WO1998041652A2 - Dna zum nachweis von veränderungen des chromosoms 7 - Google Patents

Dna zum nachweis von veränderungen des chromosoms 7 Download PDF

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WO1998041652A2
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Peter Lichter
Konstanze Fischer
Hartmut DÖHNER
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to DNA, which is used to detect changes in chromosome 7, and to polypeptides encoded by such DNA.
  • the invention further relates to antibodies which are directed against the polypeptides. Furthermore, it relates to the use of the DNA and the polypeptides and a kit suitable for detecting a change in chromosome 7.
  • a loss of chromosome 7 (-7) or a deletion of its long arm (7q-) are common chromosomal changes in myeloid diseases, especially in therapy-related myelodysplastic sydrome and myeloid leukemia. These diseases (-7 / 7q-) are characterized by a high susceptibility to infections, a weak response to chemotherapy and short survival times.
  • Chromosomal changes in myeloid diseases are detected using the chromosome banding technique.
  • changes on the chromosomal level can only be detected in dividable cells. Their resolving power is only in the range of several megabases. This only allows changes between chromosomal bands, but not within a chromosomal band, such as deletions, to be detected.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a means by which changes in chromosome 7 can be demonstrated while avoiding the above disadvantages. Another task is to provide a means by which such changes or their consequences can be corrected if necessary.
  • the present invention thus relates to a DNA which is suitable for detecting a change in chromosome 7, in particular the chromosomal band 7q22.
  • a DNA is selected from:
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that myeloid diseases, in particular myeloid leukemia, have deletions and / or translocations in the chromosomal band 7q22.
  • myeloid diseases in particular myeloid leukemia
  • myeloid leukemia have deletions and / or translocations in the chromosomal band 7q22.
  • the applicant has also recognized that these chromosomal changes can be detected by a DNA selected from:
  • a DNA of (c) whose sequence is different from that of Fig. 1 by one or more base pairs can be obtained by conventional methods. It is advantageous to use the DNA with the sequence of FIG. 1 for screening a human gene or gene expression library from chromosome 7q22. The latter library is useful if the DNA of FIG. 1 is a cDNA, which is also preferred according to the invention. Positive clones are used for hybridization with the DNA of someone suffering from a myeloid disease. used by a healthy person. Clones reacting differently represent a DNA of (c). This can have a sequence which differs from that of FIG. 1 by one or more base pairs.
  • a DNA according to the invention has a base sequence with which each of the DNAs of (a) - (c) hybridizes.
  • hybridization indicates conventional conditions, in particular a hybridization temperature of approximately 20 ° C. below the melting point of the DNA sample used. Conventional methods can be used to provide such a DNA according to the invention. It is convenient to go through the DNAs of (a) - (c)
  • a DNA according to the invention is most suitable for detecting a change in chromosome 7, in particular in chromosomal band 7q22. Usual methods can be used for this. It is favorable to use the DNA according to the invention for an in situ hybridization reaction with the DNA of the body sample to be examined. Any sample of a body containing cells, in particular bone marrow or blood, should be mentioned as a body sample.
  • an in situ hybridization reaction reference is made to the example below and the work of Lichter, P. et al., Science 247, (1 990), 64.
  • a DNA of (c) according to the invention can be present in an expression vector.
  • examples of such are known to the person skilled in the art.
  • an expression vector for E. coli these are, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pQE-8 and pet3d.
  • pY1 00 and Ycpad 1 For expression in yeast, for example, pY1 00 and Ycpad 1 should be mentioned, while for expression in animal cells, for example, pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in insect cells.
  • suitable cells in order to express a DNA of (c) present according to the invention and present in an expression vector.
  • suitable cells include the E. coli strains HB101, DH 1, x1 776, JM 101, JM 109, SG 1 3009 and BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa and the insect cells sf9).
  • Fusion polypeptide can be expressed.
  • Another object of the present invention is an antibody directed against an above polypeptide or fusion polypeptide.
  • Such an antibody can be produced by conventional methods. It can be polyclonal or monoclonal. For its production, it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) polypeptide.
  • the animals can be boosted further using the same (fusion) polypeptide.
  • the polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals.
  • animal spleen cells are fused with myeloma cells.
