CN117567605A - 检测蛋白质赖氨酸-3-羟基丁酰化的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含赖氨酸‑3‑羟基丁酰化位点的分离的多肽，一种能够特异性结合这种多肽的赖氨酸‑3‑羟基丁酰化特异性亲和试剂，以及一种使用这种试剂来检测样品中蛋白质赖氨酸‑3‑羟基丁酰化的方法。

Description

检测蛋白质赖氨酸-3-羟基丁酰化的方法和试剂
本发明的领域
本发明涉及蛋白质翻译后修饰检测试剂与方法。更具体来说，本发明涉及利用含赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰的多肽开发检测蛋白质赖氨酸3-羟基丁酰化修饰的相关试剂与方法。
本发明的科学背景
越来越多的研究表明细胞内代谢与染色体结构和表观编程有关。调控组蛋白翻译后修饰(PTMs)，或者说组蛋白标记的酶可利用高能辅助底物，如乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸来促进蛋白翻译后修饰反应。这些辅酶在胞内的浓度随着胞外环境的改变而相应改变，反过来影响组蛋白标记的状态。而且，组蛋白翻译后修饰相关酶的活性受胞内代谢产物如NAD和2-羟基戊二酸的调控。
组蛋白翻译后修饰，如赖氨酸乙酰化，在其他类型蛋白中也大量存在，并且具有多种非依赖DNA的功能，包括作用于代谢的功能。近几年来，新的组蛋白翻译后修饰不断被发现，而且细胞的代谢也被发现愈加高度复杂，这些研究表明细胞内可能还存在由代谢信号调控的未知的组蛋白翻译后修饰和通路。
3-羟基酸属于酮类物质，是组织饥饿时重要的能量来源。其可调控基因表达，在很多慢性神经疾病中起神经保护的作用，然而这些功能的分子机制仍不清楚。
目前急需建立组蛋白和非组蛋白中与不同疾病有关的翻译后修饰的检测方法并开发相应的检测试剂。
本发明总结
本发明利用含3-羟基丁酰化赖氨酸的多肽开发检测3-羟基丁酰化修饰蛋白的试剂和方法，尤其是检测赖氨酸3-羟基丁基位点特异性的试剂和方法。
本发明提供一种分离的含赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰的多肽。分离的多肽衍生自组蛋白或组蛋白片段。组蛋白可衍生自人，小鼠，果蝇，线虫和酵母的某一组织。分离的多肽其氨基酸序列与种属中序列编号为29-99的某一段氨基酸序列至少有70％的同源性。分离的多肽其序列可选自序列编号为29-99的某一段。分离的多肽中3-羟基丁酰化赖氨酸的N-端与C-端各至少各含两个氨基酸。
本发明也提供一种分离的赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。这种试剂可与含赖氨酸3-羟基丁酰化修饰的多肽特异性结合。多肽的氨基酸序列选自序列编号29-99中的一段。此亲和试剂与多肽的结合依赖于多肽中是否含3-羟基丁酰化修饰的赖氨酸，与赖氨酸周边序列无关。此亲和试剂与多肽的结合依赖于多肽中是否含3-羟基丁酰化修饰的赖氨酸及赖氨酸周边的序列。此赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂可能是一种蛋白质，也可以是抗体。
本发明提供赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和蛋白试剂的生产方法。此方法包括利用多肽筛选蛋白库。多肽中包含3-羟基丁酰化赖氨酸，并且其氨基与羧基端各至少含两个氨基酸。蛋白库是噬菌体展示库，酵母展示库，细菌展示库和核糖体展示库中的一种。
本发明提供赖氨-3-羟基丁酰化特异性亲和抗体试剂的生产方法。此方法包括用多肽免疫宿主动物。多肽中包含3-羟基丁酰化赖氨酸，并且其N-端与C-端各至少各含两个氨基酸。
本发明提供检测蛋白或蛋白片段中3-羟基丁酰化修饰赖氨酸的方法。此方法将蛋白或蛋白片段与分离的可特异性结合含3-羟基丁酰化修饰赖氨酸多肽的赖氨-3-羟基丁酰化修饰特异性亲和试剂反应。赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰特异性亲和试剂与蛋白或蛋白片段形成反应复合物，检测此反应复合物是否形成即可检测蛋白或蛋白片段中是否含3-羟基丁酰化修饰赖氨酸。此方法用到的赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰特异性亲和试剂可以是蛋白或抗体。
本发明提供确定样品中含3-羟基丁酰化赖氨酸的蛋白含量的方法。此方法包括检测样品中的3-羟基丁酰化赖氨酸的方法。
本发明提供检测蛋白或蛋白片段中3-羟基丁酰化赖氨酸的试剂盒。试剂盒中包含分离的可特异性结合含3-羟基酰化修饰赖氨酸的多肽的赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。
本发明提供分离含3-羟基酰化修饰赖氨酸多肽的试剂盒。试剂盒中包含分离的可特异性结合含3-羟基酰化修饰赖氨酸的多肽的赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。
附图的简要描述
专利或应用文件至少包含一幅彩图。专利或申请文件的复印件需用彩图时，可提出请求并支付相关费用后，由办公室提供。
图1为3-羟基丁酰化赖氨酸的同分异构体及其生物合成过程。(a)每一个同分异构体都能引起预期的+86.0368道尔顿分子量偏移。(b)3-羟基丁酸与3-羟基丁酰化辅酶A的生物合成过程及3-羟基丁酸，乙酰乙酸和丙酮的结构式。
图2为鉴定与验证赖氨酸-3-羟基丁酰化多肽。(a)HEK293核心组蛋白胰酶消化的一种多肽KQLATKacAAR(SEQ ID NO：29)的质谱图，Kac为乙酰化赖氨酸。此多肽分子量在其第一个赖氨酸残基处发生+86.0276道尔顿偏移(b)K3ohbuQLATKacAAR合成多肽的质谱图，此处的K3ohbu为3-羟基丁酰化赖氨酸(c)从(R/S)-3-羟基丁酸盐-[2，4-13C2]处理HEK293细胞中鉴定出的K3ohbu(heavy)QLATKacAAR多肽质谱图。插入的标记为两价前体多肽离子的核质比。(d)胞内K+86.0276QLATKacAAR多肽，对应的合成K3ohbu多肽，两者混合物，三种多肽的HPLC/MS/MS分析重构的离子色谱图。表明这两种多肽共洗脱。
图3利用抗赖氨酸3-羟基丁酰化泛抗体，用免疫印迹法检测细胞中的赖氨酸3-羟基丁酰化。(a)从大肠杆菌，果蝇的S2细胞，线虫，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和人胚肾细胞(HEK293)提取的全细胞蛋白；(b)从饥饿48小时和未饥饿的雄鼠肝脏中提取的全细胞蛋白(c)从STZ处理的和未处理的雌鼠肝细胞中提取的全蛋白。蛋白转印后，孵育抗体前，通过丽春红染色来确保样品量一致。(d)饥饿与(e)STZ处理的小鼠与相应的对照之间的比较。**P＜0.01，***P＜0.001，
图4为蛋白组学法筛选K3ohbu底物。(a)从人胚肾细胞细胞中(红色菱形)与从小鼠肝细胞中(绿色菱形)鉴定的组蛋白上的K3ohbu位点标记在小鼠组蛋白(UniProtKB入口分别为：P43277，P27661，P10853，P84244 and P62806)序列上。修饰的赖氨酸用红色高亮，人和小鼠组蛋白已知的Kac位点用蓝色的方块标识。细胞区室分析K3ohbu蛋白组学，(b)表明K3ohbu底物丰度(c)表明K3ohbu底物亚细胞分布。(d)分析HEK293细胞K3ohbu底物中3-羟基丁酰化赖氨酸周边序列鉴定出SK，KxxP，KxA几种特征序列(Bonferroni-corrected p＜0.05)。
本发明的详细描述
本发明是基于赖氨酸-3-羟基丁酰化，一种新型的组蛋白标记的发现基础之上。特别是赖氨酸3-羟基丁酰化(K3ohbu)被证实为一种新的，进化保守的蛋白质翻译后修饰。通过将3-羟基丁酸转化为3-羟基丁酰辅酶A，3-羟基丁酸盐可标记和刺激K3ohbu。K3ohbu是一种分布广泛和动态变化的PTM，受生理条件和细胞状态的影响。比如，在HEK293细胞和小鼠肝细胞中的组蛋白上有45个非冗余的K3ohbu位点，而HEK293细胞中已鉴定出3008个K3ohbu位点。本发明不仅进一步证实了酮类物质代谢与染色体结构有关，而且为研究蛋白质3-羟基丁酰化的病理功能和其在病理生理中不同的作用，掀开了新的篇章。
“peptide”在本发明中是指两个以上的氨基酸通过肽健连接的线性链。一条多肽可能包括2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，40，50，100，200甚至更多的氨基酸。多肽中的氨基酸可以被修饰，去除，添加或用别的氨基酸代替。多肽可通过做所周知的方法获得，如通过合成和胰酶消化天然或重组蛋白获得。
“polypeptide”在本发明中是指含至少4个氨基酸的多肽，一般是20个氨基酸左右，不管是否修饰。“protein”在本发明中是指包含一条或多条polypeptide的生物分子，不管是否修饰。蛋白质中的每条polypeptide可能就是一个亚单元。polypeptide和protein可以天然状态或修饰状态存在，具有生物学功能或生物学特征。
当蛋白质只有一条polypeptide时，“protein”和“polypeptide”可以通用。多肽或蛋白片段是指多肽或蛋白的一部分，与多肽或蛋白中的部分序列相同。一般多肽或蛋白片段与多肽或蛋白具有相同或类似的生物学功能。
“derived from”在本发明中是指从中得到生物分子的来源，包括天然的，重组的，未纯化的和纯化的分子。一种生物分子比如多肽分子(例如polypeptide或protein)可衍生自一原始分子，与原始分子一致或原始分子的变体一致。比如，衍生自原始多肽的一条多肽，其氨基酸序列与原始多肽的序列一致或类似，并至少有一个氨基酸发生修饰，去除，插入或替代。一条衍生多肽的氨基酸序列与原始多肽的序列至少有5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％or100％的类似，一般至少需要有50％的类似，80％的类似更好，90％最好。
“antibody”在本发明中包括完整的抗体分子，抗原结合片段和单链分子。完整的抗体分子是两种抗体分子类型的一种。第一种是指通常具有两条重链，两条轻链和抗原结合部分的糖基化蛋白。比如多克隆抗体和单克隆抗体。抗体的抗原结合部分在本发明中是指抗体的一个或多个具有与抗原特异性结合的片段。第二种类型是指骆驼类动物中的重链抗体，也叫做纳米抗体。单链可变片段在本发明中是指抗体的重链和轻链的可变区通过一条短的连接肽连接起来的融合蛋白。如大约20-25个氨基酸，仍可与抗原特异性结合的融合蛋白。
本发明提供一种分离的含有3-羟基丁酰化的赖氨酸的多肽。本文所用的术语“3-羟基丁酰化赖氨酸”是指e氨基被3-羟基丁酰基修饰的赖氨酸残基。它可以是R或S型，更倾向于R型。本文所用的术语“赖氨酸-3-羟基丁酰化位点”是指含有e氨基被3-羟基丁酰化的赖氨酸残基的肽、多肽或者蛋白质。本文所用的术语“赖氨酸3-羟基丁酰化”是指赖氨酸的e氨基被3-羟基丁酰化产生3-羟基丁酰基的赖氨酸残基或者3-羟基丁酰化的赖氨酸。
本发明的多肽可具有3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150或200个氨基酸。多肽可具有约3-25个氨基酸，优选5-20个氨基酸，6-14个氨基酸更好。
本发明的肽可用本领域已知的常规技术来制备。该肽可以来源于蛋白质，如组蛋白，或其片段，具有赖氨酸3-羟基丁酰化的位点。组蛋白可以来源于真核细胞，包括酵母(酿酒酵母)，秀丽隐杆线虫，果蝇(黑腹果蝇(S2))，四膜虫(嗜热四膜虫)，小鼠(M家鼠(MEF))或者人类。优先选择哺乳动物细胞，如人、灵长类、小鼠、大鼠、马、驴、牛、绵羊、山羊、鸡、狗或猫的细胞，人类细胞更好。
组蛋白可以是连接组蛋白或核心组蛋白。连接组蛋白可以从H1家族成员中选择，包括H1F亚族(如H1F0，H1FNT，H1F00和H1FX)和H1H1亚族(如HIST1H1A，HIST1H1B，HIST1H1C，HIST1H1D，HIST1H1E和HIST1H1T)。核心组蛋白是H2A，H2B，H3或H4家族的成员。H2A家族的核心组蛋白可能是H2AF亚族(如H2AFB1，H2AFB2，H2AFB3，H2AFJ，H2AFV，H2AFX，H2AFY，H2AFY2和H2AFZ)，H2A1亚族(如HIST1H2AA，HIST1H2AB，HIST1H2AC，HIST1H2AD，HIST1H2AE，HIST1H2AG，HIST1H2AH，HIST1H2AI，HIST1H2AJ，HIST1H2AK，HIST1H2AL和HIST1H2AM)，或者H2A2亚族(如HIST2H2AA3，HIST2H2AA4，HIST2H2AB和HIST2H2AC)的一员。H2B家族的核心组蛋白可以是H2BF亚族(如H2BFM和H2BFWT)，H2B1亚族(如HIST1H2BA，HIST1H2BB，HIST1H2BC，HIST1H2BD，HIST1H2BE，HIST1H2BF，HIST1H2BG，HIST1H2BH，HISTlH2BI，HIST1H2BJ，HIST1H2BK，HIST1H2BL，HIST1H2BM，HIST1H2BN和HIST1H2BO)，或者H2B2亚族(如HIST2H2BE和HIST2H2BF)的一员。核心组蛋白H3家族可以是H3A1亚族(如HIST1H3A，HIST1H3B，HIST1H3C，HIST1H3D，HIST1H3E，HIST1H3F，HIST1H3G，HIST1H3H，HIST1H3I和HIST1H3J)，H3A2亚族(如HIST2H3A，HIST2H3C和HIST2H3D)，或者H3A3亚族(如HIST3H3)，H3A3亚族(如H3F3A，H3F3B，和H3F3C)的一员。核心组蛋白H4家族可以是H41亚族(如HIST1H4A，HIST1H4B，HIST1H4C，HISTlH4D，HIST1H4E，HIST1H4F，HIST1H4G，HIST1H4H，HIST1H4I，HIST1H4J，HIST1H4K和HIST1H4L)，或H44亚族(如HIST4H4)的一员。
不同物种中组蛋白的蛋白和基因序列在本领域中是已知的。例如，人类、小鼠、酿酒酵母、四膜虫、黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫的组蛋白序列可以在GenBank数据库中找到。GenBank数据库登录号No.P16403(H1.2_HUMAN)(SEQ ID NO：1)，POCOS8(H2A.1_HUMAN)(SEQID NO：2)，P33778(H2B.1B_HUMAN)(SEQ ID NO：3)，P84243(H33_HUMAN)(SEQ ID NO：4)和P62805(H4_HUMAN)(SEQ ID NO：5)；P15864(H12_MOUSE)(SEQ ID NO：6)，P22752(H2A1_MOUSE)(SEQ ID NO：7)，P10853(H2B1F/G/L_MOUSE)(SEQ ID NO：8)，P84244(H33_MOUSE)(SEQ ID NO：9)和P62806(H4_MOUSE)(SEQ ID NO：10)；P04911(H2A.1_S.cerevisiae)(SEQID NO：11)，P02294(H2B.2_S.cerevisiae)(SEQ ID NO：12)，P61830(H3_S.cerevisiae)(SEQ ID NO：13)和P02309(H4_S.cerevisiae)(SEQ ID NO：14)；P35065(H2A.1_Tetrahymena thermophila)(SEQ ID NO：15)，P08993(H2B.1_Tetrahymena thermophila)(SEQ ID NO：16)，I7LUZ3(H3_Tetrahymena thermophila)(SEQ ID NO：17)和P69152(H4_Tetrahymena thermophila)(SEQ ID NO：18)；P02255(H1_D.melanogaster)(SEQ ID NO：19)，P08985(H2A.V_D.melanogaster)(SEQ ID NO：20)，P02283(H2B_D.melanogaster)(SEQID NO：21)，P02299(H3)(SEQ ID NO：22)和P84040(H4_D.melanogaster)(SEQ ID NO：23)；P10771(H1.1_c.elegans)(SEQ ID NO：24)，P09855(H2A_c.elegans)(SEQ ID NO：25)，P04255(H2B.1_c.elegans)(SEQ ID NO：26)，P08898(H3_c.elegans)(SEQ ID NO：27)和P62784(H4_c.elegans)(SEQ ID NO：28)。
组蛋白片段的序列可以和至少含有一个赖氨酸3-羟基丁酰化位点的氨基酸序列部分相同。组蛋白片段可以至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150或200个氨基酸。组蛋白片段可能包含3-25个连续的氨基酸，5-20个连续的氨基酸更好，而6-14个连续的氨基酸最好，这些组蛋白序列含有至少一个赖氨-3-羟基丁酰化的位点。
组蛋白或者其片段在赖氨酸3-羟基丁酰化的位点处可能含有一个3-羟基丁酰化的赖氨酸。赖氨酸3-羟基丁酰化位点可以是列举的人类(表1)和小鼠(表2)组蛋白位点中的任何一个。
组蛋白可以从生物样本中获取，或者通过重组技术来制备。组蛋白的片段可以通过重组技术制备，或通过酶(如胰酶)消化组蛋白来获得。组蛋白或其片段的赖氨酸3-羟基丁酰化位点可以是自然形成的，也可以是人工的。可以通过本领域的常规技术如质谱分析法来确定3-羟基丁酰化赖氨酸的存在。
本发明的多肽包括与序列编号为29-102的序列(SEQ ID NOs：29-102)至少有70％，80％，90％，95％或99％，通常是至少90％，最好是高达100％相似度。这些多肽包含组蛋白上任何一个赖氨酸-3-羟基丁酸化位点，无论该位点两侧还包含或不包含组蛋白的序列。本发明的多肽包括还可包含其它非3-羟基丁酸化赖氨酸的蛋白翻译后修饰位点，例如乙酰化或甲基化赖氨酸。本发明的多肽进一步包含3-羟基丁酰化赖氨酸位点的N端和C端两侧的氨基酸残基，每侧或两侧共包含至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10甚至更多氨基酸残基。最好是在3-羟基丁酰化赖氨酸位点的N端和C端两侧各有2个氨基酸残基。本发明的范例多肽可见于表1和表2。
在此我们同时提供一种赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。这里的“赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性富集试剂”在本发明中特别指代一种可以与含赖氨酸-3-羟基丁酰化位点的多肽、聚合多肽和蛋白结合的分子，这些多肽、聚合多肽和蛋白既可以是组蛋白或本发明所涉及的多肽。赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂可以是一种蛋白质，例如抗体。赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰位点可以是来源于任意物种的组蛋白。例如人(表1)和鼠(表2)的3-羟基丁酰化赖氨酸位点，以及其它真核生物组蛋白同源赖氨酸位点中包含的赖氨酸3-羟基丁酰化位点。
在一些实施例中，赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂与含有3-羟基丁酰化赖氨酸的多肽、聚合多肽和蛋白结合。这种亲和试剂对R型或S型，尤其是R型的3-羟基丁酰化赖氨酸的多肽、聚合多肽和蛋白的亲和力至少高于用未被修饰对应物的10，50，100，500，1000或5000倍。
在另外一些实施例中，赖氨酸-3-羟基丁酰化位点特异性试剂与含赖氨酸-3-羟基丁酰化位点的未被修饰的多肽、聚合多肽和蛋白结合。其亲和力至少高于与被修饰的对应物，不论R型或S型，尤其是R型的3-羟基丁酰化赖氨酸的多肽、聚合多肽和蛋白相结合的10，50，100，500，1000或5000倍。赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂可以是多肽、聚合多肽或蛋白，亦或者是抗体。这里提到的多肽倾向于指本发明的多肽。
赖氨酸3-羟基丁酰化亲和试剂可以是位点特异性的，例如这种结合取决于3-羟基丁酰化赖氨酸，不论R型或S型，尤其是R型及其它周围的多肽序列。周围的序列是指3-羟基丁酰化赖氨酸的N端和C端两侧的氨基酸残基，每侧或两侧总共可包含至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10甚至更多残基。例如这种结合取决于3-羟基丁酰化赖氨酸及其N端、C端两侧每侧至少2个氨基酸残基。
赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰的特异性亲和试剂可以没有位点特异性，或者说该试剂的结合方法只与3-羟基丁酰化赖氨酸是否存在有关，而与其临近的序列没有关系。一个例子就是抗3-羟基丁酰化赖氨酸部分的泛抗体。
接下来进一步介绍本专利涉及的赖氨酸-3-羟基丁酰化亲和试剂的生产方法。
赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂可以是一种蛋白质，该蛋白可以通过使用本发明中所涉及的多肽去筛选蛋白文库(展示文库或兼并文库)得到。用于筛选的这些肽段3-羟基丁酰化赖氨酸的N末端和C末端两侧至少得各含有2个氨基酸残基。蛋白库可以由大量的兼并蛋白序列组成，而这些序列可包含2个区段：一个或多个固定序列区段和一个多元化氨基酸兼并序列区段。这个蛋白库可以是噬菌体蛋白文库，酵母菌蛋白文库，核糖体蛋白文库，或者其他由随机氨基酸序列所组成的合成蛋白文库。
赖氨酸-3-羟基丁酰化特异性亲和试剂也可以是一种抗体，这种抗体可以使用本领域的常规技术进行生产。例如，这种方法将会用抗原肽段免疫宿主从而使其产生抗体，宿主可以是适合生产抗体的哺乳动物。例如，宿主可以是老鼠，兔子，山羊，驼科的动物(比如羊驼和骆驼)，软骨鱼。鉴于采用宿主的不同，生产的抗体可以是双链(一支重链支轻链)，亦可以是单链(或者驼科生产的只含重链的抗体)，这种单链抗体也被称作纳体(Nanobody)。。
抗原肽段可以衍生于组蛋白或含有3-羟基丁酰化赖氨酸位点的片段，该抗原肽段既可被3-羟基丁酰化也可以没有。抗原多肽包含本专利中涉及到的多肽。含有3-羟基丁酰化赖氨酸的抗原多肽可能包含表1和表2中的一个或多个多肽。不含3-羟基丁酰化赖氨酸的抗原肽段可以含有表1和表2中一样的氨基酸序列，除了其中3-羟基丁酰化赖氨酸位点没有被3-羟基丁酰化。这些肽段的N端和C端可被延长1至20个残基。
该方法还包括从抗血清中纯化这个抗体，然后分离出宿主的脾细胞，并从中获得单克隆抗体。在一些实施例中，当组蛋白或其片段的3-羟基丁酸化赖氨酸位点被3-羟基丁酸化时，该抗体与之特异性结合，而当该3-羟基丁酸化赖氨酸位点没有被3-羟基丁酰化修饰时，该抗体不能与之特异性结合。在另外的一些实施例中，当组蛋白或其片段的3-羟基丁酸化赖氨酸位点没有被3-羟基丁酸化时，该抗体与之特异性结合，而当该3-羟基丁酸化赖氨酸位点被3-羟基丁酰化修饰时，该抗体不能与之特异性结合。
该方法进一步包括将对分离出的抗体进行高效液相色谱和质谱分析，然后通过搜索蛋白质数据库去匹配所有来自宿主骨髓(或B细胞)获得IgG蛋白序列(由cDNA序列衍生而来)，从而推测抗体的序列。IgG cDNA序列可以通过对RT-PCR生成的IgG cDNA进行常规的DNA测序获得。所获得的重链和轻链的可变区(VH和VL)能够进一步配对(例如当IgG是从鼠或兔中分离出来的双链抗体)。这种匹配不必要针对来源于羊驼的只含重链的抗体(或纳抗)。然后，我们可以利用所获得的抗体蛋白的氨基酸序列，以本领域的现有技术去制备抗体。
本发明提供了一种检测蛋白或其片段上赖氨酸-3-羟基丁酰化的方法。赖氨酸-3-羟基丁酰化可能存在两种形式即赖氨酸-R-3-羟基丁酰化和赖氨酸-S-3-羟基丁酰化，赖氨酸-R-3-羟基丁酰化更常见。这套方法包括(a)用本发明的一种亲和试剂来结合蛋白或者多肽形成一个复合体，并且(b)如何检测这个复合体。复合体的存在则表明要检测的蛋白或者多肽的赖氨酸上存在3-羟基丁酰化。复合体的检测可以采用该技术领域几种常见的检测方式。这个蛋白可以是个组蛋白。我们这套方法还包括如何对这个复合物进行定量分析。所检测到的复合物的量的多少反映出蛋白或者多肽中赖氨酸上3-羟基丁酰化水平的高低。
本发明的这个检测方法提供一种试剂盒，该试剂盒中包括本发明的赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂。亲和试剂为赖氨-R-3-羟基丁酰化亲和试剂或赖氨-S-3-羟基丁酰化亲和试剂。试剂盒内还包括实验方法的具体操作步骤。
这里提供一种融合报告蛋白，该融合报告蛋白包括一个中心，两侧分别为供体荧光分子组分和受体荧光分子组分。而中心是一个包括赖氨酸3-羟基丁酰化位点和赖氨酸3-羟基丁酰化结合区域的多肽。“赖氨酸3-羟基丁酰化结合区域”一词是指蛋白序列中能够特异性结合赖氨酸3-羟基丁酰化的位点。
本发明中介绍的融合报告蛋白对于检测蛋白质中赖氨酸3-羟基丁酰化的水平和采用荧光共振能量转移(FRET)的方法筛选蛋白质中赖氨酸3-羟基丁酰化的调节物具有十分重要的作用。FRET涉及到两个荧光素分子距离足够近的时候会产生一种光子能量转移的现象。这里的供体荧光分子和受体荧光分子是符合FRET的标准的。在融合报告蛋白中，供体荧光分子将从一组包含蓝色荧光蛋白(CFP)，增强型蓝色荧光蛋白(ECFP)，以突变体A206K中选出，而受体荧光分子将从一组包含黄色荧光蛋白(YFP)，增强型黄色荧光蛋白((EYFP)，以及它的突变体形式Citrine，Venus，和A206K中产生。
融合报告蛋白中心的多肽由本发明中一条多肽构成。它来源于组蛋白或者一个包含赖氨酸3-羟基丁酰化位点的一个片段，而他们或者被3-羟基丁酰化修饰，或者没有3-羟基丁酰化的位点。
赖氨酸的3-羟基丁酰化修饰位点通常在组蛋白的N-末端，C-末端或者是组蛋白的核心区域。N-末端，C-末端和组蛋白的核心区域(如人或小鼠的H1.2，H2A，H2B，H3 or或者H4)在该领域是大家所熟知的区域。
