CN116919972A - 去氧胆酸在制备抗水生病毒感染的药物或添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了去氧胆酸在制备抗水生病毒感染的药物或添加剂中的应用，所述水生病毒为鲤春病毒血症病毒和/或传染性造血器官坏死病病毒。实验数据表明，去氧胆酸可以在体内和体外水平显著抑制鲤春病毒血症病毒和传染性造血器官坏死病病毒的增殖，并有效改善鱼类感染两种病毒后的存活率，故去氧胆酸可以被开发作为水产领域病毒防控的药物和饲料添加剂，对水生病毒的防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及去氧胆酸在制备治疗或预防水生病毒(尤其是鲤春病毒血症病毒或传染性造血器官坏死病病毒)感染的药物或饲料添加剂中的应用。
背景技术
鲤春病毒血症(SVC)是由鲤春病毒血症病毒(SVCV)引起的一种急性高致死率传染病，已被世界动物卫生组织列为必须申报的疫病之一，也是我国农业农村部规定的二类动物疫病。患病鱼主要病理症状为肝、脾、肾组织出血，严重的腹膜炎及出血性肠炎等。全国每年有10家左右苗种场为SVCV阳性。监测到的阳性样品中鲤占70.7％、锦鲤12.0％、金鱼8.0％、鲫5.2％、草鱼1.8％、鲢1.4％、鳙0.2％，其他品种为0.7％。
传染性造血器官坏死病(IHN)是由传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)引起的一种导致鲑科幼鱼高死亡率的病毒病，死亡率可达100％。鱼感染病毒后会出现螺旋状游动，粪便拖尾，皮肤变黑，眼球突出，腹部胀大和外出血等症状。在鱼类存活的情况下，脊椎畸形可能会变得明显。世界卫生组织将此病列为必须申报的动物疫病，我国将此病列为二类疫病。该病首次于20世纪50年代在美国暴发，80年代传入中国，现已广泛分布于全球许多国家，对鲑鳟养殖业造成了巨大的经济损失和威胁。
胆汁酸是胆汁的主要成分之一，在动物脂肪代谢中起着重要作用。作为一种饲料添加剂，胆汁酸的作用效果已逐渐被发现，胆汁酸的应用也越来越广泛。目前混合型胆汁酸在水产饲料中广泛使用，由于组成复杂多样，混合型胆汁酸中发挥功效的具体成分难以确定。胆汁酸根据来源可以分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。初级胆汁酸只能由宿主肝脏合成包括胆酸(CA)，鹅去氧胆酸(CDCA)等，次级胆汁酸是肠道微生物利用宿主肝脏排出肠道中的初级胆汁酸发生水解、脱羟基等作用生成包括去氧胆酸(DCA)，石胆酸(LCA)，熊去氧胆酸(UDCA)等。去氧胆酸是一种在厌氧细菌的作用下，由初级胆汁酸(CA)经胆汁酸水解酶和7α-脱羟基酶作用生成的游离型次级胆汁酸。去氧胆酸的结构、作用不同于初级胆汁酸(CA,CDCA等)，也不同于其他次级胆汁酸(LCA、UDCA等)，是胆酸在C-7位失去一个氧原子衍生而得的一种游离胆汁酸。去氧胆酸具有促进胆汁分泌，促进食物消化和吸收，消除胆汁淤积等活性，已成功用于胆道疾病和脂肪瘤的治疗。但是关于去氧胆酸对鱼类病毒感染影响的研究尚未报道。
发明内容
发明人首次发现去氧胆酸可以显著抑制某些水生病毒在鱼类体内和体外的复制，并显著改善鱼类感染水生病毒后的存活率。去氧胆酸放入结构式如下所示：
基于此，本发明的目的在于提供去氧胆酸在制备抗水生病毒感染的药物或饲料添加剂中的应用。
具体地，在上述应用中，水生病毒为鲤春病毒血症病毒(SVCV)和/或传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)。
试验数据表明，去氧胆酸在鱼类体内和体外均可显著抑制SVCV和IHNV病毒的增殖，显著改善鱼类感染病毒后的存活率。
进一步的试验数据表明，去氧胆酸具体通过降低鱼类感染病毒后脏器中的病毒载量，并减轻脏器的病理损伤，实现了存活率的显著提升；其中，脏器包括肝脏、肠道和肾脏等。
在上述应用中，药物或饲料添加剂为以去氧胆酸作为有效成分添加辅料制成的制剂。其中，制剂可以为液体制剂，也可以为固体制剂，所述固体制剂具体可以为粉剂、颗粒剂或片剂等形式。
在上述应用中，药物可以采用口服或饲料伴喂的方式，对个体进行有效量的给药，
本发明的有益效果：本发明的试验数据表明，去氧胆酸可以在体内和体外水平显著抑制鲤春病毒血症病毒和传染性造血器官坏死病病毒的增殖，并有效改善鱼类感染两种病毒后的存活率，故去氧胆酸可以被开发作为水产领域病毒防控的药物和饲料添加剂，对水生病毒(尤其是SVCV和IHNV)的防治具有重要意义。
附图说明
图1为不同浓度去氧胆酸对EPC细胞毒性的测试结果；
图2为不同浓度去氧胆酸对在EPC细胞上对SVCV-G基因表达水平的抑制作用；
图3为不同浓度去氧胆酸对在EPC细胞上对SVCV-G蛋白表达量的抑制作用；
图4为不同浓度去氧胆酸对SVCV病毒粒子形成的抑制作用；
图5为去氧胆酸在斑马鱼上对SVCV感染的保护作用；
图6为去氧胆酸对在EPC细胞上对IHNV的抑制作用；
图7为去氧胆酸在虹鳟上对IHNV感染的保护作用。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1去氧胆酸对SVCV的抑制作用
去氧胆酸可以有效抑制SVCV的增殖，本例具体通过以下几个方面的实验进行说明。
(1)去氧胆酸对细胞的毒性实验。
本例采用MTT法检测去氧胆酸毒性，具体方法如下：
收集对数生长期的鲤上皮瘤细胞(Epithelioma Papulosum Cyprini,EPC)细胞，调整细胞悬液浓度，将其加入到96孔板中，每孔加入200μL培养液，细胞密度在1000-5000/孔，边缘孔用无菌PBS填充；5％CO2，28℃孵育至细胞贴壁后(约6-8h)即可加入浓度梯度的去氧胆酸，每一梯度设6个复孔，继续孵育48h，倒置显微镜下观察细胞状态；每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h后终止培养，小心吸尽孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置于脱色摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率。
本实验同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相应浓度的溶剂、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
结果如图1所示，实验所采用的各浓度去氧胆酸处理EPC细胞48h后细胞存活率与对照组相比没有显著性变化，表明所使用浓度的去氧胆酸对EPC细胞没有毒性作用。
(2)去氧胆酸抑制SVCV-G基因表达。
SVCV共编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶(L-蛋白)等5个结构蛋白，其中由G基因编码的糖蛋白是SVCV的膜蛋白，与SVCV的病毒毒力相关，常作为病毒载量的检测靶标。本例检测了不同浓度对SVCV-G基因表达水平的影响，具体过程如下：
接种EPC于12孔板，待长到70-80％单层后，弃培养液，加入含有50μM、20μM、10μM、5μM、1μM去氧胆酸和PBS的完全培养液预处理12h，弃培养液，用0.1MOI的SVCV 1mL吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度去氧胆酸和PBS的完全培养基，28℃、5％CO2培养箱中继续培养24h(每个浓度处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测SVCV-G基因表达水平。定量检测SVCV-G基因的引物对序列为CGACCTGGATTAGACTTG/AATGTTCCGTTTCTCACT(SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2)。
结果如图2所示，与对照组相比，当去氧胆酸浓度为1μM时SVCV-G基因的表达显著降低(P＜0.01)，较对照组下降30.19％；当去氧胆酸浓度为5μM和10μM时基因表达量极显著降低(P＜0.001)，较对照组分别下调49.18％和50.69％；当去氧胆酸浓度为20μM和50μM时基因表达量极显著降低(P＜0.0001)，较对照组分别下调68％和91.99％，表明去氧胆酸可以抑制SVCV-G基因表达水平，并具有浓度依赖性。
(3)去氧胆酸抑制SVCV-G蛋白表达。
本例进一步检测了SVCV-G蛋白在去氧胆酸作用下的表达量，方法如下：
接种EPC于12孔板，待长到70-80％单层后，吸弃培养液，加入含有50μM、20μM、10μM、5μM、1μM去氧胆酸和PBS的完全培养液预处理12h，吸弃培养液，用0.1MOI的SVCV 1mL吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度去氧胆酸和PBS的完全培养基，28℃、5％CO2培养箱中继续培养24h(每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。24后用预冷的PBS吹下细胞样品，2500g离心10min，弃上清，加入32μL PBS重悬，加入8μL SDS，沸水煮10min。加入样品后80V、300mA、300W电压下进行电泳2h。转膜后进行抗体孵育，加入anti-SVCV-G或actin一抗，5％的BSA(1×TBST配的)1:5000稀释二抗，最后采用Thermo的ECL显色试剂盒进行显色，合理调整曝光时间。
