ES2301159T3 - Proteina supresora de tumores prb2, productos geneticos relacionados, y adn codificante de los mismos. - Google Patents
Proteina supresora de tumores prb2, productos geneticos relacionados, y adn codificante de los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2301159T3 ES2301159T3 ES94925920T ES94925920T ES2301159T3 ES 2301159 T3 ES2301159 T3 ES 2301159T3 ES 94925920 T ES94925920 T ES 94925920T ES 94925920 T ES94925920 T ES 94925920T ES 2301159 T3 ES2301159 T3 ES 2301159T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- prb2
- dna
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4736—Retinoblastoma protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA UNA NUEVA PROTEINA SUPRESORA DE TUMORES (PRB2) DE LA FAMILIA DEL RETINOBLASTOMA, Y EL ADN QUE CODIFICA LA MISMA.
Description
Proteína supresora de tumores pRb2, productos
genéticos relacionados, y ADN codificante de los mismos.
La presente invención se refiere a una proteína
supresora de tumores (pRb2) de la familia de retinoblastoma que se
une al dominio transformante de E1A. La invención también se refiere
al DNA que codifica pRb2 [SEQ ID NO:2] y los productos génicos
relacionados.
Actualmente se cree que muchos tipos de cáncer
en humanos son causados por un desequilibrio de los reguladores del
crecimiento en el interior de una célula. Una disminución en los
reguladores del control negativo del crecimiento y/o su
desactivación puede causar un estado canceroso. Adicionalmente, un
incremento en los reguladores del control positivo del crecimiento
puede también causar un estado canceroso.
Desde la identificación del primer gen supresor
de tumores, muchos de los esfuerzos en la investigación del cáncer
se han centrado en la identificación de nuevos genes supresores de
tumores y su participación en el cáncer humano. Se piensa que
muchos de los tipos de cáncer humano se desarrollan por una pérdida
de heterozigosidad de genes putativos supresores de tumores aún no
identificados (Lasko et al., Annu. Rev. Genetics, 25,
281-296 (1991)) según la hipótesis de la doble
mutación (two-hit) de Knudson (Knudson, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 68, 820-823 (1971)).
Uno de los genes supresores de tumores más
estudiados es el gen de susceptibilidad a retinoblastoma
(rb), cuyo producto génico (pRb) se ha demostrado que juega
un papel clave en la regulación de la división celular. En células
en interfase, pRb participa en el mantenimiento del estado de
quiescencia de la célula reprimiendo la transcripción de genes
necesarios para el ciclo celular a través de la interacción con
factores de transcripción, como E2F (Wagner et al., Nature,
352, 189-190 (1991); Nevins, Science,
258, 424-429 (1992); y Hiebert et al.,
Genes Develop., 6, 177-185 (1992)). La
pérdida de esta actividad puede provocar la transformación celular
tal como se evidencia por la inversión del fenotipo transformado en
células pRb tras el reemplazo de un pRb funcional (Huang et al.,
Science 242 1563-1565 (1998); Brookstein
et al., Science, 247 712-715 (1990); y
Sumegi et al., Cell Growth Differ., 1
247-250
(1990)).
(1990)).
Tras la entrada en el ciclo celular, parece que
pRb es fosforilado por quinasas dependientes del ciclo celular
(Lees et al., EMBO J. 10 4279-4290 (1991); Hu
et al., Mol. Cell. Biol., 12 971-980 (1992);
Hinds et al., Cell, 70 993-1006 (1992);
Matsushime et al., Nature, 35 295-300 (1992))
que, según se piensa, permiten su disociación de los factores de
transcripción y, por tanto, la expresión de genes necesarios para la
progresión del ciclo celular. Cabe mencionar que la asociación de
pRb con reguladores del ciclo celular como ciclinas y quinasas
dependientes del ciclo celular indica un carácter universal de su
función.
Sin embargo, la participación de pRb en el
cáncer humano se ha restringido a un número limitado de tipos de
tumor, indicando que esta hipotética función universal podría ser
ejercida por otros productos génicos de una manera específica de
cada tipo celular. Consecuentemente, en ratones, la inactivación
(knock out) del gen rb afecta sólo a tipos celulares
específicos y tras varios días de desarrollo embrionario (Jacks
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68
820-823 (1992); Lee et al., Nature, 359
288-294 (1992); Clarke et al., Nature, 359
328-330 (1992)).
Una herramienta útil en la identificación de
factores celulares implicados en la regulación del ciclo celular ha
sido la capacidad de varias proteínas transformantes de virus
tumorales de DNA humano para activar la proliferación celular. De
esta manera, los reguladores negativos del crecimiento celular
podrían ser dianas efectivas para su inactivación por estas
proteínas virales, como ocurre con el producto del gen de
retinoblastoma.
Se ha encontrado que el adenovirus E1A, al
antígeno SV40 T, y el papilomavirus E7 son tres proteínas virales
que se unen a pRb. Esta unión es la responsable de la liberación de
factores de transcripción necesarios para la expresión de genes del
ciclo celular (Nevins, Science, 258 424-429
(1992); Bandara et al., Nature, 351 494-497
(1991)).
