CN110563798B - 蚕蛹蛋白源四肽sgqr及其用途 - Google Patents

蚕蛹蛋白源四肽sgqr及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蚕蛹蛋白源四肽SGQR，其氨基酸序列为Ser‑Gly‑Gln‑Arg。本发明还同时公开了上述蚕蛹蛋白源四肽SGQR在制备降血脂药物中的应用。SGQR可以显著地降低HMGCR基因和蛋白量，因此证明SGQR能降低胆固醇的合成量。

Description

蚕蛹蛋白源四肽SGQR及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种能抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)活性，降低血脂(胆固醇)的四肽Ser-Gly-Gln-Arg(SGQR)。
背景技术
目前，我国高血脂患者已经突破1.8亿人。随着我国逐步进入老龄化社会和人民饮食生活水平的提升，高血脂患者人数将继续增加。而脂质代谢紊乱尤其是胆固醇代谢紊乱是公认的主要致心血管疾病因子。
家蚕蛹(bombyx mori)是一种新型的健康食品原料，在我国及其它东亚国家普遍饲养，我国年产蚕茧占世界总茧量的70％。家蚕富含蛋白质和必需氨基酸。研究发现蚕蛹蛋白质具有改善肥胖、调节血脂的作用。此外，从蚕蛹中提取的蛋白质比其他蛋白质来源的蛋白质便宜。因此，开发利用蚕蛹蛋白资源具有重要的意义与广阔的前景。
蚕蛹蛋白质可以被胃和肠道中的蛋白酶水解为多肽。同时，有研究报道蚕蛹蛋白水解物可以降低小鼠和大鼠血浆中血脂(胆固醇)水平。但目前，具体是蚕蛹蛋白水解物中的哪种肽单体起着调节血脂(胆固醇)的作用及其作用机制还不太清除。
现有的降低血脂(胆固醇)的四肽，其大多来源于苋菜(VGVL)、大豆(LPYP)等；其对HMGCR的抑制率分别约为45％、48％。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种蚕蛹蛋白源四肽SGQR及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种蚕蛹蛋白源四肽SGQR，该蚕蛹蛋白源四肽SGQR的氨基酸序列为：Ser-Gly-Gln-Arg。
蚕蛹蛋白源四肽SGQR为降血脂(胆固醇)的小分子肽。
本发明还同时提供了上述蚕蛹蛋白源四肽SGQR在制备降血脂药物中的应用，即，用于改善高血脂(胆固醇)。
本发明的蚕蛹蛋白源四肽SGQR，其来源于蚕蛹蛋白，经过酶解、分离纯化后，以抑制HMGCR活性最好的峰作为蚕蛹蛋白降血脂(胆固醇)肽一级结构鉴定的目标峰，同时以20个已经公布了结构和活性数据的HMGCR抑制肽为训练集，利用MOE分子软件生成了HMGCR抑制肽的药效团模型SGQR。
本发明的四肽的获得途径是：
(1)中性蛋白酶酶降解蚕蛹蛋白：
以水解度和HMGCR抑制率为双功能指标，研究蚕蛹蛋白的酶解条件。通过响应面优化条件等实验，得到制备蚕蛹蛋白降血脂(胆固醇)肽的最佳酶解条件为：中性蛋白酶酶用量5.1％(w/w)，酶解时间5h，酶解温度52℃，酶解pH＝7.0，底/水比(w/v)＝3.9％。在此条件下，蚕蛹蛋白降血脂肽对HMGCR的抑制率为45.24％。
(2)蚕蛹蛋白酶解液的分离纯化：
通过对分子量小于3kDa的肽段用葡聚糖凝胶G-15的柱子进行分离，得到4个峰，依次命名为1号峰、2号峰、3号峰、4号峰。1号峰、2号峰、3号峰、4号峰对HMGCR的抑制率分别为51.05％、31.38％、49.47％、52.86％。
(3)降血脂肽的鉴定：
将(2)分离得到的4号峰作为蚕蛹蛋白降血脂(胆固醇)肽一级结构鉴定的目标峰。同时，以20个已经公布了结构和活性数据的HMGCR抑制肽为训练集，用以构建HMGCR抑制肽的药效团模型。采用MOE的build-sequence模块构建活性肽结构，并利用energy minimize模块进行结构优化，得到最低能量结构。使用MOE软件中Pharmacophore搜索模块，采用MMFF94x力场，计算生成基于训练集化合物活性、具有可预测能力的药效团模型。利用MOE分子软件生成了HMGCR抑制肽的药效团模型SGQR。
(4)SGQR化学合成及对HMGCR抑制作用检测
将(3)鉴定得到SGQR进行化学合成，并利用RP-HPLC方法检测其对HMGCR抑制作用。研究发现SGQR对HMGCR的抑制率为77.70％。
本发明的优点和积极效果：
(1)本发明的四肽具有明确的降低HMGCR基因和蛋白表达水平作用：
SGQR可以显著地降低HMGCR基因和蛋白量，说明SGQR能降低胆固醇的合成量。
(2)本发明的四肽具有明确的激活LDLR基因和蛋白表达水平作用：
