WO2013136029A1 - Production de polysaccharides en mode mixotrophe par nostoc - Google Patents

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WO2013136029A1
WO2013136029A1 PCT/FR2013/050548 FR2013050548W WO2013136029A1 WO 2013136029 A1 WO2013136029 A1 WO 2013136029A1 FR 2013050548 W FR2013050548 W FR 2013050548W WO 2013136029 A1 WO2013136029 A1 WO 2013136029A1
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WO
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culture
μιτιοι
polysaccharides
cyanobacteria
nostoc
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Application number
PCT/FR2013/050548
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Inventor
Khadidja Romari
François GODART
Pierre Calleja
Original Assignee
Fermentalg
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a mixotrophic culture method, especially in the presence of discontinuous and / or variable light illumination, of a cyanobacterium, in particular of the genus Nostoc.
  • the method makes it possible to obtain a high yield of biomass and an enrichment of cyanobacteria thus cultured as polysaccharides.
  • the method thus makes it possible to select strains of cyanobacteria, in particular of the genus Nostoc, of a mixotrophic nature, and having a high yield of polysaccharides.
  • the invention also relates to new strains of cyanobacteria, in particular belonging to Nostoc sp., Particularly suitable for the production of polysaccharides. These new strains are useful for producing polysaccharides in mixotrophic mode.
  • Cyanobacteria are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature. They are prokaryotes with no real kernel, no plasts, no sexual reproduction. They are devoid of nuclear membrane, mitochondria, endoplasmic reticulum, chromosomes and flagellum. In the electron microscope, there are two differentiated zones, mainly by their color:
  • chromoplasma peripheral zone containing thylakoids, sorts of crushed bags containing photosynthetic organelles. This organelle, in addition to photosynthesis, performs two other functions: respiration and nitrogen fixation (in some species);
  • centroplasm located in the center of the cell, which performs functions similar to those of a nucleus. It contains DNA, which is usually in the form of needles. Cyanobacteria have chlorophyll and other pigments, hence their varied colors. They are blue, in nearly 50% of cases, and in other cases, they have a different external color (golden, yellow, brown, red, orange, emerald green, purple, or dark blue almost black).
  • cyanobacteria have been found, frequently in abundance, in most naturally illuminated environments, both aquatic and terrestrial, including several extreme environments. This distribution reflects a wide variety of species with diverse physiological properties and tolerance to environmental stress.
  • cyanobacteria Thanks to their ecological and biochemical diversity, cyanobacteria have been considered with interest for biotechnological applications and their potential in terms of converting light energy into renewable forms of molecules for food and pharmaceutical products [De Philippis, R. and Vincenzini M. (1998); Exocellular polysaccharides from cyanobacteria and their possible applications, FEMS Microbiology Reviews, 22: 151-175].
  • cyanobacterial strains possess, on the outside of their outer membrane, additional surface structures of a polysaccharide nature.
  • polysaccharide material may be released as a water-soluble material into the surrounding medium, causing a gradual increase in its viscosity.
  • These released polysaccharides are thus recoverable from these liquid cultures and are of interest for industrial applications, in particular for the paper industry, cosmetics and food products.
  • Polysaccharides from cyanobacteria are also known for their medical properties, such as anti-virals [Hayashasi, T. and Hayashi, K.; (1996); Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a green-blue alga Spirulina platensis, J. Nat. Prod. (Lloydia) 59, 83-87].
  • Cyanobacteria can be considered as an abundant source of structurally diverse polysaccharides, and having unique properties for specific applications, and not present in currently available polymers.
  • cyanobacterial strains producing polysaccharides include Nostoc, Gloeocapsa, Chroococcidiopsis, Phormidium, Microcyctis and Lyngbya, among others.
  • Cyanobacteria of the genus Nostoc are known for their ability to produce polysaccharides. Nostocs have the ability to fix atmospheric nitrogen through particular cells: heterocysts, which are differentiated cells with thicker walls, clearly visible under the microscope. Heterocysts usually appear at the ends of spherical, ovoid or cylindrical cell chains. These chains are more or less long.
  • Nostocs are found where they are not competing with other species, that is to say on very poor (or new) environments and exposed to strong sunshine, for example on certain roads, on gravel pits. talus, in quarries, or even on bitumen, a priori not very favorable to their development as regards the supply of nitrogenous matter of mineral origin.
