KR102019448B1 - 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류 - Google Patents

루테인 생산성이 높은 신규 미세조류 Download PDF

Info

Publication number
KR102019448B1
KR102019448B1 KR1020180018418A KR20180018418A KR102019448B1 KR 102019448 B1 KR102019448 B1 KR 102019448B1 KR 1020180018418 A KR1020180018418 A KR 1020180018418A KR 20180018418 A KR20180018418 A KR 20180018418A KR 102019448 B1 KR102019448 B1 KR 102019448B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chlorella
lutein
genus
extract
microalgae
Prior art date
Application number
KR1020180018418A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190098455A (ko
Inventor
김희식
조대현
허진아
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020180018418A priority Critical patent/KR102019448B1/ko
Publication of KR20190098455A publication Critical patent/KR20190098455A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102019448B1 publication Critical patent/KR102019448B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/05—Chlorophycota or chlorophyta (green algae), e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/202—Algae extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • C12R1/89—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류에 관한 것으로, 본 발명의 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)는 바이오매스 생성이 높고, 루테인 함량이 높으므로, 루테인을 생산할 수 있는 생물자원으로 이용될 수 있으며, 클로렐라속 HS3 유래의 원료를 루테인을 필요로 하는 약학적 조성물, 건강기능식품 또는 사료 조성물에 사용할 수 있다.

Description

루테인 생산성이 높은 신규 미세조류{Novel microalgae having high productivity for lutein}
본 발명은 성장률이 우수하고, 높은 루테인 함량을 특징으로 하는 클로렐라속 미세조류에 관련한 것이다.
황반변성이란 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직인 황반에 변성이 일어나 시력 장애를 일으키는 질환으로, 시세포의 대부분이 황반에 모여 있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 황반은 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 황반변성을 일으키는 가장 많은 원인은 연령 증가(연령관련 황반변성)를 들 수 있고, 가족력, 인종, 흡연과 관련이 있다고 알려져 있다. 황반부는 중심 시력을 담당하는 곳이므로, 이곳에 변성이 생기면 시력 감소, 중심암점, 사물이 찌그러져 보이는 증상인 변시증 등이 나타난다.
황반변성은 크게 비삼출성(건성)과 삼출성(습성)으로 구분하게 되는데 비삼출성인 경우 망막 및 맥락막 위축이 나타나는 후기를 제외하고는 대부분 시력에 큰 영향을 주지 않는다. 반면에, 삼출성의 경우에는 망막 하에 드루젠이라는 노란 침착물이 보이는 단계이나, 망막하 출혈이나 망막하액, 색소상피박리 등이 나타나고 이러한 병변의 위치가 황반 아래 또는 황반에 바로 이어져 있는 경우에는 초기부터 시력저하가 나타난다. 삼출성 황반변성의 경우 전체 황반변성의 10~20% 정도를 차지하지만, 만일 삼출성 황반변성을 치료하지 않고 그대로 방치해두면, 시력이 빠르게 저하되어 많은 환자들이 진단 후 2년 내에 실명에 이르게 된다. 황반변성을 예방하기 위해서는 정기적인 안저 검사를 통해 황반부의 이상을 초기에 발견과 비만, 흡연, 고혈압 등의 조절 가능한 인자를 줄이도록 애쓰는 것이 중요하다.
백내장은 주로 나이를 먹으면서 수정체가 활성산소에 의해 산화되는 것이다. 수정체의 조직이 파괴되면 수정체는 희게 탁해지고 시력이 저하된다. 루테인은 이러한 산화 작용을 저해한다고 알려져 있다. 또한 혈중 카로티노이드 농도가 높은 사람에게서 백내장 발병률이 감소함이 보고되었으며 루테인의 섭취가 노인인구 시력손상의 위험성을 낮출 수 있는 것으로 보고되었다.
황반변성 또는 백내장을 예방하는 예로써, 노화에 의한 손상을 감소시켜 망막을 건강하게 유지하거나, 수정체의 손상을 막는 역할을 하는 루테인과 같은 색소를 섭취하는 방법이 있다. 루테인은 야채와 과일을 통해 충분히 섭취하거나, 상용화된 비타민제를 복용할 수 있다.
황반색소는 망막의 중앙 부분에서 기인한 노인성 시력감퇴를 줄여주고, 밝은 광선에 의한 망막조직의 손상을 막아주는 역할을 하는 것으로 대표적인 예로 카로티노이드의 산소화에 의해 생산되는 카로티노이드계의 옥시카로티노이드 색소로 잔토필이 있다. 잔토필류에 속하는 색소로는 루테인이 있다. 루테인은 몸속에서 자연적으로 생성되는 산소 자유라디칼에 의해서 손상되는 눈의 내부를 보호하는 항산화제로서 활동하며, 암 종양에 혈액을 공급하는 혈관의 성장을 줄여 암세포를 사멸시켜, 유방, 결장, 폐, 난소암, 피부암 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
동물은 잔토필을 생성할 수 없고, 음식의 섭취를 통해서만 얻을 수 있다. 이러한 잔토필은 식물의 잎사귀, 꽃, 과실 등의 녹색부에 엽록소, 카로틴과 같이 존재한다. 최근 잔토필류를 포함하는 눈 건강을 위한 건강기능식품 등이 각광받고 있다.
루테인의 원료로는 기존의 마리골드 꽃이 대표적이며, 다른 고등식물에서 추출하는 것도 연구되어 있다. 그뿐만 아니라, 박테리아에서 색소 합성 기작을 유전적으로 변이시켜 루테인을 생산하기도 한다. 미세조류로부터 이들 색소를 얻는 연구도 진행된 바 있다. 이러한 종래의 원료물질 중 마리골드 꽃은 생산을 위해 화초를 육종하기까지 시간이 오래 걸리고, 연 1회만 수확가능하다는 단점이 있고, 생산을 위한 토지 면적에 비해서 생산량이 많지 않아 생산 단가가 높은 문제가 있다.