SGQR增大LDLR基因和蛋白表达量，说明SGQR能有效的清除血中的LDL并最终导致血中的LDL浓度降低。
(3)本发明的四肽具有明确的抑制SQS基因和蛋白表达水平作用：
SGQR减少SQS基因和蛋白表达量，说明SGQR能有效的抑制胆固醇的生物合成。
依据本发明所述的氨基酸序列，可委托吉尔生化(上海)有限公司合成，从而获得本发明所述的降血脂(胆固醇)肽(简称四肽SGQR)。
本发明的降血脂(胆固醇)肽(或简称为四肽SGQR)的用法和用量如下：
本发明的四肽为口服型，用量为口服一次约0.5g(此为成人剂量)，每日2～3次。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是SGQR的色谱图和质谱图；
A：SGQR的总离子流色谱图；B：SGQR的MS2光谱图；
用LC-MS/MS分析SGQR。
图2是SGQR降低HMGCR的基因和蛋白表达量的对比图；
A：SGQR对HMGCR基因表达量的影响；B：SGQR对HMGCR蛋白水平的影响。
图3是SGQR升高LDLR的基因和蛋白表达量的对比图；
A：SGQR对LDLR基因表达量的影响；B：SGQR对LDLR蛋白水平的影响。
图4是SGQR降低SQS的基因和蛋白表达量的对比图；
A：SGQR对SQS基因表达量的影响；B：SGQR对SQS蛋白水平的影响。
图5是SGQR与HMGCR、LDLR和SQS的相互作用图；
采用分子对接技术研究SGQR与HMGCR、LDLR和SQS的相互作用；
A：SGQR与HMGCR的相互作用；B：SGQR与LDLR的相互作用；C：SGQR与SQS的相互作用；
左侧图为活性口袋map图，右侧图为SGQR与活性口袋分子对接结果图。
上图中，SGQR＝Ser-Gly-Gln-Arg。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
(1)把HepG2细胞接种到6孔板中，培养24h，弃掉旧培养基后，分别于各孔中加入含终浓度为0(空白对照组)和500ng/mL SGQR(实验组)的培养基，分别培养12h。上述细胞培养条件均为37℃、CO2含量5％，相对湿度95％。培养基配方为：高糖DMEM培养基含10％FBS，1％青/链霉素。
(2)培养结束后，(1)中各孔弃掉培养基，用冰的PBS清洗细胞3次，然后向各孔中加入1.0ml Trizol裂解细胞，然后移入离心管中，加200μl氯仿；剧烈震荡15Sec(避免用振荡器振荡)，室温静置2min后，12000g 4℃离心10min；用移液器吸取上层水相至另一洁净离心管中，加入600μL的异丙醇颠倒混匀，12000g 4℃离心15min；弃水相，加入1mL75％乙醇洗沉淀，12000g 4℃离心5min，弃水相，室温干燥10min后用50μl DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。
(3)将(2)中提取的总RNA，用PrimeScriptTM反转录试剂盒将总RNA反转录合成cDNA。将cDNA、上下游引物、SYBR Green超混液和重蒸水一起配成20μL的反应体系，随后用荧光定量PCR仪定量，其反应扩增条件是95℃，10min；95℃，15Sec；60℃，45Sec(40个循环)；60℃，1min；95℃，15Sec；60℃，15Sec。然后用GAPDH作内参，计算HMGCR、LDLR和SQS的相对基因表达水平(引物序列见下表1)。
所得结果如图2A、图3A、图4A所述，与空白对照组相比，SGQR显著地降低了HepG2细胞中HMGCR和SQS基因表达水平，升高了LDLR基因表达水平。由于HMGCR是内源胆固醇合成途径中的限速酶，SQS是胆固醇合成支路的第一个关键酶，抑制HMGCR和SQS活性可以有效的降低血浆胆固醇的水平；而LDLR对低密度脂蛋白的吞噬和清除是低密度脂蛋白代谢过程中最为关键的环节；因此可知SGQR能改善高血脂(胆固醇)。
表1
Figure GDA0002383958110000041
实施例2
(1)把HepG2细胞接种于6孔板中，培养24h，弃掉旧培养基后，分别于各孔中加入含终浓度为0(空白对照组)和500ng/mL SGQR(实验组)的培养基，分别培养24h。上述细胞培养条件均为37℃、CO2含量5％，相对湿度95％。培养基配方为：高糖DMEM培养基含10％FBS，1％青/链霉素。
(2)将(1)中的各孔细胞去除培养液，用冰的PBS洗3次，加入100μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液并在冰上裂解30min，将细胞刮入1.5mL EP管中，95℃以上加热10min，然后4℃离心12000rpm 10min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