  • New sources of polysaccharides must therefore be sought in order to meet, in the future, the growing market demand for this type of molecule. It will be desirable to obtain higher polysaccharide yields than is described in the prior art for more efficient and cost effective industrial operation. In any case, it is desirable that the cyanobacteria be grown under optimum conditions to increase the yield of polysaccharides to be produced. Thus, it is preferable to have the highest yield possible (for example above 20 g / l of dry matter or more than 60% by weight relative to the total weight of the dry matter).
  • a strain (FCC 1051) representative of the new strains of Nostoc sp., Thus isolated and selected, was deposited with the CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA , Scotland, United Kingdom) under the provisions of the Budapest Treaty, accession number CCAP 1453/37.
  • the cultivation and selection process consisted more particularly in cultivating cyanobacteria under mixotrophic conditions, in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, especially in the form of flashes, with a range of variations of light intensity and a specific frequency.
  • the subject of the present invention is therefore a process for the cultivation of cyanobacteria, in particular of the genus Nostoc, in mixotrophic mode.
  • the process according to the invention allows an enrichment of cyanobacteria, in particular of the Nostoc genus in polysaccharides.
  • cyanobacteria is meant more particularly the strains of the genera Nostoc, Gloeocapsa, Chroococcidiopsis, Phormidium, Microcyctis and Lyngbya.
  • the illumination has intensity variations whose amplitude is generally between 5 ⁇ . m “2 , s " 1 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 30 and 400 ⁇ . m “2 , s " 1 . These variations can generally take place between 2 and 3600 times per hour, preferably between 2 and 200 times per hour. These cultivation conditions make it possible to provide a defined quantity of light. This luminous contribution may comprise phases of discontinuous and / or variable illumination, with variations of intensity may have identical or different amplitudes.
  • the illumination can be in particular in the form of flashes.
  • This process has the advantage of increasing the yield of biomass obtained from the culture. It also has the advantage of enriching the cyanobacteria thus cultured polysaccharides.
  • This method can also be used to select strains of cyanobacteria, in particular of the Nostoc genus, of a mixotrophic nature, and having a high yield of polysaccharides.
  • the mixotrophic culture of this cyanobacterium is preferentially carried out in the presence of 5 mM to 1 M, preferably from 50 mM to 800 mM, more preferably from 70 mM to 600 mM, and still more preferably from 100 mM to 500 mM of a substrate. organic carbon.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, in order to allow the cells to accumulate a large concentration of polysaccharides.
  • Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration.
  • This carbon substrate preferably comprises, in pure form or as a mixture: glucose, cellulose derivatives, lactate, starch, lactose, sucrose, acetate and / or glycerol.
  • the organic carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates carbonates adapted to the mixotrophic culture of cyanobacteria according to the invention.
  • This method is more particularly intended for the implementation of new strains of cyanobacteria of the genus Nostoc (Division: Cyanobacteria, Order: Nostocales, Family: Nostocaceae) [ITIS Catalog of Life, 2010] selected for their mixotrophic character, especially for their ability to be cultivated with a light input greater than 10 ⁇ l, in a mineral medium, for example medium BG1 1 [R., Rippka, R., J. Deruels, J. Waterbury, M. Herdman and R. Stanier (1979); Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 11: 1-61], in which an organic carbon substrate is added.
  • the organic carbon substrate comprises glucose, lactate, in a concentration equivalent to or greater than 5 mM.
  • a representative strain of Nostoc sp. according to the invention is the strain FCC 1051 isolated by the applicant and filed with the CCAP, under the number CCAP 1453/37. Such strains are capable of producing significant amounts of polysaccharides when grown in a mixotrophic mode with a variable or discontinuous light supply, according to the invention.
  • the CCAP 1453/37 strain belongs to the genus Nostoc.
  • the invention relates to any strain of the genus Nostoc, capable of growing in mixotrophic culture conditions as described in the present application, and capable of producing polysaccharides.
  • the isolated Nostoc strains according to the invention make it possible to produce, under mixotrophic conditions, significant amounts of polysaccharides, said polysaccharides being able to represent more than 60% or more than 70% by weight relative to the total weight of the dry matter.
  • FCC 1051 isolated by the applicant, from a culture under mixotrophic conditions in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, in particular in the form of flashes, is from 10 to 60%, more generally from 20 to 50%, greater than that of a culture with the same strain carried out in classical mixotrophic mode.