루테인의 생산 단가를 낮추기 위하여, 고등식물 시스템을 대체하기 위한 박테리아 시스템을 이용해 색소 합성 기작을 삽입한 루테인 생산 조류 개발이 이루어졌지만, 박테리아에서 얻어지는 색소는 궁극적으로 식품 첨가물로 이용되기에는 부적합하다는 문제점이 있다. 또한, 유전자 삽입 기술 등을 이용한 유전자 재조합 식품(GMO; genetically modified organism)은 국내에서 선호되고 있지 않기 때문에 소비자들의 인식이 중요한 식품 첨가물 시장에는 치명적 단점으로 작용하며, 고등식물 시스템과 마찬가지로 박테리아 배양액이나 바이오 리액터 등을 유지하는 비용이 많이 소요된다. 따라서, 기존에 사용되었던 원료를 대체하거나, 원료가 되는 생물이 루테인을 많이 생성하도록 별도의 배양 방법을 도입하거나, 원료로부터 루테인을 효율적으로 추출할 수 있는 방법의 개발의 요구가 계속되고 있다. 예를 들면 특허문헌 1에는 미세조류로부터 루테인을 포함하는 다양한 지질의 생성을 촉진하기 위해서 미세조류에 진동을 가하는 기술이 개시되어 있다. 미세조류는 카로테노이드를 세포 내에 축적하여 광합성시에 광을 수집하고, 에너지를 전달하며, 높은 광으로부터 스스로를 보호한다. 따라서, 미세조류로부터 카로테노이드와 같은 색소를 대량으로 얻기 위한 기술이 연구되고 있다.
본 발명자들은 연 1회만 수확가능한 식물 원료를 대체하여 연간 생산이 가능한 미세조류 중에서도 루테인 함량이 높고, 성장률이 높은 야생형 미세조류가 있는지 조사하였고, 하천에서 분리된 미세조류 클로렐라속 HS3가 루테인을 축적한다고 알려져 있는 다른 미세조류보다 높은 함량의 루테인을 포함하고 있고, 빠른 성장으로 인하여 기존 미세조류보다 루테인 생산성이 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허공보 제2015-0054525호
기존에 알려져 있는 미세조류와 비교하여 루테인 생산성이 높은 미세조류를 확보하고, 신규한 미세조류의 배양 최적화를 통해 루테인을 연중 생산할 수 있는 생물 자원을 확보하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된, 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된, 클로렐라속 HS3의 추출물또는 이의 분획물을 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된, 클로렐라속 HS3의 추출물또는 이의 분획물을 포함하는 안질환 예방 또는 개선용, 또는 눈 기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 새롭게 분리된 클로렐라속 HS3은 기존에 발표된 다른 미세조류와 비교하여 높은 함량의 루테인을 세포 내에 축적하고, 담수 배지에서 빠른 성장속도로 배양이 가능하여 높은 루테인 생산성을 확보할 수 있다. 이러한 높은 루테인 생산성은 마리골드로 국한되어 있는 루테인 생산을 미세조류 기반으로 확장하여 루테인의 생산 단가를 낮출 수 있어서, 건강기능식품, 의약외품 그리고 사료 등에 다양하게 사용이 가능할 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명에서 분리되고, 기탁번호 KCTC13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)(이하, '클로렐라속 HS3'으로 기재함)의 계통도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리된 클로렐라속 HS3의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명에서 분리된 클로렐라속 HS3의 온도 및 광량 최적 조건이다; A)는 온도 변화에 따른 바이오매스를 나타내고, B) 광량 변화에 따른 바이오매스를 나타낸다.
도 4a, 도 4b는 본 발명에서 분리된 클로렐라속 HS3의 색소 분석 결과이며, 도 4a는 색소 함량이고, 도 4b는 색소의 구성비를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리된 클로렐라속 HS3의 광량 증가에 따른 균체량 증가를 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 분리된 클로렐라속 HS3의 색소 생산을 위한 이산화탄소의 효과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에서 분리된 클로렐라속 HS3의 광량 증가에 루테인 함량 및 생산성 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 클로렐라속 미세조류
본 발명은 신규 클로렐라속 미세조류를 제공한다.
본 발명의 상기 신규 미세조류는 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)이다.
상기 클로렐라속 HS3는 염기서열 분석상 파라클로렐라속 및 클로렐라속과 유사하였으나, 파라클로렐라속인 Parachlorella kessieri에 대해 보고된 최적 배양 온도 등의 특성과 부합되지 않는 특징이 확인되어, 클로렐라속에 속하는 것으로 분류하였고, 이를 특별히 HS3으로 명명하였다(도 1).
