CN116200542A - 同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒，所述引物池包括检测犬瘟热病毒、犬腺病毒Ⅱ型、犬副流感病毒、支气管败血波氏杆菌和犬支原体的引物对和湮灭探针；所述试剂盒包括所述引物池、PCR反应液和缓冲液。本发明的试剂盒中设置有微阵列qPCR检测卡盒，该微阵列qPCR检测卡盒内的每个子检测区仅固定有某一种病原体的荧光核酸，进而可对样本中的多种病原体进行区分检测。与此同时，本发明在该多重PCR快速检测试剂盒的基础上针对性地做了引物的体系优化，并设计了全新的引物池，进一步实现了临床上对犬多种病原体特异、灵敏性地快速检测。

Description

同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒
技术领域
本发明属于病原体核酸检测技术领域，具体涉及一种同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus)引起犬的高度接触性、急性传染病。病毒存在于肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等多种器官与组织中，通过眼泪、鼻液、唾液、尿液和呼出的空气向外排出病毒。临床上以双相热、急性鼻卡他、结膜炎及其后出现的支气管炎或肺炎、胃肠炎和神经症状为特征。犬瘟热是当前我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。
犬副流感(CPIV)是由犬副流感病毒Ⅱ型引起的，以急性呼吸道炎症为主要症状的犬的病毒性传染病。犬副流感病毒Ⅱ型为副黏病毒科、副黏病毒属的成员，还可引起急性脑脊髓炎和脑内积水，临床表现后躯麻痹和运动失调等症状。犬副流感病毒Ⅱ型可感染各种年龄、性别和品种的犬，但幼龄、体弱和处于应激状态的犬多发，且病情较重，病程1～4周不等，死亡率可达60％。常突然发生，传播迅速，且常与近期发病犬或带毒犬接触有关。急性期病犬是最主要的传染源。自然感染途径主要是呼吸道。
犬腺病毒(CAV)属腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，为双股，线状DNA病毒。CAV是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，与人腺病毒具有相似的基因结构。根据其血凝和中和试验等特性不同可将CAV分为I型和II型，CAV-II型会引起上呼吸道感染和肠道感染，临床症状主要引起与呼吸道疾病和肠炎相关的犬接触性呼吸道疾病，但不引起肺炎症状，可引起幼犬咳嗽又叫犬窝咳。
支气管败血波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica)，又称为支气管炎博德特氏菌，是一种需氧革兰氏阴性菌，可引起多种哺乳动物呼吸道的隐性感染及急、慢性炎症，如猪、犬、猫、马、牛、兔、鼠等动物。本病不同品种、不同性别和不同年龄的犬都可感染，但以幼龄犬最为敏感、危害更为严重。临床上以咳嗽、流鼻涕为主要特征，犬群中一旦发病，很快引起整窝幼犬发病、咳嗽，故被称为“犬窝咳”
犬支原体是一种介于细菌、病毒的原核微生物，通过寄居在宿主细胞表面的受体上吸收营养，并释放有毒物质，从而损伤细胞和组织。犬支原体主要引起犬呼吸道疾病、泌尿生殖道疾病、贫血症、关节炎及结肠炎等，如犬类易感嗜血支原体导致出现持续性发热、流涕、食欲不振，严重时会出现呕吐、腹泻等急性临床症状，并产生严重贫血或溶血性贫血，最终便血而亡。犬支原体病常伴随支原体与大肠杆菌、病毒等的混合感染，病情更加凶猛。
上述几种疾病在感染后产生的临床症状相似，而且容易产生混合感染，对临床诊断带来极大的干扰性，而且，目前单一性的犬病原体检测耗时长，不能实现对多种病原体快速和准确的检测和鉴别。因此，有必要建立一种可以同步实现对大量不同病原体的快速的早期诊断方法，以节约诊断时间，以便尽快采取有效的防控措施。
发明内容
本发明针对现有技术对犬病原体的检测主为单一性检测，其耗时长且不能同步实现对多种病原体快速和准确的检测和鉴别的技术问题，目的在于提供一种能同步实现对多种犬病原体的快速诊断的同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒。
本发明的同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒，所述引物池包括如下引物对和湮灭探针：
检测犬瘟热病毒的CDV-F正向引物、CDV-R反向引物和CDV-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1～3所示；
检测犬腺病毒的CAV-1-F正向引物、CAV-1-R反向引物和CAV-1-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:4～6所示；
检测犬副流感病毒Ⅱ型的CPIV-F正向引物、CPIV-R反向引物和CPIV-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:7～9所示；
检测支气管败血波氏杆菌的Bb-F正向引物、Bb-R反向引物和Bb-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:10～12所示；
检测犬支原体的MC-F正向引物、MC-R反向引物和MC-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:13～15所示。
较佳地是，包括权利要求1所述的引物池、PCR反应液和缓冲液。
较佳地是，所述引物池为引物池冻干粉；所述PCR反应液为PCR反应液冻干粉；所述缓冲液为pH＝8.0的Tris缓冲液。
较佳地是，所述PCR反应液冻干粉包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、二价镁离子和三磷酸脱氧核糖核苷酸。
较佳地是，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：
耐热DNA聚合酶的浓度为0.01～1单位/μL，优选0.01～0.1单位/μL；
逆转录酶100-400U/μL，优选100-150U/μL；
RNA酶抑制剂30-50U/μL，优选35-45U/μL；
二价镁离子的浓度为1～4mmol/L，优选2.5～3.5mmol/L；
三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为10～500μmol/L，优选100～200μmol/L；