  • conventional mixotrophic mode is meant culture conditions with an identical culture medium, but with a contribution of natural light (outdoor culture) or a continuous and constant light supply.
  • the subject of the invention is therefore a process for culturing cyanobacteria, in particular of the genus Nostoc, in particular of the species Nostoc sp. in mixotrophic mode, in the presence of a variable or discontinuous illumination over time, for example in the form of flashes, in particular to produce polysaccharides.
  • the subject of the invention is thus a process for the selection of cyanobacteria, in particular of the genus Nostoc, of a mixotrophic nature, and having a high yield of polysaccharides, in the presence of a variable and / or discontinuous illumination with time.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes.
  • a flash within the meaning of the invention, is a short period of illumination, that is to say less than 30 minutes.
  • the duration of the flash may be less than 15 minutes, preferably less than 5 minutes or more preferably less than 1 minute.
  • the Flash duration can be less than one second.
  • the flash duration can be 1/10 of a second, or 2/10 of a second, or 3/10 of a second, or 4/10 of a second or 5 / 10 of a second, or 6/10 of a second, or 7/10 of a second, or 8/10 of a second, or 9/10 of a second.
  • the illuminance, or flash is usually longer than 15 seconds.
  • the duration of the flash is generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • This time period can be between 1 second and 30 minutes, or between 1 second and 36 seconds, or between 1, 2 seconds and 30 seconds, or between 1.44 seconds and 9 seconds, or between 1.8 seconds and 6 seconds. seconds, or between 2.4 seconds and 4.5 seconds.
  • This frequency can also be between 18 seconds and 30 minutes, preferably between 24 seconds and 6 minutes, more preferably between 36 seconds and 4 minutes, and even more preferably between 72 seconds and 3 minutes.
  • the number of flashes per hour is chosen according to the intensity and duration of the flashes (see below). In general, the intensity of the light provided in the form of flashes is between 5 and 1000 ⁇ . m "2 , s " 1 , preferably between 5 and 500 ⁇ . m "2 , s " 1 , or 50 and 400 ⁇ .
  • the intensity of the light is between 50 and 200 ⁇ . m -2 , s -1 , the time period of the flash frequency is between 10 seconds and 60 minutes for a flash duration between 1 second and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, but that the light intensity varies over time. This variation in light intensity is regular and can be periodic or cyclic. According to the invention, it is also possible to carry out a light supply combining continuous and discontinuous illumination phases.
  • the light intensity provided to the algae in culture varies at least one times in one hour.
  • the amplitude of this light intensity variation is generally between 5 and 1000, or between 50 and 800, or between 100 and 600 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light can also vary between 5 and 400 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the amplitude of the light intensity variation is between 70 and 300 ⁇ . m “2 , s " 1 and more preferably between 100 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • Said luminous intensity can successively reach, under conditions of variable illumination, for example, the values 50 ⁇ . ⁇ “2 .5 “ 1 and 100 ⁇ . m “2 s “ 1 , or 5 and 400 ⁇ . m “2 s “ 1 , or 50 and 800 ⁇ . m “2 , s " 1 several times each hour.
  • Said luminous intensity can successively reach, preferably the values 50 and 200 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • said luminous intensity can successively, several times in the hour, for example, the values 0 and 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 , the values 0 and 100 ⁇ .
  • the intensity of the light brought to the culture varies according to the cell density.
  • the denser the culture the more intense the light.
  • the cell density is the number of cells per ml and is measured according to the techniques known to those skilled in the art.
  • the light intensity can be between 5 and 15 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 10 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the light intensity can be increased to between 15 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 20 and 50 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the luminous intensity can be increased to between 50 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 for example, preferably between 50 and 150 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the intensity of the light may be greater compared to the values mentioned above.
  • the light intensity can be between 5 and 200 ⁇ . m “2 , s " 1 , preferably between 5 and 100 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 30 and 500 ⁇ . m “2 , s " 1 , for example, preferably between 50 and 400 ⁇ .
  • the luminous intensity can be increased to between 100 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 for example, preferably between 200 and 500 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the quantity of light brought to the culture in the hour remains between certain values. It is between about 2000 and 600 000, preferably between 2000 and 300 000 ⁇ . m "2. It can be between about 4000 and 200,000 ⁇ . m" 2 per hour.