상기 클로렐라속 HS3는 하천에서 분리되고 담수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 색소의 생산성이 우수하다. 특히, 상기 클로렐라속 HS3는 색소 중에서도 루테인을 매우 높은 함량으로 생산해 낼 수 있는데, 종래 루테인을 생산하는 것으로 알려진 Chlorella sorokiniana JD02, Chlorella sp. JD04, Chlamydomonas reinhardtiiCC124, Tetraselmis sp., Chlorella vulgarisOW-01와 대비하더라도 루테인의 생산성이 높았다. 동일한 속에 포함된 클로렐라속 미세조류인 Chlorella sorokiniana JD02, Chlorella sp. JD04, Chlorella vulgarisOW-01의 루테인 함량과 비교하여도, 상기 클로렐라속 HS3의 루테인 생산성이 우수하다. 따라서 본 발명의 상기 클로렐라속 HS3는 기존에 루테인 생산용으로 사용되었던 시스템을 대체할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 클로렐라속 HS3과, 다른 미세조류들을 미세조류 배양시 일반적으로 사용되는 조건인 광배양기(50 rpm, 25℃, 50 μmol/m2/s)에서 배양한 후에 루테인 함량을 확인하였으며, 클로렐라속 HS3이 일반적인 배양 조건에서 클로렐라속에 포함되는 다른 종을 비롯한 Chlamydomonas속, Tetraselmis속 미세조류에 비해서 루테인 생산성이 높은 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 클로렐라속 HS3, 종래 루테인을 생산하는 것으로 알려진 Chlorella fusca, Chlorococcum citroforme, Coelastrum proboscideum, Muriell aaurantiaca, Muriella decolor, Neospondiococcum gelatinosum, Tetracysis aplanosporum, Tetracystis intermedium, Tetracysti stetrasporum, Chlorella zofingiensis를 각각 5% 이산화탄소 조건 하에서, 35℃에서 1000 μmol/m2/s 광도로 배양하였을 때, 클로렐라속 HS3의 루테인 생산성이 기존 균주 대비 최소 1.5배 이상이다. 서열 분석상 유사성이 높았던 클로렐라속 미세조류인 Chlorella fusca, Chlorella zofingiensis의 루테인 함량과 비교하여도, 클로렐라속 HS3의 루테인 생산성이 우수하다. 따라서 본 발명의 상기 클로렐라속 HS3는 기존에 루테인 생산용으로 사용되었던 시스템을 대체할 수 있다.
상기 클로렐라속 HS3는 루테인뿐만 아니라, 네오잔틴, 베타카로틴 및 클로로필-a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 색소를 생산하여 세포 내에 축적하거나, 세포 외부로 방출할 수 있다. 구체적으로 상기 클로렐라속 HS3는 루테인, 네오잔틴, 베타-카로틴 및 클로로필-a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 색소를 생산하여 세포 내에 축적하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
상기 클로렐라속 HS3는 500 μmol/m2/s 내지 600 μmol/m2/s 사이의 광도 조건에서 최고 성장률을 나타낼 수 있다. 이러한 특성은 Parachlorella kessieri에 관하여 보고된 최적 배양 조건과는 다른 것으로, 클로렐라속 HS3만의 특성에 해당한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라속 HS3 세포주는 하천에서 분리한 미세조류를 18S rDNA 서열분석을 통하여 동정되었으며, 담수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스 생산성 및 색소 생산성, 특히 루테인의 생산성이 우수하였다. 루테인을 생산한다고 보고된 다른 미세조류와의 비교시에도 본 발명의 신규 미세조류인 클로렐라속 HS3가 루테인 함량이 높으므로, 클로렐라속 HS3는 종래의 루테인 생산 미세조류들을 대체하여 루테인을 확보할 수 있는 생물자원으로 유용하다.
2. 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.상기 안질환은 비-삼출성 노인성 황반 변성, 삼출성 노인성 황반변성을 포함하는 황반 변성, 백내장, 맥락막 혈관신생, 망막증, 당뇨병성 망막증, 급성 및 만성 황반성 신경망막병증, 중심성 장액성 맥락망막병증, 황반 부종, 급성 다발성 판상색소 상피증, 버드샷 망막맥락막증, 후공막염, 사행성 맥락막염, 망막하 섬유화, 포도막염 증후군, 망막동맥폐색병, 중심성 망막 정맥 폐색, 파종성 혈관내응고증, 분지성 망막 정맥 폐색, 고혈압성 안저변화, 안허혈 증후군, 망막 동맥 미세혈관류, 코우츠 병, 중심오목부근 모세혈관확장증, 반측 망막정맥폐색, 유두정맥염, 중심성 망막 동맥 폐색, 분지성 망막 동맥 폐색, 언가지모양혈관염, 겸상세포 망막증, 혈관무늬 망막증, 가족성 삼출 유리체망막증, 일스 병, 증식성 유리체 망막증, 증식성 당뇨병성 망막증, 종양과 관련된 망막 질환, 망막 색소 상피(RPE)의 선천성 비후, 후부 포도막 흑색종, 맥락막 혈관종, 맥락막 골종, 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 복합 과오종, 망막아세포종, 안저의 혈관증식성 종양, 망막별아교세포종, 안내 림프성 종양, 근시성 망막 변성 및 급성 망막 색소 상피염, 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있다. 바람직하게는 상기 안질환은 노인성황반변성(Age-related macular degeneration) 및 백내장(cataract) 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물은 상기 클로렐라속 HS3를 배양하는 단계; 상기 배양된 클로렐라속 HS3의 배양물을 건조하여 건조물을 수득하는 단계; 및 수득한 건조물에 유기용매를 넣고 추출하는 단계;를 포함하는 방법에 의하여 얻어질 수 있다.
상기 클로렐라속 HS3의 배양은 담수 또는 기수에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 담수에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 본 발명의 클로렐라속 HS3는 담수뿐만 아니라 기수에서도 생장이 가능하므로, 배지 제조시 사용할 수 있는 물의 종류가 다양하므로, 물의 종류를 편의에 따라 선택적으로 사용할 수 있다는 장점이 있다. 상기 클로렐라속 HS3는 바람직하게는 담수에서 배양한 경우, 바이오매스 생산성이 2 mg/L/day이고, 루테인 함량은 11.8 mg/g 색소 생산량은 25 mg/L/day일 수 있다.
