DE19710926A1 - DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7 - Google Patents
DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7Info
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, die sich zum Nachweis von Veränderun
gen des Chromosoms 7, und durch solche DNA kodierte Polypeptide. Ferner
betrifft die Erfindung Antikörper, die gegen die Polypeptide gerichtet sind. Des
weiteren betrifft sie die Verwendung der DNA und der Polypeptide sowie einen
zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7 geeigneten Kit.
Ein Verlust von Chromosom 7 (-7) oder eine Deletion seines langen Arms (7q-)
sind häufig auftretende chromosomale Veränderungen bei myeloischen Erkran
kungen, insbesondere bei Therapie-bedingtem myelodysplastischem Sydrom und
myeloischer Leukämie. Diese Erkrankungen (-7/7q-) sind durch hohe Anfälligkeit
für Infektionen, schwache Reaktion auf eine Chemotherapie und kurze
Überlebenszeit gekennzeichnet.
Der Nachweis chromosomaler Veränderungen bei myeloischen Erkrankungen
erfolgt durch die Chromosomen-Bänderungstechnik. Mit dieser Technik können
Veränderungen auf chromosomaler Ebene nur in teilungsfähigen Zellen
nachgewiesen werden. Auch liegt ihr Auflösungsvermögen nur im Bereich
mehrerer Megabasen. Dies erlaubt nur Veränderungen zwischen chromosomalen
Banden, nicht aber solche innerhalb einer chromosomalen Bande, wie
Deletionen, nachzuweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem Veränderungen des Chromosoms 7 unter Vermeidung vor
stehender Nachteile nach gewiesen werden können. Eine weitere Aufgabe liegt
darin, ein Mittel bereitzustellen, mit dem solche Veränderungen bzw. deren
Folgen gegebenenfalls korrigiert werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA, die sich zum
Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7, insbesondere der
chromosomalen Bande 7q22, eignet. Eine solche DNA ist ausgewählt aus:
- (a) PAC LLN LP 704 B 2021 Q 13
- (b) PAC LLN LP 704 B 17259 Q 13
- (c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß bei
myeloischen Erkrankungen, insbesondere myeloischer Leukämie, Deletionen
und/oder Translokationen in der chromosomalen Bande 7q22 vorliegen. Ferner
hat der Anmelder erkannt, daß diese chromosomalen Veränderungen durch eine
DNA nachgewiesen werden können, die ausgewählt ist aus:
- (a) PAC LL NLP 704 B 2021 Q 13
- (b) PAC LL NLP 704 B 17259 Q 13
- (c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz.
Diese DNAs wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen) am 12. März 1997 hinterlegt: die DNA von (a) als KD1 unter
DSM 11471, die DNA von (b) als KD2 unter DSM 11472 und die DNA von (c)
als MDS1 unter DSM 11470.
Eine DNA von (c), deren Sequenz durch ein oder mehrere Basenpaare
unterschiedlich ist zu jener von Fig. 1 kann durch übliche Verfahren erhalten
werden. Günstig ist es, die DNA mit der Sequenz von Fig. 1 zum Screenen einer
menschlichen Gen- bzw. Genexpressions-Bibliothek von Chromosom 7q22 zu
verwenden. Letztere Bibliothek bietet sich an, wenn die DNA von Fig. 1 eine
cDNA ist, was erfindungsgemäß auch bevorzugt ist. Positive Klone werden zur
Hybridisierung mit der DNA von einem an einer myeloischen Erkrankung
Leidenden bzw. von einem Gesunden verwendet. Unterschiedlich reagierende
Klone stellen eine DNA von (c) dar. Diese kann eine Sequenz aufweisen, die sich
durch ein oder mehrere Basenpaare von jener von Fig. 1 unterscheidet.
In bevorzugter Ausführungsform weist eine erfindungsgemäße DNA eine
Basensequenz auf, mit der jede der DNAs von (a)-(c) hybridisiert. Der Ausdruck
Hybridisierung weist auf übliche Bedingungen hin, insbesondere auf eine
Hybridisierungstemperatur von etwa 20°C unter dem Schmelzpunkt der
verwendeten DNA-Probe. Zur Bereitstellung einer solchen erfindungsgemäßen
DNA können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, die DNAs von
(a)-(c) durch Restriktionsspaltungen in Fragmente zu zerlegen und diese
gegeneinander zu hybridisieren. Somit werden die Fragmente auf einen
minimalen Bereich eingeschränkt, der dann eine bevorzugte erfindungsgemäße
DNA umfaßt.