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 10 ⁇ . m -2 s -1. The latter gives a total light input per hour of 9000 ⁇ . m "2.
  • the culture is irradiated with 20 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 20 ⁇ . m" 2 s "1. This gives total light output per hour of 12 000 ⁇ . m "2 .
  • the culture is illuminated with 45 flashes per hour, each flash having a duration of 15 seconds and an intensity of 5 ⁇ .
  • culture is illuminated with 120 flashes per hour, each having a flash duration of 10 seconds and an intensity of 200 ⁇ . m" 2 s "1, to give a total light output per hour of 240 000 ⁇ m- 2 .
  • the amount of light provided to the culture per hour may vary depending on the cell density.
  • the total light input in the hour is generally between about 1500 and 8000, preferably 1500 and 6000 ⁇ . m “2 , more preferably between 2000 and 5000 ⁇ . m " 2 .
  • the total light supply in the hour can be increased to between 6000 and 67 000 ⁇ . m "2 , preferably between 6000 and 50 000, and more preferably between 12 000 and 45 000 ⁇ . m " 2 , for example.
  • the total light supply in the hour can be increased to between 45,000 and 300,000, for example preferably between 45 to 300,000. 000 and 200 000 ⁇ . m "2 , and for example, more preferably between 50,000 and 150,000 ⁇ . m " 2 .
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 5 and 10 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 2250 ⁇ . m “2 to 4500 ⁇ . m “ 2 .
  • the intermediate stage at the intermediate stage (at a cell density between 10 6 and 10 7 cells per ml), the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 15 and 50 ⁇ mol.
  • the culture is irradiated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 50 and 150 ⁇ m "2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 45,000 to 135,000 ⁇ . M "2 .
  • the duration of the flashes is for example less than one minute, or less than one second
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 50 and 100 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 15,000 ⁇ . m “2 to 30,000 ⁇ . m “ 2 .
  • the culture is illuminated with 50 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 200 and 300 ⁇ . m “2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 100,000 to 150,000 ⁇ . m "2.
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 350 and 450 ⁇ m "2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 420,000 to 540,000 ⁇ . M "2 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the culture method according to the invention thus makes it possible to select strains of the genus Nostoc, similar to that isolated by the applicant and deposited at the CCAP under the number CCAP 1453/37, and having a high yield of polysaccharides.
  • This culture method is characterized in that it comprises the following steps:
  • recovery step is meant more particularly the isolation of the strain or strains whose cell number has grown the most during said generations.
  • the mixotrophic culture is carried out under discontinuous or variable illumination conditions over time, the illumination having intensity variations whose amplitude is between 5 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , these variations occurring between 2 and 200 times per hour.
  • strains of cyanobacteria in particular of the genus Nostoc, can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure, with precise monitoring of the conditions and evolution of the different cultures. It is thus easy to know the response of the various strains to the discontinuous and / or variable illumination and, where appropriate, the addition of one or more carbon substrates in the culture medium. Strains that respond Favorably with discontinuous and / or variable illumination and with carbon substrates generally offer a better yield for the production of polysaccharides.
  • the cyanobacteria can be selected in a fermentor from a heterogeneous population and the preferred variants of which are to be selected by the selection method according to the invention, combining discontinuous and / or variable light, having a range of light intensity and a specific frequency, with mixotrophic culture conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the cyanobacteria in cultures over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture method according to the invention also makes it possible to produce polysaccharides.
  • the method according to the invention also comprises the following steps:
  • the polysaccharides are secreted by cyanobacteria in their culture medium, from which they are recovered according to methods known to those skilled in the art.
  • the polysaccharides which are located in additional structures attached to the surface of the cell membrane of the cyanobacterium are recovered according to methods known to those skilled in the art.
  • the polysaccharides which are located on the outer surface of the cell membrane of the cyanobacterium are recovered according to methods known to those skilled in the art.
  • the polysaccharides which are located inside the cell membrane of the cyanobacterium are recovered according to methods known to those skilled in the art.
  • the culture method according to the invention can also be applied to any species of cyanobacteria, in particular of the genus Noctoc, capable of growing under the mixotrophic conditions according to the invention, and capable of producing polysaccharides.
  • the culture method according to the invention makes it possible to optimize the production of the biomass obtained from the culture. It also makes it possible to enrich the cyanobacteria thus cultivated with polysaccharides.