상기 클로렐라속 HS3의 배양은 3% 내지 10% 이산화탄소 조건 하에서 실시될 수 있고, 바람직하게는 3% 내지 8% 이산화탄소 조건 하에서 실시될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5% 내지 8% 이산화탄소 조건 하에서 실시될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 이산화탄소가 하한값 미만의 부피로 포함될 경우에는 클로렐라속 HS3의 바이오매스 생산성, 루테인 함량이 낮아서 최종적으로 수득되는 루테인 생산성이 현저히 감소할 수 있다. 이산화탄소가 상한값을 초과하여 포함될 경우에는 세포의 생장에 영향을 주어서 원하는 정도의 바이오매스 생산성을 얻을 수 없다. 예를 들면, 이산화탄소를 과도하게 공급하면 배양액의 pH가 감소하여 세포 생장이 저해된다. 미세조류 배양시 사용하는 이산화탄소 농도는 세포의 분열 속도 및 광량에 따라 상이할 수 있지만, 상한값을 초과하여, 나아가서는 15% 이상으로 이산화탄소를 공급할 경우 대부분의 미세조류는 낮은 pH로 사멸하게 된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 클로렐라속 HS3를 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양할 경우, 대기상(air)에서 배양하는 경우에 비해서, 루테인 함량은 약 3.2배 이상이고, 루테인 생산성은 31배 이상인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 신규 미세조류인 클로렐라속 HS3를 배양하여 고함량의 루테인을 얻기 위해서는 고농도의 이산화탄소 조건이 필요한 것을 알 수 있었다.
상기 클로렐라속 HS3의 배양은 26℃ 내지 40℃의 온도 조건에서 실시되는 것일 수 있고, 바람직하게는 30℃ 내지 37℃의 온도 조건에서 실시되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 35℃ 내지 37℃의 온도 조건에서 실시되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 하한값 미만 또는 상한값을 초과하는 온도에서 배양하면 바이오매스 생산성이 감소하여, 최종적으로 수득되는 루테인의 함량이 낮아지는 문제점이 있다.
상기 클로렐라속 HS3를 배양하는 단계는 900 μmol/m2/s 내지 1500 μmol/m2/s 사이의 광도 조건에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 950 μmol/m2/s 내지 1300 μmol/m2/s 사이의 광도 조건에서 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 950 μmol/m2/s 내지 1200 μmol/m2/s 사이의 광도 조건에서 수행될 수 있고, 보다 더 바람직하게는 1000 μmol/m2/s 내지 1200μmol/m2/s 사이의 광도 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 클로렐라속 HS3 배양을 상기 하한값 미만의 광도 조건에서 수행할 경우에는 배양을 장기간 진행하여도 바이오매스 생산성이 증가하지 않는 문제점이 있다. 클로렐라속 HS3 배양을 상기 상한값을 초과하는 광도 조건에서 수행할 경우에는 과도한 열을 동반하기 때문에 배양액의 온도를 변화시켜 조류의 생장을 저해할 수 있고, 과도한 빛은 광저해 효과를 발생시킬 수 있다. 따라서, 상한값을 초과하는 광도 조건에서 배양이 가능하더라도, 배양물에 포함된 루테인의 함량이 감소할 수 있는 문제점이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 클로렐라속 HS3를 5% 이산화탄소 조건 하에서, 35℃로 1000 μmol/m2/s 광도로 배양하였을 때, 이산화탄소 조건과 온도 조건은 동일하게 하고 광도 조건만 100 μmol/m2/s로 변경한 경우에 비해서, 루테인 생산성이 10배 이상 증대하였다. 따라서, 본 발명의 신규 미세조류인 클로렐라속 HS3로부터 루테인 생산성을 높이기 위해서는 고농도의 이산화탄소 조건, 생장에 적합한 온도, 광도 조건을 만족해야 하는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 클로렐라속 HS3, 종래 루테인을 생산하는 것으로 알려진 Chlorella fusca, Chlorococcum citroforme, Coelastrum proboscideum, Muriell aaurantiaca, Muriella decolor, Neospondiococcum gelatinosum, Tetracysis aplanosporum, Tetracystis intermedium, Tetracysti stetrasporum, Chlorella zofingiensis를 각각 5% 이산화탄소 조건 하에서, 35℃에서 1000 μmol/m2/s 광도로 배양하였을 때, 클로렐라속 HS3의 루테인 생산성이 기존 균주 대비 최소 1.5배 이상이다. 서열 분석상 유사성이 높았던 클로렐라속 미세조류인 Chlorella fusca, Chlorella zofingiensis의 루테인 함량과 비교하여도, 클로렐라속 HS3의 루테인 생산성이 우수하다. 따라서 본 발명의 상기 클로렐라속 HS3는 기존에 루테인 생산용으로 사용되었던 시스템을 대체할 수 있다.
상기 클로렐라속 HS3의 배양물은 미세조류의 증식물 및 배양액일 수 있고, 바람직하게는 배양물 중에서도 배양액을 제외한 미세조류의 증식물일 수 있다.
상기 추출물을 원료로부터 추출하여 수득할 때, 추출 방법으로는 용매 추출법(저온 암조건 추출 포함), 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 종래 알려진 통상적인 추출 방법을 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이나 환류 추출법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 상기 추출 과정은 수회 반복할 수 있으며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 구체적으로, 수득한 추출물을 감압 농축하여 농축액을 얻고, 상기 농축액을 동결건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 고농도의 추출 분말을 제조할 수 있다.
루테인은 탄소가 40개, 수소가 56개가 결합되어 있으나, 소수의 하이드록실기(OH)만 포함되어 있는 구조적 특징에 의하여 지용성을 나타낸다. 따라서, 물과 같은 완전 극성 용제에는 전혀 용해되지 않으므로, 극성 혹은 비극성 유기용매를 추출용매로 사용하는 것이 좋다. 상기한 극성 혹은 비극성 유기용매로는 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸에테르, 크실렌 및 헥산 등과 같은 유기용매를 들 수 있고, 바람직하게는 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 유기 용매는 에탄올일 수 있다.