融合报告蛋白通常包含一个或者更多赖氨酸3-羟基丁酰化修饰结合结构域。赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰结合结构域衍生自本发明中赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰亲和试剂。
在一些实施例中，多肽的赖氨酸3-羟基丁酰化修饰位点是没有被3-羟基丁酰所修饰，而赖氨酸3-羟基丁酰化修饰位点结合结构域能特异性结合那些位点被3-羟基丁酰化修饰的多肽，若没有修饰则不能被结合。
在另外一些实例中，多肽中赖氨酸3-羟基丁酰化修饰位点是被3-羟基丁酰修饰过，而赖氨酸3-羟基丁酰化修饰位点结合结构域能特异性结合那些位点不被3-羟基丁酰化修饰的多肽，如发生修饰则不能结合。
赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰位点以一个分子链接与赖氨酸3-羟基丁酰化修饰位点结合结构域相偶连。这个链接分子可以是个多肽有1-50个氨基酸的长度，而1-30个氨基酸较好，最优选的长度是2-15个氨基酸。在有些情况下，这个连接分子可以是双甘氨酸(-Gly-Gly-)。连接分子的长度与内容有时可能需要作出调整，来优化荧光供体组分与荧光受体组分之间发生荧光共振能量转移(FRET)的效率，这取决于融合报告蛋白上的3-羟基丁酰化位点发生修饰与否，或者与3-羟基丁酰化结构域结合的时候。
融合报告蛋白还包含一个靶向多肽，这个靶向多肽可能来自于受体配体，核定位序列(NLS)，核输出信号(NES)，膜定位信号，组蛋白结合蛋白或者是核蛋白。
接下来介绍一种检测样品中赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰水平的方法。该方法包括(a)利用本发明中的融合报告蛋白处理样品，和(b)对比在采用融合报告蛋白处理样品前后受体荧光分子和供体荧光分子之间的共振能量转移(FRET)水平变化。FRET水平的变化指示样品中赖氨酸3-羟基丁酰化修饰水平的情况。在融合蛋白处理前后FRET水平会发生升高或者降低。
这里还介绍一种检测蛋白中非赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰水平的方法。这种方法包括(a)利用本发明中的融合报告蛋白处理样品，和(b)对比在采用融合报告蛋白处理样品前后受体荧光分子和供体荧光分子之间的共振能量转移(FRET)水平变化。FRET水平的变化指示样品中非赖氨酸3-羟基丁酰化修饰水平的情况。在融合蛋白处理前后FRET水平会发生升高或者降低。
对于本发明的检测方法，样品可以是一个生物样本(比如：体液或者是血清)。生物学样本可以包括细胞，组织活检，或者是临床液体。生物学样本还可以是一个物体(比如，小鼠，大鼠或者是人)。样本是可以健康的，或者是可能经历或预测有蛋白质赖氨酸或非赖氨酸3-羟基丁酰化修饰水平的紊乱。这些紊或疾病与蛋白质赖氨酸或非赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰水平的异常调节相关。这些疾病可能包括：癌症，神经退行性疾病，老化，代谢异常和发育不良等。
本发明的测定方法进一步包含对比样品组合对照组的FRET的水平。对照组的FRET水平可能来自于物体本身，它们是健康的或者没有受到蛋3-羟基丁酰化修饰水平紊乱相关疾病的影响。样品组的FRET水平会高于或者低于对照组。
本发明的测定方法还包含在样品中加入物质。在一些实例中，这些物质是已知可以促进或者抑制蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化，而在另一些实例中，这些物质是用来筛选调节蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化的候选者。这些筛选的物质可能是一些化合物或者生物大分子。
对于该发明中的每一种检测方法，我们都可以提供试剂盒。该试剂包括本发明中的融合蛋白，还包括说明书来指导具体该如何操作。
我们还可提供分离包含赖氨酸-3-羟基丁酰化的多肽的试剂盒，该试剂盒包含可以分离赖氨酸3-羟基丁酰化的特异性亲和试剂。该试剂可以特异性结合含有3-羟基丁酰化修饰的多肽。
这里提供一种治疗或者预防蛋白质赖氨酸3-羟基丁酰化修饰相关的疾病的方法。该方法包含对患者给予有效剂量的组合物，该组合物中的治疗剂可调控蛋白赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰的水平。这个物质会被作为一个筛选候选者通过本发明的检测方法鉴定到。蛋白赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰可能是组蛋白的赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰。
这里提供一种治疗或者预防蛋白质非赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰相关的疾病的方法。该方法包含对患者给予有效剂量的组合物，该组合物中的治疗剂可调控蛋白去赖氨酸3-羟基丁酰化修饰的水平。这个物质会被作为一个筛选候选者通过本发明的检测方法鉴定到。蛋白去赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰可能是组蛋白的去赖氨酸-3-羟基丁酰化修饰。
实施例1
材料与方法
肽段样品制备
用来合成多肽的修饰性赖氨酸残基的合成方法与定性分析详见网上发布附加方法。根据已经报道的方法，用胰蛋白酶酶解样本中的组蛋白和全细胞溶解产物。将被胰蛋白酶酶解了的10毫克的全细胞溶解产物在碱性反相高效液相色谱中分为80个组分。这些多肽组分会被合并成20组分后用之前提到的类似的方法采用赖氨酸-3-羟基丁酰化抗体进行免疫亲和性富集。
MS/MS数据分析
多肽样本通过液质联用(HPLC-MS/MS)分析并将数据在IPI人类(v3.70)或小鼠(v3.74)的数据库中进行搜索。根据已经报道的方法，以1％的Benjamini-Hochberg假阳性率做生物信息学分析，具体的方法详见网上发表附加方法。
细胞培养和动物实验
HEK293细胞采用完全DMEM培养基培养，若进行药物处理，其具体培养条件会在文中特别指明。。C57BL/6老鼠被分为普通饮食组和禁食组(有水)在特定时间内进行试验并做详细的记录。C57BKS/J db/db同窝幼崽(得到Jackson实验室的许可)被给予单剂量腹腔膜内注射链脲霉素(STZ，200mg/kg体重)，或者是注射柠檬酸钠溶液等待48小时。此后收集小鼠的肝脏并提取组蛋白做免疫印迹和蛋白组学分析。
试剂
赖氨酸3-羟基丁酰化抗体与PTM Biolabs，Inc.(Chicago，IL)共同研发。多肽合成采用消旋或者对映体修饰的选择性基团来保护氨基酸残基。合成Fmoc-来保护氨基酸残基的方法在补充数据中有详细介绍。测序级的胰酶购买于Promega(Madison，WI)公司。C18ZipTips购买于Millipore Corporation(Bedford，MA)公司。其他化学试剂分别购买如下：购买自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)：甲酸(＞98％)，碳酸氢铵(＞99％)，三氯乙酸(6.1N)，碘乙酰胺，二硫苏糖醇，牛血清白蛋白，丁酸钠，烟酰胺，曲古抑菌素A，Fmoc-Lys-OH(98％)，钠(R/S)-3-羟基丁酸-2，4-13碳2(99％)，(R/S)-3-羟基丁酸，(R)-3-羟基丁酸，(S)-3-羟基丁酸，2-羟基异丁酸(98％)，N-羟基丁二酰亚胺(98％)，磷酸(99％)，BF3·OEt2，异丁烯(99％)，氢氧化锂(＞98％)，4-丁内酯(＞99％)，三苯氯甲烷(98％)，无水吡啶(99.8％)，乙烷基(R)-3-羟基丁酸(98％)，乙烷基(S)-3-羟基丁酸(99％)，N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(99％)，二氧六环(99.8％)，甲基(S)-3-羟基-2-甲基苯酸盐(99％)，甲基(R)-3-羟基-2-甲基苯酸盐(99％)，三氟乙酸(99％)，and乙基2-羟基丁酸(＞95％GC).Fisher(Pittsburgh，PA)：碳酸氢钠(ACS级)，氢氧化钠(ACS级)，乙腈(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)，盐酸溶液(37.3％)，甲醇(ACS级)，丙酮(ACS级)，乙酸乙酯(ACS级)，无水乙醚(ACS级)，DMEM培养基(高糖)，无水硫酸钠(ACS级)，无水硫酸镁(ACS级)，己烷(ACS级)，Et3N(＞99％)，和过氧化氢.Abcam：anti-histone H3抗体，anti-alpha tubulin抗体.