  • the present invention it is possible to detect changes in chromosome 7, in particular the chromosomal band 7q22. Such sales Changes can be found in a wide variety of diseases, especially myeloid leukemia.
  • the present invention is therefore very well suited for the diagnosis of such diseases.
  • the present invention provides polypeptides which are often missing or changed in the diseases mentioned. Especially in relation to myeloid leukemia, these polypeptides are of great importance as putative tumor suppressors.
  • the present invention makes it possible to proceed therapeutically with these diseases.
  • a cDNA of (c) according to the invention if it is present in a gene transfer vector.
  • Such vectors are known. Examples include virus vectors such as retrovirus, adenovirus, vaccinia virus or adeno-associated virus vectors.
  • the present invention provides antibodies which react with the polypeptides mentioned. With these antibodies it is possible to monitor the therapy with the polypeptides.
  • the present invention provides means which, for the first time, enable sensitive and selective examinations at the genomic level in the most diverse diseases, in particular myeloid diseases
  • the present invention also provides a kit.
  • This contains one or more DNAs, polypeptides and / or antibodies according to the invention. It also contains common additives such as carriers, buffers, solvents and controls.
  • the kit is also the subject of the present invention. Brief description of the drawing:
  • Fig. 1 shows the base sequence, which is from a DNA of the invention
  • Mononuclear cells are isolated from approximately 5 ml of heparinized blood (20 IU heparin / ml) or 5 ml of heparinized bone marrow by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation (Ficoll-Hypaque, Seromed). The cells are then incubated in hypotonic solution (approx. 1 x 10 6 -
  • Bacterial clones which contain the DNA of (a) or (b) are first spread on agar plates (LB medium).
  • the DNA of (a) or (b) is obtained with the DNA from Qiagen (Qiagen Inc., Ghatsworth,
  • the size of the DNA is crucial for achieving good hybridization signals.
  • a length between 200 and 500 base pairs is regarded as the optimum. This length range is determined by individually adjusting the DNAse I concentration and the reaction time for nick translation reached.
  • BSA bovine serum albumin
  • DNAse I stock solution 3 mg DNAse I in 0.5 ml 0.3 M NaCI + 0.5 ml glycerol, diluted 1: 1000 (Boehringer)
  • E. coli DNA polymerase I 10,000 units / ml (New England Biolabs, Beverly, MA).
  • E.coli DNA polymerase l 20 units - ad 100 ul total volume with distilled water.
  • reaction vessels After incubation for at least 45 minutes at 15 ° C, the reaction vessels are placed on ice. An aliquot (approx. 8 ⁇ l) is taken after
  • the interphase cells can be incubated on the slide with pepsin (Sigma) (2 mg / ml in 0.01 N HCl, 5 minutes at 37 ° C). This was followed by a washing step (1 x PBS, 5 minutes at room temperature), post-fixation with 2% paraformaldehyde (Sigma) (5 minutes on ice), and again
  • wash step (1 x PBS, 10 minutes).
  • the cells are then dehydrated in an alcohol series of increasing concentration (70%, 90%, 100% ethanol, each about 10 minutes).
  • the preparations are preheated at 60 ° C for about 10-20 minutes.
  • the hybridization mixture contains approx. 1 50-250 ng labeled sample DNA, 10 ⁇ g Cot-1 DNA fraction (BRL / Life Technologies, Gaitherburg, MD) and 10 ⁇ g herring sperm DNA (Boehringer Mannheim).
  • Cot-1 fraction as competitor DNA, the hybridization of the highly repetitive sequence contained in the sample DNA is effectively suppressed.
  • the chromosomal DNA is denatured on the slide for 2 minutes at 70 ° C in 70% deionized formamide, 2-x SSC (pH 7.0). This is immediately followed by dehydration in an ice-cold alcohol series of increasing concentration (70%, 90%, 100% ethanol, 5 minutes each).
  • the preparations After incubation in a moist chamber (30 minutes at 37 ° C), the preparations are washed 3 times in 4xSSC / 0.1% Tween 20 (5 minutes each at 42 ° C). The preparations are counter-stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride [DAPI (Sigma), 200 ng / ml in 2xSSC] (5-1 0 minutes at room temperature on a shaker) and then in 2xSSC / 0, 05% Tween 20 washed (3 minutes on a shaker). The washing steps after detection and counterstaining are carried out in light-protected cuvettes.