추출용매로 사용되는 에탄올은 클로렐라속 HS3의 동결건조물 10g에 대하여, 500ml 내지 1.5L의 부피로 사용할 수 있고, 바람직하게는 800ml 내지 1.3L의 부피로 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1L 내지 1.2L의 부피로 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 에탄올이 하한값 미만으로 포함될 경우에는 루테인의 추출 효율이 떨어져 최종 수득되는 루테인 함량이 감소된다.
상기와 같이 얻어지는 클로렐라속 HS3의 추출물에는, 상기 루테인이 7mg/g 내지 25mg/g의 범위의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 9mg/g 내지 20mg/g의 범위의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 11mg/g 내지 17mg/g의 범위의 함량으로 포함된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 5% 이산화탄소 조건 하에서, 35℃에서 1000 μmol/m2/s 광도로 36시간 동안 배양하여 얻어진 클로렐라속 HS3의 동결건조물에 에탄올을 처리하여 얻은 추출물에는 상기 루테인이 약 11mg/g의 함량으로 포함되어 있었고, 상기 루테인은전체 색소 중 35%로 가장 높은 함량으로 존재하는 것을 확인하였다.
상기 클로렐라속 HS3의 추출물은 추가로 분획될 수 있고, 상기와 같이 얻어지는 분획물 또한 본 발명의 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
루테인 함량을 높이기 위해서 상기 클로렐라속 HS3의 추출물을 분획하여 클로렐라속 HS3의 분획물을 수득할 수 있다. 분획물 제조시 사용될 수 있는 용매는 아세톤, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸에테르, 크실렌, 헥산 및 이들의 조합 등과 같은 유기용매일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 분획물은 루테인 함량을 농축시키기 위해서 추가로 통상의 분획 공정을 수행하여 분획물을 수득한 것일 수도 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 클로렐라속 HS3의 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획물도 본 발명의 분획물에 포함된다.
상기 활성 분획물은 분획물로부터 보다 높은 루테인 함량을 가지는 분획을 분리한 것으로, 활성 분획 또는 유효 분획물이라고도 한다. 계통분획과 같은 통상의 분획 과정을 통해 수득한 여러 성분이 혼합되어 있는 분획물 가운데 농도구배 컬럼 크로마토그래피 등을 통하여 활성 성분의 성질에 따라 분리해냄으로써 보다 높은 루테인 함량을 갖는 특정 활성 분획물을 제조할 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, LH-20, ODS 겔, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성 분획물을 분리 및 정제할 수 있고, 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 크로마토그래피를 사용함에 있어 용출 용매, 용출 속도 및 용출 시간은 당업계에서 일반적으로 사용하는 용매, 속도 또는 시간을 적용할 수 있다.
상기 루테인은 식물체 내에서는 항산화 효과 및 식물체를 자외선으로부터 보호하는 역할을 수행하며, 인간에게는 눈의 황반 및 수정체의 주요 성분으로 눈의 건강과 시력을 증진시키는 물질로 널리 알려져 있다. 또한, 루테인의 섭취량에 따라 혈청 내 루테인의 농도에 따라 황반 색소의 밀도가 영향을 받게 되며, 루테인의 섭취에 의하여 황반 색소의 밀도가 증가될 경우 시력의 개선은 물론, 특히 황반 변성이 진행된 상태에서도 식이로서 루테인의 함량을 증가시킬 경우 황반 색소의 생성을 자극하여 황반 변성의 진행을 저해시킬 수 있다.
따라서 루테인이 고함량으로 포함된 본 발명의 클로렐라속 HS3의 추출물이나 분획물은 황반변성 또는 백내장과 같은 안질환의 치료나 예방, 개선을 위한 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 클로렐라속 HS3의 추출물은 안질환 외에도 시력 저하나, 눈의 피로를 감소시키고, 노안을 예방하는 효과가 있다.
상기 클로렐라속 HS3의 추출물이나 분획물을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 및 동맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 점막 또는 국소(예, 점안), 안구, 경피 등에 적용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유될 수 있다.
본 발명의 조성물을 비경구 투여시에는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 흉부 내 주사 주입 방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 점안제, 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이는 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 클로렐라속 HS3의 추출물 또는 이의 분획물의 유효투입량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 20 mg/일이고, 바람직하게는 5 내지 10 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하게는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.
3. 안질환 예방 또는 개선용, 또는 눈 기능 개선용 건강기능식품
본 발명은 안질환 예방 또는 개선용, 또는 눈 기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.
상기 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3)의 추출물 또는 분획물의 제조 방법은 "2. 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물"의 방법에 기재하였으므로 기재를 생략한다.
상기 클로렐라속 HS3의 추출물 또는 분획물을 건강기능식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하게는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있다.
예를 들면, 클로렐라속 HS3의 추출물 또는 분획물을 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 식품 첨가물로서 적용할 수 있고, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 본 기술 분야의 통상의 기술자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.
이하, 하기 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 미세조류의 분리 및 동정
국내 하천에서 단일 세포주로 분리된 미세조류 HS3으로부터 genomic DNA을 분리하여, 18S rDNA를 미세조류 동정용 프라이머(ch165F, ch1200R)를 이용하여 PCR하고, 얻어진 PCR 산물을 시퀀싱하여 NCBI 블라스트에서 검색하였다. 프라이머 서열은 아래와 같다.
ch165F :　CGACTTCTGGAAGGGACGTA(서열번호: 1)
ch1200R : GAGTCAAATTAAGCCGCAGG(서열번호: 2)
분리된 미세조류 HS3은 파라클로렐라(Parachlorella), 클로렐라(Chlorella)와 상동성이 높았으나(도 1), Parachlorella kessieri에 관하여 보고된 최적 배양 온도 및 특성과 부합되는 특징이 낮아 염기서열 분석상 동일한 유사성(similiarity)을 보이는 클로렐라 속(Chlorella sp.) HS3으로 명명하였다. 본 발명자들은 이와 같이 분리 동정된 클로렐라속 HS3 세포주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2016년 10월 18일자로 기탁하였고(기탁번호: KCTC 13133BP), 기탁 후에 "과학적 성질 및 분류학상의 위치 표시 등의 기록서"를 제출하여 기탁증에 표시된 분류학상의 위치인 "Parachlorella kessieri HS3"를 "Chlorella sp. HS3"로 변경하였다. 도 2에 미세조류 HS3의 형태를 나타낸다.