Un motivo conservado encontrado en las tres
proteínas virales permite la interacción y la formación del complejo
con pRb (Moran, Curr. Op. Gen. Dev., 3 63-70
(1993)). En el caso de la proteína del adenovirus E1A, este motivo
se localiza en el dominio transformate 2, que es necesario para la
activación del crecimiento. El producto p107 relacionado con pRb,
también se une en esta región (Egan et al., Mol. Cell. Biol.,
8 3955-3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56
67-75 (1989)).
El dominio 2 también es el lugar de interacción
de una proteína adicional de unión a E1A, p130 (Giordano et
al., Oncogene, 6 481-485 (1991)). Esto ha
llevado a sugerir que p130 tiene una relación estructural con pRb y
p107 (Moran, Curr. Op. Gen. Dev., 3 63-70
(1993)).
El dominio de unión a E1A en pRb y p107 es una
región conservada llamada "región bolsillo" (pocket region)
(Kaelin et al., Mol. Cell. Biol., 10
3761-3769 (1990); Ewin et al., Cell, 66
1155-1164 (1991)), y se piensa que juega un papel
fundamental en la función de estas proteínas. El bolsillo (pocket)
está estructuralmente formado por dos regiones A y B, que están
conservadas en pRb y p107 y separadas por separadores no conservados
de distintos tamaños en pRb y p107.
Además de pRb y p107, existen otras proteínas
celulares de unión a E1A que han sido identificadas por experimentos
de co-inmunoprecipitación utilizando anticuerpos
frente a E1A. Estas proteínas celulares incluyen las formas
mayoritarias de los polipéptidos p300, p130, p60/ciclina A y otras
formas minoritarias varias (Yee, et al., Virology 147
142-153 (1985); Harlow et al., Mol. Cell.
Biol. 6 1579-1589 (1986); Giordano, et al.,
Cell 58 981-990 (1989); Giordano et al.
Science 253 1271-1275 (1991)). La unión a la
región N-terminal ha demostrado ser exclusiva de
p300 (Egan et al., Mol. Cell. Biol., 8
3955-3959 (1988); Whyte et al., Cell, 56
67-75 (1989); Stein et al., J. Virol., 64
4421-4427 (1990)), y pRb2 falla de forma consistente
en la unión a esta región. Ambos dominios 1 y 2 de la proteína E1A
han demostrado ser necesarios para la unión a E1A del siguiente
grupo de proteínas: pRb, p107, p60/ciclina A, y p130 (Egan et
al., Mol. Cell. Biol., 8 3955-3959 (1988); Whyte
et al., Cell, 56 67-75 (1989); Giordano
et al. Science 253 1271-1275 (1991)). Además,
se ha demostrado previamente que el mutante E1A-928
se une a p107 y p60/ciclina A, pero no a pRb y p130.
La asociación de pRb con factores de
transcripción, como E2F, sucede por interacción en la región
bolsillo (Raychaudhuri et al., Genes Develop., 5
1200-1207 (1991)) y, recientemente, se ha demostrado
que p107 ha demostrado ejerce semejante perfil de unión (Cao et
al., Nature, 355 176-179 (1992)). Además, en
varios cánceres humanos la región bolsillo se encuentra mutada,
donde se piensa que una falta de función de la proteína pRb está
implicada en la adquisición del fenotipo transformado (Hu et
al., EMBO J., 9 1147-1153 (1990)); Huang et
al., 1990).
Dyson et al., J. Virology, 66
6893-6902 (1992) sugiere que E1A requiere de dos
regiones de pRb para formar complejos estables con la proteína de
retinoblastoma y que son necesarias para la asociación de E1A con
otras proteínas, incluyendo p130, p107 ciclina A y p33^{cdk2}.
Es necesario identificar y secuenciar nuevos
genes relacionados con rb que podrían estar implicados en la
inhibición del crecimiento celular. Son necesarios genes
relacionados con rb y sus productos proteicos que también
tengan actividad supresora de tumores en tipos celulares
específicos.
La Figura 1 es una representación esquemática de
las formas salvaje y mutante de la proteína E1A. Las formas
mutantes son pm928/961, d12-36,
d138-67 y d173-120. La naturaleza de
cada mutación está representada esquemáticamente.
La Figura 2 es un gel SDS-PAGE
que muestra la unión de la proteína pRb2 a una construcción de
fusión de la proteína E1A salvaje y la proteína
glutation-S-transferasa (GST) (calle
2) y a construcciones de mutantes de E1A fusionadas a una proteína
GST: d12-36 (calle 3), d138-67
(calle 4), d173-120 (calle 5), y pm928/961 (calle
6). La proteína GST sin E1A fusionada se incluyó como control
(carril 1), que indicaba la no unión con la proteína pRb2.
La presente invención se define en las
reivindicaciones de la memoria descriptiva, a la que se hará
referencia a continuación.
De esta manera, la presente invención
proporciona un vehículo de clonación de DNA recombinante que
comprende una secuencia de DNA que comprende la secuencia de DNA
del gen de pRb2 humano. Una secuencia preferida de DNA es una
secuencia según la SEQ ID NO: 1. El DNA comprende una secuencia que
codifica la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2.