Eine erfindungsgemäße DNA eignet sich bestens, eine Veränderung des
Chromosoms 7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, nachzuweisen.
Hierzu können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, die
erfindungsgemäße DNA für eine in situ Hybridisierungsreaktion mit der DNA der
zu untersuchenden Körperprobe zu verwenden. Als Körperprobe ist jegliche
Zellen enthaltende Probe eines Körpers, insbesondere Knochenmark oder Blut,
zu nennen. Für die Durchführung einer in situ Hybridisierungsreaktion wird auf
das nachstehende Beispiel und die Arbeit von Lichter, P. et al., Science 247,
(1990), 54 verwiesen.
Des weiteren kann eine erfindungsgemäße DNA von (c) in einem
Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im
Falle eines Expressionsvektor für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate,
pGEX-2T, pQE-8 und pet3d. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und
Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR,
pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in
Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor
pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine, erfindungsgemäße, in einem
Expressionsvektor vorliegende DNA von (c) zu exprimieren. Beispiele solcher
Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, SG
13009 und BL21, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen
Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9).
Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße DNA von (c) in
einem Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese
DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Polypeptid kodierenden DNA
inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA von (c) in Form eines
Fusionspolypeptids exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw.
transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das
Polypeptid zu isolieren und zu reinigen, welches eine Aminosäuresequenz
umfaßt, die durch die erfindungsgemäße DNA von (c) kodiert ist. Ein solches
Polypeptid, das auch ein Fusionspolypeptid sein kann, ist somit ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein
vorstehendes Polypeptid bzw. Fusionspolypeptid gerichteter Antikörper. Ein
solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann
polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tier,
insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen
monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)polypeptid zu
immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen
(Fusions)polypeptid erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem
Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für den monoklonalen Antikörper
werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Veränderungen des Chromosoms
7, insbesondere der chromosomalen Bande 7q22, nachzuweisen. Solche
Veränderungen finden sich bei den verschiedensten Erkrankungen, insbesondere
myeloischen Leukämien. Somit eignet sich die vorliegende Erfindung bestens zur
Diagnose solcher Erkrankungen.
Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung Polypeptide bereit, die bei den
angesprochenen Erkrankungen häufig fehlen oder verändert sind. Gerade in
Bezug zu myeloischen Leukämien haben diese Polypeptide als putative
Tumor-Suppressoren eine große Bedeutung. Durch die Bereitstellung dieser Polypeptide
schafft die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, therapeutisch bei diesen
Erkrankungen vorzugehen. Gleiches ist auch mit einer erfindungsgemäßen cDNA
von (c) möglich, wenn sie in einem Gentransfervektor vorliegt. Solche Vektoren
sind bekannt. Beispiele umfassen Virus-Vektoren, wie Retrovirus-, Adenovirus-,
Vaccinavirus- oder Adeno-assoziierte Virusvektoren.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die mit den
angesprochenen Polypeptiden reagieren. Mit diesen Antikörpern ist eine
Überwachung der Therapie mit den Polypeptiden möglich.
Insgesamt gesehen, stellt die vorliegende Erfindung Mittel bereit, die zum ersten
Mal sensitive und selektive Untersuchungen auf genomischer Ebene bei
verschiedensten Erkrankungen, insbesondere myeloischen Erkrankungen,
ermöglichen.
Hierzu stellt die vorliegende Erfindung auch einen Kit bereit. Dieser enthält eine
oder mehrere erfindungsgemäße DNAs, Polypeptide und/oder Antikörper. Ferner
enthält er übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen.
Der Kit ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnung:
Fig. 1 zeit die Basensequenz, die von einer erfindungsgemäßen DNA von
(c) umfaßt wird.
Die Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.