[실시예 2] 클로렐라속 HS3의 최적 배양 조건 분석
최적 배양조건은 Photo-Biobox를 통해서 분석하였다(Heo et al. 2015 Biochemical Engineering Journal, 103, 193-197). Photo-Biobox는 High throughput photo bioreactor로서 한 배치에 96가지의 다른 환경을 구현하여 빠르게 온도, 광 그리고 이산화탄소 유무에 의한 미세조류 최적 조건을 찾는데 유용한 장비이다. 사용된 배지는 녹조류 배양 배지로 널리 사용되고 있는 BG11 배지를 사용하였다.
포토바이오박스를 사용하여 클로렐라속 HS3의 배양 조건을 확인한 결과, 클로렐라속 HS3은 5% 이산화탄소 조건 하에서 온도 35~37℃, 광 500~600 μmol·m-2·s-1의 조건에서 바이오매스량이 가장 높아 최적 배양 조건으로 확인되었다(도 3).
[실시예 3] 색소 함량 및 생산성
색소 분석은 상기 실시예 2에서 확인된 최적 배양 조건에서 96시간 동안 배양된 클로렐라속 HS3를 동결건조하여 얻어진 10mg의 바이오매스에 실리카 비드를 10mg 넣고, 100% 에탄올을 1ml 처리하여 비드를 비팅(beating)하여 추출하였다. 얻어진 추출물을 10,000 x g로 1분간 원심분리하여 세포 잔사를 제거하였고, 0.2 ㎛ PTFE 필터를 이용하여 여과하여 HPLC 분석 시료를 준비하였다. HPLC를 이용하여 색소 추출물에 포함된 색소의 함량을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
컬럼: waters Spherisorb S5 ODS1 4.6x250 mm, 5 ㎛ Cartridge column
오븐 온도: 40℃
이동상 용리액(mobile phase eluents): 0.1M Tris-HCl pH 8.0, 아세토니트릴, 메탄올, 에틸아세테이트
검출기: photodiode array detector(SPD-M20A, Shimadzu) 476 nm, 450 nm
프로그램:
(0분~15분) 14% 0.1M TrisHCl(pH 8.0), 84% 아세토니트릴, 2% 메탄올
(15분~19분) 68% 메탄올 및 32% 에틸아세테이트
(19~25) 14% 0.1M TrisHCl(pH 8.0), 84% 아세토니트릴, 2% 메탄올
유량 속도: 1.2 ml/min
색소 분석 결과, 루테인이 클로로필-a, 클로로필-b 다음으로 가장 높게 포함되었다(도 4a, 도 4b). 색소의 총 함량은 32mg/g으로 신규 클로렐라속 HS3의 건조 중량의 1.5%가 색소로 확인되었다.
[실시예 4] 클로렐라속 HS3와 다른 조류의 루테인 생산량 비교
클로렐라속 HS3, 클로렐라속의 다른 종, 또는 다른 속의 균주를 각각 250ml 플라스크에 동일한 양으로 접종하고 광배양기(50 rpm, 25℃, 50 μmol/m2/s)에서 배양한 후에 실시예 3과 동일한 방법으로 HPLC를 이용하여 루테인 함량을 확인하였다. 확인 결과를 표 1에 나타낸다.
Microalgae RetTime Area Lutein
content
[min] [mAU*s] [mg/g]
Chlorella sp. HS3 17.141 4050.2 3.66
Chlorella sorokiniana JD02 17.14 2438.3 2.20
Chlorella sp. JD04 17.139 2799.1 2.46
Chlamydomonas reinhardtiiCC124 17.138 2955.3 2.67
Tetraselmissp. 17.141 238.51 0.21
Chlorella vulgarisOW-01 17.139 2626.8 2.37
Achnanthidium sp. BS-003 N.D 0 0
Amphidinium carterae N.D 0 0
Chaetoceros difficilis N.D 0 0
Nannochloropsis oceanica N.D 0 0
Pavlova lutheri N.D 0 0
표 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 클로렐라속 HS3는 다른 균주와 동일한 배양 조건에서 루테인 함량이 제일 높았다. 이를 통해서, 일반적인 배양 조건에서 클로렐라속 HS3가 루테인을 다량으로 생산하는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5] 광량에 의한 루테인 생산성 증대 방법
색소 생산성 증대를 위해 100~1,000 μmol·m-2·s-1 범위의 광량으로 5% 이산화탄소 조건에서 클로렐라속 HS3를 배양하였다. 5% 이산화탄소 조건에 대한 음성 대조군으로는 5% 이산화탄소 대신에 대기상(air)을 이용하였다. 고농도 이산화탄소 유무에 따른 생산성 비교 결과를 표 2에 나타낸다. 루테인 함량은 시료를 다르게 한 것을 제외하고 실시예 3의 방법과 동일하게 실시하여 추출물을 얻어 확인하였다.