(3)将(2)的蛋白裂解液上样，先把浓缩胶在80V电压下电泳20min，然后使分离胶在120V电压下电泳直至各个目的条带分开，再把电泳胶中的目的蛋白转膜到PVDF膜上。
(4)将(3)中的PVDF膜取出，放入孵育盒中，加入含5％脱脂乳的TBST溶液，室温下封闭1h。
(5)将(4)中封闭后的PVDF膜用TBST液洗3次，每次5min，然后把PVDF膜放入HMGCR，LDLR或SQS抗体中，在4℃摇床中孵育过夜。
(5)将(5)中的PVDF膜用TBST液洗3次，每次5min，然后把PVDF膜放入与一抗相对应的二抗中，室温孵育2h，然后用TBST液洗涤3次，每次5min，最后使用ECL化学发光液进行显影。使用AlpHVIEW SA软件对PVDF膜上各条带灰度值进行分析。
所得结果如图2B、图3B、图4B所述，与空白对照组相比，SGQR显著地降低了HepG2细胞中HMGCR和SQS的蛋白表达水平，并增加了HepG2细胞中LDLR蛋白表达水平。由于HMGCR和SQS可以调节体内胆固醇生物合成，而肝脏中90％的低密度脂蛋白是由LDLR清除和吞噬的；因此可知SGQR能有效的降低体内胆固醇水平。
实施例3
(1)使用MOE软件中的Docking模块进行活性肽与HMGCR的分子对接。HMGCR结构来自PDB生物大分子结构数据库中的晶体结构(PDB code:1HW8)。
(2)使用MOE软件中的Docking模块进行活性肽与LDLR的分子对接。LDLR结构来自PDB生物大分子结构数据库中的晶体结构(PDB code:2MG9)。
(3)使用MOE软件中的Docking模块进行活性肽与SQS的分子对接。SQS结构来自PDB生物大分子结构数据库中的晶体结构(PDB code:3WC9)。
采用分子对接技术分析SGQR与HMGCR、LDLR和SQS的互相作用机制。SGQR与HMGCR可以以4个氢键结合，分别是HMGCR活性口袋中的Glu A730、Asn A734和Glu C782这3个氨基酸，其最强结合自由能为-14.8756。SGQR可以以2个氢键与LDLR的Ser 13结合。由于LDLR分子较小，无明显活性口袋，所以SGQR应该是在外围与LDLR通过上述作用，增强了LDLR的活力，从而增加其清除LDL能力，其最强结合自由能为-11.6178。SGQR可以以7个氢键与SQS的Arg D228、Asp D84、Asp D223、Asp D219、Asn D215、Arg D52、Glu D116结合，其最强结合自由能为-19.0865。
根据图5，可得知SGQR与HMGCR、LDLR和SQS的相互作用保证了SGQR对胆固醇生物合成的调节作用。
实施例4、SGQR对HMGCR的抑制率
实验过程和计算方法具体如下：
(1)色谱条件：
Figure GDA0002383958110000061
C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。流动相为:V(K2HPO4-KH2PO4)：V(甲醇)＝85：15，pH 7.2，等度洗脱，流速1mL/min；检测波长337nm；进样量20μL；柱温25℃。
(2)实验过程：反应中各种组分的加入量及顺序如下表，反应温度37℃，反应完成后加入200μL 0.5mol/L NaOH溶液终止反应，按(1)中的色谱条件测量样品中NADPH的浓度。反应时间根据酶对照组时间梯度来确定。
Figure GDA0002383958110000062
(2)计算方法：
Figure GDA0002383958110000063
加入抑制剂后,HMG-CoA还原酶的活性受到抑制,底物反应的量减少。因此，可以利用HPLC测定反应前后NADPH量的变化来评价抑制剂对HMG-CoA还原酶的抑制率。计算公式为：
R＝(S抑制剂-S对照)/(S空白-S对照)×100
式中，R为抑制率(％)；S空白、S对照和S抑制剂分别为空白组、酶对照组和抑制剂组中NADPH的峰面积(mAU.min)。
SGQR对HMGCR的抑制率为77.70％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 蚕蛹蛋白源四肽SGQR及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Gln Arg
1

Claims (2)

1.蚕蛹蛋白源四肽SGQR，其特征是：所述蚕蛹蛋白源四肽SGQR的氨基酸序列为Ser-Gly-Gln-Arg。
2.如权利要求1所述的蚕蛹蛋白源四肽SGQR在制备降血脂药物中的应用，其特征是：通过影响HMGCR、LDLR、SQS的表达量对胆固醇产生影响。
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