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride
  • an antifade solution e.g. Pipette 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 90% glycerol, 2.3% 1, 4 diazabicyclo- (2.2.2.) Octane (DABCO, Sigma) and cover with a 24x36 mm cover slip.
  • DABCO diazabicyclo- (2.2.2.) Octane
  • the microscopic evaluation of the preparations determines the number of signals from at least 100 cell nuclei in the hybridization area.
  • Microscopes equipped for epifluorescence microscopy with filter sets for DAPI, Pl, Cy3 and FITC are used for analysis.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7 und durch solche DNA kodierte Polypeptide. Ferner betrifft die Erfindung Antikörper, die gegen die Polypeptide gerichtet sind. Desweiteren betrifft sie die Verwendung der DNA und der Polypeptide sowie einen zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7 geeigneten Kit.

Description

DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, die sich zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7, und durch solche DNA kodierte Polypeptide. Ferner betrifft die Erfindung Antikörper, die gegen die Polypeptide gerichtet sind. Des weiteren betrifft sie die Verwendung der DNA und der Polypeptide sowie einen zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7 geeigneten Kit.'
Ein Verlust von Chromosom 7 (-7) oder eine Deletion seines langen Arms (7q-) sind häufig auftretende chromosomale Veränderungen bei myeloischen Erkrankungen, insbesondere bei Therapie-bedingtem myelodysplastischem Sydrom und myeloischer Leukämie. Diese Erkrankungen (-7/7q-) sind durch hohe Anfälligkeit für Infektionen, schwache Reaktion auf eine Chemotherapie und kurze Überlebenszeit gekennzeichnet.
Der Nachweis chromosomaier Veränderungen bei myeloischen Erkrankungen erfolgt durch die Chromosomen-Bänderungstechnik. Mit dieser Technik können Veränderungen auf chromosomaier Ebene nur in teilungsfähigen Zellen nachgewiesen werden. Auch liegt ihr Auflösungsvermögen nur im Bereich mehrerer Megabasen. Dies erlaubt nur Veränderungen zwischen chromosomalen Banden, nicht aber solche innerhalb einer chromosomalen Bande, wie Deletionen, nachzuweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu- stellen, mit dem Veränderungen des Chromosoms 7 unter Vermeidung vorstehender Nachteile nach gewiesen werden können. Eine weitere Aufgabe liegt darin, ein Mittel bereitzustellen, mit dem solche Veränderungen bzw. deren Folgen gegebenenfalls korrigiert werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA, die sich zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, eignet. Eine solche DNA ist ausgewählt aus:
(a) PAC LLN LP 704 B 2021 Q 13
(b) PAC LLN LP 704 B 1 7259 Q 1 3
(c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß bei myeloischen Erkrankungen, insbesondere myeloischer Leukämie, Deletionen und/oder Translokationen in der chromosomalen Bande 7q22 vorliegen. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß diese chromosomalen Veränderungen durch eine DNA nachgewiesen werden können, die ausgewählt ist aus:
(a) PAC LL NLP 704 B 2021 Q 1 3
(b) PAC LL NLP 704 B 1 7259 Q 1 3
(c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz.
Diese DNAs wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 1 2. März 1 997 hinterlegt: die DNA von (a) als KD 1 unter DSM 1 1471 , die DNA von (b) als KD2 unter DSM 1 1472 und die DNA von (c) als MDS1 unter DSM 1 1470.
Eine DNA von (c), deren Sequenz durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedlich ist zu jener von Fig. 1 kann durch übliche Verfahren erhalten werden. Günstig ist es, die DNA mit der Sequenz von Fig. 1 zum Screenen einer menschlichen Gen- bzw. Genexpressions-Bibliothek von Chromosom 7q22 zu verwenden. Letztere Bibliothek bietet sich an, wenn die DNA von Fig. 1 eine cDNA ist, was erfindungsgemäß auch bevorzugt ist. Positive Klone werden zur Hybridisierung mit der DNA von einem an einer myeloischen Erkrankung Leiden- den bzw. von einem Gesunden verwendet. Unterschiedlich reagierende Klone stellen eine DNA von (c) dar. Diese kann eine Sequenz aufweisen, die sich durch ein oder mehrere Basenpaare von jener von Fig. 1 unterscheidet.