조건 바이오매스
(g/L)		 바이오매스 생산성
(g/L/day)		 루테인 함량
(mg/g)		 루테인 생산성
(mg/L/day)
Air 1.2 0.275 3.66 0.79
5% CO2 8.5 2.095 11.87 25.03
배양 결과, 클로렐라속 HS3는 광량이 증가할수록 바이오매스도 증가하였고, 광량 1,000 μmol·m-2·s-1 에서 96시간 동안 배양하면 바이오매스 생산성이 2.095 g/L/day, 루테인 함량이 11.87 mg/g으로 루테인 생산성은 25.03 mg/L/day였다(도 5). 광량 1,000 μmol·m-2·s- 1으로 처리한 경우, 광량 100 μmol·m-2·s- 1으로 처리한 경우와 비교하였을 때, 약 10배 이상의 생산성 증대를 확인하였다. 이러한 루테인 생산성 증대 효과는 대기상(air)의 공급 조건에서는 나타나지 않았으며, 5% CO2와 1,000 μmol·m-2·s- 1 의 광량에서 확인되었다(표 2 및 도 6). 색소 분석 결과 루테인 함량도 광량이 증가함에 따라 높아졌다(도 7).
[비교예 1] 클로렐라속 HS3와 루테인을 생산하는 다른 미세조류의 루테인 함량 비교
클로렐라속 HS3의 루테인 생산량을 기존에 루테인을 생산한다고 보고된 다른 미세조류의 루테인 생산량과 비교하였다. 5% CO2와 1,000 μmol·m-2·s- 1 의 광량에서 36시간 동안 각 미세조류를 배양하였다. 루테인 함량은 시료를 다르게 한 것을 제외하고 실시예 3의 방법과 동일하게 실시하여 확인하였다. 비교 결과를 표 3에 나타낸다.
미세조류 루테인 함량 (mg/g)
Chlorella fusca 4.2-4.7
Chlorococcum citroforme 7.4
Coelastrum proboscideum 3.4-5.0
Muriell aaurantiaca 2.6
Muriella decolor 0.5
Neospondiococcum gelatinosum 4.4
Tetracysis aplanosporum 5.9
Tetracystis intermedium 3.5
Tetracysti stetrasporum 4.4
Chlorella zofingiensis 2.4-2.8
Chlorella sp. HS3 11.8
클로렐라속 HS3의 루테인 생산 최적 조건에서의 루테인 함량은 다른 루테인 생산 미세조류와 비교하여 최소 50% 이상인 고함량이었고, 루테인 생산성도 발표된 모든 미세조류의 것보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 청색광 유발 황반변성증 동물모델에서 치료 효과 확인
황반변성증은 흡연, 비만, 식습관, 혈중 내 콜레스테롤 증가, 청색광 조사 등과 같은 다양한 요소들에 의해 촉진된다고 보고되고 있고, 이들 요인들에 의해 광수용체 세포의 손상과 그에 따른 세포 사멸이 망막색소상피를 퇴화(변성)시킨다. 본 발명의 클로렐라속 HS3 추출물 또는 분획물이 청색광을 조사한 황반변성증 동물 모델에서 치료 효과가 있는지 확인하였다.
Balb/C 마우스를 일주일간 순화 사육 후 상기 실시예 5에서 제조된 클로렐라속 HS3 추출물을 5일간 1일 1회 주기로 투여하였고, 24시간 암순응을 거친 후 2주 동안 청색광을 10000lux로 1일 1시간으로 조사하였고, 클로렐라속 HS3 추출물을 1일 1회 투여한 다음 7일 후 부검하여 안구를 시신경을 포함하여 적출하였다. 적출한 안구조직은 데이비슨 고정액에 10일간 고정 후 포르말린으로 1~2일간 고정 한 다음 파라핀 블록을 제작하고 H&E 염색을 진행하였다.
염색이 수행된 안구 조직을 관찰하여 시세포 외핵층 두께 및 외핵층의 핵수를 확인하였으며, 클로렐라속 HS3 추출물 처리에 따라 시세포의 외핵층 두께 및 외핵층 핵수가 현저히 회복되는 것이 확인되었다.
[실시예 7] 백내장 치료 효과 확인
백내장의 발생 원인은 산화적 스트레스, 단백질 응집 등 다양하며 산화 장해에 대한 방호 능력이 저하되기 때문에 수정체가 혼탁되는 것으로 생각되고 있다. 본 발명의 클로렐라속 HS3 추출물 또는 분획물이 청색광을 조사한 황반변성증 동물 모델에서 치료 효과가 있는지 확인하였다.
SD 랫 70마리를 각각 10마리씩 6개의 군으로 나누어 정상군을 제외하고 나머지 음성대조군, 양성대조군, 실험군에 소듐셀레나이트 15μmol/kg bwt를 피하 주사하여 백내장을 유발하였다. 음성대조군은 생리식염수, 양성대조군은 아스코르브산(1000mg/kg bwt), 실험군은 실시예 5에서 제조된 클로렐라속 HS3 추출물을 이용하여 각각 25mg/kg bwt, 50mg/kg bwt, 100mg/kg bwt를 복강 내로 투여하였다. 소듐 셀레나이트 주사 4일째 백내장 발생 정도를 확인하였다.
정상군을 제외한 양성대조군, 음성대조군, 실험군의 경우 백내장이 발생하였고, 클로렐라속 HS3 추출물을 처리한 실험군의 경우 양성대조군 및 음성대조군에 비해서 백내장이 발생한 개체의 수가 적었으므로, 본 발명의 클로렐라속 HS3 추출물을 종래의 항산화제를 대체하여 백내장 치료에 사용할 수 있음을 알 수 있다.
[제조예 1] 정제, 시럽제, 건강기능식품의 제조
1) 정제의 제조
본 발명에 따른 클로렐라속 HS3 추출물을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다[유효성분 15mg].
상기 클로렐라속 HS3 추출물 250 g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하고, 여기에 10% 젤라틴 용액을 첨가한 후 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물로 정제를 제조하였다.
2) 시럽제의 제조
본 발명에 따른 클로렐라속 HS3 추출물을 유효성분으로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
상기 클로렐라속 HS3 추출물(2 중량%), 사카린, 당을 온수 80 g에 녹인 후 냉각시키고, 여기에 글리세린, 감미제, 향미제, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였으며, 여기에 물을 첨가하여 100 mL가 되게 하였다.
