DE19710926C2 - DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7 - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, die sich zum Nachweis von Veränderun­ gen des Chromosoms 7, und durch solche DNA kodierte Polypeptide. Ferner betrifft die Erfindung Antikörper, die gegen die Polypeptide gerichtet sind. Des weiteren betrifft sie die Verwendung der DNA und der Polypeptide sowie einen zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7 geeigneten Kit.

Ein Verlust von Chromosom 7 (-7) oder eine Deletion seines langen Arms (7q-) sind häufig auftretende chromosomale Veränderungen bei myeloischen Erkran­ kungen, insbesondere bei Therapie-bedingtem myelodysplastischem Sydrom und myeloischer Leukämie. Diese Erkrankungen (-7/7q-) sind durch hohe Anfälligkeit für Infektionen, schwache Reaktion auf eine Chemotherapie und kurze Überlebenszeit gekennzeichnet.

Der Nachweis chromosomaler Veränderungen bei myeloischen Erkrankungen erfolgt durch die Chromosomen-Bänderungstechnik. Mit dieser Technik können Veränderungen auf chromosomaler Ebene nur in teilungsfähigen Zellen nachgewiesen werden. Auch liegt ihr Auflösungsvermögen nur im Bereich mehrerer Megabasen. Dies erlaubt nur Veränderungen zwischen chromosomalen Banden, nicht aber solche innerhalb einer chromosomalen Bande, wie Deletionen, nachzuweisen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem Veränderungen des Chromosoms 7 unter Vermeidung vor­ stehender Nachteile nach gewiesen werden können. Eine weitere Aufgabe liegt darin, ein Mittel bereitzustellen, mit dem solche Veränderungen bzw. deren Folgen gegebenenfalls korrigiert werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA, die sich zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, eignet. Eine solche DNA ist ausgewählt aus:

• a) PAC LLN LP 704 B 2021 Q 13
• b) PAC LLN LP 704 B 17259 Q 13
• c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und sich in der Hybridisierung mit der DNA von einem an einer myeloischen Erkrankung leidenden im Vergleich zur Hybridisierung mit der DNA von einem Gesunden unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß bei myeloischen Erkrankungen, insbesondere myeloischer Leukämie, Deletionen und/oder Translokationen in der chromosomalen Bande 7q22 vorliegen. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß diese chromosomalen Veränderungen durch eine DNA nachgewiesen werden können, die ausgewählt ist aus:

• a) PAC LL NLP 704 B 2021 Q 13
• b) PAC LL NLP 704 B 17259 Q 13
• c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz.

Diese DNAs wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 12. März 1997 hinterlegt: die DNA von (a) als KD1 unter DSM 11471, die DNA von (b) als KD2 unter DSM 11472 und die DNA von (c) als MDS1 unter DSM 11470.

Eine DNA von (c), deren Sequenz durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedlich ist zu jener von Fig. 1 kann durch übliche Verfahren erhalten werden. Günstig ist es, die DNA mit der Sequenz von Fig. 1 zum Screenen einer menschlichen Gen- bzw. Genexpressions-Bibliothek von Chromosom 7q22 zu verwenden. Letztere Bibliothek bietet sich an, wenn die DNA von Fig. 1 eine cDNA ist, was erfindungsgemäß auch bevorzugt ist. Positive Klone werden zur Hybridisierung mit der DNA von einem an einer myeloischen Erkrankung Leidenden bzw. von einem Gesunden verwendet. Unterschiedlich reagierende Klone stellen eine DNA von (c) dar. Diese kann eine Sequenz aufweisen, die sich durch ein oder mehrere Basenpaare von jener von Fig. 1 unterscheidet.

