CN104739825A - 异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明利用建立的GFP-Bcr-Abl筛选细胞系，提供了一种异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用，发明人发现异土木香内酯抗CML活性是通过特异性诱导K562细胞内自噬溶酶体活性降解Bcr-Abl融合蛋白来实现的，同时发现异土木香内酯能够显著抑制慢性粒初诊患者及耐药患者中Bcr-Abl阳性干细胞克隆的形成，这为通过异土木香内酯天然小分子化合物诱导Bcr-Abl融合蛋白降解治疗耐药或复发CML患者提供了可能性。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然小分子化合物异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用。
背景技术
白血病(Leukemia)是一类造血干细胞异常的恶性克隆性疾病。在我国白血病发病率逐年上升，约占总癌症发病率的5％。其中，慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)占成人白血病的20％。大约90％以上的CML患者可检出特异性的费城染色体(Philadelphia，Ph)，即t(9；22)(q34；q11)染色体易位，9号染色体长臂的C-Abl基因移位至22号染色体上长臂断裂点集中区(BCR)产生致癌的BCR-ABL融合基因，有95％的慢性粒细胞性白血病患者被检测有此染色体易位，该融合基因编码的Bcr-Abl融合蛋白(Bcr-Ablfusion protein)具有很强的络氨酸蛋白激酶活性，是CML发病的分子生物学基础。
基于对Bcr-Abl蛋白分子结构及其络氨酸残基功能的研究，以它作为靶标寻找治疗CML的特效药物成为相关领域研究的重要热点。上世纪90年代，Zimmermann研究组经过筛选发现，小分子化合物伊马替尼(Imatinib，Gleevec)能够通过竞争性抑制Bcr-Abl蛋白与ATP结合来特异阻断该融合蛋白的络氨酸激酶活性，从而抑制CML细胞增殖并促使其凋亡，2001年美国FDA批准其用于临床治疗CML。随着Imatinib临床疗效获得肯定的同时，也渐渐发现它的缺陷：Imatinib主要针对CML早期患者，中晚期患者对Imatinib完全缓解率低于30％；部分患者可出现Imatinib耐药且比例逐年上升，主要与BCR-ABL突变或基因扩增过表达导致其对Imatinib敏感性降低有关。针对这些问题，沿着既有的思路继续开发新一代的靶向Bcr-Abl融合蛋白的络氨酸激酶抑制剂，诸如Nilotinib，Dasatinib和Ponatinib新一代抑制剂的开发和上市，这固然是解决问题的一种选择，但是鉴于既往的经验，这种选择并不能从根本上治愈CML。因为在这种策略中，只是选择性抑制Bcr-Abl的络氨酸激酶活性，而没有除去Bcr-Abl蛋白。
随着细胞分子生物学知识的积累，现在通过特定的化合物诱导细胞内的某种蛋白酶活性定点清除特定蛋白已成为可能，所以，寻求可诱导Bcr-Abl融合蛋白降解的小分子化合物已成为一种优于只抑制它的活性的治疗策略。这种策略不仅可以克服Bcr-Abl当前各种点突变造成的对络氨酸激酶抑制剂的耐药性，同时它也是靶向Bcr-Abl融合蛋白治疗CML的一种新策略，是一条充满希望值得探索的新治疗途径。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的。
本发明利用建立的GFP-Bcr-Abl筛选细胞系，提供了一种异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用，发明人发现异土木香内酯抗CML活性是通过特异性诱导K562细胞内自噬溶酶体活性来实现降解Bcr-Abl融合蛋白的，同时发现异土木香内酯能够显著抑制慢性粒初诊患者及耐药患者中Bcr-Abl阳性干细胞克隆的形成，这为通过异土木香内酯天然小分子化合物诱导Bcr-Abl融合蛋白降解治疗耐药或复发CML患者提供了可能性。
本发明解决的技术问题包括：
1、筛选出能够降解Bcr-Abl蛋白的单体化合物-异土木香内酯；
2、验证异土木香内酯对Bcr-Abl蛋白的降解效应；
3、异土木香内酯对CML细胞的效应；
4、异土木香内酯降解Bcr-Abl的可能机制；