Aus ca. 5 ml heparinisiertem Blut (20 I.E. Heparin/ml) oder 5 ml heparini
siertem Knochenmark werden mononukleäre Zellen durch Ficoll-Hypaque-Dichte
gradienten-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque, Seromed) isoliert. An
schließend werden die Zellen in hypotoner Lösung inkubiert (ca. 1×106-
1×107 Zellen in 10 ml 0,075 molarer Kalium-Chlorid-Lösung für ca. 16
Minuten bei 37°C) und mit einem Essigsäure/Methanol-Gemisch (1 : 3)
fixiert. Die auf diese Weise präparierten Zellen können für Jahre bei -20°C
konserviert werden und für nicht-radioaktive in situ Hybridisier
ungs-Experimente verwendet werden. Für die in situ Hybridisierungsexperi
mente werden Zellen aus den bei -20°C konservierten Zellpellets auf
Glas-Objektträger getropft. Alternativ können auch Blut- oder Knochenmarkausstrich-Präparate, die im Hämatologischen Routinelabor der Klinik angefertigt werden, für die Experimente verwendet werden.
Glas-Objektträger getropft. Alternativ können auch Blut- oder Knochenmarkausstrich-Präparate, die im Hämatologischen Routinelabor der Klinik angefertigt werden, für die Experimente verwendet werden.
Bakterienklone, welche die DNA von (a) oder (b) enthalten, werden
zunächst auf Agarplatten (LB-Medium) ausgestrichen. Die DNA von (a)
bzw. (b) wird mit den von der Firma Qiagen (Qiagen Inc., Ghatsworth,
USA) hergestellten Reagenzansätzen und Harzsäulen präpariert.
Entscheidend für das Erzielen guter Hybridisierungssignale ist neben der
effizienten Markierung mit modifizierten Nukleotiden die Größe der
DNA-Probe. Als Optimum wird eine Länge zwischen 200 und 500 Basenpaaren
angesehen. Dieser Längenbereich wird durch individuelles Anpassen der
DNAse I-Konzentration und der Reaktionszeit bei der Nick-Translation
erreicht.
Für die Reaktionsansätze wurden folgende Lösungen verwendet:
- - 10× konzentrierter Puffer: 0,5 M Tris-HCl pH 8,0, 50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA (Rinder-Serumalbumin, Sigma)
- - 0,1 M β-Mercaptoethanol (Merck)
- - 10× konzentrierte Nukleotidlösung: 0,5 mM dATP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dCTP (Boehringer Mannheim)
- - 0,5 mM Biotin-16-dUTP oder 0,125 mM Digoxigenin-11-dUTP/ 0.375 mM dTTP (Boehringer)
- - DNAse I-Stammlösung: 3 mg DNAse I in 0,5 ml 0,3 M NaCl + 0,5 ml Glycerin, 1 : 1000 verdünnt (Boehringer)
- - E.coli DNA-Polymerase 1:10 000 Units/ml (New England Biolabs, Beverly, MA).
Reaktionsansatz für 2 Mg Proben-DNA:
- - 2 µg Proben-DNA in wäßriger Lösung
- - 10 µl 10 × konzentrierter Puffer
- - 10 µl 10 × konzentrierte Nukleotidlösung
- - 10 µl 0,1 M β-Mercaptoethanol
- - 10 µl 0,5 mM Biotin-16 dUTP für Biotinylierungsreaktionen bzw. 0,5 mM Digoxigenin-11-dUTP/dTTP für Digoxigenierungsreaktionen
- - 2 µl 1 : 1 000 Verdünnung der DNAse I-Stammlösung (3 mg/ml, s. o.) in Aqua dest.
- - 2 µl E.coli DNA-Polymerase 1 = 20 Units
- - ad 100 µl Gesamtvolumen mit Aqua dest.
