X105 cells mL-1 였으며, 배양용기는 50 mL의 cell culture flask를 사용하였고 총 용량을 25 mL로 맞추어 150 rpm의 shaking 속도로 진탕배양을 진행하였다.
염분 구간별 일 성장률 측정
독도 유래의 미세조류 Chlorella gloriosa MABIK LP119의 일일 성장률은 흡광도 기법을 이용하여 측정하였으며, 매 24시간마다 Multiskan™ FC Microplate reader (Thermo Scientific™, USA)를 활용하여 투명한 96-well plate에서 100 μL의 배양액을 분주하여 750nm 파장으로 optical density (OD)를 측정하였고, 이후 Hemocytometer를 이용하여 세포 농도를 정량한 이후 검량선(Calibration curve)을 만들고 (도 5) 배양된 미세조류의 OD 값을 적용하여 20일간 세포수를 계산하여 미세조류의 성장변화를 분석하였다(Al Ahmad et al. 2014, RF Microalgal lipid content characterization. Scientific reports, 4(1), 1-6). 성장률은 Guillard et al. (In Culture of Marine Invertebrate Animals (Smith WL and MH Chanley eds.). Plenum Press, New York, USA.1975).를 따라 계산하였으며 수식은 다음과 같다. μ=ln (N2/N1) / (t2-t1) 여기서 시간은 t1과 t2, 개체수는 N1과 N2를 나타낸다.
카로티노이드 분석
카로티노이드는 Song et al. (2020). Microbial Cell Factories, 19(1), 1-9)과 Baek et al. (2018) Biotechnology and bioengineering, 115(3), 719-728)이 사용한 분석법을 이용하여 다음과 같이 진행하였다. 먼저, 30일간 배양된 각 염분 구간별 미세조류 배양액 3 mL를 5분간 12,000 xg 에서 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, 증류수를 이용하여 세포를 3회 씻어주었다. 그 후 다시 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 1 mL의 90% 아세톤(HPLC grade)을 첨가하여 Ultrasonic으로 5분간 세포를 파쇄하여 추출을 진행하였다. 이후 아세톤 추출물에 함유된 카로테노이드를 HPLC system (1260 Infinity, Agilent, Germany)를 이용하여 분석하였다. 이동상 용매는 A(14% 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 84% acetonitrile, 2% methanol), B(68% methanol, 32% ethyl acetate) 두 가지를 Gradient 조건으로 사용하였으며 0~15분은 이동상 A, 15~19분은 이동상 B, 19분 이후 6분간은 이동상 A로 1.2 mL/min의 flow rate로 분석하였다. 분석용 컬럼(Column)은 Spherisorb S5 ODS1(4.6 x 250 mm)의 column (Waters, USA)을 활용하였고, 아세톤 추출물 시료 10 μL를 주입하여 Column 온도를 40도씨로 설정하여, DAD 검출기로 25분간 분석을 진행하였다. 분석을 통해 확인된 HPLC 크로마토그램의 Area 값은 카로티노이드 표준시약의 농도의 Area 값과 비교하여 정량하였으며, 이를 통해 독도 유래의 미세조류 Chlorella gloriosa MABIK LP119 카로티노이드 색소를 분석하였다.
실시예 1. 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주의 동정
클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주는 독립적이고 운동성이 없으며 전체적으로 둥근 모양을 보이고 세포의 지름은 4-7 μm로 나타났다 (도 1, 3). 세포는 얇고, 매끄러운 세포벽으로 둘러싸여 있으며 컵 모양의 엽록체와 피레노이드가 존재했다 (도 1, 3). 또한 모세포에서 딸세포들이 연속적으로 분할되면서 보이는 무성생식 현상이 관찰되었다 (도 2, 3). 전반적으로 MABIK LP119 종주는 전형적인 클로렐라 글로리오사 형태적 특징을 보였다. 18S rRNA 염기서열 분석 결과에서 추론된 분자적 특성 또한 클로렐라 글로리오사 종들과 매우 밀접한 관련이 있음을 보여주었다 (표 3, 도 4). 그러므로 해양미세조류 균주는 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119로 동정 되었고, 국립해양생물자원관 바이오뱅크와 한국생명공학연구원 생물자원센터에 MABIK-LPS-0119, KCTC13751BP으로 균주 등록 및 특허 기탁하였다. 게다가, ITS 영역, 28S rRNA 서열, rbcL 및 tufA 유전자를 분석하였으나, NCBI 데이터베이스를 이용하여 BLAST 검색을 통해 분류학적 위치에 대한 결정적인 증거는 발견되지 않았다 (표 3).
[표 3]
실시예 2. 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주의 염분에 따른 성장 변화
미세조류 배양 20일 동안 0~75 psu의 서로 다른 염분 구간별 세포 농도(cell concentration)를 확인 한 결과 15, 30, 45, 60 psu에서 초기 농도보다 증가하는 결과를 보였다(도 6). 하지만 최대 고염 구간인 75 psu과 최소 염분 구간인 0 psu에서는 세포 농도 변화가 거의 없었다(도 6). 30 psu 염분 구간에서 가장 높은 세포 농도를 보였고, 전 세계 바닷물의 평균 염분 농도인 35 psu보다 높은 고염 구간인 45 psu에서 그 다음으로 높았다 (도 6). 이러한 결과는 배양 20일 후 배양액 사진에서도 확인할 수 있었다(도 7). 또한 20일 배양 이후 비성장속도 (specific growth rate)를 계산하였을 시 30 psu에서 최대 SGR 값을 보였고 그 다음 높은 구간은 45 psu 였다. (도 8).
실시예 3. 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주의 염분에 따른 카로티노이드 축적량 변화
클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주 염분에 따른 광합성 색소 생산량 변화 변화는 3회 반복 측정치의 평균 ±표준편차를 기초로 하여 표 4에 나타냈다.
[표 4]
본원에 따른 분리주의 주요 카로티노이드는 루테인 (Lutein), 베타카로틴(ß및 비올라크산틴(Violaxanthin)으로 확인되었다(도 9, 10, 11, 12). 15 psu와 30 psu 염분 구간에서는 약 260-280 ng/mL의 루테인이 생산되었다(도 9, 10). 하지만 베타카로틴과 비올라크산틴은 검출한계 이하로 분석 소프트웨어에서 식별되지 않았다. 염분 60 psu 구간에서는 루테인이 133 ng/mL 농도로 생산되었지만, 베타카로틴 및 비올라크산틴은 식별되지 않았다(도 12). 45 psu 에서는 서로 다른 염분 구간에서 가장 높은 루테인(483 ng/mL)이 생산되었다. 또한 다른 염분 구간에서 식별되지 않았던 베타카로틴(48 ng/mL)과 비올라크산틴(79 ng/mL)이 식별된 것을 확인할 수 있었다(도 11).
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제번호]2021M00100
[부처명]해양수산부
[과제관리(전문)기관명]국립해양생물자원관(기획조정실)
[연구사업명]국가자산화 확대
[연구과제명]해양생물자원 효율적 확보 및 분류 연구
[기여율]1/1
[과제수행기관명]국립해양생물자원관(생물분류실)
[연구기간]2021.01.01 - 2021.12.31
Claims (6)
- 기탁번호 KCTC 13751BP로 기탁된 클로렐라 글로리오사 MABIK LP119 균주를 염분 농도 45 psu를 포함하는 배지에 접종하고 배양하는 단계;
상기 균주의 배양물로부터 색소를 추출하는 단계; 및
상기 색소로부터 루테인, 베타카로틴 및 비올라크산틴을 분리하는 단계를 포함하는, 루테인, 베타카로틴 또는 비올라크산틴의 생산 향상 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 균주의 루테인, 베타카로틴 및 상기 베타카로틴의 생산능은 염분 구간 45 psu에서 루테인 483 ng/mL, 베타카로틴 48 ng/mL 및 비올라크산틴 79 ng/mL인, 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 배양하는 단계에서 배양시간은 30시간인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 배양된 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 루테인, 베타카로틴 또는 비올라크산틴의 생산용 미생물 제제.
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
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| GRNT | Written decision to grant |