En otra realización, la presente invención
proporciona una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos
según la SEQ ID NO:2. La proteína no está fosforilada.
En una realización adicional la presente
invención proporciona una línea celular hospedante transformada por
el DNA del vehículo de clonación descrito arriba, línea celular
hospedante que expresa el DNA del vehículo de clonación para
producir una proteína. Preferiblemente el DNA tiene una secuencia
según la SEQ ID NO:1, y la proteína producida tiene una secuencia
según la SEQ ID NO:2.
La proteína pRb2 es un miembro previamente no
secuenciado ni caracterizado de la familia pRb de proteínas
supresoras de tumores. Esta proteína se nombró como pRb2 debido a
que se une a la proteína Adenovirus E1A de una forma similar a pRb
y p107. Así, la secuencia de cDNA que codifica pRb2 se designó como
el gen de pRb2.
Se utilizó la reacción en cadena de la
Polimerasa (PCR), empleando sondas derivadas de los dominios 1 y 2
del gen rb, para identificar la secuencia de cDNA de pRb2 de
la siguiente forma.
\newpage
Se diseñaron oligonucleótidos sintéticos
degenerados basados en secuencias conservadas de aminoácidos,
flanqueando los espaciadores en pRb y p107. Estos oligonucleótidos
se denominaron cebador A y cebador B y se utilizaron como cebadores
o iniciadores en la PCR para aislar y clonar la secuencia de cDNA de
pRb2.
El cebador A es un oligonucleótido que contiene
18 nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos
Phe-Tyr-Lys-Val-Ile-Glu
(SEQ ID NO:3). El extremo 5' del cebador A también contiene nueve
nucleótidos que forman un sitio de restricción BamHI.
El cebador B es un oligonucleótido que contiene
18 nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos
Gln-Asp-Leu-His-Arg-Asp
(SEQ ID NO:4). El extremo 5' del cebador B también contiene nueve
nucleótidos que forman un sitio de restricción HindIII.
Cada uno de los cebadores A y B de 18
nucleótidos equivalen a porciones conservadas en las regiones
bolsillo de pRb y p107. Los dos sitios de restricción (BamHI para
el cebador A, y HindIII para el cebador B) se usaron para subclonar
convenientemente los fragmentos amplificados de la PCR en un vector
disponible comercialmente (pBluescript, Stratagene, La Jolla,
CA).
El producto de la PCR se usó como sonda para el
rastreo de librerías de cDNA de células 293 y HeLa humanas. A
partir del rastreo, se identificaron varios clones positivos. Estos
clones se secuenciaron y analizaron para un clon que contuviera cDNA
completo.
Uno de los clones de cDNA de HeLa contenía un
codón de iniciación putativo compatible con la secuencia de
iniciación de Kozak (Kozak, J. Mol. Biol., 196
947-950 (1987). Este clon mostraba un único marco de
lectura abierto que termina en un codón de terminación 3.249 pares
de bases secuencia abajo (ver SEQ ID NO:1). La secuencia completa
incluye 55 pares de bases secuencia arriba del marco de lectura
abierto que no contiene ningún sitio de iniciación putativo, y una
región 3' no codificante terminada en una cola de poli A. El marco
de lectura abierto codificaba para un polipéptido de 1.082
aminoácidos (SEQ ID NO:2) con una masa molecular de aproximadamente
120 kD. Este clon de cDNA se denominó rb2 y, de ahí, la
proteína codificada pRb2.
La secuencia de la proteína pRb2 (SEQ ID NO:2),
al compararla con las secuencias de las proteínas pRb y p107,
muestra un alto nivel de identidad, 53% con respecto a p107, y 32%
con respecto a pRb. Esto sugiere una relación más próxima de pRb2
con p107. Una comparación parcial de la secuencia de aminoácidos de
estas tres proteínas muestra que la región bolsillo está claramente
conservada en pRb2, principalmente a nivel de los dominios A y B.
Esto sugiere que pRb2 tiene propiedades similares a pRb y p107, como
la formación de complejos de proteínas asociadas al ciclo celular,
que se sabe que se producen vía la región bolsillo. Esto sugiere que
pRb2 podría estar implicada en la maquinaria del ciclo celular.
Además, las elevadas identidades encontradas en las porciones C y
N-terminal entre pRb2 y p107 indican un papel para
estas regiones en la función de p107 y pRb2 que las puede
diferenciar de pRb.
El clon de cDNA de pRb2 se transcribió in
vitro a un segmento de ARN por la reacción de adición de la
caperuza por la RNA polimerasa de T7 sobre el
pBluescript-pRb2 lineal. El producto de
transcripción resultante (segmento de ARN) se extrajo con una
solución de fenol/cloroformo y se precipitó con una solución de
etanol.
El producto de transcripción se usó como
sustrato para la traducción in vitro a una proteína, usando
un lisado de reticulocitos de conejo (Promega, Biotec, Madison, WI)
y ^{35}S-metionina como marcador radiactivo
(Pelham et al., Eur. J. Biochem., 67 248-256
(1976)). Se produjeron varias formas truncadas de la proteína. La
forma proteica más grande de pRb2 migraba a aproximadamente 120 kD
en SDS-PAGE. La banda más prominente corresponde a
una forma proteica que migra a alrededor de 90 kD, y una tercera
forma proteica se encontró que migraba a 85 kD.
Tras el aislamiento, se analizaron las
propiedades de unión de la proteína pRb2 de 120 kD y sus formas
truncadas de 90 y 85 kD a la proteína E1A. Los resultados de unión
a E1A se compararon con las propiedades de unión de las proteína
pRb y p107 a E1A. Ambas proteínas pRb y p107 se unen a la proteína
de adenoviral E1A a través de sus respectivas regiones bolsillo. La
prueba de la unión de la proteína E1A a la proteína pRb2 indicaría
que esta última proteína tiene un papel clave en la regulación de la
división celular. La capacidad de unión de pRb2 a E1A se determinó a
continuación.
Se obtuvieron formas salvajes y mutantes de la
proteína E1A. La naturaleza de las mutaciones están representadas
en la Figura 1. Se realizó un ensayo de unión para analizar la unión
de las proteínas salvaje y mutante de E1A con la proteína pRb2
traducida in vitro (proteína de 120 kD y proteínas truncadas
de 90 kD y 85 kD) y preaclaradasde la solución de traducción. Cada
una de las tres formas mayoritarias de pRb2 traducidas in
vitro se unieron a E1A.
Una mutación de deleción en E1A que implica a la
porción N-terminal de E1A (d12-36)
no afectó a la unión de pRb2 a E1A. Tampoco se vio afectada la
unión de pRb2por mutaciones de deleción que implican al dominio
transformante 1 de E1A (mutantes de E1A d138-67 y
d173-120). Esto sugiere que la unión de pRb2 a E1A
no se produce vía estas regiones de E1A. Sin embargo, la capacidad
de unión de la proteína pRb2 se suprimió casi completamente cuando
se utilizó una proteína mutante de E1A que contenía una doble
mutación en el dominio transformante 2 (mutante E1A pm928/961,
donde Gly se sustituyó por Cys en la posición 124, y Glu por Lys en
la posición 135). Por tanto, el dominio transformante 2 de E1A es
necesario para unirse a pRb2. Esto sugiere que la capacidad de unión
de pRb2 a E1A está involucrada, al menos en parte, en la actividad
transformante de E1A.
Aunque la proteína pRb2 es similar en peso
molecular a la proteína p130 y ambas tienen similares perfiles de
unión a las proteínas salvaje y mutante de E1A las dos proteínas no
son idénticas. La proteína p130 está fosforilada en restos de Ser y
Thr mientras que pRb2 no está fosforilada. Además, p130 existe en
más de una forma fosforilada.
El 11 de Agosto de 1993 se depositó en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD, con el
número de registro 75521, un vector de clonación designado como
pBluescript-pRb2 que contiene el cDNA de pRb2.
El 11 de Agosto de 1993 se depositó en la ATCC,
Rockville, MD, con el número de registro 69383, una estirpe de
E. coli designada como E. coli
pBluescript-pRb2 conteniendo un plásmido que
contiene el cDNA de pRb2.
Es bien conocido por expertos en ingeniería
genética el uso de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:1 o
secuencias relacionadas que codifican para la proteína pRb2 de la
presente invención para producir la proteína pRb2 vía procesos
microbiológicos. Para aquella persona experta en la técnica, es más
sencillo el uso de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:1 para
obtener pRb2 utilizando el vector de clonación
pBluescript-pR b2 de la invención.
La fusión de secuencias de nucleótidos que
codifican para la proteína pRb2 dentro de un vector de expresión y
su transformación o transfección a hospedadores, tanto eucarióticos
(levaduras o células de mamíferos) como procarióticos (células
bacterianas), son procedimientos estándar utilizados para la
producción de proteínas conocidas, como por ejemplo, insulina,
interferones, la hormona de crecimiento humana y similares. De
acuerdo con la presente invención se pueden emplear procedimientos
similares, o modificaciones obvias de los mismos, para preparar
proteínas pRb2 por medios microbiológicos o por tecnología de
cultivo tisular de mamíferos.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican
para la proteína pRb2 se pueden insertar en vectores conocidos pasa
su uso en técnicas estándar de DNA recombinante para obtener la
proteína pRb2 recombinante. Las técnicas estándar de ADN
recombinante incluyen aquellas técnicas descritas por Sambrook et
al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y por Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley
& Sons, New York, NY (1991). Los vectores pueden ser circulares
o no circulares. La célula hospedadora puede ser procariótica o
eucariótica. El hospedador procariótico preferido comprende E.
coli. El huésped eucariótico preferido incluye levaduras,
células de insecto y de mamífero. Las células de mamífero
preferidas incluyen, células de primate como células de mono
transformadas por virus de simio (por ejemplo, células COS),
células humanas y células de ovario de hamster Chino.