Nach Inkubation von mindestens 45 Minuten bei 15°C werden die
Reaktionsgefäße auf Eis gestellt. Ein Aliquot (ca. 8 µl) wird entnommen,
nach 3 Minuten Denaturierung in kochendem Wasser auf ein 1%
Agarose-Gel aufgetragen und neben einem 1 Kilobasen-Größenmarker (1
kb DNA Ladder, Gibco) bei ca. 100 Volt für 30 Minuten im elektrischen
Feld aufgetrennt. Anschließend wird die DNA im Agarose-Gel durch
Ethidium-Bromid-Färbung und UV-Licht-Exposition sichtbar gemacht. Die
DNA ist nun als "Schmier" erkennbar. Befindet sich der Hauptanteil dieses
Schmiers bei einer Länger von ca. 200-300 Nukleotiden und besteht er
vorwiegend aus Fragmenten, die kleiner als 500 und größer als 100
Nukleotide sind, wird die Probenlänge als optimal angesehen. Im Falle des
unzureichenden Verdaus wird ein weiteres Aliquot DNAse I (1 : 1 000) zum
Reaktionsansatz gegeben und bei 15°C für weitere 15 bis 30 Minuten
inkubiert. Zur Inaktivierung der DNAse I wird 2 µl 0,5 M EDTA (Merck)
(Endkonzentration 15 mM) und 1 µl 10% SDS (Merck)
(Endkonzentration) 0,1%) zugegeben, und die Probe für 10 Minuten bei
68°C erhitzt. Um die markierte Probe von nicht inkorporierten Nukleotiden
zu trennen, folgt die Gelfiltration durch Zentrifugation des
Reaktionsansatzes über 1 ml Sephadex G 50 Säulen (Sigma) (äquilibriert
mit 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA und 0,1% SDS) für ca. 6
Minuten bei 3000 U/min. Danach befindet sich im Eluat die spezifisch
markierte DNA-Probe in einer Konzentration von ca. 20 ng/µl.
Zur Verbesserung der Penetration der Proben-DNA in die Zellkerne können
die Interphase-Zellen auf den Objektträger mit Pepsin (Sigma) (2 mg/ml in
0,01 N HCl, 5 Minuten bei 37°C) inkubiert werden. Es folgte ein
Waschschritt (1×PBS, 5 Minuten bei Raumtemperatur), die
Nachfixierung mit 2% Paraformaldehyd (Sigma) (5 Minuten auf Eis), und
wiederum ein Waschschritt (1×PBS, 10 Minuten). Anschließend werden
die Zellen in einer Alkoholreihe steigender Konzentration (70%, 90%,
100% Ethanol, jeweils ca. 10 Minuten) dehydriert. Vor der Hybridisierung
werden die Präparate für ca. 10-20 Minuten bei 60°C vorgewärmt.
Das Hybridisierungsgemisch enthält ca. 150-250 ng markierte Proben-DNA,
10 µg Cot-1 DNA Fraktion (BRL/Life Technologies, Gaitherburg,
MD) und 10 µg Hering Sperma DNA (Boehringer Mannheim). Durch den
Einsatz der Cot-1 Fraktion als Competitor-DNA wird die Hybridisierung der
in der Proben-DNA enthaltenen hoch-repetitiven Sequenz wirkungsvoll
supprimiert. Nach Denaturierung von Proben- und Cot-1-DNA werden
diese zunächst für ca. 15-30 Minuten bei 37°C zusammen inkubiert (sog.
Preanealing).
Parallel hierzu wird die chromosomale DNA auf den Objektträger für 2
Minuten bei 70°C in 70% deionisiertem Formamid, 2-x SSC (pH 7,0)
denaturiert. Unmittelbar darauf folgt die Dehydrierung in einer
eisgekühlten Alkoholreihe steigender Konzentration (70%, 90%, 100%
Ethanol, je 5 Minuten).
Danach werden 10 µl des o.g. Hybridisierungsgemisches auf ein zuvor
markiertes Areal des Objektträgers pipettiert und unter Vermeidung von
Luftblasen mit einem 18×18 mm großen Deckglas abgedeckt. Die Ränder
des Deckglases werden mit elastischem Klebstoff (Fixogumm Rubber
Cement, Fa. Marabu, Tamm) abgedichtet und der Objektträger über Nacht
in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.
Nach Hybridisierung über Nacht werden die Deckgläser vorsichtig entfernt
und es folgen zwei Waschschritte:
- 1. 1×5 Minuten bei 42°C in 50% Formamid/2×SSC, gefolgt von 3× je 5 Minuten bei 42°C in 50% Formamid/2xSSC
- 2. 3× je 5 Minuten bei 60°C in 0,5×SSC.
Zur Vermeidung unspezifische Bindungen werden danach 200 µl 4×SSC/
3% BSA auf das markierte Areal des Objektträgers pipettiert, mit einem
24×36 mm großen Deckglas bedeckt, und für 30 Minuten bei 37°C in
einer feuchten Kammer inkubiert. Die Fluoreszenz-Detektion erfolgt z. B.
mit den folgenden Fluorochromen:
- 1. Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugiertes Avidin (1 mg/ml) Boehringer); pro Objektträger 1 µl in 200 µl Detektionspuffer (4×SSC/1% BSA/0,1% Tween 20)
- 2. Streptavidin-Cy3 (2 mg/ml) (Dianova, Hamburg): 2 µl pro Objektträger
- 3. Schaf-Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab-Fragmente (2,5 mg/ml) (Boehringer): 6 µl pro Objektträger
- 4. Schaf-Anti-Digoxigenin-Rhodamin, Fab-Fragmente (2,5 mg/ml) (Boehringer): 6 µl pro Objektträger.