  • the invention therefore also aims at optimizing the production of biomass, as well as the production of polysaccharides, via the cultivation of cyanobacteria, in particular of the genus Noctoc of a mixotrophic nature, preferably cultivated or selected according to the methods referred to above, then recovering the cyanobacteria thus cultured to extract the polysaccharide content thereof, and / or recovering the polysaccharides secreted in said cyanobacteria culture medium.
  • the invention also relates to cyanobacteria, in particular of the genus Noctoc, which can be obtained according to the method of the invention as previously described.
  • cyanobacteria are enriched in polysaccharides. They generally have a polysaccharide yield of more than 60% or more than 70% by weight relative to the total weight of the dry matter.
  • Nostoc FCC 1051 were carried out in fermenters (bioreactors) of 1, 5L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 22 ° C.
  • Stirring is carried out by means of two stirring shakers placed on the shaft according to the following configuration: Rushton propeller and three-bladed pumping propellers.
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank.
  • the reactors are inoculated with a pre-culture carried out on a stirring table (140 rpm) in thermo-steady enclosure (23 ° C.) and illuminated between 80 and 100 ⁇ .
  • the pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in the BG1 1 medium (R., Rippka, R., Deruels J., Waterbury J., Herdman M. and Stanier R. (1979)).
  • the organic carbon substrate used for the bioreactor mixotrophic culture is glucose at concentrations between 50 mM and 150 mM. Crop monitoring:
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on GFB filter, Whatman, then drying in an oven at 100 ° C for a minimum of 24 hours before weighing).
  • the crop is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 80 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • LED lamps Electro Luminescent Diodes
  • Computer control triggers the power supply of the LEDs for lighting times or flashes.

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de cyanobactéries appartenant au genre Noctoc permettant une production à haut rendement de polysaccharides, en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture de telles souches, utilisant un apport de lumière variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs.

Description

Production de polysaccharides en mode mixotrophe par Nostoc
L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'une cyanobactérie, en particulier du genre Nostoc. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des cyanobactéries ainsi cultivées en polysaccharides. Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en polysaccharides. L'invention se rapporte aussi à de nouvelles souches de cyanobactéries, en particulier appartenant à Nostoc sp., particulièrement adaptées à la production des polysaccharides. Ces nouvelles souches sont utiles pour produire des polysaccharides en mode mixotrophe.
Préambule
Les cyanobactéries sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe. Elles sont des procaryotes ne présentant ni noyau véritable, ni plaste, ni reproduction sexuée. Elles sont dépourvues de membrane nucléaire, de mitochondries, de réticulum endoplasmique, de chromosomes et de flagelle. Au microscope électronique, on distingue deux zones différenciées, principalement par leur couleur :
- le chromoplasma (zone périphérique contenant les thylakoïdes, sortes de sacs écrasés contenant les organites photosynthétiques). Cet organite, outre la photosynthèse, assure deux autres fonctions : la respiration et la fixation de l'azote (chez certaines espèces) ;
- le centroplasma, situé au centre de la cellule, qui assure des fonctions semblables à celles d'un noyau. Il contient l'ADN, qui se présente généralement sous formes d'aiguilles. Les cyanobactéries possèdent de la chlorophylle et d'autres pigments, d'où leurs couleurs variées. Elles sont bleues, dans près de 50 % des cas, et, dans les autres cas, elles ont une couleur extérieure autre (dorée, jaune, brune, rouge, orangée, vert émeraude, violette, ou bleu foncé presque noire).
Des cyanobactéries représentatives ont été trouvées, fréquemment en abondance, dans la plupart des environnements naturellement illuminés, à la fois aquatiques et terrestres, incluant plusieurs environnements extrêmes. Cette répartition reflète une grande variété d'espèces présentant des propriétés physiologiques diverses et une tolérance au stress environnemental.
Grâce à leur diversité écologique et biochimique, des cyanobactéries ont été considérées avec intérêt pour des applications biotechnologiques et leur potentiel en terme de conversion d'énergie lumineuse en des formes renouvelables des molécules pour des produits alimentaires et pharmaceutiques [De Philippis, R. et Vincenzini, M. (1998); Exocellular polysaccharides from cyanobacteria and their possible applications, FEMS Microbiology Reviews, 22 : 151 -175].