In bevorzugter Ausführungsform weist eine erfindungsgemäße DNA eine Basensequenz auf, mit der jede der DNAs von (a)-(c) hybridisiert. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf übliche Bedingungen hin, insbesondere auf eine Hybridisierungstemperatur von etwa 20°C unter dem Schmelzpunkt der verwendeten DNA-Probe. Zur Bereitstellung einer solchen erfindungsgemäßen DNA können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, die DNAs von (a)-(c) durch Restriktionsspaltungen in Fragmente zu zerlegen und diese gegeneinander zu hybridisieren. Somit werden die Fragmente auf einen minimalen Bereich eingeschränkt, der dann eine bevorzugte erfindungsgemäße DNA umfaßt.

Eine erfindungsgemäße DNA eignet sich bestens, eine Veränderung des Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, nachzuweisen. Hierzu können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, die erfindungsgemäße DNA für eine in situ Hybridisierungsreaktion mit der DNA der zu untersuchenden Körperprobe zu verwenden. Als Körperprobe ist jegliche Zellen enthaltende Probe eines Körpers, insbesondere Knochenmark oder Blut, zu nennen. Für die Durchführung einer in situ Hybridisierungsreaktion wird auf das nachstehende Beispiel und die Arbeit von Lichter, P. et al., Science 247, (1990), 64 verwiesen.

Des weiteren kann eine erfindungsgemäße DNA von (c) in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektor für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pQE-8 und pet3d. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA von (c) zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, SG 13009 und BL21, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9).

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA von (c) in einem Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA von (c) in Form eines Fusionspolypeptids exprimiert werden kann.

Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das Polypeptid zu isolieren und zu reinigen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die erfindungsgemäße DNA von (c) kodiert ist. Ein solches Polypeptid, das auch ein Fusionspolypeptid sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tier, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)polypeptid zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)polypeptid erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Veränderungen des Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, nachzuweisen. Solche Veränderungen finden sich bei den verschiedensten Erkrankungen, insbesondere myeloischen Leukämien. Somit eignet sich die vorliegende Erfindung bestens zur Diagnose solcher Erkrankungen.

Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung Polypeptide bereit, die bei den angesprochenen Erkrankungen häufig fehlen oder verändert sind. Gerade in Bezug zu myeloischen Leukämien haben diese Polypeptide als putative Tumor- Suppressoren eine große Bedeutung. Durch die Bereitstellung dieser Polypeptide schafft die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, therapeutisch bei diesen Erkrankungen vorzugehen. Gleiches ist auch mit einer erfindungsgemäßen cDNA von (c) möglich, wenn sie in einem Gentransfervektor vorliegt. Solche Vektoren sind bekannt. Beispiele umfassen Virus-Vektoren, wie Retrovirus-, Adenovirus-, Vaccinavirus- oder Adeno-assoziierte Virusvektoren.

Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die mit den angesprochenen Polypeptiden reagieren. Mit diesen Antikörpern ist eine Überwachung der Therapie mit den Polypeptiden möglich.

Insgesamt gesehen, stellt die vorliegende Erfindung Mittel bereit, die zum ersten Mal sensitive und selektive Untersuchungen auf genomischer Ebene bei verschiedensten Erkrankungen, insbesondere myeloischen Erkrankungen, ermöglichen.

Hierzu stellt die vorliegende Erfindung auch einen Kit bereit. Dieser enthält eine oder mehrere erfindungsgemäße DNAs, Polypeptide und/oder Antikörper. Ferner enthält er übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen. Der Kit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Basensequenz, die von einer erfindungsgemäßen DNA von (c) umfaßt wird.

Die Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.

Beispiel: Nachweis einer Veränderung der chromosomalen Bande 7q22 durch eine erfindungsgemäße DNA 1. Präparation von Knochenmark- und Blut-Zellen