El experto en la técnica valorará el hecho de
que el fragmento de cDNA representado por SEQ ID NO:1 es sólo un
segmento de DNA que codifica para pRb2. Otros segmentos de DNA
equivalentes de semejanza sustancial serán inmediatamente
considerados como codificantes de pRb2. La presente invención
también incluye aquellas secuencias equivalentes de DNA.
Además, la sustitución de aminoácidos
equivalentes en la SEQ ID NO:2 no se espera que afecte a la
actividad de la proteína pRb2. Estas sustituciones de aminoácidos
podrían ser predichas por aquellos expertos en la técnica. Dichas
secuencias de aminoácidos equivalentes también se incluyen en la
presente invención.
Se proporcionan los siguientes ejemplos no
limitantes para ilustrar la invención.
Los cebadores A y B se sintetizaron utilizando
técnicas clásicas de síntesis de nucleótidos y fueron
purificados.
El cebador A contenía 18 nucleótidos que
codifican para la secuencia polipeptídica según la SEQ ID NO:3. El
extremo 5' era de nueve nucleótidos adicionales que formaban un
sitio de restricción BamHI. El cebador B contenía 18 nucleótidos
que codifican para la secuencia polipeptídica según la SEQ ID NO:4.
El extremo 5' era de nueve aminoácidos adicionales que formaban el
sitio de restricción HindIII.
Utilizando técnicas clásicas y por transcripción
inversa de RNA de células 293 humanas, se obtuvo una librería de
cDNA de lambda-ZAPII. El banco de cDNA se amplificó
por PCR con los cebadores A y B del ejemplo 1A arriba descrito. La
PCR se llevó a cabo usando el kit GeneAmp^{TM} (Perkin Elmer
Cetus, Norwalk, CN) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Brevemente, tras treinta ciclos incluyendo
desnaturalización durante un minuto a 94ºC, un minuto de
apareamiento (annealing) a 37ºC, y dos minutos de amplificación a
68ºC, se siguió con 15 minutos de amplificación. Como consecuencia,
además de los segmentos de pRb y p107, se amplificó por PCR un
fragmento de 1 kb.
El fragmento de 1 kb amplificado se subclonó en
un vector pBluescript (Stratagene). Tras la subclonación, se llevó
a cabo la secuenciación de nucleótidos usando el método didesoxi del
kit Sequenase (United States Biochemicals). La secuencia de
nucleótidos del fragmento de 1 kb reveló alguna homología con los
cDNAs de pRb y p107.
El fragmento de 1 kb se utilizó como sonda para
escrutar bancos adicionales de cDNA. Por el método del cebador al
azar (Boehringer Mannheim) se rastrearon librerías de cDNA
Lambda-ZAPII de células 293 y HeLa (Stratagene)
respectivamente, utilizando el fragmento de 1 kb marcado con
\alpha-^{32}P-CTP. Brevemente,
el fago lambda-ZAP se adsorbió a la estirpe
bacteriana Escherichia coli BB4 y se cultivó en medio agar.
Los filtros de nitrocelulosa se hibridaron con la sonda de PCR en
un protocolo de alta astringencia que incluía la mezcla de
pre-hibridación: SSPE 5x, solución de Denhardt 10x
s, 150 \mug/ml de DNA de esperma de arenque; formamida al 50% y
SDS al 2%; añadiendo una mezcla de hibridación de 10^{6} cpm/ml
de la sonda de PCR de 1 kb a la mezcla de
pre-hibridación; y, lavando tres veces durante
veinte minutos cada vez a 42ºC con SSD 0.2x y SDS al 0.1%.
A partir de los procedimientos de sondeo del
ejemplo 1D se localizaron varios clones positivos. Se realizó la
escisión in vivo (Stratagene) sobre varios clones de
Lambda-ZAP. Se obtuvieron vectores pBluescript
conteniendo clones de cDNA. Se reprodujeron los clones de cDNA y se
realizó la secuenciación nucleotídica de cada clon de cDNA tal y
como se describe arriba en el ejemplo 1C. Se analizaron los
resultados de la secuenciación para determinar el cDNA de longitud
completa que incluía el fragmento de 1 kb.
Uno de los clones de cDNA de HeLa contenía un
codón de iniciación putativo que era compatible con la secuencia de
iniciación de Kozak. Este clon mostró un único marco de lectura
abierto terminado en un codón de terminación 3.249 pares de bases
secuencia abajo (ver SEQ ID NO:1). La secuencia completa incluía 55
pares de bases secuencia arriba del marco de lectura abierto que no
contenía ningún sitio de iniciación putativo, y una región 3' no
codificante terminada en una cola de poli A. El marco de lectura
abierto codificaba para un polipéptido de 1.082 aminoácidos (SEQ ID
NO:2) con una masa molecular de aproximadamente 120 kD. Este clon de
cDNA se denominó rb2 y, de ahí, la proteína codificada pRb2.
El vector pBluescript clonado con el gen pRb2 se denominó
pBluescript-pRb2.
La secuencia de la proteína pRb2 (SEQ ID NO:2,
que deriva de la correspondiente secuencia de cDNA) al compararlas
con las secuencias de las proteínas pRb y p107 mostró un alto nivel
de identidad, 53ª con respecto a p107, y 32% con respecto a pRb.