Plusieurs souches cyanobactériennes possèdent à l'extérieur de leur membrane externe des structures de surface additionnelle de nature polysaccharidique. Pendant la culture de cellules en mode batch, de la matière polysaccharidique peut être libérée en tant que matière soluble dans l'eau dans le milieu environnant, provoquant une augmentation progressive de sa viscosité. Ces polysaccharides libérés sont ainsi récupérables de ces cultures liquides et présentent un intérêt pour des applications industrielles, notamment pour les industries papetières, les produits cosmétiques et alimentaires. Des polysaccharides issus des cyanobactéries sont aussi connus pour leurs propriétés médicales, telles que anti-virales [Hayashasi, T. and Hayashi, K. ; (1996) ; Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a blue-green alga Spirulina platensis, J. Nat. Prod. (Lloydia) 59, 83-87]. Des cyanobactéries peuvent être considérées en tant que source abondante de polysaccharides structurellement divers, et ayant des propriétés uniques pour des applications spécifiques, et non présentes dans les polymères disponibles actuellement.
Pour mettre en œuvre la production des polysaccharides par des cyanobactéries à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte, par exemple la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources, telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture, doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.
Des exemples des souches de cyanobactéries produisant des polysaccharides sont, entre autres, Nostoc, Gloeocapsa, Chroococcidiopsis, Phormidium, Microcyctis et Lyngbya.
Les cyanobactéries du genre Nostoc sont connues pour leur capacité à produire des polysaccharides. Les Nostocs ont la capacité de fixer l'azote atmosphérique par l'intermédiaire des cellules particulières : les hétérocystes, qui sont des cellules différenciées à paroi plus épaisse, nettement visibles au microscope. Les hétérocystes apparaissent habituellement aux extrémités des chaînes de cellules sphériques, ovoïdes ou cylindriques. Ces chaînes sont plus ou moins longues.
Les Nostocs se trouvent là où elles ne sont pas concurrencées par d'autres espèces, c'est-à-dire sur des milieux très pauvres (ou neufs) et exposés à un fort ensoleillement, par exemple sur certains chemins, sur des cailloutis de talus, dans des carrières, voire sur le bitume, milieux a priori peu favorables à leur développement en ce qui concerne l'approvisionnement en matière azotée d'origine minérale.
La demande internationale WO 201 1/140 839 divulgue une méthode pour la production des cellules Nostoc flagelliforme et des polysaccharides extracellulaires. La méthode inclut deux étapes, l'une portant sur l'inoculation d'une solution de cellules dans une culture comprenant « BGI médium » et une culture pendant 8 à 10 jours, suivie par la deuxième étape portant sur l'adjonction de glucose à 1 à 20 grammes/litre au médium et la culture pendant 2 à 8 jours et l'extraction des polysaccharides extracellulaires de la solution de culture. La biomasse (3,0-5 g/L) obtenue par cette méthode est de 5 à 8 fois plus élevée par rapport aux méthodes autotrophiques classiques. Le rendement en polysaccharides extracellulaires (1 ,0-2,3 g/L) est également amélioré (15 à 31 fois plus élevé).
De nouvelles sources de polysaccharides doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type de molécule. Il sera souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en polysaccharides plus importants que ce qui est décrit dans l'art antérieur pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable. En tout état de cause, il est souhaitable que les cyanobactéries soient cultivées dans des conditions optimales pour augmenter le rendement de polysaccharides à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 20 g/L de matière sèche ou plus de 60% en poids par rapport au poids total de la matière sèche).
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de cyanobactéries de l'espèce Nostoc sp., cultivables en mode mixotrophe permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement de polysaccharides.
Une souche (FCC 1051 ) représentative des nouvelles souches de Nostoc sp., ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 1453/37.
Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les cyanobactéries en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques.
L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les cyanobactéries, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Nostoc sp. une production élevée de biomasse et de polysaccharides. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle des polysaccharides, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après. Description détaillée
La présente invention a donc pour objet un procédé de culture de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, en mode mixotrophe. Le procédé selon l'invention permet un enrichissement des cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc en polysaccharides. Par cyanobactérie, on entend plus particulièrement les souches des genres Nostoc, Gloeocapsa, Chroococcidiopsis, Phormidium, Microcyctis et Lyngbya.
Elle concerne également un procédé de culture en mode mixotrophe dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 30 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.
Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les cyanobactéries ainsi cultivées en polysaccharides. Ce procédé peut être également utilisé, pour sélectionner des souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en polysaccharides.