Aus ca. 5 ml heparinisiertem Blut (20 I.E. Heparin/ml) oder 5 ml heparini­ siertem Knochenmark werden mononukleäre Zellen durch Ficoll-Hypaque- Dichtegradienten-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque, Seromed) isoliert. An­ schließend werden die Zellen in hypotoner Lösung inkubiert (ca. 1 × 10⁶- 1 × 10⁷ Zellen in 10 ml 0,075 molarer Kalium-Chlorid-Lösung für ca. 16 Minuten bei 37°C) und mit einem Essigsäure/Methanol-Gemisch (1 : 3) fixiert. Die auf diese Weise präparierten Zellen können für Jahre bei -20°C konserviert werden und für nicht-radioaktive in situ Hybridisierungs- Experimente verwendet werden. Für die in situ Hybridisierungsexperi­ mente werden Zellen aus den bei -20°C konservierten Zellpellets auf Glas-Objektträger getropft. Alternativ können auch Blut- oder Knochenmarkausstrich-Präparate, die im Hämatologischen Routinelabor der Klinik angefertigt werden, für die Experimente verwendet werden.

2. Nicht-radioaktive in situ Hybridisierung Präparation der Proben-DNA.

Bakterienklone, welche die DNA von (a) oder (b) enthalten, werden zunächst auf Agarplatten (LB-Medium) ausgestrichen. Die DNA von (a) bzw. (b) wird mit den von der Firma Qiagen (Qiagen Inc., Ghatsworth, USA) hergestellten Reagenzansätzen und Harzsäulen präpariert.

Markierung der DNA-Proben durch Nick-Translation.

Entscheidend für das Erzielen guter Hybridisierungssignale ist neben der effizienten Markierung mit modifizierten Nukleotiden die Größe der DNA- Probe. Als Optimum wird eine Länge zwischen 200 und 500 Basenpaaren angesehen. Dieser Längenbereich wird durch individuelles Anpassen der DNAse I-Konzentration und der Reaktionszeit bei der Nick-Translation erreicht.

Für die Reaktionsansätze wurden folgende Lösungen verwendet:

• - 10 × konzentrierter Puffer: 0,5 M Tris-HCl pH 8,0, 50 mM MgCl₂, 0,5 mg/ml BSA (Rinder-Serumalbumin, Sigma)
• - 0,1 M β-Mercaptoethanol (Merck)
• - 10 × konzentrierte Nukleotidlösung: 0,5 mM dATP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dCTP (Boehringer Mannheim)
• - 0,5 mM Biotin-16-dUTP oder 0,125 mM Digoxigenin-11-dUTP/­ 0.375 mM dTTP (Boehringer)
• - DNAse I-Stammlösung: 3 mg DNAse I in 0,5 ml 0,3 M NaCl + 0,5 ml Glycerin, 1 : 1000 verdünnt (Boehringer)
• - E.coli DNA-Polymerase I: 10000 Units/ml (New England Biolabs, Beverly, MA).

Reaktionsansatz für 2 µg Proben-DNA:

• - 2 µg Proben-DNA in wäßriger Lösung
• - 10 µl 10 × konzentrierter Puffer
• - 10 µl 10 × konzentrierte Nukleotidlösung
• - 10 µl 0,1 M β-Mercaptoethanol
• - 10 µl 0,5 mM Biotin-16 dUTP für Biotinylierungsreaktionen bzw. 0,5 mM Digoxigenin-11-dUTP/dTTP für Digoxigenierungsreaktionen
• - 2 µl 1 : 1000 Verdünnung der DNAse I-Stammlösung (3 mg/ml, s. o.) in Aqua dest.
• - 2 µl E.coli DNA-Polymerase I = 20 Units
• - ad 100 µl Gesamtvolumen mit Aqua dest.