细胞培养和多肽样品的制备
HEK293细胞在37℃，补充5％CO2的湿润培养箱中，用DMEM完全培养基培养至汇合度达90％。对于同位素标记，HEK293细胞需要在含有20mM(R/S)-3-羟基丁酸[2，4-13C2]的DMEM完全培养基，培养48小时达到95％汇合度。为了找出3-羟基丁酸的作用底物，根据参考文献，将HEK293细胞，分别用3-羟基丁酸钠处理和未处理的DMEM完全培养基培养。收集好细胞用裂解缓冲液(100mM氯化钠，20mM Tris，0.5mM EDTA，0.5％(v/v)NP40，0.2mM PMSF，2μg/μL亮抑酶肽，10μg/mL抑肽酶，5mM 丁酸钠and 10mM烟酰胺)裂解，在4℃匀速旋转20分钟。将样品在4℃，20，000xg离心10分钟。再将不溶沉淀物悬浮于10倍体积的裂解缓冲液，4℃短时超声处理。合并蛋白裂解样品，用-20℃预冷的80％丙酮和10％三氯乙酸溶液，-20℃沉淀2小时。蛋白沉淀用预冷的丙酮洗涤两次，干燥，再用用50∶1(样品：酶)测序级改良的胰蛋白酶(Promega)37℃消化16小时。酶解产物用5mM二硫苏糖醇50℃还原处理30分钟，用15mM碘乙酰胺室温30分钟烷基化，30mM的半胱氨酸室温封闭30分钟。二硫苏糖醇还原和烷基化后，样品用胰蛋白酶100∶1，37℃消化4小时。为了蛋白质组学水平鉴定HEK293细胞的K3ohbu底物，酶解后的多肽将通过如下所述的反相色谱进一步分离。
动物实验
所有的动物实验均经中国上海药物研究所动物伦理委员会批准，并实施实验。对于饥饿实验，如文中详述，两组16周龄成年C57BL/6小鼠(对照组：n＝20，雄性10例，雌性10例；实验组：n＝40，雄性20例，雌性20例)，喂食含19％蛋白质的标准食物，或禁食(可自由饮水)24，48和72小时(上午9:00至9:00)。
C57BKS/J db/db小鼠是经杰克逊实验室授权并在试验单位饲养和繁殖的。所有小鼠均安置在一个温度控制在(22±2℃)的房间里，12小时光照/12小时黑暗循环。12周龄时，C57BKS/J的db/db同窝小鼠(C57BLKS/J瘦型小鼠)被招募到实验中并随机分配。对于酮症酸中毒实验，db-同窝小鼠(每个组n＝6，3名雄性和3名雌性)进行单剂量腹膜内注射链脲佐菌素(STZ，200毫克/公斤体重)，或对照柠檬酸钠缓冲液。48小时后(9:00am至9:00am)，尾静脉取血液样本，利用葡萄糖酮体检测仪(LifeScan公司，不列颠哥伦比亚省，加拿大)测定血糖和3-羟基丁酸浓度。将小鼠断头，收集肝组织提取组蛋白，制备裂解物。
组蛋白提取
根据前面描述的方案稍作修改，从HEK293细胞和小鼠肝脏中分别提取核心组蛋白。将肝脏样品用玻璃杜恩斯匀浆器(研磨20下)在冰冷裂解缓冲液中匀浆。将匀浆液通过两层纱布，然后以1000×g转速在4℃下离心5分钟。用裂解缓冲液将沉淀快速洗涤并用0.4N硫酸重悬4℃过夜。第二天4℃，20,000x g离心10min得到得到上清。用20％三氯乙酸沉淀含有组蛋白的上清液，用预冷丙酮将组蛋白沉淀洗涤两遍并干燥。然后，如前所述，用测序级胰蛋白酶消化组蛋白。
反相分离酶解多肽
多肽反相色谱分馏采用日本岛津公司制备型高效液相色谱系统，色谱柱为Phenomenex Luna C18 column(10mm X 250mm，5μm particle，pore size)，流速4毫升每分钟。缓冲液A为10mM甲酸铵水(pH 7.8)，缓冲液B为10mM甲酸铵，90％乙腈(pH 7.8)。多肽溶解在装有2毫升缓冲液A的色谱柱中，并在2-30％B梯度中洗脱40分钟，30-90％B梯度中洗脱10分钟。共收集到80个组分，合并为20个组分。通过连接一个水泵的旋转蒸发仪抽干每个组分中的乙腈；剩下的样品用冷冻干燥法干燥。如先前所述对含有赖氨酸-3-羟基丁酸的多肽进行免疫亲和富集。
液质联用分析
采用Eksigent1D纳米流液相色谱，酶解多肽溶解在高效液相色谱中的缓冲液A(0.1％甲酸的水)，并加载到自填充C18毛细管柱(10厘米长，75微米ID)，柱内填充有Jupiter C12树脂(Phenomenex，90埃，4微米)。5％-30％B液线性梯度，200纳升每分钟恒定流速洗脱2小时。电喷雾形成肽离子进入LTQ Velos Orbitrap质谱仪，以数据依赖模式破碎成20个强度最高的离子，或通过碰撞诱导解离破碎指定的母离子。
多肽定性和定量
通过内置Andromeda搜索引擎的Maxquant(v1.3.0.5)，用IPI人类(V3.70)或IPI小鼠(v3.74)数据库，对MS/MS数据进行蛋白质和多肽的鉴定分析。赖氨酸乙酰化，3-羟基丁酰化，甲硫氨酸氧化和蛋白N-末端乙酰化被设定为可变修饰。母离子质量容差设为6ppm，碎片离子质量容差设为0.5Da。蛋白质，多肽和位点的结果均被以1％的假阳性率过滤过滤。
为了减少低质量的蛋白质翻译后修饰鉴定数量，进一步去除了Maxquant中多肽得分低于60或位点存在可能性低于0.9的多肽。我们还去掉了含有C-末端赖氨酸修饰和鉴定到的已知杂蛋白多肽修饰的鉴定结果。
生物信息学分析
如前所述，以1％的Benjamini-Hochberg假阳性率，进行基因本体论(GO)，京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路和Pfam结构域分析。采用鼠和人类的手工辅助CORUM蛋白质复杂数据库进行蛋白质复合物的分析。以1％的Benjamini-Hochberg假阳性率，通过超几何分布鉴定出冗余复合物，在Cytoscape中可视化展现。从STRING数据库中提取出与赖氨酸3-羟基丁酰化蛋白有关的蛋白质相互作用信息，用Cytoscape中的的MCODE插件工具制作蛋白互作网络。侧翼序列偏好由Icelogo以P＜0.05分析。序列基序鉴定由Weblogo以motif-x(Bonferroni p＜0.05)进行并直观展现。
多肽合成和合成多肽的赖氨酸修饰残基特性
在30mL含有2-羟基异丁酸溶液(32mM，3.35g)和羟基琥珀酰亚胺(32.6mM，3.75mg)的无水乙腈中加入Fmoc-Lys(2-hydroxyisobutyryl)-OH.二环己基碳二亚胺(32.6mM，6.72g)。将所得混合物在室温下搅拌3小时，然后过滤，蒸发至干。残余物被再溶于300mL二氯甲烷，加入Et3N(64mM，8.9mL)和Fmoc-Lys-OH(32mM，12.9g)。混合物室温下搅拌8小时。溶剂蒸发，残余物复溶于水。溶液PH值调至2.0。水溶液用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。将溶剂干燥，残余物通过快速柱色谱法纯化(洗脱液：甲醇/二氯甲烷＝1/40至1/20)。得到8.7g(60％)的Fmoc-Lys(2-hydroxyisobutyryl)-OH。
Fmoc-Lys(2-hydroxyisobutyryl)-OH：1H NMR(500MHz，氘代氯仿)：δ7.69(d，J＝7.5Hz，2H)，7.54(t，J＝7.5Hz，2H)，7.33(t，J＝7.5Hz，2H)，7.23(t，J＝7.5Hz，2H)，5.99(d，J＝8.0Hz，1H)，4.30-4.40(m，3H)，4.12-4.14(m，1H)，3.18-3.19(m，2H)，1.64-1.84(m，2H)，1.37-1.47(m，10H)；13C NMR(125MHz，氘代氯仿)：δ177.6，174.9，156.4，143.7(143.6)，141.2(141.1)，127.7，127.0，125.0，119.9，73.5，67.1，53.6，47.0，38.6，31.6，28.7，27.5(27.4)，22.1；IR(KBr)：3361.7，2934.8，2868.3，1711.2，1696.9，1642.5，1631.6，1536.4，1454.6，1270.5，1254.9，1200.1，1176.6，1047.3，765.4，740.3cm-1；HRMS(m/z)：[M]+已计算的.对于C25H31N2O6，455.2182；found，455.2165.
Fmoc-Lys((±)-2-(tBuO)butyryl)-OH.步骤1：外消旋乙基2-羟基丁酸(15.1mM，1.78g，1.83mL)溶于25mL二氯甲烷。然后，按顺序加入2g的99％磷酸和312μL BF3·OEt2。将所得混合物在冰丙酮浴中冷却，搅拌。然后，用50毫升量筒(在干冰丙酮浴预冷却)量取10毫升异丁烯倒入烧瓶中。将烧瓶密封，并将反应物在-78℃下搅拌1小时，然后使之恢复到室温。10小时后，异丁烯排出，溶剂蒸发至干。将残余物再溶解在100mL EtOAc中。该溶液用用饱和NaHCO 3溶液洗涤3次，然后用盐水洗涤。将有机层分离并用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂，残余物通过快速柱色谱法纯化。该柱先用50毫升己烷/三乙胺(体积/体积＝50/1)，然后用200毫升己烷/二氯甲烷(V/V＝7)，接着用200ml己烷/乙酸乙酯(体积/体积＝8/1)。获得1.31克(50％)乙基2-甲(tBuO)丁酸乙酯。
步骤2：乙基2-(tBuO)丁酸乙酯(1.31g，7mM)溶解在20ml的MeOH/H2O＝1∶1的溶液。加入LiOH(25mM，575mg。将混合物在室温下搅拌1.5小时。加入五十毫升的水。用Et2O(30mL×2)洗涤，除去一些杂质。然后，将水层分离并用1M的HCl溶液调至pH2.3。用EtOAc萃取水溶液3次。合并有机层，用盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。溶剂过滤并蒸发，得到粗产物2-(tBuO)丁酸，其无需经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤3：将DCC(6.5mM，1.31g)加入到80mL含有2-(tBuO)丁酸(1.04g，6.5mM)和N-羟基琥珀酰亚胺(6.5mM，748mg)的乙腈溶液中。将反应混合物在室温搅拌4小时。所得悬浮液过滤，并在真空下浓缩。残余物再溶解于100mL二氯甲烷。依次加入Et3N(13mM，1.81mL)和Fmoc-Lys-OH(6.5mM，2.62g)。将反应混合物在室温下搅拌8小时，然后蒸发，将残余物溶于150毫升水中。调节溶液至pH 2.3。将有机层分离，用EtOAc水层萃取3次。合并有机层，用无水硫酸钠干燥。将残余物通过快速柱色谱法(缓冲液：MeOH/CH2C12＝1/40至1/20)纯化。得到2.5克(75％)的Fmoc-Lys(2-(tBuO)butyryl)-OH。1H NMR(500MHz，氘代氯仿)：δ9.73(s，1H)，7.73(d，J＝7.5Hz，2H)，7.54-7.61(m，2H)，7.36(t，J＝7.5Hz，2H)，7.28(t，J＝7.5Hz，2H)，6.87-6.90(m，1H)，5.85(dd，J＝27.5，9.0Hz，1H)，4.28-4.44(m，3H)，4.15-4.19(m，1H)，3.91-3.94(m，1H)，3.19-3.36(m，2H)，1.38-1.92(m，8H)，1.17(1.15)(s，9H)，0.88(q，J＝7.0Hz，3H)；13C NMR(125MHz，氘代氯仿)：δ175.7，174.6，156.1，143.87(143.86，143.70，143.68)，141.2，127.6，127.0，125.2(125.1)，119.8，75.3(75.2)，73.6(73.5)，67.0，53.6，47.1，38.4(38.4)，31.84(31.2)，29.22(29.16)，27.89(27.87)，27.67(27.66)，22.22(22.18)，9.42(9.36)；IR(KBr)：3404，3336，3065，2973，2936，2875，1718，1632，1538，1451，1338，1255，1192，1107，1081，1057，1005，760，740cm-1；HRMS(m/z)：[M]+calcd.forC29H39N2O6，511.2808；found，511.2787.
采用不同原材料，以类似的方式将Fmoc-Lys((S)-3-(tBuO)isobutyryl)-OH，Fmoc-Lys((R)-3-(tBuO)isobutyryl)-OH，Fmoc-Lys((R)-3-(tBuO)butyryl)-OH和Fmoc-Lys((S)-3-(tBuO)butyryl)-OH，合成Fmoc-Lys((±)-2-(tBuO)butyryl)-OH。Fmoc-Lys((±)-3-(tBuO)isobutyryl)-OH：1H NMR(500MHz，氘代氯仿)：δ9.76(s，1H)，7.72(d，J＝7.5Hz，2H)，7.58(dd，J＝10.0，8.0Hz，2H)，7.35(t，J＝7.5Hz，2H)，7.26(t，J＝7.5Hz，2H)，6.85(t，J＝6.0Hz，1H)，5.91(t，J＝8.0Hz，1H)，4.29-4.41(m，3H)，4.16-4.18(m，1H)，3.38-3.39(m，2H)，3.18-3.30(m，2H)，2.42-2.48(m，1H)，1.47-1.94(m，2H)，1.41-1.53(m，4H)，1.14(s，9H)，1.11(d，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(125MHz，氘代氯仿)：δ176.2(176.1)，174.6，156.2，143.8(143.7)，141.1，127.5，126.9，125.0g(125.05)，119.8，73.6，66.9，63.8(63.7)，53.6，47.0，40.99(40.97)，38.8，31.7，29.0，27.265(27.260)，22.2，14p.0(13.9)；IR(KBr)：3334，3066，2974，2927，2872，1726，1657，1541，1450，1364，1335，1235，1028，876，760，739cm-1；HRMS(m/z)：[M]+calcd.for C29H39N2O6，511.2808；found，511.2791.
Fmoc-Lys((S)-3-(tBuO)butyryl)-OH：1H NMR(500MHz，氘代氯仿)：δ9.23(s，1H)，7.73(d，J＝7.5Hz，2H)，7.58(t，J＝7.5Hz，2H)，7.36(t，J＝7.5Hz，2H)，7.27(t，J＝7.5Hz，2H)，6.87-6.89(m，1H)，5.85(d，J＝8.0Hz，1H)，4.33-4.46(m，3H)，4.16-4.19(m，1H)，4.01-4.07(m，1H)，3.31-3.38(m，1H)，3.12-3.18(m，1H)，2.61(ddd，J＝52.5，14.5，6.5Hz，2H)，1.78-1.95(m，2H)，1.38-1.57(m，4H)，1.15-1.16(m，12H)；13CNMR(125MHz，氘代氯仿)：δ174.6，172.4，156.1，143.9(143.7)，141.2，127.6，126.99(126.97)，125.12(125.09)，119.9，74.7，66.9，65.1，53.6，47.1，45.2，38.9，31.9，28.9，28.2，22.8，22.3；IR(KBr)：3332，3065，2974，2935，2869，1718，1653，1541，1450，1366，1208，1106，1084，1053，989，760，740cm-1；HRMS(m/z)：[M]+calcd.for C29H39N2O6，511.2808；found，511.2787.
Fmoc-Lys(4-(tritylO)butyryl)-OH.步骤1：2.58克4-丁内酯(30mM，2.28mL)和氢氧化钠1.2克(30mM)在30毫升的水中混合，70℃下加热过夜。将透明溶液冷却并浓缩。将所得白色固体悬浮于甲苯中，并进一步浓缩，以除去剩余的水痕量。得到4-羟基丁酸钠几乎定量的产率。
步骤2：4-羟基丁酸钠(1.26g，10mM)和三苯甲基氯(10mM，2.79g)30℃下溶解在30毫升吡啶3天。蒸发溶剂，将残余物溶于乙醚。该醚溶液用氢氧化钠水溶液(4克在250毫升水中)萃取得到。将水溶液调至pH3.0，并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机相用盐水洗涤，并用无水MgSO4干燥。将混合物过滤，过滤液蒸发至干，得到固体产物4-(tritylO)丁酸(1.29克，37％)。
步骤3：二环己基碳二亚胺(3.7mM，760mg)加入到30毫升含有4-(tritylO)丁酸(1.29g，3.7mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.7毫米，425毫克)的二恶烷溶液中。将反应物室温搅拌10小时。将溶液过滤并蒸发至干，残余物再溶于60毫升二氯甲烷。依次加入Et3N(8mM，1.2mL)和Fmoc-赖氨酸-OH(4mM，1.62g)。混合物在室温下搅拌4小时。之后，将150mL水加入到该混合物中，溶液的pH调至2.3。分离有机层，用EtOAc萃取水层。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂，残余物用快速柱色谱法纯化(甲醇/二氯甲烷＝1/30)。得到1.5克粗的Fmoc-Lys(4-(tritylO)butyryl)-OH。质谱结果表明该粗产物含有大于20％的1，3-二环己基脲(DCU)，但是这个纯度足够用于多肽合成。Fmoc-Lys(4-tritylO butyryl)-OH：1HNMR(500MHz，氘代氯仿)：δ8.03(s，1H)，7.69-7.72(m，2H)，7.49-7.57(m，2H)，7.31-7.42(m，7H)，7.23-7.29(m，12H)，5.88(t，J＝5.5Hz，1H)，5.83(d，J＝8.5Hz，1H)，4.28-4.44(m，3H)，4.09-4.20(m，1H)，3.04-3.17(m，4H)，2.28(t，J＝7.5Hz，2H)，1.67-1.94(m，4H)，1.26-1.39(m，4H)；13C NMR(125MHz，氘代氯仿)：δ174.8，174.0，156.2，144.1(144.0)，143.9(143.7)，141.2，128.6(128.5)，127.8(127.7)，127.6，127.03(127.01)，127.98(127.93)，125.15(125.09)，119.9，86.6，67.0，62.5，53.6，47.1，39.0，33.7，31.7，28.9，26.0，22.1；IR(KBr)：3420，3325，3059，2934，2869，1718，1653，1539，1492，1449，1419，1336，1265，1221，1073，760，740，707cm-1；HRMS(m/z)：[M]+calcd.for C44H45N2O6，697.3278；found，697.3268.
结果与讨论
为了寻找可能存在的新的组蛋白标记，我们用HPLC/MS/MS的方法分析了来自HEK293细胞的用胰蛋白酶消化的核心组蛋白。我们对产生的MS/MS数据进行非限制性的序列比对，寻找那些与已知的翻译后修饰的氨基酸有不同质量偏移的氨基酸残基。该分析检测到多个之前未出现过的在赖氨酸残基上有+86.0368Da±0.02Da(同位素质量)质量偏移的组蛋白多肽。这种质量偏移可能是由于一种新的翻译后修饰引起的。我们根据精确的质量偏移来预测这种修饰的化学元素组成(http：//library.med.utah.edu/masspec/ elcomp.htm)，这种修饰最有可能的元素组成为C4H7O2(质量偏移加上一个质子的分子式)。这个分子式有7个可能的异构体结构：3-羟基丁酰基(3ohbu)的R和S亚型(R和S亚型是3-羟基丁酰基组中2种可能的对映异构体)，3-羟基异丁酰基(3ohibu)，R-和S-2-羟基丁酰基(2ohbu)，2-羟基异丁酰基(2ohibu)以及4-羟基丁酰基(4ohbu)(图1a)。
我们用化学方法来确定引起这种质量偏移的异构体结构。我们首先合成了2种组蛋白多肽底物的变体，K+86.0276QLATKacAAR和PEPAK+86.0374SAPAPK，与其他可发生相同质量偏移的7种可能的同分异构体合并。同预期的一样，合成的含有K3ohbu的H2BK5多肽序列PEPAK3ohbuSAPAPK，不论是R型K(R)-3ohbu还是S型K(R)-3ohbu都可以在HPLC/MS分析中被洗脱下来，这是因为对映体不能通过反相液相色谱的非手性柱来分离。同样的，K(R)-3ohbuQLATKacAAR和K(S)-3ohbuQLATKacAAR的混合物共同被洗脱下来，用于后续的洗脱实验。R-3-羟基丁酰辅酶A是一种重要的脂类代谢产物，R-3-羟基丁酸是酮体的重要组成成分，因此我们认为赖氨酸R-3-羟基丁酰化是更为可能的修饰。在本文的其余部分，除非特殊指出，所有的3-羟基丁酰化和赖氨酸3-羟基丁酰化都是指R型，而不是S型。
合成的多肽K3ohbuQLATKacAAR与共同洗脱下来的体内产生的相应多肽K+ 86.0276QLATKacAAR，在HPLC/MS/MS分析中存在相同的裂解方式(图2a，b，和d)。相比而言，体内产生的多肽K+86.0276QLATKacAAR与其他4种合成的相同质量的结构异构体K3ohibuQLATKacAAR，K2ohbuQLATKacAAR(R/S mixture)，K2ohibuQLATKacAAR和K4ohbuQLATKacAAR在HPLC中的停留时间不同。通过同样的方法，我们证实了发生质量偏移的多肽PEPAK+86.0374SAPAPK也是由赖氨酸R-3-羟基丁酰化造成的。总之，我们得出结论，鉴定到的+86Da的质量偏移是由3-羟基丁酰化造成的，而不是其他的结构异构体。
接下来，我们生产了一种针对于R-3-羟基丁酰化(anti-K3ohbu)的泛抗体，利用这种泛抗体来进一步证明赖氨酸的R-3-羟基丁酰化。这种抗体在斑点杂交和竞争性实验中显示出很好的特异性。在免疫染色的HEK293细胞中，该修饰主要存在于细胞核中。用10mM，浓度相当于人类糖尿病酮症酸中毒范围的3-羟基丁酸钠处理细胞，显著的增强了核中赖氨酸3-羟基丁酰化的程度。R-3-羟基丁酸和(R/S)-3-羟基丁酸(20mM)，急剧的诱导HEK293细胞中赖氨酸3-羟基丁酰化，而S-3-hydroxybutyrate(20mM)则不可以，这表明R-3-羟基丁酸是导致R-3-羟基丁酰化的主要底物。全细胞裂解样品的蛋白质免疫印迹分析表明，赖氨酸3-羟基丁酰化存在于大肠杆菌(菌株ME9062)，黑腹果蝇S2细胞，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和HEK293细胞中(图3a)。
由于短链辅酶A是用于多种赖氨酸酰化的辅因子，因此R-3-羟基丁酰基辅酶A也可能是3羟基丁基酰化反应的辅因子。R-3-羟基丁酰化辅酶A可以通过一些代谢途径合成(图1b)。或者，它也可以通过细胞的3-羟基丁酸酯产生，可能是由3-羟基辅酶A合成，这同乙酸和巴豆酸酯转化成其相应的辅酶A衍生物的方法相同。为了验证这一假设，我们首先用10mMR-3-羟基丁酸处理HEK293细胞，再通过蛋白质免疫印迹检测赖氨酸的修饰。我们发现与对照相比，处理过的细胞中赖氨酸赖氨酸3-羟基丁酰化的整体水平有显著的增加。在巴豆酸酯处理的细胞中，赖氨酸3-羟基丁酰化的水平也有略微的增加，这可能是由于巴豆酰辅酶A和3-羟基丁酰辅酶A之间的相互转化导致3-羟基丁酰辅酶A略微增加造成的。这些结果不仅证实了赖氨酸3-羟基丁酰化，同时也意味着3-羟基丁酰辅酶A是赖氨酸3-羟基丁酰化的辅因子，正如乙酰辅酶A和巴豆酰辅酶A分别用于蛋白质赖氨酸的乙酰化和巴豆酰化。
为了确认这种可能性，我们用20mM的同位素标记(R/S)-3-羟基丁酸[2，4-13C2]，随后采用与之前描述类似的HPLC/MS/MS方法分析细胞中组蛋白的多肽。我们发现同位素标记的赖氨酸3-羟基丁酰化多肽具有2道尔顿的附加质量偏移(e.g.，88.0328道尔顿vs86.0276道尔顿在图2c中)。另外，这些多肽与相应的体内衍生以及合成的含赖氨酸3-羟基丁酰化的多肽具有相同的碎裂方式(图2a-c)。总之，我们通过2道尔顿的质量偏移鉴定了30个带有同位素标记赖氨酸3-羟基丁酰化的组蛋白多肽。
3-羟基丁酸是酮体的重要组成成分(图1b)，其浓度在饥饿状态下可以显著增加10倍以上，而在病理条件下可以增加20倍，如I型糖尿病(T1DM)和酒精性肝损伤(高达20mM)。因此，赖氨酸3-羟基丁酰化的水平可能会因3-羟基丁酸的增加而有所改变，反过来又会增强3-羟基丁酰辅酶A的浓度。为了验证这种可能性，我们通过蛋白质免疫印记(WesternBlot)研究来自c57BL6小鼠的肝脏样本中赖氨酸3-羟基丁酰化的丰度，这些小鼠被喂食正常的食物或者被禁食(只提供水)。我们的结果表明与对照组相比，被禁食48小时的小鼠肝脏样本中K3ohbu大幅度的上调(图3b)。这与观察到的被禁食小鼠血液中3-羟基丁酸的浓度(平均为3.5mM，n＝30)是正常对照组平均值(0.5mM，n＝20)的7倍的结果是一致的(-图3d)。与这个结果相一致，饥饿24小时和72小时的小鼠体内赖氨酸3-羟基丁酰化也出现类似的增加状态。
我们进一步研究由链脲霉素(STZ)诱发的I型糖尿病模式小鼠中赖氨酸3-羟基丁酰化的丰度。我们观察到与对照组小鼠相比，链脲霉素处理的小鼠肝脏蛋白(图3c)中赖氨酸3-羟基丁酰化急剧增加。同时我们还发现，注射链脲霉素(200mg/kg体重；图3e)48小时后，患有糖尿病的同窝出生的小鼠血液中血糖和3-羟基丁酸的浓度分别增加了2.4和10倍。因此，在禁食和链脲霉素处理的小鼠中，我们观测到3-羟基丁酸的浓度和赖氨酸3-羟基丁酰化的水平协同增加。
组蛋白标记物有助于表观遗传学机理研究，在各种病理学的研究过程中有着关键的作用。为了定位含有赖氨酸3-羟基丁酰化的重要的组蛋白标记物，我们选取了禁食48小时或者用链脲霉素处理过小鼠肝脏细胞中的HEK293细胞，并用10mM R-3-羟基丁酸对HEK293细胞中的核心组蛋白处理后胰酶酶解的肽段进行了分析。同时，我们鉴定到45个组蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化位点，其中包括38个组蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化位点来自于3-羟基丁酸处理的HEK293细胞(图4a)，21个组蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化位点来自于饥饿状态小鼠肝脏(图4a)，和16组蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化位点从链脲霉素处理过的患有糖尿病的小鼠肝脏(图4a)，在小鼠肝脏细胞已鉴定到27个赖氨酸3-羟基丁酰化位点中鉴定到11个位点同时存在于链脲霉素处理的糖尿病小鼠和饥饿状态的小鼠肝脏中。
在一个广泛的，细胞规模上对赖氨酸3-羟基丁酰化底物鉴定可以揭示这种修饰的范围以及这种修饰调控的原理。此外，底物数据库的发展会为研究赖氨酸3-羟基丁酰化非染色质功能奠定基础，正如研究赖氨酸乙酰化历史所证明的那样。基于这个目的，我们通过系统分析方式鉴定在HEK293细胞中含有赖氨酸3-羟基丁酰化的非组蛋白的底物。用胰酶酶解10mg的细胞裂解物，然后通过常规的HPLC分成20个组分，用抗赖氨酸3-羟基丁酰化的抗体亲和富集酶解的赖氨酸3-羟基丁酰化肽段，然后通过HPLC-MS/MS分析。我们在HEK293细胞中鉴定到了3232非冗余的赖氨酸3-羟基丁酰化位点，并且这些位点的假阳性概率小于1％。之后我们采用严格的筛选条件进一步提高我们鉴定的质量。我们删除了Maxquant肽段打分低于60和位点存在机率小于0.9的鉴定位点所有鉴定到的肽段。最终数据库从1359个蛋白中鉴定到了3008个非冗余的赖氨酸3-羟基丁酰化位点(3156个基于基因的位点)。这些肽段的平均质量误差为0.069ppm，标准偏差为0.70ppm。
Gene ontology(GO)功能注释分析表明含有赖氨酸3-羟基丁酰化蛋白质组明显定位于细胞核(7.2E-192)，细胞内腔(2.5E-174)，细胞质基质的核糖体(1.8E-22)以及线粒体基质(2.4E-12)(图4，b和c)。在与翻译和新陈代谢过程相关的各种蛋白中，像核酸的新陈代谢(1E-130)，基因表达(1.0E-97)，高分子配合物组织(5.0E-41)，染色质修饰(1.2E-40)，以及DNA修复(1.6E-31)，赖氨酸3-羟基丁酰化的丰度很高。KEGG pathway富集分析表明HEK293细胞中含有赖氨酸3-羟基丁酰化蛋白质组明显富集在16种复合物或通路中，包括剪接体(7.2E-43)，核糖体(2.5E-19)，RNA运输(2.0E-11)，核苷酸切除修复(1.3E-8)以及线粒体中脂肪酸的延长(2.3E-3)。当蛋白质蛋白质之间相互作用图是由赖氨酸3-羟基丁酰化蛋白质间构成时，剪接体和核糖体便很容易形成赖氨酸3-羟基丁酰化的复合物。对赖氨酸3-羟基丁酰化位点附近的序列进行分析，结果显示在-1和+3位分别有较多的丝氨酸和脯氨酸，在+2位则有丙氨酸和甘氨酸(图4d)，这种模式与见过的赖氨酸乙酰化不同。
为了鉴定含有多个赖氨酸3-羟基丁酰化位点的高分子复合物，我们用CORUM数据库对化合物富集进行了分析并在含有赖氨酸3-羟基丁酰化亚结构单元中占有重要比例中成功鉴定到了70个以上的复合物这些化合物中的大多数存在于转录过程和RNA通路中，包含有剪接体(3.5E-124)，核糖体(7.0E-59)，抗-HDAC2复合物(1.64E-27)，ALL-1超复合物(1.9E-24)，大型的Drosha复合物(3.6E-23)，LSD1复合物(2.8E-17)及MeCP1复合物(1.3E-17)。
3-羟基丁酸主要是处于比如饥饿或在葡萄糖不足产生的初期的生理条件时，由肝脏中的脂肪酸的氧化而成。当胰岛素的信号通路受阻时，如1型糖尿病，机体也会发生酮病。当处于饥饿期间，酮体对于乙酰辅酶的产生是非常重要的，这是为大脑和其他组织(比如，心脏或骨骼肌)提供代用能源的一种方式。考虑到3-羟基丁酸和赖氨酸3-羟基丁酰化水平的动力学性质，赖氨酸3-羟基丁酰化通过表观遗传重编程和调控细胞中蛋白质的功能而充当细胞适应能量来源发生改变时(比如从葡萄糖转变为脂肪)的一种机制。最新证据表明一些KDACs酶具有很微弱的去乙酰化功能或者比去乙酰化强的其他功能。这就可能说明任何KDACs酶可以催化3-羟基丁酰化脱去，从而实现调控细胞新陈代谢。
多个证据表明3-羟基丁酸具有多种作用而不仅仅是简单的供能。3-羟基丁酸已经成功用于癫痫病的治疗。3-羟基丁酸同时也被证实具有治疗多种神经退行性疾病的潜能，例如老年痴呆症，帕金森病，外伤性脑损伤，局部缺血症以及肌肉萎缩性侧索硬化症。在细胞水平上，3-羟基丁酸被发现于调节精子能动性的，信号通路受体，和自噬以及调控与“多能性”癌细胞的全谱基因表达。不仅如此，3-羟基丁酸是在细胞核内发挥这些功能的分子机制。因此，赖氨酸3-羟基丁酰化途径的发现说明了一种研究不同R-3-羟基丁酰化生理功能和它药理学重要性的新方向。
当涉及一种可测值比如数量，百分比等等，而这些又无法避免的含有±20％或±10％，甚至好一点的±5％，也甚至是±1％和±0.1％的变化，同时这些变化都是合理的时，我们用“大约”这个词指代。
所有的文件，书籍，手册，论文，专利，出版的专利申请书，指南，合同及其他参考文献通过引用结合到本文中。这个发明在此公开的实施方式从说明和实践来说对于本领域技术人员是显而易见的。这些说明和例子希望仅被看作典范，本发明的真正适用范围及精神将通过以下阐述进行说明。
表1.用10mM R-3-羟基丁酸钠处理了72小时的HEK293细胞中鉴定到的组蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化位点多肽的列表。K(3ohbu)″和″K(ac)″分别表示3-羟基丁酰化的和乙酰化的赖氨酸。
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表2.下表是从处于48小时饥饿状态下的C57BL/6雌性小鼠肝脏或用链脲霉素(200mg/kg体重)处理48小时C57BKS/J db/db雌性小鼠肝脏中鉴定到的组蛋白赖氨酸3-羟基丁酰化位点列表。″K(3ohbu)″and″K(ac)″分别表示3-羟基丁酸化的和乙酰化的赖氨酸。
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Claims (6)

1.一种制备赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂的方法，其特征在于：包括使用包含3-羟基丁酰化的赖氨酸的多肽去筛选蛋白文库。
2.一种制备赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂的方法，其特征在于：包括使用包含3-羟基丁酰化的赖氨酸的多肽去免疫宿主。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
其中“K(3ohbu)”表示3-羟基丁酰化的赖氨酸，“K(ac)”表示乙酰化的赖氨酸，并且“M(ox)”表示氧化的甲硫氨酸。
4.一种在蛋白或其片段中检测3-羟基丁酰化的赖氨酸的方法，该方法包括：
(a)使所述蛋白或其片段与通过权利要求1-3中任一项的方法制备的赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂接触，从而所述赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂与所述蛋白或其片段形成结合复合体，并且
(b)检测所述结合复合体，其中所述结合复合体的存在表明在所述蛋白或其片段中存在3-羟基丁酰化的赖氨酸。
5.权利要求4所述的方法，其中所述赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂是一种蛋白。
6.权利要求4所述的方法，其中所述赖氨酸3-羟基丁酰化特异性亲和试剂是一种抗体。
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