La culture en mode mixotrophe de cette cyanobactérie s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de polysaccharides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol.
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des cyanobactéries selon l'invention.
Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de cyanobactéries du genre Nostoc (Division : Cyanobactérie, Ordre : Nostocales, Famille : Nostocaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple le milieu BG1 1 [R., Rippka, R., J. Deruelles, J. Waterbury, M. Herdman and R. Stanier (1979) ; Generic assignments, strain historiés and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 1 1 1 : 1 -61], dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose, du lactate, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM.
Ces nouvelles souches de Nostoc peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.
Une souche représentative des souches de Nostoc sp. selon l'invention est la souche FCC 1051 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, sous le numéro CCAP 1453/37. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de polysaccharides quand elles sont cultivées en mode mixotrophe avec un apport en lumière variable ou discontinu, selon l'invention.
Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 1453/37 appartient au genre Nostoc. L'invention porte sur toute souche du genre Nostoc, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des polysaccharides.
Les souches de Nostoc isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de polysaccharides, lesdits polysaccharides pouvant représenter plus de 60% ou plus de 70% en poids par rapport au poids total de la matière sèche.
Dans la présente invention, la biomasse obtenue avec la souche
FCC 1051 , isolée par le demandeur, d'une culture en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, est de 10 à 60 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode mixotrophe classique. Par mode mixotrophe classique, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, notamment de l'espèce Nostoc sp. en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs, notamment en vue de produire des polysaccharides.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en polysaccharides, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.
Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des cyanobactéries et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de polysaccharides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux cyanobactéries a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des polysaccharides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les cyanobactéries ont tendance à accumuler des réserves polysaccharides pour résister aux contraintes de leur environnement.
Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée du flash peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. La durée du flash est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est comprise entre 5 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1, ou 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 150 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1. Par définition, 1 μιτιοΙ. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature. Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 μιτιοΙ. m-2, s-1 , la période temporelle de la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιτιοΙ. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement comprise entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 μιτιοΙ. m"2, s"1. L'intensité de la lumière peut également varier entre 5 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 μηηοΙ.ηη"2.5"1 et 100 μηηοΙ. m"2 s"1 , ou 5 et 400 μηηοΙ. m"2 s"1, ou 50 et 800 μηηοΙ. m"2, s"1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence les valeurs 50 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1 , les valeurs 0 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1. Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 , les valeurs 0 et 600 mol.m"2.s"1, les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 mol.m"2.s"1. Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et elle est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.
Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 10 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , par exemple, de préférence entre 20 et 50 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 par exemple, de préférence entre 50 et 150 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou de moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1, par exemple, de préférence entre 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1 par exemple, de préférence entre 200 et 500 μιτιοΙ. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 μηηοΙ. m"2. Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 μιτιοΙ. m"2, par heure.
Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 μηηοΙ. m-2, s-1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 μιτιοΙ. m"2, s"1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 μιτιοΙ. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μηηοΙ. m"2.
Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est 105 et 5 x105 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 μιτιοΙ. m"2, de préférence encore entre 2000 et 5000 μηηοΙ. m"2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 μηηοΙ. m"2, de préférence entre 6000 et 50 000, et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 μιτιοΙ. m"2, par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple de préférence entre 45 000 et 200 000 μιτιοΙ. m"2, et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 μηηοΙ. m"2.
Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 μιτιοΙ. m"2 à 4500 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 μmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 μηηοΙ. m"2.
Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou de moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 μιτιοΙ. m"2 à 30 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 μιτιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 μιτιοΙ. m"2.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée de polysaccharides.
Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Nostoc, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 1453/37, et ayant un haut rendement en polysaccharides. Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure, b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des cyanobactéries ainsi cultivées.
Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.
Avantageusement, la culture en mode mixotrophe s'effectue dans des conditions d'éclairement discontinu ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m"2, s"1 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.
Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés offrent généralement un meilleur rendement pour la production de polysaccharides.
Les cyanobactéries peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue et/ou variable, présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les cyanobactéries en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des polysaccharides.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :
d) une étape d'extraction des polysaccharides des cyanobactéries ainsi récupérées et/ou éventuellement,
e) une étape de récupération des polysaccharides sécrétés dans ledit milieu de culture des cyanobactéries.