结果如图3所示，与对照组相比，随着去氧胆酸浓度的提高，SVCV的G蛋白的表达量依次降低，表明去氧胆酸以剂量依赖的方式抑制SVCV蛋白的表达。
(4)去氧胆酸抑制SVCV病毒的形成。
接种EPC于12孔板，待长到70-80％单层后，吸弃培养液，加入含有50μM、20μM、10μM、5μM、1μM去氧胆酸和PBS的完全培养液预处理12h，吸弃培养液，用0.1MOI的SVCV 1mL吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度去氧胆酸和PBS的完全培养基，28℃、5％CO2培养箱中继续培养24h(每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。
24h后收集细胞上清，进行空斑实验，其具体步骤如下：将EPC细胞接种到24孔板中，待单层细胞长至100％用于病毒感染；无血清培养基洗涤细胞两次，10倍梯度稀释病毒，每孔加入500μL的病毒液，每个浓度做三次重复；28℃培养箱孵育1h；用无血清培养基清洗一次，加入1mL含有DMEM-CMC半固体培养基；28℃培养箱继续培养48-60h，待形成肉眼可见空斑后弃培养基；用10％的甲醛固定12h；弃固体培养基，自来水冲洗干净；结晶紫染色液染色3h；回收染液，自来水冲洗干净后晾干；计数空斑个数，计算病毒滴度。
结果如图4所示，对照组的SVCV的病毒滴度为106.11PFU/mL，1μM、5μM、10μM、20μM的去氧胆酸处理后SVCV的病毒滴度分别105.81PFU/mL、105.18PFU/mL、104.96PFU/mL、104.4PFU/mL，当去氧胆酸的浓度达到50μM时，SVCV在细胞上清中无法被检测到，表明去氧胆酸可以显著抑制SVCV病毒粒子的形成。
实施例2去氧胆酸对斑马鱼感染SVCV的保护作用
本例以斑马鱼为例，检测了投喂去氧胆酸对鱼类感染SVCV的影响，方法如下：
成年三月龄斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心，于28℃养殖环境下适应性饲养两个星期，每日早晚各投喂丰年虫1次。待适应期结束后，分别挑选出健康无病且个体大小相近、规格一致的斑马鱼。将挑选的斑马鱼每天降温1℃，将水温从28℃匀速降至16℃，并保持在16℃以备后续实验。通过气泵将养殖水体溶氧量控制在6-14mg/L，控制水体的pH值在6.8-7.8。将斑马鱼分成对照组和去氧胆酸添加组(DCA组)，DCA组斑马鱼每次通过将DCA添加到丰年虫中，确定投喂量为0.2mg/尾，对照组添加相同体积的DMSO作为对照。DCA投喂7天后将104PFU的SVCV病毒悬液沿着腹鳍基部注射感染斑马鱼，观察并记录14d内的存活情况。
结果见图5A，对照斑马鱼感染SVCV的存活率为23.33％，而去氧胆酸添加后显著提高SVCV感染斑马鱼的存活率至66.67％，表明去氧胆酸可以提高斑马鱼感染SVCV的存活率。
取上述试验中SVCV感染5d斑马鱼的肝脏、肠道、肾脏，提取总RNA，反转录后荧光定量进行SVCV-G绝对定量检测。定量检测SVCV-G基因引物序列为TGCTGTGTTGCTTGCACTTATYT/TCAAACKAARGACCGCATTTCG(SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4)，探针序列为FAM-ATGAAGARGAGTAAACKGCCTGCAACAGA-TAMRA(SEQ ID NO.5)。
图5B显示了去氧胆酸能显著降低斑马鱼感染SVCV后肝脏(Liver)、肠道(Intestine)、肾脏(Kidney)的病毒载量。
取未感染SVCV的斑马鱼以及SVCV感染5d斑马鱼的肝脏、肠道、肾脏固定于4％多聚甲醛后，依次进行脱水，透明，浸蜡，包埋切片，H&E染色后观察脏器中的组织结构变化。
图5C显示了去氧胆酸饲喂斑马鱼与对照组斑马鱼相比各个脏器均较正常，无差异，说明去氧胆酸处理对斑马鱼没有毒性，对比SVCV感染组发现去氧胆酸饲喂斑马鱼感染SVCV后各个脏器中病毒感染造成的病理损伤明显减轻，表明去氧胆酸显著降低了SVCV感染斑马鱼的致病性。
实施例3去氧胆酸对IHNV的抑制作用
去氧胆酸可以有效抑制SVCV的增殖，本例通过以下试验过程验证：
接种EPC于12孔板，待长到70-80％单层后，吸弃培养液，加入含有50μM去氧胆酸和PBS的完全培养液预处理12h，吸弃培养液，用0.1MOI的IHNV 1mL吸附细胞，16℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度去氧胆酸和PBS的完全培养基，16℃、5％CO2培养箱中继续培养24h(每一个处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测IHNV-G基因表达水平。其中，定量检测IHNV-G基因所用的引物序列为CACGGAAACAACACCACCATTA/AACAGCAAGGAGGAGAACAAGG(SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7)。
结果如图6所示，与对照组相比，50μM去氧胆酸处理后显著降低了IHNV的病毒载量(P<0.0001)，表明去氧胆酸可以显著抑制细胞水平IHNV的增殖。
实施例4去氧胆酸对虹鳟感染IHNV的保护作用
本例以虹鳟为例，检测了投喂去氧胆酸对鱼类感染IHNV的影响，方法如下：
6-7cm的虹鳟购自四川眉山养殖场，于16℃养殖环境下适应性饲养两个星期，每日早晚各投喂饲料1次。待适应期结束后，分别挑选出健康无病且个体大小相近、规格一致的虹鳟继续保持在16℃以备后续实验。通过气泵将养殖水体溶氧量控制在6-14mg/L，控制水体的pH值在6.8-7.8。将虹鳟分成对照组和去氧胆酸添加组(DCA组)，通过将DCA与饲料搅拌均匀，确定每次投喂量为0.2mg/尾饲养DCA组虹鳟，对照组添加相同体积的DMSO作为对照。DCA投喂7天后将104PFU的IHNV病毒悬液沿着腹鳍基部注射感染虹鳟，观察并记录14d内的存活情况。
结果见图7A，对照虹鳟感染IHNV的存活率为30％，而去氧胆酸添加后显著提高IHNV感染虹鳟的存活率至60％，表明去氧胆酸可以提高虹鳟感染IHNV的存活率。
取上述试验中IHNV感染5d后虹鳟的肝脏、肠道、肾脏，提取总RNA，反转录后荧光定量法进行IHNV-G定量检测(所用引物序列同实施例3)。结果见图7B，显示去氧胆酸显著降低虹鳟感染IHNV后肠道、肾脏的病毒载量。
取未感染IHNV的虹鳟以及IHNV感染5d虹鳟的肝脏、肠道、肾脏固定于4％多聚甲醛后，依次进行脱水，透明，浸蜡，包埋切片，H&E染色后观察脏器中的组织结构变化。
结果见图7C，显示去氧胆酸饲喂虹鳟与对照组虹鳟相比各个脏器均较正常，无差异，说明去氧胆酸处理对虹鳟没有毒性，对比IHNV感染组发现去氧胆酸饲喂虹鳟感染IHNV后各个脏器中病毒感染造成的病理损伤明显减轻，表明去氧胆酸显著降低了IHNV感染虹鳟的致病性。
综上所述，去氧胆酸可以有效地抑制鲤春病毒血症病毒和传染性造血器官坏死病病毒的增殖，而且将去氧胆酸作为饲料添加剂拌饲投喂斑马鱼和虹鳟时，可以有效提高鱼类感染SVCV和IHNV后的存活率。可见去氧胆酸可以被开发成用于水产领域病毒防控的药物和饲料添加剂，对水生病毒的防治具有重要意义。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.去氧胆酸在制备抗水生病毒感染的药物或饲料添加剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水生病毒为鲤春病毒血症病毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水生病毒为传染性造血器官坏死病病毒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述去氧胆酸抑制病毒增殖，提高鱼类感染病毒后的存活率。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述去氧胆酸降低了鱼类感染病毒后脏器中的病毒载量，并减轻了脏器的病理损伤。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述脏器包括肝脏、肠道和肾脏。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物或饲料添加剂为以去氧胆酸作为有效成分添加辅料制成的制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制剂包括液体制剂、粉剂和颗粒剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物以口服或饲料伴喂的方式给药。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，对个体进行有效量的所述药物的给药。
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