各正向引物、各反向引物和各湮灭探针的浓度分别为10～500nmol/L，优选100～200nmol/L。
较佳地是，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：
耐热DNA聚合酶的浓度为0.05单位/μL；
逆转录酶的浓度为125U/μL；
RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL；
二价镁离子的浓度为3mmol/L；
三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/L；
各正向引物、各反向引物和各湮灭探针的浓度分别为200nmol/L。
较佳地是，所述试剂盒还包括PCR质控品，所述PCR质控品包括阳性质控品和阴性质控品。
较佳地是，所述阳性质控品为质粒或核酸模板标准品，所述阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。
较佳地是，所述质粒或核酸模板标准品的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO:16～20所示。
较佳地是，所述试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的试剂盒中设置有微阵列qPCR检测卡盒，该微阵列qPCR检测卡盒内的每个子检测区仅固定有某一种病原体的荧光核酸，进而可对样本中的多种病原体进行区分检测。与此同时，本发明在该多重PCR快速检测试剂盒的基础上针对性地做了引物的体系优化，并设计了全新的引物池，进一步实现了临床上对犬多种病原体特异、灵敏性地快速检测。相比于现有的单一性的犬病原体检测，本发明通过一次PCR扩增的反应体系可实现犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅱ型、支气管败血波氏杆菌、犬支原体5种犬病原体的同时检测，且具有较强的特异性和较高的灵敏度。
附图说明
图1为本发明的实施例3中的CDV扩增曲线图；
图2为本发明的实施例3中的CAV-1扩增曲线图；
图3为本发明的实施例3中的CPIV扩增曲线图；
图4为本发明的实施例3中的Bb扩增曲线图图；
图5为本发明的实施例3中的MC扩增曲线图；
图6为本发明的实施例3中的阴性质控品扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明提供了一种同时检测犬多种病原体的引物池和试剂盒，以下将结合具体实施例进一步描述所述引物池和试剂盒，具体内容如下：
实施例1引物池的设计
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对CDV，CAV-1,CPIV,Bb,MC基于NCBI(nt和细菌病毒)数据库进行基因组序列比对分析。通过Genbank中公用的BLAST软件，将这些基因的序列分别与其他微生物(包括环境和相关微生物，如大肠杆菌、犬细小病毒等)进行比对，选出特异性≥98％的序列区段。然后结合软件Primer 5.0和oligo7在这些特异序列中设计相应的上下游引物和探针。
引物探针的设计遵循3个基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
通过以上过程设计得到全新的引物池，引物池中包括的引物和探针的具体序列情况如下表1所示：
表1引物和湮灭探针序列
Figure BDA0004040244100000051
需要说明的是，本发明的同时检测犬多种病原体的引物池包括且不限于表1中的引物和湮灭探针。
实施例2试剂盒的灵敏度检测
作为示例说明，本发明的同时检测犬多种病原体的试剂盒包括实施例1中所述引物池的引物池冻干粉、PCR反应液冻干粉和pH＝8.0的Tris缓冲液，其中，PCR反应液冻干粉包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、二价镁离子和三磷酸脱氧核糖核苷酸。本发明的同时检测犬多种病原体的试剂盒的试剂成分的具体成分浓度为：耐热DNA聚合酶0.05单位/μL、逆转录酶125U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL、二价镁离子3mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸200μmol/L、表1中的正向引物、反向引物和湮灭探针分别200nmol/L。
本发明的试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒(闪量微阵列-qPCR试剂卡盒，即含有CN2019107011550所述的多重连接探针微阵列)，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸。本发明的试剂盒还包括PCR质控品，所述PCR质控品采用质粒或核酸模板标准品作为阳性质控品，同时采用灭菌后焦碳酸二乙酯处理水作为阴性质控品。
本发明的同时检测犬多种病原体的试剂盒的灵敏度的检测方法包括以下步骤：
步骤S1、样本制备。将5种质粒或核酸模板标准品分别置于生理盐水。所述5种质粒或核酸模板标准品是委托供应商(生工生物工程(上海)股份有限公司)生产，序列情况如表2所示。按照供应商提供的浓度利用TE缓冲液(pH＝8.0)稀释制备成5种靶标的标准品(浓度为8×108copy/mL)，然后分别使用生理盐水梯度稀释成浓度为1.5×105copy/mL、1.5×104copy/mL和1.5×103copy/mL的三个测试样品浓度。
表2质粒或核酸模板标准品的序列
Figure BDA0004040244100000061
步骤S2、检测试剂盒灵敏度。分别取100μL的步骤S1中稀释后的3个样品，然后分别加入到本发明的试剂盒中的微阵列qPCR检测卡盒的加样口内(或者利用CN201810022723X表面探针定量PCR方法，或者CN2020102299920基于通用探针芯片的多重定量PCR检测系统也都是可以的)。一次性微阵列qPCR检测卡盒内含有本发明的同时检测犬多种病原体的试剂盒内的试剂成分，具体成分浓度为：耐热DNA聚合酶的浓度为0.05单位/μL、逆转录酶125U/μL、RNA酶抑制剂40U/μL、二价镁离子的浓度为3mmol/L、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/L、以及表1中的正向引物、反向引物和湮灭探针分别200nmol/L；所述微阵列qPCR检测卡盒内缓冲液为pH＝8.0的Tris缓冲液。