5、异土木香内酯抗CML耐伊马替尼细胞的效应。
本发明创造性解决其技术问题所采用的技术方案是：构建GFP-Bcr-Abl融合蛋白质粒转入K562细胞中，不同化合物处理转染的细胞，然后检查荧光强度来筛选降解GFP-Bcr-Abl的化合物，得到可能诱导Bcr-Abl蛋白降解的化合物—异土木香内酯。通过Western bloting技术检测异土木香内酯处理或未处理的K562细胞、伊马替尼耐药细胞中的Bcr-Abl，以Bcr-Abl蛋白量是否减少或消失来判断异土木香内酯对Bcr-Abl蛋白的降解效应。通过CCK-8检测异土木香内酯处理的K562细胞来判断它对细胞活力的影响；Annex-V、PI染色异土木香内酯处理的K562细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡；Western bloting检测异土木香内酯处理的K562细胞中的凋亡Maker：Caspase-3和PARP。Real time PCR检测异土木香内酯处理不同时相Bcr-Abl的mRNA水平；蛋白酶体抑制剂(MG132)、Caspase-3抑制剂(Z-VAD)、自噬抑制剂(3-MA，CQ)，对异土木香内酯诱导Bcr-Abl蛋白降解效应的影响。磁珠分选CML患者骨髓CD34阳性细胞，Western bloting检测异土木香内酯对CML干细胞中Bcr-Abl蛋白的降解效应；克隆形成实验检测异土木香内酯对CML患者中干细胞形成克隆能力的影响。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
异土木香内酯单体化合物降解Bcr-Abl蛋白具有以下特点：
1)分子量较小；
2)毒性较低；
3)容易获取；
4)可用于耐伊马替尼CML患者。
附图说明
图1为异土木香内酯(IsoA)的结构(A)，IsoA分别处理转染GFP-Vector(B)和GFP-BCR-ABL(C)的K562细胞，导致GFP-Bcr-Abl荧光信号减弱；
图2为异土木香内酯下调Bcr-Abl蛋白水平：(A)5，10μM异土木香内酯处理K562细胞不同时间，Western blot检测Bcr-Abl蛋白；(B，C)10μM异土木香内酯处理K562R(B)和转染T315I突变BCR-ABL(C)的32D细胞，检测Bcr-Abl蛋白；
图3为异土木香内酯诱导K562细胞凋亡：(A)K562细胞经异土木香内酯处理24、48小时检测生长抑制率；(B)K562细胞经异土木香内酯处理24、48小时检测细胞凋亡率；(C)Western blot检测凋亡相关蛋白水平。
图4为异土木香内酯不改变Bcr-Abl的mRNA水平；
图5为自噬抑制剂抑制异土木香内酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解：蛋白酶体抑制剂(A)和caspase抑制剂(B)不能抑制异土木香内酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解；(C)自噬抑制剂CQ-3-MA抑制异土木香内酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解；
图6为异土木香内酯可抑制慢性粒细胞白血病患者干细胞的克隆形成：(A)磁珠分选CML患者骨髓CD34阳性细胞，异土木香内酯处理或不处理分离到的CD34阳性细胞48小时，然后Western blot检测Bcr-Abl蛋白；(C)异土木香内酯处理慢性粒患者CD34阳性细胞72小时，观察异土木香内酯对克隆形成能力的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
为筛选能够降解Bcr-Abl蛋白的天然小分子化合物，我们首先建立了一种能反映蛋白质稳定性的细胞筛选模型：将GFP融合的BCR-ABL稳定转染到K562细胞中，通过检测绿色荧光的改变，筛选能够降低Bcr-Abl蛋白水平的小分子。通过对一系列天然产物的筛选，我们发现一种天然小分子化合物—异土木香内酯(Isoalantolactone，IsoA)，它能够显著减少GFP-Bcr-Abl绿色荧光信号(图1)。异土木香内酯从菊科旋复花属植物土木香的根中分离得到，属桉烷型倍半萜内酯类化合物(图1)，是中药土木香中的主要活性成分，含量高达1.2％-5.6％。药理学研究表明异土木香内酯具有较强的驱虫、抗原虫、抗菌等活性。最近的研究显示，异土木香内酯具有抗癌活性，可以诱导胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞死亡，而对正常细胞没有明显的毒性。在这里，我们首次发现异土木香内酯具有下调Bcr-Abl融合蛋白的效应，为它应用于靶向降解Bcr-Abl提供了可能的线索。