In bevorzugter Ausführungsform weist eine erfindungsgemäße DNA eine Basensequenz auf, mit der jede der DNAs von (a)-(c) hybridisiert. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf übliche Bedingungen hin, insbesondere auf eine Hybridis- ierungstemperatur von etwa 20°C unter dem Schmelzpunkt der verwendeten DNA-Probe. Zur Bereitstellung einer solchen erfindungsgemäßen DNA können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, die DNAs von (a)-(c) durch
Restriktionsspaltungen in Fragmente zu zerlegen und diese gegeneinander zu hybridisieren. Somit werden die Fragmente auf einen minimalen Bereich eingeschränkt, der dann eine bevorzugte erfindungsgemäße DNA umfaßt.
Eine erfindungsgemäße DNA eignet sich bestens, eine Veränderung des Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, nachzuweisen. Hierzu können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, die erfindungsgemäße DNA für eine in situ Hybridisierungsreaktion mit der DNA der zu untersuchenden Körperprobe zu verwenden. Als Körperprobe ist jegliche Zellen enthaltende Probe eines Körpers, insbesondere Knochenmark oder Blut, zu nennen. Für die Durchführung einer in situ Hybridisierungsreaktion wird auf das nachstehende Beispiel und die Arbeit von Lichter, P. et al., Science 247, ( 1 990), 64 verwiesen.
Des weiteren kann eine erfindungsgemäße DNA von (c) in einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektor für E.coli sind dies z.B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pQE-8 und pet3d. Für die Expression in Hefe sind z.B. pY1 00 und Ycpad l zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende DNA von (c) zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101 , DH 1 , x1 776, JM 101 , JM 109, SG 1 3009 und BL21 , den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9).
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA von (c) in einem Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA von (c) in Form eines
Fusionspolypeptids exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans- fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das Polypeptid zu isolieren und zu reinigen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch die erfindungsgemäße DNA von (c) kodiert ist. Ein solches Polypeptid, das auch ein Fusionspolypeptid sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tier, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona- len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)polypeptid zu immunisieren.
Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)polypeptid erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Veränderungen des Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, nachzuweisen. Solche Ver- änderungen finden sich bei den verschiedensten Erkrankungen, insbesondere myeloischen Leukämien. Somit eignet sich die vorliegende Erfindung bestens zur Diagnose solcher Erkrankungen.
Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung Polypeptide bereit, die bei den angesprochenen Erkrankungen häufig fehlen oder verändert sind. Gerade in Bezug zu myeloischen Leukämien haben diese Polypeptide als putative Tumor- Suppressoren eine große Bedeutung. Durch die Bereitstellung dieser Polypeptide schafft die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, therapeutisch bei diesen Erkrankungen vorzugehen. Gleiches ist auch mit einer erfindungsgemäßen cDNA von (c) möglich, wenn sie in einem Gentransfervektor vorliegt. Solche Vektoren sind bekannt. Beispiele umfassen Virus-Vektoren, wie Retrovirus-, Adenovirus-, Vaccinavirus- oder Adeno-assoziierte Virusvektoren.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die mit den angesprochenen Polypeptiden reagieren. Mit diesen Antikörpern ist eine Überwachung der Therapie mit den Polypeptiden möglich.
Insgesamt gesehen, stellt die vorliegende Erfindung Mittel bereit, die zum ersten Mal sensitive und selektive Untersuchungen auf genomischer Ebene bei verschiedensten Erkrankungen, insbesondere myeloischen Erkrankungen, ermöglichen
Hierzu stellt die vorliegende Erfindung auch einen Kit bereit. Dieser enthält eine oder mehrere erfindungsgemäße DNAs, Polypeptide und/oder Antikörper. Ferner enthält er übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen. Der Kit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Kurze Beschreibung der Zeichnung:
Fig. 1 zeigt die Basensequenz, die von einer erfindungsgemäßen DNA von
(c) umfaßt wird. Die Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.
Beispiel: Nachweis einer Veränderung der chromosomalen Bande 7q22 durch eine erfindungsgemäße DNA
1. Präparation von Knochenmark- und Blut-Zellen
Aus ca. 5 ml heparinisiertem Blut (20 I.E. Heparin/ml) oder 5 ml heparini- siertem Knochenmark werden mononukleäre Zellen durch Ficoll-Hypaque- Dichtegradienten-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque, Seromed) isoliert. An- schließend werden die Zellen in hypotoner Lösung inkubiert (ca. 1 x 106 -
1 x 107 Zellen in 10 ml 0,075 molarer Kalium-Chlorid-Lösung für ca. 1 6 Minuten bei 37°C) und mit einem Essigsäure/Methanol-Gemisch (1 :3) fixiert. Die auf diese Weise präparierten Zellen können für Jahre bei -20°C konserviert werden und für nicht-radioaktive in situ Hybridisierungs-Expe- rimente verwendet werden. Für die in situ Hybridisierungsexperi- mente werden Zellen aus den bei -20°C konservierten Zellpellets auf Glas-Objektträger getropft. Alternativ können auch Blut- oder Knochenmarkausstrich-Präparate, die im Hämatologischen Routinelabor der Klinik angefertigt werden, für die Experimente verwendet werden.
2. Nicht-radioaktive in situ Hybridisierung Präparation der Proben-DNA.
Bakterienklone, welche die DNA von (a) oder (b) enthalten, werden zunächst auf Agarplatten (LB-Medium) ausgestrichen. Die DNA von (a) bzw. (b) wird mit den von der Firma Qiagen (Qiagen Inc., Ghatsworth,
USA) hergestellten Reagenzansätzen und Harzsäulen präpariert.
Markierung der DNA-Proben durch Nick-Translation.
Entscheidend für das Erzielen guter Hybridisierungssignale ist neben der effizienten Markierung mit modifizierten Nukleotiden die Größe der DNA-
Probe. Als Optimum wird eine Länge zwischen 200 und 500 Basenpaaren angesehen. Dieser Längenbereich wird durch individuelles Anpassen der DNAse I-Konzentration und der Reaktionszeit bei der Nick-Translation erreicht.
Für die Reaktionsansätze wurden folgende Lösungen verwendet: - 10 x konzentrierter Puffer: 0,5 M Tris-HCI pH 8,0, 50 mM MgCI2,
0,5 mg/ml BSA (Rinder-Serumalbumin, Sigma)
0, 1 M ß-Mercaptoethanol (Merck)
10 x konzentrierte Nukleotidlösung: 0,5 mM dATP, 0,5 mM dGTP,
0,5 mM dCTP (Boehringer Mannheim) - 0,5 mM Biotin-1 6-dUTP oder 0, 1 25 mM Digoxigenin-1 1 -dUTP/
0.375 mM dTTP (Boehringer)
DNAse I-Stammlösung: 3 mg DNAse I in 0,5 ml 0,3 M NaCI + 0,5 ml Glycerin, 1 : 1000 verdünnt (Boehringer)
E.coli DNA-Polymerase I: 10 000 Units/ml (New England Biolabs, Beverly, MA).
Reaktionsansatz für 2 μg Proben-DNA:
2 μg Proben-DNA in wäßriger Lösung 10 μl 10 x konzentrierter Puffer - 10 μl 10 x konzentrierte Nukleotidlösung
10 μl 0, 1 M ß-Mercaptoethanol
10 μl 0,5 mM Biotin-16 dUTP für Biotinylierungsreaktionen bzw. 0,5 mM Digoxigenin-1 1 -dUTP/dTTPfür Digoxigenierungsreaktionen 2 μl 1 : 1000 Verdünnung der DNAse I-Stammlösung (3 mg/ml, s.o.) in Aqua dest.
2 μl E.coli DNA-Polymerase l = 20 Units - ad 100 μl Gesamtvolumen mit Aqua dest.
Nach Inkubation von mindestens 45 Minuten bei 1 5 °C werden die Reak- tionsgefäße auf Eis gestellt. Ein Aliquot (ca. 8 μl) wird entnommen, nach
3 Minuten Denaturierung in kochendem Wasser auf ein 1 % Agarose-Gel aufgetragen und neben einem 1 Kilobasen-Größenmarker (1 kb DNA Ladder, Gibco) bei ca. 100 Volt für 30 Minuten im elektrischen Feld aufgetrennt. Anschließend wird die DNA im Agarose-Gel durch Ethidium- Bromid-Färbung und UV-Licht-Exposition sichtbar gemacht. Die DNA ist nun als "Schmier" erkennbar. Befindet sich der Hauptanteil dieses Schmiers bei einer Länger von ca. 200-300 Nukleotiden und besteht er vorwiegend aus Fragmenten, die kleiner als 500 und größer als 100 Nukleotide sind, wird die Probenlänge als optimal angesehen. Im Falle des unzureichenden Verdaus wird ein weiteres Aliquot DNAse I (1 : 1000) zum Reaktionsansatz gegeben und bei 1 5 °C für weitere 1 5 bis 30 Minuten inkubiert. Zur Inaktivierung der DNAse I wird 2 μl 0,5 M EDTA (Merck)
(Endkonzentration 1 5 mM) und 1 μl 10 % SDS (Merck) (Endkonzentration) 0, 1 %) zugegeben, und die Probe für 10 Minuten bei 68°C erhitzt. Um die markierte Probe von nicht inkorporierten Nukleotiden zu trennen, folgt die Gelfiltration durch Zentrifugation des Reaktionsansatzes über 1 ml Sephadex G 50 Säulen (Sigma) (äquilibriert mit 1 0 mM Tris-HCI pH
8,0, 1 mM EDTA und 0, 1 % SDS) für ca. 6 Minuten bei 3000 U/min. Danach befindet sich im Eluat die spezifisch markierte DNA-Probe in einer Konzentration von ca. 20 ng/μl. •
Vorbehandlung der Objektträger.
Zur Verbesserung der Penetration der Proben-DNA in die Zellkerne können die Interphase-Zellen auf den Objektträger mit Pepsin (Sigma) (2 mg/ml in 0,01 N HCI, 5 Minuten bei 37°C) inkubiert werden. Es folgte ein Waschschritt ( 1 x PBS, 5 Minuten bei Raumtemperatur), die Nachfixierung mit 2 % Paraformaldehyd (Sigma) (5 Minuten auf Eis), und wiederum ein
Waschschritt ( 1 x PBS, 10 Minuten). Anschließend werden die Zellen in einer Alkoholreihe steigender Konzentration (70 %, 90 %, 100 % Etha- nol, jeweils ca. 10 Minuten) dehydriert. Vor der Hybridisierung werden die Präparate für ca. 10-20 Minuten bei 60°C vorgewärmt.
In situ Hybridisierung.
Das Hybridisierungsgemisch enthält ca. 1 50-250 ng markierte Proben- DNA, 10 μg Cot-1 DNA Fraktion (BRL/Life Technologies, Gaitherburg, MD) und 10 μg Hering Sperma DNA (Boehringer Mannheim). Durch den Einsatz der Cot-1 Fraktion als Competitor-DNA wird die Hybridisierung der in der Proben-DNA enthaltenen hoch-repetitiven Sequenz wirkungsvoll supprimiert. Nach Denaturierung von Proben- und Cot-1 -DNA werden diese zunächst für ca. 1 5-30 Minuten bei 37°C zusammen inkubiert (sog. Preanealing).
Parallel hierzu wird die chromosomale DNA auf den Objektträger für 2 Minuten bei 70°C in 70 % deionisiertem Formamid, 2-x SSC (pH 7,0) denaturiert. Unmittelbar darauf folgt die Dehydrierung in einer eisgekühlten Alkoholreihe steigender Konzentration (70 %, 90 %, 100 % Ethanol, je 5 Minuten).
Danach werden 10 μl des o.g. Hybridisierungsgemisches auf ein zuvor markiertes Areal des Objektträgers pipettiert und unter Vermeidung von Luftblasen mit einem 1 8x1 8 mm großen Deckglas abgedeckt. Die Ränder des Deckglases werden mit elastischem Klebstoff (Fixogumm Rubber Cement, Fa. Marabu, Tamm) abgedichtet und der Objektträger über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37 °C inkubiert.
Fluoreszenz-Detektion.
Nach Hybridisierung über Nacht werden die Deckgläser vorsichtig entfernt und es folgen zwei Waschschritte:
1 . 1 x5 Minuten bei 42°C in 50 % Formamid/2xSSC, gefolgt von 3x je 5 Minuten bei 42°C in 50% Formamid/2xSSC 2. 3x je 5 Minuten bei 60°C in 0,5xSSC.
Zur Vermeidung unspezifische Bindungen werden danach 200 μl 4xSSC/ 3% BSA auf das markierte Areal des Objektträgers pipettiert, mit einem 24x36 mm großen Deckglas bedeckt, und für 30 Minuten bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Fluoreszenz-Detektion erfolgt z.B. mit den folgenden Fluorochromen:
1 . Fluorescein-isothiocyanat (FΙTC)-konjugiertes Avidin ( 1 mg/ml) Boehringer); pro Objektträger 1 μl in 200 μl Detektionspuffer (4xSSC/1 % BSA/0, 1 % Tween 20)
2. Streptavidin-Cy3 (2mg/ml) (Dianova, Hamburg): 2 μl pro Objektträger
3. Schaf-Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab-Fragmente (2,5 mg/ml) (Boehringer): 6 μl pro Objektträger
4. Schaf-Anti-Digoxigenin-Rhodamin, Fab-Fragmente (2, 5 mg/ml) (Boehringer): 6 μl pro Objektträger
Nach Inkubation in einer feuchten Kammer (30 Minuten bei 37°C) werden die Präparate 3x in 4xSSC/0, 1 % Tween 20 (je 5 Minuten bei 42 °C) gewaschen. Die Präparate werden mit 4,6-diamidino-2-phenylindol-dihy- drochlorid [DAPI (Sigma), 200 ng/ml in 2xSSC] gegengefärbt (5-1 0 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler) und anschließend in 2xSSC/0,05 % Tween 20 gewaschen (3 Minuten auf einem Schüttler). Die Waschschritte nach Detektion und Gegenfärbung erfolgen in licht- geschützten Küvetten. Um ein schnelles Ausbleichen der Fluorochrome zu vermeiden, werden auf das auf dem Objektträger markierte Areal 30 μl einer Antifade-Lösung [z.B. 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 90 % Glycerin, 2,3 % 1 ,4 diazabicyclo-(2.2.2.)octan (DABCO, Sigma) pipettiert und mit einem 24x36 mm Deckglas bedeckt. Bis zur mikroskopischen Auswertung werden die Präparate bei 4°C lichtgeschützt aufbewahrt.
Mikroskopische Auswertung.
Bei der mikroskopischen Auswertung der Präparate wird die Anzahl der Signale von mindestens 100 Zellkernen im Hybridisierungsareal bestimmt. Zur Analyse dienen Mikroskope ausgerüstet für Epifluoreszenz-Mikrosko- pie mit Filtersets für DAPI, Pl, Cy3 und FITC.

Claims

Patentansprüche
1 . DNA, geeignet zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7, wobei die DNA ausgewählt ist aus:
(a) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 1 1471 , (b) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 1 1472,
(c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 , hinterlegt bei der
DSMZ unter DSM 1 1470, oder eine hiervon durch ein oder mehrere
Basenpaare unterschiedliche Sequenz.
2. DNA nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie die Basensequenz umfaßt, mit der jede der DNAs (a)-(c) hybridisiert.
3. Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch die DNA von (c) nach Anspruch 1 codiert ist.
4. Antikörper, gerichtet gegen das Polypeptid nach Anspruch 3.
5. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose und/oder Therapie.
6. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 3 als Reagens zur Therapie.
7. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 4 als Reagens zur Diagnose.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5-7, wobei sich die Diagnose und
Therapie auf myeloische Erkrankungen, insbesondere myeloische Leukämie, bezieht.
9. Kit, umfassend ein oder mehrere DNAs nach Anspruch 1 , Polypeptide nach Anspruch 3 und/oder Antikörper nach Anspruch 4 sowie übliche Hilfsstoffe.
PCT/DE1998/000782 1997-03-15 1998-03-13 Dna zum nachweis von veränderungen des chromosoms 7 WO1998041652A2 (de)

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Citations (1)

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WO1997008339A1 (en) * 1995-08-25 1997-03-06 Dade International Inc. Chronic myelogenous leukemia diagnostic assay

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