Nach Inkubation von mindestens 45 Minuten bei 15°C werden die Reaktionsgefäße auf Eis gestellt. Ein Aliquot (ca. 8 µl) wird entnommen, nach 3 Minuten Denaturierung in kochendem Wasser auf ein 1% Agarose-Gel aufgetragen und neben einem 1 Kilobasen-Größenmarker (1 kb DNA Ladder, Gibco) bei ca. 100 Volt für 30 Minuten im elektrischen Feld aufgetrennt. Anschließend wird die DNA im Agarose-Gel durch Ethidium-Bromid-Färbung und UV-Licht-Exposition sichtbar gemacht. Die DNA ist nun als "Schmier" erkennbar. Befindet sich der Hauptanteil dieses Schmiers bei einer Länger von ca. 200-300 Nukleotiden und besteht er vorwiegend aus Fragmenten, die kleiner als 500 und größer als 100 Nukleotide sind, wird die Probenlänge als optimal angesehen. Im Falle des unzureichenden Verdaus wird ein weiteres Aliquot DNAse I (1 : 1000) zum Reaktionsansatz gegeben und bei 15°C für weitere 15 bis 30 Minuten inkubiert. Zur Inaktivierung der DNAse I wird 2 µl 0,5 M EDTA (Merck) (Endkonzentration 15 mM) und 1 µl 10% SDS (Merck) (Endkonzentration) 0,1%) zugegeben, und die Probe für 10 Minuten bei 68°C erhitzt. Um die markierte Probe von nicht inkorporierten Nukleotiden zu trennen, folgt die Gelfiltration durch Zentrifugation des Reaktionsansatzes über 1 ml Sephadex G 50 Säulen (Sigma) (äquilibriert mit 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,1% SDS) für ca. 6 Minuten bei 3000 U/min. Danach befindet sich im Eluat die spezifisch markierte DNA-Probe in einer Konzentration von ca. 20 ng/µl.

Vorbehandlung der Objektträger.

Zur Verbesserung der Penetration der Proben-DNA in die Zellkerne können die Interphase-Zellen auf den Objektträger mit Pepsin (Sigma) (2 mg/ml in 0,01 N HCl, 5 Minuten bei 37°C) inkubiert werden. Es folgte ein Waschschritt (1 × PBS, 5 Minuten bei Raumtemperatur), die Nachfixierung mit 2% Paraformaldehyd (Sigma) (5 Minuten auf Eis), und wiederum ein Waschschritt (1 × PBS, 10 Minuten). Anschließend werden die Zellen in einer Alkoholreihe steigender Konzentration (70%, 90%, 100% Ethanol, jeweils ca. 10 Minuten) dehydriert. Vor der Hybridisierung werden die Präparate für ca. 10-20 Minuten bei 60°C vorgewärmt.

In situ Hybridisierung.

Das Hybridisierungsgemisch enthält ca. 150-250 ng markierte Proben- DNA, 10 µg Cot-1 DNA Fraktion (BRL/Life Technologies, Gaitherburg, MD) und 10 µg Hering Sperma DNA (Boehringer Mannheim). Durch den Einsatz der Cot-1 Fraktion als Competitor-DNA wird die Hybridisierung der in der Proben-DNA enthaltenen hoch-repetitiven Sequenz wirkungsvoll supprimiert. Nach Denaturierung von Proben- und Cot-1-DNA werden diese zunächst für ca. 15-30 Minuten bei 37°C zusammen inkubiert (sog. Preanealing).

Parallel hierzu wird die chromosomale DNA auf den Objektträger für 2 Minuten bei 70°C in 70% deionisiertem Formamid, 2-x SSC (pH 7,0) denaturiert. Unmittelbar darauf folgt die Dehydrierung in einer eisgekühlten Alkoholreihe steigender Konzentration (70%, 90%, 100% Ethanol, je 5 Minuten).

Danach werden 10 µl des o. g. Hybridisierungsgemisches auf ein zuvor markiertes Areal des Objektträgers pipettiert und unter Vermeidung von Luftblasen mit einem 18 × 18 mm großen Deckglas abgedeckt. Die Ränder des Deckglases werden mit elastischem Klebstoff (Fixogumm Rubber Cement, Fa. Marabu, Tamm) abgedichtet und der Objektträger über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.

Fluoreszenz-Detektion.

Nach Hybridisierung über Nacht werden die Deckgläser vorsichtig entfernt und es folgen zwei Waschschritte:

• 1. 1 × 5 Minuten bei 42°C in 50% Formamid/2 × SSC, gefolgt von 3 × je 5 Minuten bei 42°C in 50% Formamid/2 × SSC
• 2. 3 × je 5 Minuten bei 60°C in 0,5 × SSC.

Zur Vermeidung unspezifische Bindungen werden danach 200 µl 4 × SSC/­ 3% BSA auf das markierte Areal des Objektträgers pipettiert, mit einem 24 × 36 mm großen Deckglas bedeckt, und für 30 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Fluoreszenz-Detektion erfolgt z. B. mit den folgenden Fluorochromen:

• 1. Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugiertes Avidin (1 mg/ml) Boehringer); pro Objektträger 1 µl in 200 µl Detektionspuffer (4 × SSC/1% BSA/0,1% Tween 20)
• 2. Streptavidin-Cy3 (2 mg/ml) (Dianova, Hamburg): 2 µl pro Objektträger
• 3. Schaf-Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab-Fragmente (2,5 mg/ml) (Boehringer): 6 µl pro Objektträger
• 4. Schaf-Anti-Digoxigenin-Rhodamin, Fab-Fragmente (2,5 mg/ml) (Boehringer): 6 µl pro Objektträger

Nach Inkubation in einer feuchten Kammer (30 Minuten bei 37°C) werden die Präparate 3 × in 4 × SSC/0,1% Tween 20 (je 5 Minuten bei 42°C) gewaschen. Die Präparate werden mit 4,6-diamidino-2-phenylindol­ dihydrochlorid [DAPI (Sigma), 200 ng/ml in 2 × SSC] gegengefärbt (5-10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler) und anschließend in 2 × SSC/0,05% Tween 20 gewaschen (3 Minuten auf einem Schüttler). Die Waschschritte nach Detektion und Gegenfärbung erfolgen in lichtgeschützten Küvetten. Um ein schnelles Ausbleichen der Fluorochrome zu vermeiden, werden auf das auf dem Objektträger markierte Areal 30 µl einer Antifade-Lösung [z. B. 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 90% Glycerin, 2, 3% 1,4 diazabicyclo-(2.2.2.)octan (DABCO, Sigma) pipettiert und mit einem 24 × 36 mm Deckglas bedeckt. Bis zur mikroskopischen Auswertung werden die Präparate bei 4°C lichtgeschützt aufbewahrt.

Mikroskopische Auswertung.

Bei der mikroskopischen Auswertung der Präparate wird die Anzahl der Signale von mindestens 100 Zellkernen im Hybridisierungsareal bestimmt. Zur Analyse dienen Mikroskope ausgerüstet für Epifluoreszenz- Mikroskopie mit Filtersets für DAPI, PI, Cy3 und FITC.

Claims (7)

1. DNA, geeignet zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7, wobei die DNA ausgewählt ist aus:

• a) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 11471,
• b) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 11472,
• c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Be­ standteil dieses Anspruchs ist, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 11470, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und sich in der Hybridisierung mit der DNA von einem an einer myeloischen Erkrankung leidenden im Vergleich zur Hybridisierung mit der DNA von einem Gesunden unterscheidet.

2. DNA nach Anspruch 1, wobei sie eine Basensequenz umfaßt, mit der jede der DNAs (a)-(c) hybridisiert, und erhältlich ist dadurch, daß die DNAs von (a)-(c) durch Restriktionsspaltungen in Fragmente zerlegt und diese gegeneinander hybridisiert werden, wodurch die Fragmente auf einen minimalen Bereich eingeschränkt werden, der sich zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7 eignet.

3. Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch die DNA von (c) nach Anspruch 1 codiert ist.

4. Antikörper, gerichtet gegen das Polypeptid nach Anspruch 3.

5. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie von myeloischen Erkrankungen, insbesondere mye­ loischer Leukämie.

6. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 3 als Reagens zur Therapie von myeloischen Erkrankungen, insbesondere myeloischer Leukämie.

7. Kit, umfassend ein oder mehrere DNAs nach Anspruch 1, Polypeptide nach Anspruch 3 und/oder Antikörper nach Anspruch 4 sowie übliche Hilfsstoffe.