Esto sugiere una relación más próxima de pRb2 con p107.
Comparaciones parciales de estas tres secuencias proteicas muestran
que la región bolsillo está claramente conservada en pRb2,
principalmente a nivel de los dominios A y B.
El clon de cDNA pBluescript-pRb2
del Ejemplo 1E se transcribió in vitro a un segmento de RNA
por la reacción de adición de la caperuza por la RNA polimerasa de
T7 sobre un pBluescript-pRb2 lineal. El producto de
transcipción resultante (segmento de RNA) se extrajo con una
solución de fenol/cloroformo y se precipitó con una solución de
etanol.
El segmento de RNA producto de la transcripción
se usó como sustrato para la traducción in vitro a una
proteína utilizando un lisado de reticulocitos de conejo (Promega,
Biotec, Madison, WI) y ^{35}S-metionina como
marcaje radiactivo (Pelham et al., Eur. J. Biochem., 67
248-256 (1976)). Se obtuvieron varias formas
truncadas de la proteína. La forma más grande migraba
aproximadamente 120 kD en SDS-PAGE. L más prominente
de estas bandas migraba a alrededor de 90 kD, y una tercera se
encontró que migraba a 85 kD.
Se obtuvieron las formas salvaje y mutante de la
proteína E1A. Las formas mutantes eran pm928/961,
d12-36, d138-67 y
d173-120. La naturaleza de las mutaciones se
representan en la Figura 1. Las formas salvaje y mutante de E1A se
subclonaron en pGEX-2T y expresaron en E.
coli como proteínas de fusión de GST. Después las proteínas E1A
se aislaron de cultivos de E. coli mediante técnicas
clásicas.
Se llevó a cabo un ensayo de unión para analizar
la unión de las proteínas E1A salvaje y mutante del Ejemplo 2B a
las proteínas pRb2 traducidas in vitro del Ejemplo 2A
pre-aclaradas de la solución de traducción. La
proteína pRb2 (120 kD, 90 kD, y 85 kD) se liberó con perlas de
glutation-sefarosa y
GST-glutation-sefarosa en tampón
NETN conteniendo DTT 1mM, PMSF 1 mM, y 10 \mug/ml de leupeptina, a
4ºC.
Se incubaron durante una hora a 4ºC 2 \mug de
cada proteína E1A con pRb2 pre-aclarada, y se
añadieron las perlas de glutation-sefarosa e
incubaron durante una hora más. Las proteínas se resolvieron usando
SDS-PAGE de acuerdo con los protocolos clásicos y
se utilizó un sistema verificador de datos Fuji de fosfoimagen para
revelar la señal de la proteína.
Los resultados del ensayo de unión se
representan en la Figura 2, que es un SDS-PAGE que
muestra la unión a las construcciones E1A salvaje (calle 2) y E1A
mutante: d12-36 (calle 3), d138-67
(calle 4), d173-120 (calle 5), y pm928/961 (calle
6). Se incluyó como control GST sin E1A fusionada (carril 1). Se
incluyó como control el producto de la traducción in vitro
resultante de una reacción de traducción de reticulocito de conejo
con RNA no exógeno, que no dio señal (no mostrado).
Cada una de las 3 formas principales de la
proteína pRb2 traducida in vitro (120 kD, 90 kD, y 85 kD)
unen E1A. Una mutación de deleción implicada en la porción
N-terminal de E1A (d12-36) no afecta
la unión con pRb2. La unión de E1A a pRb2 no se vio afectada por
las mutaciones de deleción d138-67 o
d173-120, ambas implicadas en el dominio
transformante de E1A. Esto sugiere que la unión de pRb2 a E1A no se
da en estas regiones. Sin embargo, la unión se suprimió casi
completamente cuando se usó una proteína de fusión E1A conteniendo
una mutación doble en el dominio transformante 2 de E1A (mutante
E1A pm928/961, donde Gly se sustituyó por Cysen la posición 124, y
Glu por Lys en la posición 135). Por tanto, el dominio transformante
2 de E1A es necesario para unir pRb2. Esto sugiere que la capacidad
de unión a E1A de pRb2 está involucrada, al menos en parte, en la
actividad transformante de E1A. Para propósitos comparativos, se
obtuvieron las proteínas pRb y p107 y se realizó un ensayo de unión
con las proteínas E1A salvaje y mutante. La proteína pRb2 mostró
características de unión similares a las proteínas pRb y p107.
Debido a que la proteína pRb2 une la proteína
E1A de una forma similar a la proteína pRb, la proteína pRb2 es una
herramienta diagnóstica útil para identificar células infectadas con
adenovirus E1A, o un virus de DNA relacionado productor de
oncoproteínas relacionadas con la proteína E1A. Debido a la
capacidad de unión de pRb2 a E1A, la proteína debe ser administrada
a células infectadas con adenovirus E1A, donde puede actuar como
supresor del crecimiento celular para invertir los efectos de la
oncoproteína de E1A. Esta inversión de los efectos de la proteína
E1A podría restaurar el equilibrio del crecimiento celular en cáncer
tumoral de retinoblastoma. De esta manera, se cree que pRb2 es útil
como agente supresor de tumores, en el tratamiento de cánceres como
el cáncer interocular de retinoblastoma. Además, pRb2 podría ser una
herramienta de investigación útil para unir e identificar otras
oncoproteínas tumorales de virus de DNA que tienen secuencias
relacionadas con la proteína E1A.