为证实异土木香内酯下调GFP融合的Bcr-Abl蛋白，我们用western blotting检测了异土木香内酯对Bcr-Abl的蛋白水平的影响，结果发现异土木香内酯呈时间和剂量依赖性下调K562细胞中Bcr-Abl蛋白(图2A)，同时也发现异土木香内酯能够下调对Gleevec耐药的K562R细胞中Bcr-Abl蛋白(图2B)。更为重要的是，对于具有T315I突变的Bcr-Abl蛋白，异土木香内酯处理同样可以导致其减少(图2C)。
Bcr-Abl蛋白对于CML的发病至关重要，它可以活化诸如PI3K/AKT/mTOR，NF-KB，JAK/STAT等多条信号传导通路来促进细胞的存活和增殖。如三氧化二砷，HDAC抑制剂LBH589，雷公藤甲素，藤黄酸等多种化合物便是通过这些信号通路的抑制而诱导CML细胞死亡。为了解异土木香内酯下调Bcr-Abl蛋白会产生何种效应，用异土木香内酯处理K562细胞，结果发现异土木香内酯可以抑制K562细胞生长，诱导K562细胞死亡(图3)。
为探索异土木香内酯下调Bcr-Abl蛋白的分子机制，用5-10μM浓度的异土木香内酯处理K562细胞，检测BCR-ABL的mRNA水平，数据表明，尽管Bcr-Abl蛋白在6小时开始减少(图2)，同时伴随凋亡相关蛋白的显著改变(图3)，而异土木香内酯的处理并不影响BCR-ABL的mRNA水平(图4)，这提示异土木香内酯可能通过转录后水平下调Bcr-Abl蛋白，我们首先考虑异土木香内酯可能通过诱导细胞内的特异蛋白酶活性来降解Bcr-Abl蛋白。
细胞内特定蛋白的降解一般通过泛素/蛋白酶体途径和溶酶体途径实现的，正如以前文献报导的那样，三氧化二砷和硫化砷通过靶向泛素E3连接酶c-CBL诱导Bcr-Abl蛋白降解，也可以通过自噬途径促进Bcr-Abl蛋白降解，也有文献报道活化的Caspase也可剪切Bcr-Abl蛋白。异土木香内酯诱导Bcr-Abl蛋白的下调通过何种途径实现，目前并不清楚。为回答此疑问，我们用蛋白酶体抑制剂、caspase抑制剂和自噬抑制剂来探索异土木香内酯诱导Bcr-Abl蛋白蛋白下调的分子机制。数据显示蛋白酶体抑制剂MG132和Caspase抑制剂都不能抑制异土木香内酯诱导的Bcr-Abl蛋白降解；而自噬抑制剂CQ和3-MA可以显著抑制异土木香内酯诱导的Bcr-Abl蛋白降解(图5)。这些结果表明，异土木香内酯诱导的Bcr-Abl蛋白下调有可能是通过自噬相关的途径降解而实现的。
当前CML治疗失败面临的主要问题是耐药的产生，慢急变的发生，这些问题归根结底是在CML患者中存在Bcr-Abl阳性干细胞。为了解异土木香内酯是否能作用于Bcr-Abl阳性干细胞，我们用磁珠分选的方法得到CML患者骨髓的CD34阳性细胞，然后用异土木香内酯10μM处理48小时，western bloting检测Bcr-Abl蛋白的降解情况，同时用克隆形成实验检测异土木香内酯对这些CD34阳性细胞克隆形成的影响。结果显示异土木香内酯不仅能降解CD34阳性细胞中的Bcr-Abl蛋白，而且显著抑制这些干细胞克隆形成能力。这表明了异土木香内酯能够通过降解CML患者中干细胞内的Bcr-Abl蛋白发挥抑制CML患者中Bcr-Abl阳性干细胞的效应，为克服CML治疗过程中遇到耐药和慢粒急变发生打下了坚实的工作基础，也为根治CML提供了可能。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (2)
1.异土木香内酯在制备抗慢性粒细胞性白血病药物中的应用，其特征在于，所述异土木香内酯特异性诱导慢性粒细胞内自噬溶酶体活性，降解慢性粒发生和发展的分子--Bcr-Abl融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异土木香内酯可抑制Bcr-Abl融合蛋白阳性的干细胞克隆的形成。
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Non-Patent Citations (1)
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