CN116516035A

CN116516035A - 检测不同鲍特菌的组合物、试剂盒、方法及其用途

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Publication number: CN116516035A
Application number: CN202310532516.XA
Authority: CN
Inventors: 乔同; 孙青芝; 谭德勇; 吴康; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-08-01

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及呼吸道感染相关病原菌的检测，更具体地，涉及副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。

Description

检测不同鲍特菌的组合物、试剂盒、方法及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及呼吸道感染相关病原菌病原体的检测，更具体地，涉及副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌的检测。

背景技术

副百日咳鲍特菌是一种革兰氏阴性细菌病原体，在呼吸道中定植并引起百日咳。然而，由副百日咳鲍特菌引起的疾病的严重程度被认为持续时间更短，并且比百日咳杆菌更轻，百日咳杆菌是人类百日咳的主要致病病原体。鲍特氏菌种的比较基因组分析表明，百日咳杆菌和副百日咳鲍特菌是从支气管败血症菌样祖先独立进化而来的。副百日咳鲍特菌分化为两个不同的谱系：一个引起婴儿百日咳，另一个感染绵羊。

霍氏鲍特菌是一种革兰氏阴性，杆状(或主要是小球虫和短杆状)，生长缓慢的微生物。被认为可引起侵袭性感染(菌血症、脑膜炎、心内膜炎、心包炎、肺炎和关节炎)和百日咳症状。由于百日咳的常规诊断试验不是物种特有的，因此霍氏鲍特菌经常被误认为是百日咳鲍特菌感染。抗菌治疗也可能存在问题，因为霍氏鲍特菌对大环内酯(经验用于治疗百日咳)和第三代头孢菌素(通常用于治疗侵袭性感染)的敏感性低于预期。霍氏鲍特菌对人类的适应仍在继续，毒性可能会增加，因此需要更好的诊断方法和流行病学监测。

通过生物培养(血液、胸膜或关节培养或鼻咽样本)来培养霍氏鲍特菌是很麻烦的，血液培养阳性的平均培养时间为40h，而且细菌在麦康基琼脂上生长较差。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)通过快速和准确地鉴定临床微生物学中获得的大多数病原体，已经彻底改变了细菌的鉴定。对于难以用生化方法准确鉴定的病原体，如霍氏鲍特菌，MALDI-TOF MS是一种理想的鉴定仪器。然而，只有少数已发表的著作报告了霍氏鲍特菌与MALDI-TOF MS。鉴定的金标准仍然是16S rDNA测序。然而，通过16S测序获得的序列通常与百日咳杆菌获得的序列非常相似，必须进行进一步的序列分析，例如通过PCR检测霍氏鲍特菌特异性基因。

支气管败血鲍特菌是鲍特菌属中的一种小型革兰氏阴性球杆菌。与挑剔的百日咳杆菌不同，支气管败血鲍特菌在标准细菌培养基上很容易生长。支气管鲍特菌对狗、猫、兔、猪、马和小鼠等动物的呼吸道表现出倾向性。它会导致狗的气管支气管炎或“犬舍咳嗽”，猪萎缩性鼻炎和兔子鼻塞。因为这种倾向性使支气管鲍特菌感染在人类中并不常见，并且因为动物先于大多数人类感染，其被认为是人畜共患病。支气管鲍特菌是一种专性需氧菌，在血液、巧克力和麦康基琼脂等标准实验室培养基上生长1至2天。鉴定是通过生化和表型方法或分子方法进行的，如聚合酶链反应(PCR)、16S rRNA测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)。该病原体可能与百日咳杆菌抗体发生交叉反应，导致百日咳杆菌荧光抗体检测呈假阳性。尽管百日咳杆菌检测长期以来一直被认为是特异性的，但当前PCR检测中使用的靶插入基因序列IS481可能存在于支气管败血鲍特菌菌株中，并引起对错误识别的担忧。

因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且灵敏度高，特异性好。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种病原体联检并区分的组合物，包括：

如SEQ ID NO:1～3所示的检测副百日咳鲍特菌的上游引物、下游引物及探针；

如SEQ ID NO:4～6所示的检测霍氏鲍特菌的上游引物、下游引物及探针；以及

如SEQ ID NO:7～9所示的检测支气管败血鲍特菌的上游引物、下游引物及探针。

副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌均被报道能够感染人类，由于三者在遗传上高度相似，常规临床诊断和菌种鉴定的金标准16S rDNA测序均很难进行区分。