La presente invención puede realizarse de otras
formas específicas sin apartarse de los atributos esenciales de la
misma y, por consiguiente, se hará referencia a las reivindicaciones
anejas, en vez de a la memoria descriptiva anterior, indicativas
del alcance de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Temple University - Of the Commonwealth System of Higher Education
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Broad Street and Montgomery Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Philadelphia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: United States of America
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): PA 19122
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína supresora de tumores pRb2, productos génicos relacionados, y ADN codificante de los mismos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- TIPO DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 94925920.4
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 106496
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA: 12-AGOSTO-1993
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO US 94/09293
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA: 12-AGOSTO-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGUITUD: 3249 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGUITUD: 1082 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGUITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Tyr Lys Val Ile Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGUITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asp Leu His Arg Asp}
Claims (14)
1. Un vector de DNA recombinante que comprende
una secuencia de DNA que codifica una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
2. Un vector según la reivindicación 1, donde la
secuencia de DNA comprende la secuencia de DNA SEQ ID NO:1.
3. Un vector según la reivindicación 1 o 2, que
es un vector pBluescript.
4. Un vector según la reivindicación 3, que es
ATCC No. 75521.
5. Un DNA esencialmente puro que comprende una
secuencia de DNA que codifica una proteína que tiene la secuencia
de aminoácidos SEQ ID NO:2
6. Un DNA esencialmente puro según la
reivindicación 5, donde la secuencia de DNA comprende la secuencia
de DNA SEQ ID NO:1.
7. Una proteína aislada que comprende la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, no estando fosforilada la
proteína.
8. Una célula hospedadora o línea celular
transformada por un vector de DNA recombinante según la
reivindicación 1 o 2.
9. Una célula hospedadora o línea celular según
la reivindicación 8, donde la célula hospedadora es
procatiótica.
10. Una línea celular hospedante transformada
según la reivindicación 8 que es ATCC No. 69383.
11. Un método para la preparación de una
proteína pRb2 humana no fosforilada que comprende cultivar una
célula hospedadora que contiene un vector de DNA recombinante según
la reivindicación 1 o 2.
12. Uso de una proteína con la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO:2, que no está fosforilada, en la fabricación
de un medicamento para uso en el tratamiento del cáncer.
13. Uso según la reivindicación 12, donde la
proteína invierte los efectos de la oncoproteína E1A.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la
proteína actúa para restaurar el equilibrio del crecimiento celular
en el tumor del cáncer de retinoblastoma.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US106493 | 1993-08-12 | ||
| US08/106,493 US5457049A (en) | 1993-08-12 | 1993-08-12 | Tumor suppressor protein pRb2, related gene products, and DNA encoding therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2301159T3 true ES2301159T3 (es) | 2008-06-16 |
Family
ID=22311702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94925920T Expired - Lifetime ES2301159T3 (es) | 1993-08-12 | 1994-08-12 | Proteina supresora de tumores prb2, productos geneticos relacionados, y adn codificante de los mismos. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5457049A (es) |
| EP (1) | EP0737249B1 (es) |
| JP (1) | JP3718848B2 (es) |
| AT (1) | ATE385255T1 (es) |
| AU (1) | AU7567994A (es) |
| CA (1) | CA2169355C (es) |
| DE (1) | DE69435071T2 (es) |
| ES (1) | ES2301159T3 (es) |
| WO (1) | WO1995005470A1 (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6251597B1 (en) | 1996-03-29 | 2001-06-26 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods for detecting fohy030 |
| US6825320B1 (en) | 1995-03-29 | 2004-11-30 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | FOHY03 polypeptides |
| US5633161A (en) * | 1995-03-29 | 1997-05-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Murine gene fomy030 coding for tumor progression inhibitor |
| US6794185B1 (en) | 1995-03-29 | 2004-09-21 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | fohy030 nucleic acid molecules |
| US6312909B1 (en) | 1996-03-29 | 2001-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis prevention and treatment of tumor progression |
| US5807681A (en) * | 1996-04-05 | 1998-09-15 | Thomas Jefferson University | Human retinoblastoma-related (pRb2/p130) genomic DNA and methods for detecting mutations therein |