Nach Inkubation in einer feuchten Kammer (30 Minuten bei 37°C) werden
die Präparate 3× in 4×SSC/0,1% Tween 20 (je 5 Minuten bei 42°C)
gewaschen. Die Präparate werden mit 4,6-diamidino-2-phenylindol
dihydrochlorid [DAPI (Sigma), 200 ng/ml in 2×SSC] gegengefärbt (5-10
Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler) und anschließend in
2×SSC/0,05% Tween 20 gewaschen (3 Minuten auf einem Schüttler).
Die Waschschritte nach Detektion und Gegenfärbung erfolgen in
lichtgeschützten Küvetten. Um ein schnelles Ausbleichen der
Fluorochrome zu vermeiden, werden auf das auf dem Objektträger
markierte Areal 30 P1 einer Antifade-Lösung [z. B. 20 mM Tris-HCl, pH
8,0, 90% Glycerin, 2,3% 1,4 diazabicyclo-(2.2.2.)octan (DABCO,
Sigma) pipettiert und mit einem 24×36 mm Deckglas bedeckt. Bis zur
mikroskopischen Auswertung werden die Präparate bei 4°C
lichtgeschützt aufbewahrt.
Bei der mikroskopischen Auswertung der Präparate wird die Anzahl der
Signale von mindestens 100 Zellkernen im Hybridisierungsareal bestimmt.
Zur Analyse dienen Mikroskope ausgerüstet für Epifluor
eszenz-Mikroskopie mit Filtersets für DAPI, PI, Cy3 und FITC.
Claims (9)
1. DNA, geeignet zum Nachweis einer Veränderung des Chromosoms 7,
wobei die DNA ausgewählt ist aus:
- (a) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 11471,
- (b) DNA, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 11472,
- (c) DNA, umfassend die Basensequenz von Fig. 1, hinterlegt bei der DSMZ unter DSM 11470, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz.
2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Basense
quenz umfaßt, mit der jede der DNAs (a)-(c) hybridisiert.
3. Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch die DNA von
(c) nach Anspruch 1 codiert ist.
4. Antikörper, gerichtet gegen das Polypeptid nach Anspruch 3.
5. Verwendung der DNA nach Anspruch 1 oder 2 als Reagens zur Diagnose
und/oder Therapie.
6. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 3 als Reagens zur Therapie.
7. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 4 als Reagens zur Diagnose.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5-7, wobei sich die Diagnose und
Therapie auf myeloische Erkrankungen, insbesondere myeloische Leu
kämie, bezieht.
9. Kit, umfassend ein oder mehrere DNAs nach Anspruch 1, Polypeptide
nach Anspruch 3 und/oder Antikörper nach Anspruch 4 sowie übliche
Hilfsstoffe.
Priority Applications (2)
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DE19710926C2 DE19710926C2 (de) | 1999-11-04 |
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Family Applications (1)
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DE19710926A Expired - Fee Related DE19710926C2 (de) | 1997-03-15 | 1997-03-15 | DNA zum Nachweis von Veränderungen des Chromosoms 7 |
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1998
- 1998-03-13 WO PCT/DE1998/000782 patent/WO1998041652A2/de active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Science, 247, S. 64-69, 1990 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1998041652A3 (de) | 1998-12-17 |
DE19710926C2 (de) | 1999-11-04 |
WO1998041652A2 (de) | 1998-09-24 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: LICHTER, PETER, DR., 69251 GAIBERG, DE DOEHNERR, HARTMUT, DR., 69120 HEIDELBERG, DE FISCHER, KONSTANZE, DR., 69120 HEIDELBERG, DE |
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8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: LICHTER, PETER, DR., 69251 GAIBERG, DE DOEHNER, HARTMUT, DR., 69120 HEIDELBERG, DE FISCHER, KONSTANZE, DR., 69120 HEIDELBERG, DE |
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D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |