CN117721230A - 针对呼吸道病原体及耐药基因的检测试剂盒和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了针对呼吸道病原体及耐药基因的检测试剂盒和制备方法，涉及生物学检测技术领域。本发明提供了一种用于呼吸道病原体及其耐药基因检测的引物探针组合，所述的引物探针组合包括检测金黄色葡萄球菌及其耐药基因的引物和探针、检测肺炎链球菌及其耐药基因的引物和探针、检测肺炎克雷伯菌及其耐药基因的引物和探针、检测肺炎支原体及其耐药基因的引物和探针。本发明提供的引物探针组合具有较好的重复性、漏检率低，并且灵敏度和特异性较高，抗干扰性较强。
Description
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及针对多病原体耐药鉴别的联检试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
病原体是指能够造成人或动植物干扰疾病的微生物，当病原体侵入机体时，一方面可以直接损伤呼吸道上皮细胞以及粘膜屏障，引起外源性抗原的侵入，同时也可以促进多种炎症介质、细胞因子及氧自由基等的释放，造成机体氧化和抗氧化之间动态平衡的改变，从而加重肺部组织损伤。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称SA)是造成人和动物感染的主要病原菌之一，可引起鼻腔、口腔粘膜以及皮肤和上皮组织的的感染，严重的可导致肺炎、败血症甚至死亡。抗生素的开发利用，使细菌逐渐产生了耐药性，尤其是耐甲氧西林的SA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)发展到几乎对所有抗生素都产生了抗药性，由SA和MRSA引起的疾病和死亡大大增加。
肺炎链球菌是儿童感染性疾病中重要的病原菌，不仅可在机体抵抗力降低时向邻近组织扩散，引起上呼吸道感染、中耳炎、鼻窦炎等非侵袭性肺炎链球菌疾病。抗生素是应用于肺炎链球菌疾病的主要治疗手段，肺炎链球菌的耐药问题不断加剧，多重耐药菌株也不断被报道。
肺炎克雷伯菌是革兰阴性菌，属肠杆菌科，常存在于人体上呼吸道、胃肠道、皮肤和泌尿生殖器等处，可引起肺炎、泌尿道感染、败血症等多系统的感染。肺炎克雷伯菌医是院常见的耐药菌株。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)检出率持续上升。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)可选药物极少，病死率高。
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是一种介于病毒和细菌之间的无细胞壁型微生物，也是引起儿童社区获得性肺炎(Community acquiredpneumonia，CAP)的重要病原体。由于抗生素的广泛使用，近年来MP对大环内酯类药物耐药现象严重。
目前实验室常规用的检测病原体手段如染色镜检、耐药培养皿测试等，耗时长，操作复杂，且需专业人士才能准确判断结果，临床对快速分子诊断试剂有较大需求。荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和肺炎支原体的侵袭力强、治疗时间长，且由于抗生素的滥用，常常带有耐药性。因此早期确诊，及早治疗是提高治愈率的关键。目前，亟需一种重复性、灵敏度和特异性均较高检测上述四种病原体及其耐药基因的引物探针组合。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于呼吸道病原体及其耐药基因检测的引物探针组合，所述的引物探针组合具有较好的重复性、较低的漏检率，并且灵敏度和特异性较高，具有较好的抗干扰性。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种用于呼吸道病原体及其耐药基因检测的引物探针组合，包括：检测金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO:1-2所示的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针；检测肺炎链球菌的如SEQ ID NO:4-5所示的引物对和SEQ ID NO:6所示的探针；检测肺炎克雷伯菌的如SEQ ID NO:7-8所示的引物对和SEQ ID NO:9所示的探针；检测肺炎支原体的如SEQ ID NO:10-11所示的引物对和SEQ ID NO:12所示的探针；检测金黄色葡萄球菌耐药基因的如SEQ ID NO:13-14所示的引物对和SEQ ID NO:15所示的探针；检测肺炎链球菌耐药基因的如SEQ ID NO:16-17所示的引物对和SEQ ID NO:18所示的探针；检测肺炎克雷伯菌耐药基因的如SEQ ID NO:19-20所示的引物对和SEQ ID NO:21所示的探针；检测肺炎支原体耐药基因的如SEQ ID NO:22-23所示的引物对和SEQ ID NO:24所示的探针。
优选地，所述的探针的5’端连接荧光报告基团。
进一步地，所述的荧光报告基团选自FAM、ROX、HEX、CY5、VIC、TET、JOE、Cy3、Cy7、RED610、Texas Red、RED670、NED、AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、Alexa Fluor488、Yakima Yellow、Quasar 570、Aqua Phluor593、Atto 590、Cy5.5中的至少一种。
再进一步地，所述的荧光报告基团选自FAM、ROX、HEX、CY5中的至少一种。
具体地，序列如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：15所示的探针荧光报告基团为FAM。
具体地，序列如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：18所示的探针荧光报告基团为HEX。
具体地，序列如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：21所示的探针荧光报告基团为ROX。
具体地，序列如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：24所示的探针荧光报告基团为CY5。
又一方面，本发明提供了上述的引物探针组合在制备检测呼吸道病原体及其耐药基因的试剂盒中的应用。
又一方面，本发明提供了一种检测呼吸道病原体及其耐药基因的试剂盒，所述的试剂盒包括上述的引物探针组合。
进一步地，所述的呼吸道病原体包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和肺炎支原体。
进一步地，所述的耐药基因包括金黄色葡萄球菌耐药基因、肺炎链球菌耐药基因、肺炎克雷伯菌耐药基因和肺炎支原体耐药基因。
优选地，所述的试剂盒还包括缓冲液、MgCl2溶液、Taq酶和UNG酶。
优选地，所述的试剂盒中引物或探针的浓度为40-60pmol/μL。
进一步优选地，所述的试剂盒中引物或探针的浓度为50pmol/μL。
优选地，所述的试剂盒中MgCl2溶液的浓度为0.5-1.5mol/L。
进一步优选地，所述的试剂盒中MgCl2溶液的浓度为1mol/L。
优选地，所述的试剂盒中Taq酶的浓度为1-10U/mL。
进一步优选地，所述的试剂盒中Taq酶的浓度为5U/mL。
优选地，所述的试剂盒中UNG酶的浓度为1-10U/mL。
进一步优选地，所述的试剂盒中UNG酶的浓度为5U/mL。
优选地，所述的试剂盒中还包括dNTPs。
优选地，所述的试剂盒的PCR反应程序为：50℃，3min，循环1次；94℃，1min，循环1次；94℃，15s，60℃，25s，循环41次。
根据本发明的一些实施方式，所述的试剂盒还可以包括阳性对照和阴性对照。
优选地，所述的试剂盒的检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液中的一种或多种。
进一步优选地，所述的试剂盒的检测样本为咽拭子、痰液中的一种或多种。
本发明的有益效果为：
本发明分别在四种病原体的保守区域和耐药突变区域设计引物探针，用以鉴定病原体和其耐药性，其中耐药突变靶点的引物探针设计，使用了ARMS引物探针设计技术。本发明的引物探针组合具有较好的重复性、漏检率低，并且灵敏度和特异性较高，抗干扰性较强。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌检测结果。
图2为肺炎克雷伯菌检测结果。
图3为肺炎链球菌检测结果。
图4为肺炎支原体检测结果。
图5为联合靶点检测结果。
图6为金黄色葡萄球菌灵敏度检测结果。
图7为肺炎克雷伯菌灵敏度检测结果。
图8为肺炎链球菌灵敏度检测结果。
图9为肺炎支原体灵敏度检测结果。
图10为特异性检测结果。
图11为金黄色葡萄球菌抗干扰性检测结果。
图12为肺炎克雷伯菌抗干扰性检测结果。
图13为肺炎链球菌抗干扰性检测结果。
图14为肺炎支原体抗干扰性检测结果。
图15为对比例1的引物探针组合物检测结果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1引物及探针
本发明实施例中使用的引物及探针如下表1所示。
表1.