Ainsi, selon un mode de l'invention, les polysaccharides sont sécrétés par les cyanobactéries dans leur milieu de culture, d'où ils sont récupérés selon des méthodes connues à l'homme de l'art. Selon un autre mode de l'invention, les polysaccharides qui sont localisés dans des structures additionnelles attachées à la surface de la membrane cellulaire de la cyanobactérie, sont récupérés selon des méthodes connues de l'homme de l'art. Selon un autre mode de l'invention, les polysaccharides qui sont localisés à la surface extérieure de la membrane cellulaire de la cyanobactérie sont récupérés selon des méthodes connues à l'homme de l'art. Selon un autre mode de l'invention, les polysaccharides qui sont localisés à l'intérieur de la membrane cellulaire de la cyanobactérie sont récupérés selon des méthodes connues de l'homme de l'art. Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce de cyanobactéries, en particulier du genre Noctoc, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire des polysaccharides.
Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les cyanobactéries ainsi cultivées en polysaccharides.
L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production des polysaccharides, via la culture de cyanobactéries, en particulier du genre Noctoc à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des cyanobactéries ainsi cultivées pour en extraire le contenu polysaccharidique, et/ou la récupération des polysaccharides sécrétés dans ledit milieu de culture des cyanobactéries.
Les méthodes de récupération et d'extraction des polysaccharides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Smith, I. H. et Pace, G. W. (1982) Recovery of microbial polysaccharides, J. Chem. Tech. Biotechnol., 32 :1 19-121 ].
L'invention porte également sur les cyanobactéries, en particulier du genre Noctoc, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces cyanobactéries sont enrichies en polysaccharides. Elles ont généralement un rendement en polysaccharides de plus de 60% ou plus de 70% en poids par rapport au poids total de la matière sèche.
Exemple 1
Les cultures de Nostoc FCC 1051 ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 ,5L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration suivante : hélice de Rushton et hélices tripales à pompage descendant. La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table agitante (140 rpm) en enceinte thermo statée (23°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu BG1 1 (R., Rippka, R., J. Deruelles, J. Waterbury, M. Herdman and R. Stanier (1979))
Le substrat carboné organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glucose à des concentrations entre 50 mM et 150 mM. Suivi des cultures :
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFB, Whatman, puis séchage à l'étuve à 100°C pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des polysaccharides externes en fin de culture, 100mL de suspension cellulaire sont utilisés pour réaliser l'extraction. Les méthodes de dosage des polysaccharides sont connues de l'homme du métier.
Eclairement :
La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 80 μιτιοΙ. m"2, s"1.
L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED (Diodes Electro Luminescentes) réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Un pilotage informatique déclenche l'alimentation des LED pour des temps d'éclairement ou des flashs.
Figure imgf000019_0001

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé comprenant l'étape suivante :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Nostoc dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μmol. m-2, s-1 et 1000 μιτιοΙ. m-2, s-1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μmol. m-2, s-1 et 400 μιτιοΙ. m-2, ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la cyanobactérie est de l'espèce Nostoc sp.
4. Procédé selon la revendication 1 , 2 ou 3, caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM, le substrat carboné organique étant choisi parmi l'amidon, le lactate, le lactose, le saccharose, l'acétate, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glucose.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 30 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1 , de préférence entre 70 et 300 μιτιοΙ. m"2, s"1 , et plus préférentiellement entre 100 et 200 μιτιοΙ. m"2, s"1.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence entre
5 secondes et 10 minutes, plus préférentiellement entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement encore entre 20 secondes et 1 minute.
9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence, entre 10 et
150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement entre 20 et 50 fois par heure.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'apport total de lumière par heure en micromoles des photons est entre 2000 à 600 000, de préférence entre 2000 à 200 000 μηηοΙ. m"2.
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes :
a) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
b) une étape de récupération des cyanobactéries ainsi cultivées, et l'extraction des polysaccharides des cyanobactéries ainsi récupérées et/ou c) une étape de récupération des polysaccharides sécrétés dans ledit milieu de culture des cyanobactéries.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce que ladite cyanobactérie de l'espèce Nostoc, correspond à la souche FCC 1051 , déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 1453/37.
13. Cyanobactérie du genre Nostoc susceptible d'être obtenue par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 .
14. Cyanobactérie du genre Nostoc, selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle produit des polysaccharides à un rendement de plus de 60% ou plus de 70% en poids par rapport au poids total de la matière sèche.
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