本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。

进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。

在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。

在一些具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。

进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

在一些具体的实施方案中，副百日咳鲍特菌探针的荧光报告基团为FAM；支气管败血鲍特菌探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)；霍氏鲍特菌探针的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。

进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。

在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。

进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。

在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌。

第三方面，本发明提供了一种病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H₂O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌的片段质粒或片段DNA中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。

更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、尿嘧啶糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、Mg²⁺、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。

常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl₂、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。

在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。

第四方面，提供了一种用于病原体联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是鼻拭子，咽拭子等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

UDG酶反应，温度为40～60℃，时间为30～150秒，1次循环；cDNA预变性，温度为94℃，时间为3～6min，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的的病原体联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

UDG酶反应，温度为40～60℃，时间为30～150秒，1次循环；cDNA预变性，温度为94℃，时间为3～6min，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5～20秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患呼吸道疾病的信息。例如，该方法可以在检测培养物中(例如咽拭子)需求检测是否有上述病原体。

附图说明

图1～4为本发明组合物检测结果图(分别为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌、内标)；

图5～7为本发明组合物灵敏度结果图(分别为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌)；

图8为本发明组合物特异性结果图；

图9～11为本发明组合物精密度结果图(分别为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌)；

图12～14为本发明对比例组合物检测结果图(分别为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌)。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

本发明所使用的引物及探针如下表1所示：

其中，BPP的荧光报告基团为FAM；BH的荧光报告基团为HEX(或VIC)；BBP的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。

实施例2、检测病原体的方法

本发明检测样本为鼻咽拭子。磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：

2.1根据待测样本数量取1.5mL离心管若干，每管加入300μL样品；

2.2加入500μL提取溶液1和50μL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。

2.3室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)；

2.4加入200μL洗涤液1和600μL洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃。

2.6将离心管至于离心机中低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将管底液体完全吸尽。

2.7加入30～100μL洗脱液S(推荐使用80μL洗脱)，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置3min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5mL离心管中。

2.8吸取上述处理好的样本、BPP/BH/BBP-阳性对照及BPP/BH/BBP-阴性

对照各10μL分别加入对应的0.2 mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。

实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置：

组份	每一个反应中的体积/浓度
		模板	5-10μL
Mg²⁺	4-6mM
		dNTPs(100mM)	0.2-0.4mM
Taq酶(5U/μl)	5-15U
		引物	100-500nM
探针	50-250nM
		PCR缓冲液(1x)	补至50μL

PCR扩增程序如下进行设置：

结果分析：

1)目的检测信号为FAM，HEX(或VIC)，ROX，人基因内标检测信号为CY5；

2)Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；

3)结果判读

A)对于FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为BPP阳性；对于FAM通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，且CY5通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为BPP阴性。

B)对于HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为BH阳性；对于HEX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，且CY5通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为BH阴性。

C)对于ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为BBP阳性；对于ROX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，且CY5通道有扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为BBP阴性。

D)对于FAM、ROX、HEX、CY5通道均未检测到典型的S型扩增曲线(No无Ct)值显示，或Ct＞40，表示本次检测样本细胞含量太低或者有干扰物质抑制反应，该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验。

实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果

将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1～4所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，浓度分别为5000、1000、500、200拷贝/ml，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图5～7所示，表明对低至500拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/mL。。

实施例5、本发明组合物的特异性

本发明组合物与呼吸道常见病原体及感染症状相似的其他病原体(如百日咳鲍特菌、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、EB病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌等)均无交叉反应。结果如图8所示。

实施例6、本发明组合物的精密度

选择强阳、弱阳2个浓度水平(分别为10000copies/ml和2000copies/ul)的质控品进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定10次。结果显示强阳、弱阳参考品的检出率均为100％，并批内、批间的检测Ct值变异系数(CV)小于5％，可以认为本试剂盒批内、批间均有着很好的检测精密度。如图9～11所示。

对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针

由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。

因此，发明人还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系1～3(序列未示出)，同样用于检测上述病原体。具体检测结果如图12～14所示，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低，无平台期，而其他靶标甚至无扩增曲线，因此，整体检测效果差。

Claims

1.一种病原体联检并区分的组合物，包括：

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，副百日咳鲍特菌的荧光报告基团为FAM；霍氏鲍特菌的荧光报告基团为HEX或IVC；支气管败血鲍特菌的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌。

7.一种病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UDG酶、PCR缓冲液以及Mg²⁺中的至少一种。

10.一种以非诊断目的检测并区分病原体的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。