其中，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：15探针的荧光报告基团为FAM；SEQ ID NO：6，SEQID NO：18探针的荧光报告基团为HEX；SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：21的荧光报告基团为ROX；SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：24的荧光报告基团为CY5。
实施例2病原体的检测方法
1.试剂准备
1.1取出盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀并瞬时离心后备用。
1.2根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按比例(PCR反应液26μL/人份+酶混合液4μL/人份)取相应量的组分，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心后备用。
1.3将上述准备好的试剂转移至样本处理区，待用。
2.样本处理与加样
本发明检测样本为咽拭子/痰液。磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：
2.1取1.5mL冻存管加入玻璃珠，将300uL样本和300uL TE加至含混合玻璃珠的1.5mL冻存管中，使用研磨仪进行研磨。待研磨结束，取出冻存管瞬时离心(离心的转速为5000rpm/min，离心的时间为3s，吸取上清液作为待测样本进行备用。
2.2根据待测样本数量取1.5mL离心管若干，每管加入300μL待测样本；
2.3使用圣湘S10015提取试剂盒，进行提取，加入500μL提取溶液1和50μL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热10min。
2.4室温静置1min，低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，5min后缓慢吸弃废液(*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠)；
2.5加入200μL洗涤液1和600μL洗涤液2，震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管置于磁性分离器。磁吸3min，将液体完全吸出丢弃。
2.6将离心管至于离心机中低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器。磁吸3min，将管底液体完全吸尽。
2.7加入75μL洗脱液S(推荐使用80μL洗脱)，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置3min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5mL离心管中。
2.8吸取上述处理好的样本、阳性对照(阳性假病毒)及阴性对照(生理盐水)各20μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入30μL PCR混合液，盖上管盖。
表2.
3.PCR扩增
在ABI7500荧光定量PCR仪、LifeTechnologiesQuantStudioTM5荧光PCR仪、SLAN-96P全自动医用PCR分析系统等PCR仪器上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增，本发明中的PCR反应程序如表3所示。
表3.
检测结果解释如表4-表5所示。
表4A管检测结果说明
表5B管检测结果说明
具体解释如下：
如果该样本FAM，HEX(VIC)，ROX，CY5通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果该样本FAM，HEX(VIC)、ROX，CY5通道无扩增曲线(NoCt)或Ct值＞40，则判为阴性。
1.对于A管且B管FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为金黄色葡萄球菌耐药阳性；对于A管FAM通道检测到典型的S型扩增曲线而B管FAM通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为金黄色葡萄球菌耐药阴性，对于A管FAM通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为金黄色葡萄球菌耐药阴性。
2.对于A管且B管HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为肺炎克雷伯菌耐药阳性；对于A管HEX通道检测到典型的S型扩增曲线而B管HEX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为肺炎克雷伯菌耐药阴性，对于A管HEX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为肺炎克雷伯菌耐药阴性。
3.对于A管且B管ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为肺炎链球菌耐药阳性；对于A管ROX通道检测到典型的S型扩增曲线而B管ROX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为肺炎链球菌耐药阴性，对于A管ROX通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为肺炎链球菌耐药阴性。
4.对于A管且B管Cy5通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40的样本，报告为肺炎支原体耐药阳性；对于A管Cy5通道检测到典型的S型扩增曲线而B管Cy5通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为肺炎支原体耐药阴性，对于A管Cy5通道未检测到典型的S型扩增曲线，或Ct＞40，报告为肺炎支原体耐药阴性。
使用金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体等病原体及其耐药样本(样本为经湖南圣维尔医学检验有限公司提供的阳性样本)各1例(共8例)，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测方法如上所述，结果如图1-图5所示。图1中的检测结果为金黄色葡萄球菌阳性，金黄色葡萄球菌耐药阳性；图2中的检测结果为肺炎克雷伯菌阳性，肺炎克雷伯菌耐药阳性；图3中的检测结果为肺炎链球菌阳性，肺炎链球菌耐药阳性；图4中的检测结果为肺炎支原体阳性，肺炎支原体耐药阳性；图5的检测结果为联合靶点检测为阳性。
实施例3灵敏度检测
取梯度稀释的质粒，浓度分别为500000、50000、5000、500、50copies/ml，分别对5个浓度进行检测，检测方法同实施例1-2，取20ul做模板。结果如图6-图9，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体及其耐药靶点测试结果，表明本发明的方法灵敏度高，检测浓度可达500copies/ml。
实施例4特异性检测
本发明体系分别针对流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、肺炎衣原体、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌、大肠埃希菌、马红球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒(上述样本为湖南圣维尔医学检验所有限公司提供)进行特异性检测实验，实验结果如图10所示，从图10中可以看出无非特异性扩增，本发明组合物的特异性高。
实施例5抗干扰性检测
本发明体系为在样本中添加干扰物质至10μg/mL粘蛋白、20μg/mL血红素、0.5mg/mL美罗培南、20μg/mL甲氧苄啶、0.44mg/mL磺胺甲恶唑、0.8mg/mL两性霉素B、0.1g/mL伊曲康唑、0.5mg/mL氟康唑、0.1g/ml阿奇霉素、1mg/ml肾上腺素、4mg/mL盐酸利多卡中，检测结果如图11-图14所示，表明本发明组合物的抗干扰能力强高。
对比例1
基于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计并验证。
本发明还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系同样用于金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体及其耐药靶点联检。与本发明实施例2的区别仅在于引物和探针的序列不同，其余皆相同，引物和探针序列如下表6所示。
结果如图15所示，检测只出现部分扩增曲线，且扩增曲线增幅低重复性差，且出现漏检现象，因此，对比例1的引物和探针组合的整体检测效果差。
表6.
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于呼吸道病原体及其耐药基因检测的引物探针组合，其特征在于，所述的引物探针组合包括：检测金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO:1-2所示的引物对和SEQ ID NO:3所示的探针；检测肺炎链球菌的如SEQ ID NO:4-5所示的引物对和SEQ ID NO:6所示的探针；检测肺炎克雷伯菌的如SEQ ID NO:7-8所示的引物对和SEQ ID NO:9所示的探针；检测肺炎支原体的如SEQ ID NO:10-11所示的引物对和SEQ ID NO:12所示的探针；检测金黄色葡萄球菌耐药基因的如SEQ ID NO:13-14所示的引物对和SEQ ID NO:15所示的探针；检测肺炎链球菌耐药基因的如SEQ ID NO:16-17所示的引物对和SEQ ID NO:18所示的探针；检测肺炎克雷伯菌耐药基因的如SEQ ID NO:19-20所示的引物对和SEQ ID NO:21所示的探针；检测肺炎支原体耐药基因的如SEQ ID NO:22-23所示的引物对和SEQ ID NO:24所示的探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述的探针的5’端连接荧光报告基团；所述的荧光报告基团选自FAM、ROX、HEX、CY5、VIC、TET、JOE、Cy3、Cy7、RED610、TexasRed、RED670、NED、AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、Alexa Fluor 488、YakimaYellow、Quasar 570、Aqua Phluor593、Atto 590、Cy5.5中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：15所示的探针荧光报告基团为FAM；序列如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：18所示的探针荧光报告基团为HEX；序列如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：21所示的探针荧光报告基团为ROX；序列如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：24所示的探针荧光报告基团为CY5。
4.权利要求1-3任一项所述的引物探针组合在制备检测呼吸道病原体及其耐药基因的试剂盒中的应用。
5.一种检测呼吸道病原体及其耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的呼吸道病原体包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌和肺炎支原体；所述的耐药基因包括金黄色葡萄球菌耐药基因、肺炎链球菌耐药基因、肺炎克雷伯菌耐药基因和肺炎支原体耐药基因。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中引物或探针的浓度为40-60pmol/μL。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括缓冲液、MgCl2溶液、Taq酶和UNG酶；所述的MgCl2溶液的浓度为0.5-1.5mol/L，所述的Taq酶的浓度为1-10U/mL，所述的UNG酶的浓度为1-10U/mL。
9.根据权利要求5-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的PCR反应程序为：50℃，3min，循环1次；94℃，1min，循环1次；94℃，15s，60℃，25s，循环41次。
10.根据权利要求5-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液中的一种或多种。
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