扩增检测实验使用闪量公司的FDx-1000核酸扩增检测分析仪(国械注准20223221095)作为相应的荧光实时定量PCR仪(专利号：CN111621551B)，选择预设快速自动检测程序为45个循环。该设备通过检测到微阵列qPCR检测卡盒型号后，自动运行所选择的程序，并进行全自动的扩增检测。其中，PCR扩增检测的变性温度为92度30秒，复性温度为65度45秒，扩增温度为72度45秒。FDx-1000系统通过扩增曲线，自动测量扩增反应的各检测靶标的Ct值：若Ct≤38，该样本为阳性；若38＜Ct＜40，该样本为灵敏度边缘样本，需要重新采样检测；若Ct≥40，该样本为阴性。同时采用灭菌后焦碳酸二乙酯处理水作为阴性质控品，作为对照。
检测结果如表3所示，通过该实验可以观察到扩增体系能稳定地检测到较低浓度的病毒样本，即便样本浓度低到1.5×103copy/mL也依然能够检测到。
表3 5种犬病原体标准品使用本发明的试剂盒检测灵敏度结果
Figure BDA0004040244100000071
实施例3试剂盒的特异性检测
本发明的同时检测犬多种病原体的试剂盒的特异性的检测方法为：测试样本为CDV、CAV-1、CPIV、Bb、MC、弓形虫、滴虫这7种临床感染阳性的宠物样本(灭活猫临床样本)，将上述7种临床阳性样本和阴性质控品(灭菌后焦碳酸二乙酯处理水)用本发明的试剂盒在实施例2的检测方法下进行检测和分析，检测结果如表4所示。
表4 7种临床阳性样本和阴性质控品使用本发明的试剂盒的特异性检测结果
Figure BDA0004040244100000081
由图1～6和表4可知：本发明的实施例3所采用的阴阳性样本的阴性阳性符合率100％，因此说明特异性检测的实验有效。其中，CDV、CAV-1、CPIV、Bb、MC均在相应的靶标上面有检出，含有其它病毒的弓形虫临床阳性样本、滴虫临床阳性样本和阴性质控品中均无扩增，说明本发明的试剂盒具有较好的特异性。
以上结合附图实施例对本发明进行了详细说明，本领域中普通技术人员可根据上述说明对本发明做出种种变化例。因而，实施例中的某些细节不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (10)

1.一种同时检测犬多种病原体的引物池，其特征在于所述引物池包括如下引物对和湮灭探针：
检测犬瘟热病毒的CDV-F正向引物、CDV-R反向引物和CDV-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1～3所示；
检测犬腺病毒Ⅱ型的CAV-1-F正向引物、CAV-1-R反向引物和CAV-1-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:4～6所示；
检测犬副流感病毒的CPIV-F正向引物、CPIV-R反向引物和CPIV-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:7～9所示；
检测支气管败血波氏杆菌的Bb-F正向引物、Bb-R反向引物和Bb-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:10～12所示；
检测犬支原体的MC-F正向引物、MC-R反向引物和MC-P湮灭探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:13～15所示。
2.一种同时检测犬多种病原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物池、PCR反应液和缓冲液。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物池为引物池冻干粉；所述PCR反应液为PCR反应液冻干粉；所述缓冲液为pH＝8.0的Tris缓冲液。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、二价镁离子和三磷酸脱氧核糖核苷酸。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：
耐热DNA聚合酶的浓度为0.01～1单位/μL，优选0.01～0.1单位/μL；
逆转录酶100-400U/μL，优选100-150U/μL；
RNA酶抑制剂30-50U/μL，优选35-45U/μL；
二价镁离子的浓度为1～4mmol/L，优选2.5～3.5mmol/L；
三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为10～500μmol/L，优选100～200μmol/L；
各正向引物、各反向引物和各湮灭探针的浓度分别为10～500nmol/L，优选100～200nmol/L。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的PCR反应液：
耐热DNA聚合酶的浓度为0.05单位/μL；
逆转录酶的浓度为125U/μL；
RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL；
二价镁离子的浓度为3mmol/L；
三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200μmol/L；
各正向引物、各反向引物和各湮灭探针的浓度分别为200nmol/L。
7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR质控品，所述PCR质控品包括阳性质控品和阴性质控品。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为质粒或核酸模板标准品，所述阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒或核酸模板标准品的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:16～20所示。
10.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微阵列qPCR检测卡盒，所述微阵列qPCR检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸。
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