| US5840506A (en) * | 1996-06-05 | 1998-11-24 | Thomas Jefferson University | Methods for the diagnosis and prognosis of cancer |
| AU7713798A (en) | 1997-06-02 | 1998-12-21 | Thomas Jefferson University | A method of inhibiting cancer cell growth using a vector expressing prb2/p130 |
| DE69837808T2 (de) | 1997-08-21 | 2008-02-07 | Thomas Jefferson University | pRb2/p130 PEPTIDINHIBITOREN DER cdk2 KINASEAKTIVITÄT |
| US20040077575A1 (en) * | 2002-01-11 | 2004-04-22 | Giordano Giovan Giacomo | Inhibition of pathological angiogenesis in vivo |
| DE60229856D1 (es) * | 2001-01-12 | 2008-12-24 | Sbarro Health Res Organization | |
| WO2004015086A2 (en) * | 2002-08-08 | 2004-02-19 | Johns Hopkins University | Enhancement of adenoviral oncolytic activity in prostate cells by modification of the e1a gene product |
| JP2007507233A (ja) | 2003-09-30 | 2007-03-29 | スバッロ ヘルス リサーチ オーガニゼーション | ＲＢ２／ｐ１３０発現による遺伝子調節 |
| US7470670B2 (en) * | 2006-10-17 | 2008-12-30 | Sbarro Health Research Organization, Inc. | Peptide inhibitors of cyclin-dependent kinase activity and uses thereof |
| US20090054333A1 (en) * | 2006-10-17 | 2009-02-26 | Antonio Giordano | Peptide inhibitors of cyclin-dependent kinase activity and uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675285A (en) * | 1984-09-19 | 1987-06-23 | Genetics Institute, Inc. | Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein |
-
1993
- 1993-08-12 US US08/106,493 patent/US5457049A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-08-12 AT AT94925920T patent/ATE385255T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-12 DE DE69435071T patent/DE69435071T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-12 CA CA002169355A patent/CA2169355C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-12 AU AU75679/94A patent/AU7567994A/en not_active Abandoned
- 1994-08-12 JP JP50716595A patent/JP3718848B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-12 WO PCT/US1994/009293 patent/WO1995005470A1/en active IP Right Grant
- 1994-08-12 EP EP94925920A patent/EP0737249B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-12 ES ES94925920T patent/ES2301159T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 US US08/429,264 patent/US5532340A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0737249A4 (en) | 1996-07-09 |
| US5457049A (en) | 1995-10-10 |
| DE69435071D1 (de) | 2008-03-20 |
| JPH09501568A (ja) | 1997-02-18 |
| WO1995005470A1 (en) | 1995-02-23 |
| US5532340A (en) | 1996-07-02 |
| ATE385255T1 (de) | 2008-02-15 |
| CA2169355C (en) | 2004-12-14 |
| JP3718848B2 (ja) | 2005-11-24 |
| EP0737249A1 (en) | 1996-10-16 |
| AU7567994A (en) | 1995-03-14 |
| CA2169355A1 (en) | 1995-02-23 |
| DE69435071T2 (de) | 2009-01-29 |
| EP0737249B1 (en) | 2008-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2301159T3 (es) | Proteina supresora de tumores prb2, productos geneticos relacionados, y adn codificante de los mismos. | |
| Adams et al. | Identification of a cyclin-cdk2 recognition motif present in substrates and p21-like cyclin-dependent kinase inhibitors | |
| Lucas et al. | Mapping the lectin-like activity of tumor necrosis factor | |
| Raben et al. | A motif in human histidyl-tRNA synthetase which is shared among several aminoacyl-tRNA synthetases is a coiled-coil that is essential for enzymatic activity and contains the major autoantigenic epitope. | |
| Kaelin Jr et al. | Definition of the Minimal Simian Virus 40 Large Τ Antigen-and Adenovirus E1A-Binding Domain in the Retinoblastoma Gene Product | |
| Xue et al. | Cooperative interactions between the Caenorhabditis elegans homeoproteins UNC-86 and MEC-3 | |
| ES2301208T3 (es) | Composiciones de polinucleotido y antigeno de tumor de prostata. | |
| ES2247591T3 (es) | Proteasa-3 y 4 de apoptosis similares a la enzima conversora de interleuquina-1 beta. | |
| US5350835A (en) | Cellular nucleic acid binding protein and uses thereof in regulating gene expression and in the treatment of aids | |
| SK112996A3 (en) | Firoblast growth factor-10 | |
| KR20000064765A (ko) | 케모카인 알파 ２ | |
| US5464936A (en) | Compositions for identification of papillomavirus replication inhibitors | |
| JPH1175862A (ja) | 新規トポイソメラーゼｉｉｉ | |
| WO1996035703A1 (en) | Human inhibitor of apoptosis gene 1 | |
| US5650313A (en) | Ubiquitin conjugating enzymes 8 and 9 | |
| AU698473B2 (en) | Assay for inhibitors of DP-1 and other DP proteins | |
| Li et al. | Polyomavirus VP1 phosphorylation: coexpression with the VP2 capsid protein modulates VP1 phosphorylation in Sf9 insect cells. | |
| Seif | Sequence homology between the large tumor antigen of polyoma viruses and the putative E1 protein of papilloma viruses | |
| US20030124124A1 (en) | Therapeutic modulation of chemokines using a helminth parasite chemokine-binding protein | |
| KR19990008319A (ko) | 섬유아세포 성장 인자 15 | |
| US6432708B1 (en) | Human choline acetyltransferase | |
| AU709319B2 (en) | Transcription factor E2F-4 | |
| JPH11243969A (ja) | 新規ＭｕｒＤ | |
| JPH11501802A (ja) | ユビキチン結合酵素７、８および９ | |
| ES2247594T3 (es) | Proteina antivirica. |