3) 건강기능 식품의 제조
본 발명에 따른 클로렐라속 HS3 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능 식품은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
클로렐라속 HS3 추출물의 건조물 1000 ㎎, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B1 0.13 ㎎, 비타민 B2 0.15 ㎎, 비타민 B6 0.5 ㎎, 비타민 B12 0.2 ㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 통상의 건강식품 제조방법에 따라 혼합하여 제조하였다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC13133BP 20161018
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel microalgae having high productivity for lutein <130> 2017-dpa-2475 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ch165F <400> 1 cgacttctgg aagggacgta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ch1200R <400> 2 gagtcaaatt aagccgcagg 20

Claims (8)

  1. 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3(Chlorella sp. HS3).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 클로렐라속 HS3는 루테인, 네오잔틴, 베타카로틴 및 클로로필-a로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 색소를 생산할 수 있는 클로렐라속 HS3.
  3. 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 클로렐라속 HS3의 추출물은 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸에테르, 크실렌 및 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유기용매, 물 또는 이들의 혼합물로 추출되는 것인 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 클로렐라속 HS3의 추출물은 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 추출되는 것인 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 저급 알코올은 에탄올인 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 청구항 3에 있어서,
    상기 안질환은 노인성황반변성(Agerelated macular degeneration) 또는 백내장(cataract)인 안질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 기탁번호 KCTC 13133BP로 기탁된 클로렐라속 HS3의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 안질환 예방 또는 개선용, 또는 눈 기능 개선용 건강기능식품.
KR1020180018418A 2018-02-14 2018-02-14 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류 KR102019448B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180018418A KR102019448B1 (ko) 2018-02-14 2018-02-14 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180018418A KR102019448B1 (ko) 2018-02-14 2018-02-14 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190098455A KR20190098455A (ko) 2019-08-22
KR102019448B1 true KR102019448B1 (ko) 2019-09-06

Family

ID=67767177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180018418A KR102019448B1 (ko) 2018-02-14 2018-02-14 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102019448B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102508254B1 (ko) * 2021-01-15 2023-03-09 한국과학기술원 루테인 고생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 루테인 생산 방법
KR20220159073A (ko) * 2021-05-25 2022-12-02 한양대학교 산학협력단 신규 두나리엘라 살리나 및 이의 용도
KR102667539B1 (ko) * 2021-12-15 2024-05-20 국립해양생물자원관 미세조류 클로렐라 글로리오사 mabik lp119의 염분 스트레스 조건에 따른 색소 생산성 증대 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110117454A (ko) * 2010-04-21 2011-10-27 한국과학기술연구원 클로렐라로부터 아임계 용매를 이용하여 카로티노이드 및 클로로필을 생산하는 방법
KR20150054525A (ko) 2013-11-12 2015-05-20 서울대학교산학협력단 음파진동을 이용한 미세조류 성장 및 지질 생성 촉진 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
http://newsvn.tistory.com/513 (2017.05.22.)*
https://uses.plantnet-project.org/en/Chlorella_(PROSEA) (2016.04.22.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190098455A (ko) 2019-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102019448B1 (ko) 루테인 생산성이 높은 신규 미세조류
KR100922311B1 (ko) 활성화된 당 관련 화합물을 함유하는 물질을 생성하는 차가버섯, 상황버섯, 영지버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초의 복식 배양 방법
US10980252B2 (en) Chlamydomonas mutants produced using RGEN RNP and method for preparing pigment using the same
US11197843B2 (en) Process for producing fucoxanthin and/or polysaccharides from microalgae
JP5154964B2 (ja) ローヤルゼリー分解酵素含有物
JP2007306898A (ja) 冬虫夏草を用いた機能性食品とその製造方法
KR20080112338A (ko) 카로테노이드의 제조 방법
KR102620997B1 (ko) 노각나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력 보호용 또는 망막 질환의 개선 및 예방용 조성물
US11179428B2 (en) Dunaliella mutant and method for producing pigment by using same
JP3911427B2 (ja) 新規セスキテルペン系化合物、その製造方法及び組成物
KR101278600B1 (ko) 가바와 아미노산이 다량 포함된 거대배아미 밀양263호의 쌀겨 추출물 및 이 추출물을 포함하는 조성물
KR102048458B1 (ko) 테트라셀미스를 포함하는 눈 건강 개선용 조성물
KR102508306B1 (ko) 루테인 및 제아잔틴의 함량이 증대된 계란 생산방법, 이로부터 생산된 계란, 및 상기 계란으로부터 난황유 또는 난황 분말을 제조하는 방법
KR101483581B1 (ko) 눈큰흑찰(흑찰거대배아미) 현미 또는 이의 추출물을 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물
KR102552069B1 (ko) 제아잔틴 및 루테인의 생산성이 높은 신규 미세조류
KR20160090662A (ko) 쥐눈이콩 추출물을 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 조성물
JP2007126398A (ja) 神経分化誘導物質とその利用法
JP2021529183A (ja) 酵母抽出物を含む糖尿改善または抗酸化用の組成物と酵母抽出物の製造方法
WO2007034958A1 (ja) 穀類由来の成分を有効成分とする血管新生阻害の作用を有する組成物
KR102336045B1 (ko) 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
KR20170023055A (ko) 쥐눈이콩 추출물을 포함하는 망막질환의 예방 또는 치료용 조성물
JP3988833B2 (ja) 新規セスキテルペン系化合物、その製造方法及び組成物
KR102676617B1 (ko) 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
KR102611944B1 (ko) 애기우산나물 추출물을 유효성분으로 포함하는 안질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20230054133A (ko) 폴리아민을 유효성분으로 포함하는 시력 개선 및 안질환의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant