JP2000502097A

JP2000502097A - タンパク質合成の制御、および作用薬のスクリーニング法

Info

Publication number: JP2000502097A
Application number: JP09522599A
Authority: JP
Inventors: フィリップ、コーヘン; ダリオ、アーレッシ; ダーレン、クロス
Original assignee: University of Dundee
Current assignee: University of Dundee
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2000-02-22
Also published as: CA2241080A1; AU1200497A; WO1997022360A2; WO1997022360A3; EP0868195A2

Abstract

(57)【要約】キナーゼＧＳＫ3 およびＰＫＢの活性に影響を与え得る作用薬をスクリーニングする方法が開示されている。この方法は、２つのアミノ酸上特にＰＫＢ分子上のＰＫＢのリン酸化を評価することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質合成の制御、および作用薬のスクリーニング法本発明はグリコーゲン代謝およびタンパク質合成の制御、特にインスリンの利用を通してのものに関する。糖尿病患者の多くは血液中のインスリンレベルは正常であるが、そのインスリンが筋細胞および脂肪細胞を正常に刺激しない（タイプＩＩ糖尿病）。最近ではインスリンが筋細胞および脂肪細胞にシグナルを送る機構に故障があると信じられている。インスリンによるグリコーゲン（Parkerら、1983）およびプロテイン（Welsh ら、1993）合成の制御、転写因子ＡＰ−１およびＣＲＥＢ（Nikolakiら、deGroo t ら、1993 および Fiolら、1994）の調節、キイロショウジョウバエ（Drosoph ila）の細胞運命仕様書（Siegfiedら、1992）およびツメガエル（Xenopus）胚中の背腹のパターニング（Heら、1995）を包含する、幾つかの生理学的プロセスの調節には、酵素グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ3 ）（Embiら、1980 ）が関与している。ＧＳＫ3 は、インスリンまたは成長因子（Welshら、1993、H ughesら、1994、Cross ら、1994およびSaito ら、1994）に応答するセリンリン酸化により、およびＭＡＰキナーゼで活性化されたプロテイン（ＭＡＰＫＡＰ）キナーゼ−１（ｐ９０^rakとしても知られる）またはｐ７０リボソームＳ6 キナーゼ（ｐ７０^S6K）（Sutherlandら、1993、およびSutherlandら、1994）によりi n vitro で阻害される。しかし本発明者らは、インスリンによるＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１およびｐ７０^S6K両者の活性化を阻止する作用薬（agent）がＧＳＫ3 のリン酸化および阻害を in vivo でブロックしないことを見いだした。インスリン刺激された他の１つのプロテインキナーゼがこれらの条件下でＧＳＫ3 を不活性化し、発明者らはこのものがプロト腫瘍遺伝子Ａｋｔ（ＲＡＣまたはＰＫＢとしても公知；ここでは”ＰＫＢ”と呼称する）の産物であることを実証している。ＧＳＫ3 はＰＫＢαの活性化の場合の半期（１分）より僅かに遅い、半期（ha lf time）２分でインスリンに応答して阻害される。インスリンによるＧＳＫ3 の阻害は、結果として in vitro でのＰＫＢαにより標的にされる同じセリン残基（セリン２１）におけるリン酸化を引き起こす。ＰＫＢαの活性化同様にインスリンによるＧＳＫ3 の阻害は、ホスフアチジルイノシトール（ＰＩ−３）キナーゼ阻害剤ワートマンニン（wortmannin）により、およびＬＹ２９４００２により阻止される。ＧＳＫ3 のこの阻害は、インスリンによるグリコーゲン合成（Cr oss ら、1994）の速度向上および、ある種ｍＲＮＡｓのインスリンによる翻訳速度向上に寄与するらしい（Welsh ら、1994）。ＰＫＢα（Coffer ＆ Woodgett,1991）、ＰＫＢβ（Cheng ら、1992）、およびＰＫＢγ（Konishi ら、1995）と呼称するＰＫＢの２つのイソ型（isoform）が確認され、特性付けられている。ＲＡＣβおよびＡｋｔ−２とも呼称されるＰＫＢβは、著しく多数の卵巣がん（Cheng ら、1992）および膵臓がん（Changら、1996）中に過剰発現され、また乳がん上皮細胞ラインＭＣＦ７中に過剰発現される。ＰＫＢはＮ末端 pleckstrin 相同（ＰＨ）領域、続いて触媒領域および短いＣ末端尾部からなる。この触媒領域はサイクリックＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ、６５％類似性）およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ、７５％類似性）に非常に似ている。これらの発見は、いわゆるＰＫＢ（すなわちＰＫＡとＰＫＣとの間）およびＲＡＣ（ＡおよびＣキナーゼに関係する）という２つの呼称の原因になっている。多くの成長因子は、ＰＩ４，５−ビスホスフエート（ＰＩＰ２）をその推定第２メッセンジャーＰＩ３，４，５−トリホスフエート（ＰＩＰ３）に転化する酵素ホスフアチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼの活性化の引き金となり、そしてＰＫＢはＰＩ３−キナーゼの下流に在る（Frankeら、1995）。ＰＫＢαは、細胞がＰＤＧＦ（Frankeら、1995）、ＥＧＦまたは塩基性ＦＧＦ（Burg ering ＆ Coffer、1995）またはインスリン（Cross ら、1995および Kohnら、19 95）またはペルペルバナジン酸塩（Andjelkovic ら、1996）により刺激される際に約１分の半期で不活性型から活性型へと転化される。インスリンまたは成長因子によるＰＫＢの活性化は、細胞がＰＩ３−キナーゼ（wortmanninまたはＬＹ２９４００２）の阻害剤と共に前保温された場合、またはＰＩ３−キナーゼの優性ネガテイブ突然変異体の過剰発現（Burgering ＆ Coffer、1995）により阻止される。またリン酸化に際してＰＩ３−キナーゼに結合するＰＤＧＦ受容体中のチロシン残基の変異もＰＫＢα活性化を阻止する（Burgering ＆ Coffer、1995 および Franke ら、1995）。かくして本発明は、例えばタイプＩＩ糖尿病の治療；また卵巣がん、乳がんおよび膵臓がん等のがんの治療に際して、特にグリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成が異常を示す疾病状態において、特にグリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成を調節する目的でのＰＫＢ、その類似体、イソ型（isoform ）、阻害剤、賦活剤（activator）および／またはそれらの機能的同等物の使用を提供するものである。かかる作用薬を含む組成物も本発明の範囲に包含され、またグリコーゲン代謝および／またはプロテイン合成が異常を示す疾病状態の治療目的に対するかかる組成物の使用も本発明の範囲に包含される。また本発明は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ｓｅｒ−／Ｔｈｒ−Ｈｙｄ［ここでＸａａはいずれか（任意）のアミノ酸、ＹａａおよびＺａａはいずれかのアミノ酸（好ましくはグリシンではなく）、およびＨｙｄはＰｈｅもしくはＬｅｕ等の大きな疎水性残基である］を含む新規ペプチド、またはその機能的同等物を提供する。一文字コードで表示すると、適当なペプチドはＲＸＲＸ’Ｘ’ Ｓ／ＴＦ／Ｌ［ここでＸ’はいずれかのアミノ酸でありうるが、好ましくはグリシンではなく；グリシンは実際には使用可能であるが、他のアミノ酸が好ましい］で表示される。典型的ペプチド中には、ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ、ＲＰＲＡＡＴＣまたはこれらの機能的同等物が包含される。このペプチドはＰＫＢ活性を測定するための基質である。本発明は、ＰＩＰ3 またはＰＩ3,4 −ビスＰでその相互作用を阻止することにより in vivo でＰＫＢの活性化を阻害する物質のスクリーニング方法も提供する。このように本発明は、ＰＫＢの活性もしくは活性化に影響を与える物質の能力の測定方法も提供し、この方法は、物質をＰＫＢおよびホスフアチジルイノシトールポリホスフエート（すなわちＰＩＰ3 、ＰＩ3,4−ビスＰ等）に曝露し、かつＰＫＢとホスフアチジルイノシトールポリホスフエートとの間の相互作用を測定することを含む。ＰＫＢとホスフアチジルイノシトールポリホスフエートとの間の相互作用は、例えばラジオラベル³²ＰのＰＩＰ3 （例えば）からＰＫＢへの移転の測定により、および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＫＢの（好ましくはＴ３０８および／またはＳ４７３における）リン酸化状態の評価により便利に測定できる。また本発明の方法は、ＧＳＫ3 の賦活剤または阻害剤を確認するためにも使用でき、かかる方法は試験する物質をＧＳＫ3 および（任意に）リン酸化源に曝露し、ＧＳＫ3 の活性化状態を（任意にそのリン酸化状態を測定することにより）測定することを含む。本発明のこの局面は、糖尿病、がん、またはタンパク質合成もしくはグリコーゲン代謝の不規則性を伴う任意の疾病と闘うのに使用するための試験物質の適合性を決定するのに有用でありうる。本発明は、ＰＫＢのリン酸化を触媒する酵素の阻害剤または賦活剤のスクリーニング方法も提供し、この方法は試験する物質を次の −ＰＫＢ上流の１つまたは２つ以上の酵素； −ＰＫＢ；および（任意に） −ヌクレオシドトリホスフエートに曝露し、Ｔ３０８および／またはＳ４７３上でＰＫＢがリン酸化されているかどうか（および任意にその程度）を測定することを含む。本発明はまた、ＧＳＫ3 の活性に影響し得る作用薬の識別方法を提供し、この方法は次の：ａ．試験物質をＧＳＫ3 の基質に曝露し；ｂ．上記ペプチドがリン酸化されているかどうか（および任意にその程度）を検出する；ことを含む。試験する物質はＰＫＢの類似体、イソ型、阻害剤、または賦活剤であってよく、また上記方法はＰＫＢ自体を刺激または阻害するこれら作用薬を識別するために修飾してもよい。このように、上記方法は次の工程を含むことができる：ａ．試験する物質をＰＫＢ含有試料に曝露して混合物を形成し；ｂ．上記定義のアミノ酸配列を含むペプチドまたはその機能的同等物に上上記混合物を曝露し（通常はＭｇ²⁺およびＡＴＰの存在下で）；ｃ．上記ペプチドがリン酸化されているかどうか（および任意にその程度）を検出する。この局面において本発明の方法は、試験する物質がＰＫＢに作用、または直接ＧＳＫ3 に作用するかどうかの決定に使用できる。これはペプチドおよびＰＫＢのリン酸化状態を比較することにより行なうことができ；もしＧＳＫ3 のリン酸化状態が変化しても、ＰＫＢの状態が変化しなければ、試験する物質はＰＫＢに作用することなくＧＳＫ3 に直接作用する。本発明のさらなる局面では、ヒトまたは非ヒト動物身体（好ましくは哺乳類）の治療方法を提供し、この方法はＰＫＢ、その類似体、阻害剤、刺激剤またはその機能的同等物を上記身体に投与することからなる。上記方法は、治療した身体中でのグリコーゲン代謝の調節に影響を与える。本発明の治療方法は、タイプＩＩ糖尿病の治療に特に有用である（ここではＰＫＢの作用によるＧＳＫ3 活性のダウンレギユレーションが強化されるようにＰＫＢの賦活剤が利用されることが望ましい）。別法として本発明の治療の方法は、卵巣がん等のがんの治療にも特に有用である（ここではＰＫＢの作用によるＧＳＫ3 のダウンレギユレーションが弱められるようにＰＫＢの阻害剤が使用されるのが望ましい）。ＰＫＢおよび／またはＧＳＫ3 活性の不規則性に付随する膵臓がん、および乳がん等の他のがんもこの方法により治療できる。インスリンでＰＫＢを刺激すると５分以内に活性が１２倍も増加し、Ｔｈｒ− ３０８およびＳｅｒ−４７３におけるリン酸化を誘発する。細胞中へ過渡的にトランスフエクションされたＰＫＢはインスリンに応答して２０倍も活性化され、かつＩＧＦ−１に応答して４６倍も活性化されることができ、またＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３でリン酸化されるようになった。ＰＫＢの活性化、およびＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３両方でのそのリン酸化はホスフアチジルイノシトール（Ｐ１）３−キナーゼ阻害剤 wortmannin により阻止され得る。スレオニン３０８およびセリン４７３のリン酸化は、ＰＫＢの活性化するのに相乗的に作用する。Ｓｅｒ−４７３におけるＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２−リン酸化ＰＫＢは invit ro で活性を７倍増加させ、効果はＳｅｒ−４７３をＡｓｐへ変異させるとき（５倍活性化）に類似している。Ｔｈｒ−３０８のＡｓｐへの変異もＰＫＢ活性を５倍増加させ、引き続くＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２によるＳｅｒ−４７３のリン酸化は活性をさらに５倍刺激し、この効果はＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ− ４７３の両方をＡｓｐへ変異させるとき（１８倍活性化）に類似している。Ａｓｐ−３０８／Ａｓｐ−４７３二重突然変異体の活性は完全リン酸化酵素の活性と類似しており、かつインスリンによってはそれ以上の活性化はできなかった。Ｔｈｒ−３０８のＡｌａへの変異は、インスリンまたはＩＧＦ−１による２９３細胞の刺激後は、Ｓｅｒ−４７３においてトランスフエクションされたＰＫＢのリン酸化を阻止しなかったが、ＰＫＢの活性化を廃止した。同様に、Ｓｅｒ−４７３のＡｌａへの変異はＴｈｒ−３０８においてトランスフェクションされたＰＫＢのリン酸化を阻止しなかったが、トランスフエクションされたＰＫＢの活性化を著しく低減した。このことは、インスリンまたはＩＧＦ−１によるＰＫＢの活性化は結果としてＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３のリン酸化から起こること、および両残基のリン酸化は in vitro または in vivo で高レベルのＰＫＢ活性を生じさせるのに好ましいことを実証している。また、in vivo におけるＴｈｒ−３０８のリン酸化はＳｅｒ−４７３のリン酸化には依存せず、逆もまた同じであり、Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３のリン酸化は両方共にＰＩ３−キナーゼ活性に依存すること、およびＴｈｒ−３０８リン酸化もＳｅｒ− ４７３リン酸化もいずれもＰＫＢ自体により触媒されないことを暗示している。このように本発明では、例えばインスリン、wortmannin その他のＰＩ３− キナーゼ阻害剤のような、アミノ酸３０８および／または４７３におけるＰＫＢのリン酸化に影響を与える任意の作用薬の使用を組み入れることが好ましい。アミノ酸３０８および／または４７３においてそれ自体が変更された（例えばリン酸化および／または突然変異により）ＰＫＢの使用も適当である。本発明方法の変形ではＰＫＢの剌激または阻害を、ＰＫＢ自体上のアミノ酸３０８および／または４７３のリン酸化状態をモニターすることにより評価できる。ＰＫＢの異なったイソ型、例えばＰＫＢα、βまたはγは本発明では使用可能であり、目標にされ得る。次に本発明を実施例および図面を参照しながらさらに詳細に説明するが、これらの実施例は説明目的で記載したものであって、本発明の制限を意図するものではない。実施例１：ＰＫＢはＧＳＫ3 活性に影響を及ぼす。図１：ａ、Ｌ6 筋管を２ｍＭ８−ブロモサイクリック−ＡＭＰ（８Ｂｒ− ｃＡＭＰ）と共に１５分間、次いで０．１μＭインスリンと共に（５分間）保温（incubated）した。両ＧＳＫ3 イソ型は、溶解物（lysate）から共免疫沈降させ、ＰＰ2 Ａ（Cross ら、1994）を用いた再活性化の前（黒バー）後（白バー）で評価した。無刺激細胞における活性との対比で結果を示すと、０．０８±０ .００６Ｕｍｇ^-1（ｎ＝１０）であった。ｂ、C、インスリン（０．１μＭ）によるＧＳＫ3 の阻害はラパマイシン（０．１μＭ）およびＰＤ９８０５９（５０μ Ｍ）により影響されないが、ＬＹ２９４００２（１００μＭ）により阻止される。ｂ、ＬＹ２９４００２との１５分間の前保温を伴う場合（充填三角）と伴わない場合（充填丸）について、Ｌ6 筋管を表示時間インスリンで刺激し、次いでａにおけるようにＧＳＫ3 を測定した。ＧＳＫ3 を、ＰＰ2 Ａによる再活性化後に評価した場合（Cross ら、1994）の、インスリン刺激した細胞からの実験をオープン丸で示す。ｃ、インスリンでの刺激に先立ってラパマイシン（三角）またはラパマイシンプラスＰＤ９８０５９（丸）と共に細胞を保温し、次いでＰＰ２Ａによる前処理前（充填記号）および前処理後（オープン記号）に、ａにおけると同様にＧＳＫ 3 活性を測定した。ｄ、ｅ、Ｌ6 筋管を８Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１５分間）、ＰＤ９８０５９（６０分間）もしくはＬＹ２９４００２（１５分間）、次いでａ−ｃにおけると同様にインスリン（５分間）と共に保温した。各酵素を溶解物からの免疫沈降後に評価し、得られた活性に関してその結果を示す。インスリンが存在し、かつ８Ｂｒ−ｃＡＭＰが不在の場合、それは０．０４±０．００５Ｕｍg^-1（ｐ４２ＭＡＰキナーゼ、ｎ＝６）および０．０７１±０．００４Ｕｍｇ^-1（ＭＡＰＫＡＰＫｉｎａｓe^-1、ｎ＝６）であった。すべての結果（±ｓ．ｅ．ｍ．）は少なくとも３回の実験結果による。Ｌ6 細胞の単層を培養し、刺激し、次いで前記（Cross ら、1994）のように溶解した。次いでｐ４２ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ１または（ＧＳＫ3 −αプラスＧＳＫ3 −β）を溶解物から免疫沈降させ、前記（Cross ら、19 94）のように特定プロテインまたはペプチド基質を用いて評価した。プロテインキナーゼ活性の１単位は、１分間に基質１ｎｍｏｌのリン酸化を触媒する量であった。表示のように、免疫沈降物中のＧＳＫ3 はＰＰ2 Ａで再活性化された（Cr oss ら、1994）。図２インスリン剌激された、wortmannin 感受性でＰＤ９８０５９／ラパマイシン不感受性の、Ｌ6 筋管中のクロスチド（Crosstide）キナーゼとしてのＰＫＢの確認ａ．５０μＭＰＤ９８０５９（１時間）および０．１μＭラパマイシン（１０分間）と共に細胞を保温し、次いで０．１μＭインスリンで刺激（５分間）し、溶解（Cross ら、1994）した。この溶解物（０．３ｍｇタンパク質）をＭｏｎｏＱ（５×０．１６ｃｍ）上でクロマトグラフイーし、画分（０．０５ｍｌ）の Crosstide キナーゼを評価した（充填丸）。別途実験ではインスリンを省略（オープン丸）、またはインスリンの１０分前に wortmannnin （０．１μ Ｍ）を添加した（充填三角）。破線はＮａＣｌ勾配を示す。６回の実験で同様の結果が得られた。ｂ．ａからプールした画分（１０μｌ）３１−３４（レーン１）、３５−３８（レーン２）、３９−４２（レーン３）、４３−４５（レーン４）、４６−４９（レーン５）および５０−５３（レーン６）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、Ｃ末端抗−ＰＫＢα抗体で免疫ブロッテイングした。マーカープロテインが示されている。画分１−３０または５４−８０中には免疫反応性種はなんら存在しなかった。ｃ．抗−ＰＨ領域抗体を用い、前記（Lazar ら、1995）と本質的同様にして０．１μＭインスリン、および溶解物（５０μｇプロテイン）から免疫沈降させたＰＫＢを用いてＬ6 筋管を刺激し、次いで Crosstide キナーゼ（オープン丸）を評価した。対照実験ではインスリン刺激の前に、０．１μＭラパマイシンプラス５０μＭＰＤ９８０５９（オープン三角）もしくは２ｍＭ８Ｂｒ−ｃＡＭＰ（オープン四角）、または０．１μＭ wortmannin （充填丸）もしくは１００μＭＬＹ２９４００２（充填三角）と共に筋管を保温した。ｄ．ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１を溶解物から免疫沈降し、かつＳ6 ペプチド（充填丸）で評価した以外はｃに準拠。対照実験ではインスリン剌激に先立って、０．１μＭラパマイシンプラス５０μＭＰＤ９８０５９（充填三角）と共にまたは２μＭ８ＢＲ−ｃＡＭＰ（オープン丸）と共に細胞を保温した。ｃおよびｄでは、誤差バーは３回の測定を示し、かつ別個３回の実験で類似の結果が得られた。同じく緩衝液が１ｍＭＥＧＴＡ、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００を含有する以外は前記（Bu rgering ら、1995）に従ってＭｏｎｏＱクロマトグラフイーを遂行した。２つのＰＫＢα抗体をウサギ中でＣ末端ペプチドＦＰＱＦＳＹＳＡＳＳＴＡに対して生起させ、バクテリアによってＰＫＢαのＰＨ領域を発現させた。このＣ−末端抗体をアフイニテー精製した（Jones ら、1991）。クロスチド（Crosstide）に対するＰＫＢの活性はヒストンＨ２Ｂに対する活性より３倍高く、かつ以前ＰＫＢ評価に用いた基質であるミエリン（myelin）塩基性タンパク質に対するその活性よりも１１倍も高い。他の実験詳細およびプロテインキナーゼ活性の単位を図１に示す。図３ＧＳＫ3 は、インスリン刺激したＬ6 筋管からのＰＫＢにより不活性化される。ａ．０．１μＭインスリン、および細胞溶解物１００μｇから免疫沈降させたＰＫＢと共に細胞を５分間刺激し、前記（Sutherlandら、1993およびSutherla ndら、1994）と本質的同様にＧＳＫ3 イソ型の不活性化に用いた。黒バーはＭｇＡＴＰおよびＰＫＢと共に保温後に測定したＧＳＫ3 活性を、ＰＫＢ省略の場合の対照保温において得られた活性の百分率で示す。ＰＫＢが存在しない場合、ＧＳＫ3 活性は実験を通じて安定であった。白色バーは、ＰＰ２ＡでＧＳＫ3 を再活性化後に得られた活性を示す（Embiら、1980）。インスリン省略の場合、またはインスリンの１０分前に wortmannin （０．１μＭ）を添加した場合、または免疫沈降に先立ってペプチド免疫原（０．５ｍＭ）と共に抗−ＰＫＢ抗体を保温した場合には、ＧＳＫ3 の不活性化はなんら生起しなかった。結果（±ｓ．ｅ．ｍ．）は３実験（各実験は３回の繰り返し）の場合である。ｂ．ＨＡ−ＰＫＢαによるＧＳＫ3 −βの不活性化。ＨＡ−ＰＫＢαをコードする相補ＤＮＡがＣＯＳ−１細胞中にトランスフエクションされ、０．１ｍＭペルバナジン酸ナトリウムで１５分間刺激後、標識プロテインキナーゼを溶解物０．３ｍｇから免疫沈降し、ＧＳＫ3 −βおよびＭｇＡＴＰと共に２０分間保温した。対照実験では、ペルバナジン酸塩が省略されるか、またはベクター（模擬翻訳）により野生型（ＷＴ）ＰＫＢαが置換されるか、もしくはＬｙｓ１７９がＡｌａへ変異されたＰＫＢαのキナーゼ−不活性変異体（Ｋ１７９Ａ）により野生型（ＷＴ）ＰＫＢαが置換された。３回の別個の実験でも同様の結果が得られた。各免疫沈降物中のＷＴおよびＫ１７９Ａ−ＰＫＢ αの濃度は各トランスフエクションで類似していた。ａでは、ＧＳＫ3 −αおよびＧＳＫ3 −βは部分精製され、評価され、ＰＫＢで不活性化され、かつ前記（Sutherlandら、1993および Sutherland ら、1994）のようにウサギ骨格筋からのＰＰ２Ａにより再活性化された。ＰＰ２Ａの前にok adaic acid（２μＭ）を添加した対照実験ではなんらの再活性化も起こらなかった。図４： in vitro で、かつＬ6 筋管中のインスリンに応答してＰＫＢでリン酸化されたＧＳＫ3 中の残基の確認。ａ．ＰＫＢおよびＭｇ−［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとの保温によりＧＳＫ3 −βを最大限に不活性化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、³²ＰラベルＧＳＫ3 −β（Ｍ_r ４７K ）をトリプシン¹¹で消化し、さらにＣ₁₈カラム（Sutherland ら、1993）上でクロマトグラフィーに処した。画分（０．８ｍl）の³²Ｐ放射能を分析（オープン丸）した。対角線はアセトニトリル勾配を示す。ｂ．ａ（４００ｃ．ｐ．ｍ．）からの主要ホスホペプチドを固相配列決定（Su therlandら、1993）に処し、エドマン分解の各サイクル後に放出された³²Ｐ−放射能を示す。ｃ．ＧＳＫ3 −αおよびＧＳＫ3 −βを³²Ｐラベル細胞の溶解物から共−免疫沈降させ、ＳＤＳ中で変性し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに処し、ニトロセルロースへ移転し、次いでオートラジオグラフイー（Saito ら、1994）にかけた。レーン１− ３は未刺激細胞から免疫沈降させたＧＳＫ3 イソ型；レーン４−６はインスリン刺激した細胞から免疫沈降させたＧＳＫ3 イソ型。ｄ．ｃからのＧＳＫ3 イソ型をトリプシン消化し、生成ホスホペプチドを等電点電気泳動（Saito ら、1994）により分離し、次いでオートラジオグラフイーにより確認した。レーン１およびレーン４は、それぞれＰＫＢおよびＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１によるＧＳＫ3 −βの in vitro でのリン酸化由来の主要ホスホペプチドを示し；レーン２およびレーン５は未剌激細胞から免疫沈降させた、ＧＳＫ3 −βおよびＧＳＫ3 −αから得られたホスホペプチドを示し；レーン３およびレーン６は０．１μＭインスリンで５分間刺激した細胞から免疫沈降させた、ＧＳＫ3 −βおよびＧＳＫ3 −αから得られたホスホペプチドを示し；矢印はリン酸化がインスリンにより増強されたペプチドを示す。２つのマーカー、すなわちパテントブルー（２．４）およびアズリン（５．７）のＰＩ値を示す。ａでは、インスリン刺激したＬ6 筋管の溶解物（０．５ｍｇプロテイン）からのＣ末端抗体を用いてＰＫＢαを免疫沈降させ、ＧＳＫ−β¹²のリン酸化に用いた。ｃでは、Ｌ6 筋管の径１０ｃｍ皿３枚をＨＥＰＥＳ−緩衝塩水中で４時間保温した（Cross ら、1994）。この緩衝食塩水は、５０μＭＰＤ９８０５９、１００ｎＭラパマイシン、およびインスリン（０．１μＭ）もしくは緩衝液で５分間刺激した１．５ｍＣＩｍ１^-1 ³²Ｐ−オルトホスフエート、および図１の溶解物から共−免疫沈降させたＧＳＫ3 イソ型を含有する。論議Ｌ6 筋管中のインスリンにより誘発されたＧＳＫ3 の阻害（図１ａ−ｃ）は、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１［８−ブロモ−サイクリックＡＭＰ、またはＰＤ９８０５９（Alessiら、1995）、（図１ｄ、ｅ）］および／またはｐ７０^S6K［ラパマイシン（Kuo ら、1992）（Cross ら、1994）の活性化を阻止した作用薬によっては影響されなかつた。このことはＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１またはｐ７０^S6K のいずれも、このプロセスとって必須ではないことを暗示している。しかし、ホルボール（phorbol）エステル処理（Stambolic ら、1994）後のＧＳＫ3 −βのリン酸化と阻害はＨｅＬａＳ3 細胞中でのＭＡＰＫＡＰキナーゼ１との共発現により強化されるのに対して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＧＳＫ3 −αおよびＧＳＫ３−β（Saito ら、1994）のＥＧＦ誘発阻害はＭＡＰキナーゼキナーゼ−１の優勢ネガテイブ変異体の発現により著しく弱められる（Elgar ら、1995）。したがって古典的ＭＡＰキナーゼ経路の賦活剤としてはインスリンより遥かに強力なアゴニストによるＧＳＫ3 の阻害をＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１が仲介する可能性がある。ラパマイシンおよびＰＤ９８０５９の存在下でＧＳＫ3 を阻害する、インスリン刺激したプロテインキナーゼを識別するために、Ｌ6 筋管を両化合物と共に保温し、インスリン刺激した。次いで溶解物をＭｏｎｏＱ上でクロマトグラフイーにかけ、この画分をクロスチド”Crosstide”（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）を用いて評価した。このクロスチドはＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１およびｐ７０^S6K ［ＧＳＫ3 −α中のＳｅｒ−２１（Sutherlandら、1994）およびＧＳＫ3 −β中のＳｅｒ−９（Sutherlandら、1994）］によりリン酸化されたセリン（下線）を包囲するＧＳＫ3 中の配列に該当するペプチドである。クロスチドキナーゼ活性の３つのピークが検出されるが、このピークはインスリン刺激を省略したり、細胞を先ずＰＩ３−キナーゼ阻害剤 wortmannninで前保温した場合には存在しない（図２ａ）。wortmannin(Crossら、1994、および Welshら、1994)、および構造的にこれと無関係なＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（参考１９）（図１ｂ）は両方共インスリンによるＧＳＫ3 の阻害を阻止する。プロテインキナーゼＰＫＢ−α、ＰＫＢ−βおよびＰＫＢγはＳｅｒ／Ｔｈｒ特異的であり、ウイルス性がん遺伝子ｖ−ａｋｔの細胞性同族体である（coffer ら、1991、Jones ら、1991、Ahmed ら、1995 および Chengら、1992）。最近に至りこれらの酵素は、成長因子またはインスリンに応答してＮＩＨ３Ｔ３、Ｒａｔ−１またはＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞中で活性化され、この活性化は種々の方法でＰＩ３−キナーゼの活性化をブロックすることにより抑制されることが判ってきた（Frankeら、1995および Burgeringら、1995）。ＰＫＢ−αのカルボキシル末端ペプチドに対して生起した抗体を用いて免疫ブロッテイングが行われた場合（図２ｂ）、クロスチド（Crosstide）キナーゼ（図２ａ）の全ての３つのピークは、他の細胞中に観察されているＰＫＢ特有の多重バンド（比分子質量、Ｍ_r＝５８Ｋ、５９Ｋまたは６０Ｋ）を示すが、ＭｏｎｏＱからの他の画分には少しもみられない。この一層緩慢な移動形は一層高度にリン酸化されたプロテインを示し、これらの形はホスフアターゼ処理により最高速度の移動種に転化される。またホスフアターゼ処理は結果として、ＰＫＢの不活性化を引き起こし（ Burgering ら、1995）、したがってクロスチドキナーゼ活性の完全損失を来す（データは示さず）。ＭｏｎｏＱからのピーク２および３におけるクロスチドキナーゼ活性中の７０−８０％は、ＰＫＢ−αのアミノ末端プレクストリン（plec kstrin）相同（ＰＨ）領域に対して生起した別個抗体により免疫沈降された。Ｃ末端抗体も明らかにピーク２および３からのＰＫＢ活性を免疫沈降したが、その効果は抗−ＰＨ領域抗体よりも低かった。ピーク１はいずれの抗体によっても殆ど免疫沈降されず、ＰＫＢ−βを表し得る。免疫沈降抗-ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１抗体（Cross ら、1994）はピーク１、２または３に伴うクロスチドキナーゼ活性を少しも低減させなかった。Ｌ6 筋管のインスリン刺激は、ＰＫＢ活性を１０倍を超えて（図２ｃ）増大させ、活性化は wortmannin またはＬＹ２９４００２によりブロックされたが、８ −ブロモ−サイクリックＡＭＰまたはラパマイシンプラスＰＤ９８０５９によっては本質的には影響されなかった（図２ｃ）。半期（half-time）（ｔ_0.5）またはＰＫＢの活性化（１分）はＧＳＫ3 の阻害の場合（２分）のそれよりも僅かに速い（Crossら、1994）。反対にＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１（図２ｄ）およびｐ７０^S6K（図示せず）の活性化はこれより遅かった（t_0.5＞５分）。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１の活性化は８−ブロモ−サイクリックＡＭＰまたはＰＤ９８０５９（図２ｄ）により、またｐ７０^S6Kの活性化はラパマイシンにより阻止された。Ａｋｔ／ＲＡＣは、ＧＳＫ3 −α中のＳｅｒ−２１およびＧＳＫ3 −β中のＳｅｒ−９に該当するクロスチド中のＳｅｒをリン酸化する（図示せず）。インスリンで刺激したＬ6 筋管からの（未刺激または wortmannin 処理細胞からのではなく）ＰＫＢは in vitro でＧＳＫ3 −αおよびＧＳＫ3 −βを不活性化し、かつ阻害はＳｅｒ／Ｔｈｒ−特異性プロテインホスフアターゼＰＰ２Ａ（Embiら、 1980）（図３ａ）により逆転される。不活性化が共免疫沈降プロテインキナーゼによってではなくＰＫＢによって触媒されることをさらに確認するために、赤血球凝集素標識ＰＫＢ−α（ＨＡ−ＰＫＢ）をＣＯＳ−１細胞中にトランスフエクションし、この系でのＰＫＢ活性化の最強誘発剤であるペルバナジン酸塩（perv anadate）を用いて刺激して活性化した。このＨＡ−ＰＫＢはＧＳＫ3 −βを不活性化したが、ペルバナジン酸塩による処理を省略したり、野生型ＨＡ−ＰＢＫを”キナーゼ不活性”変異体（図３ｂ）で置換した場合には不活性化しない。ＰＫＢによる in vitro でのＧＳＫ3 −βの不活性化は、主要トリプン（tryp tic）ペプチド（図４ａ）のリン酸化を伴い、このペプチドはＣ₁₈クロマトグラフイー（Sutherlandら、1993）および等電点電気泳動の期間中に、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１によるリン酸化後に得られたペプチド（図４ｄ）と共に共溶離した。（ラパマイシンおよびＰＤ９８０５９の存在下での）インスリンによるＬ6 筋管の刺激は、ＧＳＫ3 −αおよびＧＳＫ3 −βの³²Ｐラベリングを６０−１００％も増強し（図４ｃ）、かつ in vitro でラベルされた同じトリプシンペプチドの³²Ｐ−ラベリングを増強した（図４ｄ）。配列決定分析によれば、Ｓｅｒ−９（ＧＳＫ3 −β）またはＳｅｒ−２１（ＧＳＫ3 −α）に相当するこれらの第３残基は、in vitro（図４ｂ）および in vivo （図示せず）の両方で、各ホスホペプチド中のリン酸化部位であった。他の（一層酸性の）トリプシンホスホペプチドの³²Ｐラベリングはインスリンにより増強されなかった（図４ｄ）。これらのペプチドはＡ４３１細胞からのＧＳＫ3 中に以前から認められており、ホスホセリンおよびホスホチロシンを含むことが判明していた（Saito ら、1994）。ＰＫＣ−δ、εおよびζはミトゲンにより活性化され、かつＰＫＣ−ζはＰＩ３−キナーゼ反応の生成物であるＰＩ（３，４，５）Ｐ₃を包含するいくつかのイノシトールホスホリピドにより in vitro で刺激されることが報告されている（Andjelkovic ら、1995）。しかし、精製ＰＫＣ−ε（Palmerら、1995）、ＰＫＣ−δ、ＰＫＣ−ζ（データは示さず）はいずれもＧＳＫ3 −αおよびＧＳＫ3 −βを in vitro では阻害できなかった。そのうえ、ＰＫＣ−α、β₁およびγは in vitro でＧＳＫ3 −βを阻害するが（Palmerら、1995）ＧＳＫ3 −α は影響されないのに反して、ホルボールエステルとの長期保温によるＬ6 筋管中のそれらのダウンレギユレーションが、ホルボールエステルを用いた引き続く抗原投与(challenge)に応答してＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１の活性化を無効にする。この際、インスリンによるＧＳＫ3 の阻害への影響はない（データは示さず）。総合するに、これらの結果はＰＫＢの基質としてのＧＳＫ3 を確認するものである。骨格筋内のインスリンによるグリコーゲン合成の刺激には、グリコーゲン合成におけるＳｅｒ残基の脱リン酸が包含され（Parkerら、1983）、これらはin vitro でＧＳＫ3 によりリン酸化される。したがってインスリンによるＧＳＫ3 の４０−５０％阻害は、関連グリコーゲンシンターゼホスフアターゼの類似活性化（Goode ら、1992）と相まって、骨格筋（Parkerら、1983）またはＬ6 筋管（Goode ら、1992）中でのインスリンによるグリコーゲン合成の刺激を説明できる。グリコーゲン合成活性化および、その結果としてのＬ6 筋管中でのインスリンによるグリコーゲン合成の刺激は wortmannin によりブロックされるが、Ａｋｔ／ＲＡＣの活性化およびＧＳＫ3 の阻害と同様に、ＰＤ９８０５９によってはブロックされない（Dentら、1990）。しかし、ＧＳＫ3 は in vivoでのＰＫＢの唯一の基質ではないらしく、したがって他の生理学的関連基質を確認することが重要となろう。その理由は、多くの卵巣新生物中にＰＫＢ−βが増幅され、かつ過剰発現されるからである（Cheng ら、1992）。実施例２：Ｌ6 筋管中のインスリンによるＰＫＢの活性化は残基Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３のリン酸化を伴う。インスリンはＬ6 筋管中でＰＫＢαの活性化およびリン酸化を誘発する。Ｌ6 筋管の３つの１０ｃｍ皿を³²Ｐラベルし、１００ｎＭ wortmannin の存在下、または不在下に１０分間処理し、次いで１００ｎＭインスリンの存在下、または不在下に５分間処理した。ＰＫＢαを溶解物から免疫沈降させ、アリコット（１５％）につきＰＫＢα活性（図５Ａ）を評価した。未剌激細胞（１０ｍＵ／ｍｇ）由来のＰＫＢαに関する３実験の場合の活性を±ＳＥＭでプロットする。免疫沈降したＰＫＢαの残部８５％は４−ビニルピリジンでアルキル化し、１０％ポリアクリルアミドゲル（リン酸化誘発による泳動度低下を高めるためにＳＤＳ処理なしに調製）上で電気泳動に処し、オートラジオグラフイーにかけた。分子質量マーカーであるグリコーゲンホスホリラーゼ（９７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）およびオバルブミン（４３ｋＤａ）の位置をマークする。これらの条件下、インスリン刺激は結果として１２倍のＰＫＢα活性化（図５Ａ）を引き起こし、かつ³²Ｐラベリング（４回実験）の１．９±０．３倍の増加およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（図５Ｂ）上のその移動度の劣化を伴った（図５Ｂ）。ＰＫＢαの活性化、その³²Ｐラベリングの増加および電気泳動移動の低減は、１００ｎＭ wortmannin を用いた細胞の前保温によりすべて消滅した。全タンパク質のホスホアミノ酸分析によれば、³²ＰラベルＰＫＢαはセリンおよびスレオニン両残基でリン酸化され、インスリン刺激は両ホスホアミノ酸の両³²Ｐラベリングを増加させることが明瞭になった（データは開示せず）。図６．Ｌ6 筋管のインスリン剌激はＰＫＢα中の２つのペプチドのリン酸化を誘発する。図５Ｂからの³²ＰラベルＰＫＢαに該当するバンドをゲルから切り出し、４− ビニルピリジンで処理してシステイン残基をアルキル化し、トリプシンで消化し、かつ０．１％（容量）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて平衡状態に置いたＶｙｄａｃ２１８ＴＰ５４Ｃ１８カラム（Separations Group, Hesperia, CA ）上でクロマトグラフイーにかけ、カラムはアセトニトリル直線勾配（斜線）で展開した。流速は０．８ｍｌ／分であり、画分０．４ｍｌを捕集した（Ａ）未刺激Ｌ6 筋管からの³²ＰラベルＰＫＢαのトリプシン（tryptic）ペプチドマップ；（Ｂ）インスリン刺激したＬ6 筋管からの³²ＰラベルＰＫＢαのトリプシンペプチドンマップ；（Ｃ）インスリンの前に wortmannin で処理したＬ6 筋管からの³² ＰラベルＰＫＢαのトリプシンペプチドマップ。２３．７％および２８％アセトニトリルにおいて溶離する２つの主要³²ＰラベルペプチドをそれぞれペプチドＡおよびペプチドＢと呼称する。同様の結果が４回（ＡおよびＢ）の実験および２回（Ｃ）の実験で得られた。未刺激Ｌ6 筋管（図６Ａ）由来の³²ＰラベルＰＫＢαからは主要³²Ｐラベルペプチドはなんら回収されなかった。このことは、多数部位でのリン酸化がインスリン不在では低レベルであったことを示している。しかしインスリン刺激すると、２つの主要³²Ｐラベルペプチドが観察され［ＡおよびＢ（図６Ｂ）と呼称］、この³²Ｐラベリングは、筋管を wortmannin と共に先ず前保温すれば阻止された（図６Ｃ）。図７．ペプチドＡおよびＢ中のリン酸化部位の確認。（Ａ）図５Ｂ（1000cpm）からのペプチドＡおよびＢを６ＭＨＣｌ中１１０ ℃で９０分間保温し、ｐＨ３．５で薄層セルロース上で電気泳動に処し、オルトリン酸（Ｐｉ）、ホスホセリン（ｐＳ）、ホスホスレオニン（ｐＴ）およびホスホチロシン（ｐＹ）に分割し、オートラジオグラフイーにかけた。（Ｂ）³²ＰラベルＬ6 筋管の５０の１０ｃｍ皿から得られたペプチドＡ（図５Ｂ）を、０．１％ＴＦＡの代わりに１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）中で平衡状態に置いたミクロボアＣ18カラム上のクロマトグラフイーでさらに精製した。³²Ｐ放射能の単一ピークが２１％アセトニトリルで観察され、このピークは２１４ｎｍ吸光度のピークと一致する。試料（１ｐｍｏｌ）の８０％を Applied Biosystem s476 Ａシークエンサーで分析してアミノ酸配列を決定し、エドマン分解の各サイクル後に確認されたフエニルチオヒダントイン（Ｐｔｈ）アミノ酸をアミノ酸用一文字コードで表示する。括弧内残基は十分量で存在しなかったので明瞭に確認できなかった。リン酸化部位を認識するために、次いで試料（600cpm）の残余２０％を Sequelon アリールアミン膜と共有結合させ、Applied Biosystems 470Ａシークエンサーを用いて Stokoe らが記載（1992）した修飾プログラムに従って分析した。エドマン分解の各サイクル後には³²Ｐ放射能を測定した。（Ｃ）図２Ｂ（800cpm）からのペプチドＢは（Ｂ）におけるように固相配列決定した。ペプチドＡは主としてセリン上でリン酸化されたのに反して、ペプチドＢはスレオニン（図７Ａ）上でラベルされた。アミノ酸配列決定によればペプチドＡは残基４６５で開始することが確認された。エドマン分解の第８サイクル後に³²Ｐ放射能の単一バーストのみが観察（図７Ｂ）され、Ｌ6 筋管のインスリン刺激が、タンパク質のＣ末端から９残基に位置するＳｅｒ−４７３におけるＰＫＢαのリン酸化を誘発したことが立証された。トリプシン消化に先立って³²ＰラベルＰＫＢαを４−ビニルピリジンで処理する際にのみ、ホスホペプチドＢが有意量で回収されたことは、このペプチドがシステイン残基（１または複数）を含有することを示し、かつ３２ｐ放射能の単一バーストがエドマン分解の第１サイクル後に観察された（図７Ｃ）。このことはリシンまたはアルギニン残基に続くのはＰＫＢα中のスレオニンのみであり、このものはシステイン残基（位置３１０）含有のトリプシンペプチド中に位置しているから、リン酸化部位は残基３０８であったことを暗示していた。ホスホペプチドＢがＣ18カラム（２８％）から溶離するアセトニトリル濃度およびその等電点（４．０）も、ＰＫＢαの残基３０８− ３２５を含むペプチドとしてのその帰属とは矛盾しない。ｐＨ６．５でさらに精製するとペプチドＢの回収率が悪いので、アミノ酸配列の決定が妨げられたが、過渡的にトランスフエクションされた２９３細胞を用いる更なる追加実験によれば、このペプチドはＰＫＢαの残基３０８−３２５に該当することが確認された。図８：過渡的にトランスフエクションされた２９３細胞中でのＰＫＢαのリン酸化部位のマッピング。２９３細胞を、野生型ＰＫＢαを発現するＤＮＡ構築体により、またはＨＡ− ＫＤＰＫＢα、ＨＡ−４７３ＡＰＫＢαもしくはＨＡ−３０８ＡＰＫＢα 等の、ヒトタンパク質をコードする赤血球凝集素エピトープ・標識ＰＫＢαにより過渡的にトランスフエクションした。１００ｎＭ wortmannin の存在下、または不在下に１０分間処理後、これらの細胞を１００ｎＭインスリンまたは５０ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−１の存在下、または不在下に wortmannin を常時存在させて１０分間刺激した。溶解物からＰＫＢαを免疫沈降させ、評価し、かつ活性を各ＨＡ−ＰＫＢαの相対発現レベルについて補正した。結果を未刺激２９３細胞（２．５±０．５Ｕ／ｍｇ）からの野生型ＨＡ−ＰＫＢαの比活性に関して表示した。（Ｂ）各溶解物からのプロテイン２０μｇを、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、モノクロナールＨＡ抗体を用いて免疫ブロッテイングした。分子マーカーは図５Ｂで用いたものである。図９：２９３細胞のＩＧＦ−１刺激はトランスフエクションされたＨＡ−ＰＫＢ α中の２つのペプチドのリン酸化を誘発する。野生型ＨＡ−ＰＫＢａＤＮＡ構築体を用いて過渡的にトランスフエクションされた２９３細胞を³²Ｐラベルし、（Ａ、Ｂ）の不在または（Ｃ）１００ｎＭwo rtmannin の存在下に１０分間、次いで（Ａ）の不在下または（Ｂ、Ｃ）の存在下に５０ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−１と共に１０分間処理した。３２ｐラベルＨＡ− ＰＫＢαを溶解物から免疫沈降させ、４−ビニルピリジンで処理、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ゲルから切り出し、トリプシンで消化した。次いでＣ₁₈カラム上でのクロマトグラフイーによりＣ、Ｄ、ＥおよびＦと呼称する４つの主要ホスホペプチドに分割した。同様の結果が（Ａ）および（Ｂ）の場合の６回の別個の実験で得られ、（Ｃ）の場合には２回の実験で得られた。インスリンおよびＩＧＦ−１による刺激は、トランスフエクションされたＰＫＢαをそれぞれ２０倍および４６倍も活性化する結果が得られ、半期は他の細胞で見いだされるように１分であった。インスリンまたはＩＧＦ−１によるＰＫＢ αの活性化は wortmannin （図８Ａ）との前保温により阻止され、かつ２９３細胞がベクターのみでトランスフエクションされ、次いでインスリンまたはＩＧＦ −１で刺激された場合には、なんらの活性化も生起しなかった（図示せず）。２つの顕著な³²Ｐラベルペプチドが未刺激２９３細胞中に存在した（図９Ａ）。１つは２０−２１％アセトニトリルにおいてダブレットとして溶離し（ペプチドＣと呼称）、他は２９．７％アセトニトリルにおいて溶離した（ペプチドＦと呼ばれる）。インスリンまたはＩＧＦ−１による刺激はペプチドＣおよびＦの³² Ｐラベリングには影響しない（図９ＡおよびＢ）が、Ｄ（２３．４％アセトニトリル）およびＥ（２８％アセトニトリル）と呼称する２つの新規ペプチドの³²Ｐラベリングを誘発した。上記ＤおよびＥはペプチドＡおよびＢと同じアセトニトリル濃度においてＬ6 筋管から溶離し（図６Ｂ）、同じ等電点を有していた（それぞれ７．２および４．０）。ＩＧＦ−１刺激に先立って、ＨＡ−ＰＫＢα発現２９３細胞を１００ｎＭ wortmannin で処理すると、ペプチドＤおよびＥのリン酸化は阻止されるが、ペプチドＣおよびＦ（図９Ｃ）の３２ｐラベリングには影響しなかった。ペプチドＣ、Ｄ、ＥおよびＦをさらにＣ18カラム（ｐＨ６．５）上のクロマトグラフイーで精製し配列決定した。ぺプチドＣは３つの別個の（しかし接近して溶離する）³²Ｐラベルペプチド（データは示さず）を生じた。アミノ酸配列決定によれば、３つのすべてはＰＫＢαの残基１２２において始まり、Ｓｅｒ−１２４がリン酸化部位である（図１０Ａ）ことが明瞭になった。ぺプチドＤはホスホセリンのみを含み、期待通り、Ｓｅｒ−４７３でリン酸化された残基４６５で始まるＰＫＢαトリプシンペプチドに該当した（図１０Ｂ）。ぺプチドＥはホスホスレオニンのみを含み、したがってアミノ酸配列決定では、このものは残基３０８−３２５に該当し、そのリン酸化部位はＴｈｒ−３０８（図１０Ｃ）であることを示した。ペプチドＦはホスホスレオニンのみを含み、したがってＴｈｒ−４５０（図１０Ｄ）においてリン酸化されたＰＫＢαの残基４３７で開始するペプチドに該当した。ホスフアチジルセリンの存在下、ＰＫＢαはサブミクロモルの親和性でＰＩＰ 3 に結合する（James ら、1996、Frech ら、1996）。ホスフアチジル４，５−ビスホスフエートおよびホスフアチジル３，４−ビスホスフエートは一層低い親和性でＰＫＢαに結合し、かつＰＩ3,5−ビスホスフエートおよびＰＩ３ホスフエートはこれらの条件下では全然結合しない（James ら、1996）。ＰＩＰ3 と相互作用するＰＫＢα領域はそのＰＨ領域であることは確実であり、その理由は単離ＰＨ領域はＰＫＢα自体に対すると類似の親和性でＰＩＰ3 に結合する（Frec h ら、1996）からであり、またβ−スペクトリン（spectrin）およびホスホリパーゼＣｌのＰＨ領域等の他のいくつかのタンパク質のＰＨ領域は他のホスホイノシチドと特異的に相互作用することが知られているからである（Hyvonenら、199 5 および Lemmon ら、1995）。上記実験をＩＧＦ−１に替えてインスリンを用いて繰り返した。ペプチドＤおよびＥの³²ＰラベリングがＩＧＦ−１を用いて観察されたレベルの約５０％であった以外は、結果は同一であった（データは示さず）。このことは、ＩＧＦ−１との比較ではインスリンによるＰＫＢαの活性化レベルが１／２であることと一致する（図７Ａ）。実施例３：ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は部分活性化を引き起こすＰＫＢαのＳｅｒ−４７３をリン酸化する。ＰＫＢαのＳｅｒ−４７３は、シグナル形質導入経路に関与する多数のプロテインキナーゼ中に保存されていることが判明している共通配列Ｐｈｅ−ｘ−ｘ− Ｐｈｅ／Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｈｅ／Ｔｈｒ中に在る（Pearson ら、1995 ）。したがってＳｅｒ−４７３キナーゼを識別するために、ウサギ骨格筋抽出物をＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ上でクロマトグラフィーにかけ、ＰＫＢαの残基４６５から４７８までに該当する合成ペプチドをリン酸化し得るプロテインキイナーゼについてこの画分を評価した。これらの研究では、ＰＫＢαのＳｅｒ−４７３に該当する残基におけるペプチド４６５−４７８をリン酸化して０．３ＭＮａＣｌにおいて溶離する酵素を確認した。このＳｅｒ−４７３キナーゼは、ストレスおよびサイトカイン活性化ＭＡＰキナーゼカスケード（Rouse ら、1994；Cuenda ら、1995）の１成分であるＭＡＰキナーゼ−活性化プロテイン（ＭＡＰＫＡＰ）キナーゼ−２と共にＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘから共溶離した（Stokoe etal，199 2）。このＳｅｒ−４７３キナーゼはフエニル−セフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭｏｎｏＳおよびＭｏｎｏＱを通してＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２と共に共分別を続け、かつ抗−ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２抗体（Gould ら、1995）により定量的に免疫沈降されたことは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２が実際のところ発明者らが精製したＳｅｒ−４７３であったことを証明している。図１１これらの構築体を発現する未刺激ＣＯＳ−１細胞の溶解物からＨＡ− ＰＫＢαを免疫沈降させた。（Ａ）緩衝液Ｂ（全量４０μｌ）中のＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび１００ｍＭ［³²γＰ］ＡＴＰと共に、免疫沈降したＨＡ−ＰＫＢａ０．５μｇを保温した。時間をかえてアリコットをとり、ＰＫＢα活性（オープン丸）またはＰＫＢα中へのリン酸の取り込み（クローズド丸）のいずれかについて評価した。ＰＫＢα 活性測定に先立ち、最終濃度２０ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加して反応を停止し、かつ免疫沈降物を０．５ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ｂ１．０ｍｌで２回洗浄し、次いで緩衝液Ｂ１．０ｍｌで２回洗浄してＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２を除去した。この結果を６回の決定の場合の±ＳＥＭとして示し（２回の別個の実験）、かつＰＫＢα活性を対照実験との対比で示した。ここではＨＡ−ＰＫＢαはＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２（なんら活性化を起こさず）の存在下でＭｇＡＴＰと共に保温した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ＰＫＢαバンドに伴う³²Ｐ放射能をカウントしてリン酸化を評価した。オープン三角は、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２によりリン酸化された免疫沈降ＨＡ−ＫＤＰＫＢαの活性を示す。（Ｂ）ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２および³²Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて（Ａ）同様に１時間リン酸化したＨＡ−ＰＫＢαをトリプシントと共に消化し、次いで図２の場合の説明同様にＣ18カラム上でクロマトグラフイーに処した。（Ｃ）（Ｂ）からの主要³²Ｐラベルペプチドを図３におけるように４７０Ａシークエンサーを用いて分析し、リン酸化部位を確認した。バクテリアによって発現したＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は野生型ＨＡ−ＰＫＢ αを、またはＬｙｓ−１７９がＡｌａへと変異（データは示さず）した触媒的不活性な変異体ＨＡ−ＰＫＢαを１モル／モル・プロテインに接近するレベルまでリン酸化した。野生型ＰＫＢαのリン酸化程度は活性の７倍増加に該当し、他方触媒的に不活性な変異体のリン酸化は少しの活性化も起こさなかった（図１１Ａ）。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２またはＭｇＡＴＰを反応から省略した場合には野生型ＨＡ−ＰＫＢαのリン酸化または活性化はなんら生起しなかった（データは示さず）。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２により最大限に活性化された野生型ＨＡ− ＰＫＢαはプロテインホスフアターゼ２Ａによる処理で完全に脱リン酸および不活性化された。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２で最大限リン酸化したＨＡ−ＰＫＢαをトリプシンで消化したところ、Ｃ18クロマトグラフイーでは単一主要³²Ｐラベルホスホセリン含有ペプチド（図１１Ｂ）が現れた。このペプチドは同じアセトニトリル濃度で溶離し（図１１Ｂ）、Ｓｅｒ−４７３（図１１Ｂおよび６Ｂを比較）含有３２ｐラベルトリプシンペプチドと同じ等電点７．２を有していた（データは示さず）。固相配列決定ではエドマン分解の第８サイクル後に³²Ｐ放射能バーストを与え（図１１Ｃ）、Ｓｅｒ−４７３がリン酸化部位であったことを立証した。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２でリン酸化した触媒的に不活性なＨＡ−ＫＤＰＫＢαのトリプシン消化に続いて、これと同じ³²Ｐペプチドが得られた（データは示さず）。実施例４：Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３のリン酸化はＰＫＢαの相乗活性化を起こす。上記実験は、Ｓｅｒ−４７３のリン酸化は in vitro でＰＫＢαを活性化するが、Ｔｈｒ−３０８のリン酸化の役割は示さず、すなわちＳｅｒ−４７３リン酸化の活性に及ぼす効果に対してＴｈｒ−３０８リン酸化がどのような影響を与えるかについては示さなかったこと、逆もまた同じであることを実証している。したがって発明者らは、構築体中でＳｅｒ−４７３またはＴｈｒ−３０８のいずれかがＡｌａ（リン酸化効果を遮断する）またはＡｓｐ（リン酸化効果を試し、かつ模倣する）のいずれかに変化されるような、赤血球凝集素（ＨＡ）標識ＰＫＢ αＤＮＡ構築体を調製した。図１２．ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２による in vitro でのＨＡ−ＰＫＢα変異体の活性化（Ａ）野生型および変異体ＨＡ−ＰＫＢαプロテインをこれらの構築体を発現する未刺激ＣＯＳ−１細胞の溶解物から免疫沈降させ、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ− ２およびＭｇＡＴＰ（５０Ｕ／ｍｌ）の不在（−、充填バー）もしくは存在下（＋、ハッチングのバー）にＭｇＡＴＰと共に６０分間保温した。このＰＫＢαプロテインを各構築体中におけると類似のレベルで発現させ、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２（０．０３Ｕ／ｍｇ）の不在下に保温した野生型ＨＡ−ＰＫＢαに較べた比活性を表示する。結果を３回実験の平均±ＳＥＭとして示す。（Ｂ）各溶解物からのタンパク質（２０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、モノクロナールＨＡ−抗体を用いて免疫ブロッテイングした。すべての変異体は、血清枯れ（serum-starved）ＣＯＳ−１細胞中で類似のレベルで発現されており（データは示さず）、かつＳｅｒ−４７３においてこれらのそれぞれを最高度にリン酸化することの効果を図１２Ａに示す。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２でリン酸化する以前のＨＡ−４７３ＡＰＫＢαの活性は未刺激野生型ＨＡ−ＰＫＢαの活性に類似しており、期待通り、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２およびＭｇＡＴＰとの保温ではＨＡ−４７３ＡＰＫＢαの活性化はそれ以上起こらなかった。反対に、ＨＡ−４７３ＤＰＫＢαの活性は、未刺激野生型ＨＡ −ＰＫＢαプロテインの活性より５倍から６倍高く，かつＳｅｒ−４７３でリン酸化された野生型ＨＡ−ＰＫＢαの活性に類似していた。期待通り、ＨＡ−４７３ＤＰＫＢαもＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２およびＭｇＡＴＰとの保温によってはそれ以上は活性化されなかった。ＨＡ−３０８ＡＰＫＢαの活性は未刺激野生型酵素の活性の約４０％であり、かつＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２によりリン酸化後はＳｅｒ−４７３でリン酸化された野生型ＨＡ−ＰＫＢαの活性に類似のレベルまで活性が増強された。興味あることに、（ＨＡ−４７３ＤＰＫ同様に）リン酸化された野生型ＨＡ−ＰＫＢαよりも活性が５倍高かったＨＡ−３０８ＤＰＫＢαはＳｅｒ−４７３のリン酸化により劇的に活性化された。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２およびＭｇＡＴＰとの保温後は、ＨＡ−３０８ＤＰＫＢαの活性はＳｅｒ−４７３でリン酸化された野生ＨＡ−ＰＫＢαの活性よりも約５倍高かった（図１２Ｂ）。これらの結果は、Ｔｈｒ−３０８またはＳｅｒ−４７３いずれかにおけるリン酸化は in vitro でのＰＫＢαの部分活性化をもたらし、そして両残基のリン酸化は結果としてこの酵素の相乗的活性化を引き起こすことを暗示している。このアイデアは、Ｔｈｒ−３０８とＳｅｒ−４７３の両方がＡｓｐに変わった場合のさらなる実験により支持された。この二重変異体がＣＯＳ− １細胞中で発現された場合、脱リン酸したその野生型プロテインよりも１８倍も高い比活性を示すことが判った。期待通り、この変異体の活性はＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２およびＭｇＡＴＰとの保温（incubation）ではそれ以上は増強されなかった（図１２Ｂ）。実施例５：Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３両方のリン酸化は in vivo でのＰＫＢαの高レベル活性化に必要である。図９．２９３細胞中のインスリンによる活性化に及ぼすＰＫＢαの変異の影響（Ａ）野生型ＰＫＢα、ＨＡ−Ｄ４７３−ＰＫＢα、およびＨＡ−３０８Ｄ／４７３Ｄ−ＰＫＢαを発現するＤＮＡ構築体を用いて２９３細胞を過渡的にトランスフエクションした。１００ｎＭ wortmannin の存在下または不在下に１０分間処理後、インスリン１００ｎＭの存在下または不在下、wortmannin の連続的存在下で細胞を１０分間刺激した。ＰＫＢαを溶解物から免疫沈降させ、評価し、かつ活性は方法中に記載のようなＨＡ−ＰＫＢα発現の相対レベルを修正した。未刺激２９３細胞から得られた野生型Ａ−ＰＫＢαの比活性に比べた結果を表示する。（Ｂ）各溶解物からのプロテイン２０μｇを１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、モノクロナールＨＡ−抗体を用いて免疫ブロッテイングした。未刺激細胞由来のＨＡ−４７３ＡＰＫＢα活性の基本的レベルは野生型ＰＫＢαのレベルに類似していた（図８Ａ）。ＨＡ−４７３ＡＰＫＢαを発現する２９３細胞をインスリンまたはＩＧＦ−１で刺激すると、この変異体の活性がそれぞれ３倍および５倍に増加した；すなわち同一条件で過渡的に発現および刺激されている野生型ＨＡ−ＰＫＢαの活性の１５％へと高められた。また未刺激細胞におけるＨＡ−３０８ＡＰＫＢαの基本的活性も未刺激細胞由来の野生型ＨＡ−ＰＫＢαの活性に類似していたが、この変異体の活性化はインスリンまたはＩＧＦ−１による細胞の刺激後にはなんら生起しなかった。これらのデータは in vitro での実験と一致し、かつＰＫＢαの最大活性化にはＳｅｒ−４７３およびＴｈｒ−３０８両方のリン酸化を必要とし、かつ両残基のリン酸化が酵素の相乗的活性化を引き起こすことを示している。これらの結果と矛盾せずに、ＨＡ −４７３ＤＰＫＢαは未刺激細胞中で発現されると、野生型ＨＡ−ＰＫＢαよりも５倍高い活性を示し、ＨＡ−３０８Ｄ／ＨＡ−４７３Ｄ二重変異体は４０倍も高い活性を示す。インスリン刺激後、ＨＡ−ＰＫＢαは野生型酵素で観察された活性に類似のレベルまで活性化されるのに反し、ＨＡ−３０８Ｄ／ＨＡ−４７３Ｄ二重変異体はそれ以上は活性化されなかった（図１３）。予想通り、インスリンによるＨＡ−４７３ＤＰＫＢαの活性化は wortmannin により阻止され、かつＨＡ−３０８Ｄ／ＨＡ−４７３Ｄ二重変異体の活性は wortmannin に抵抗した（図１３）。実施例６：Ｔｈｒ−３０８のリン酸化はＳｅｒ−４７３のリン酸化に依存せず、逆も同様である（２９３細胞において）。（図１０）２９３細胞の１０ｃｍ皿をＨＡ−３０８ＡＰＫＢαまたはＨＡ−４７３ＡＰＫＢαのいずれかでトランスフエクションし、³²Ｐラベルし、次いでＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）または緩衝液のいずれかで剌激した。これらの³² ＰラベルＰＫＢα変異体を溶解物から免疫沈降させ、４−ビニルピリジンで処理し、１０％ポリアクリルアミド上で電気泳動し、ゲルから切り取ってトリプシンで消化し、次いでＣ18カラム上でクロマトグラフイーに処した。リン酸化された残基Ｓｅｒ−１２４、Ｔｈｒ−３０８、Ｔｈｒ−４５０、Ｓｅｒ−４７３を含むトリプシンペプチドをマークし、これらの帰属（assignment）をホスホアミノ酸分析により確認し、リン酸化部位を識別するための配列決定を行った（データは示さず）。Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３を含むホスホペプチドはＩＧＦ −１による刺激を省略した場合には存在しないのに反して、Ｓｅｒ−１２４およびＴｈｒ−４５０含有ホスホペプチドは野生型ＰＫＢαの際に観察されたものと類似レベルで存在した（図９Ａ）。同様の結果が別個３回の実験で得られた。これらの実験は、ＩＧＦ−１刺激がＴｈｒ−３０８におけるＨＡ−４７３ＡＰＫＢαのリン酸化を誘発し、さらにＳｅｒ−４７３におけるＨＡ−３０８ＡＰＫＢαのリン酸化も誘発することを実証した。同様の結果がＩＧＦ−１よりもむしろインスリン刺激後に得られた。実施例７：ＩＧＦ−１またはインスリンは、触媒的に不活性なＰＫＢα変異体のＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３のリン酸化を誘発する。図１５．２９３細胞中に発現された触媒的に不活性なＰＫＢα変異体（ＨＡ− ＫＤ−ＰＫＢα）は、ＩＧＦ−１刺激後にＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３においてリン酸化される。ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢα ＤＮＡ構築体を用いて過渡的にトランスフエクションされた２９３細胞の各１０ｃｍ皿を³²Ｐラベルし、緩衝液（Ａ）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１（Ｂ）または１００ｎＭインスリン（Ｃ）で１０分間保温した。この³²ＰラベルＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢαを溶解物から免疫沈降させ、４−ビニルピリジンで処理し、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ゲルから切り出し、トリプシンで消化し、次いでＣ18カラム上でクロマトグラフイーに処した。リン酸化された残基Ｓｅｒ−１２４、Ｔｈｒ−３０８、Ｔｈｒ−４５０およびＳｅｒ−４７３を含むトリプシンペプチドがマークされる。同様の結果が（Ａ）および（Ｂ）の場合の別途３回、（Ｃ）の場合の別途２回の実験で得られた。Ｌｙｓ−１７９がＡｌａに変わった（上記）ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢαと呼称するこの”キナーゼ（死）（kinase dead）”ＰＫＢα変異体を、２９３細胞中で過渡的に発現させると、その発現レベルは同一条件下で発現した野生型ＨＡ−ＰＫＢαのレベルよりも数倍も低いことが判った（図８Ｂ）。予期通り、ＨＡ−ＫＤ −ＰＫＢαを発現する２９３細胞がインスリンまたはＩＧＦ−１で刺激された場合にはＰＫＢα活性はなんら検出されなかった（図７Ａ）。ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢαで過渡的にトランスフエックションされている２９３細胞を³²Ｐラベルし、次いで緩衝液、インスリンまたはＩＧＦ−１で刺激し、これらの条件下でリン酸化されたＰＫＢα上の部位をマッピングした。未刺激２９３細胞（図９）からの野生型ＨＡ−ＰＫＢαとは反対に、ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢαはＳｅｒ−１２４においてこれより著しく低レベルでリン酸化されたが、Ｔｈｒ− ４５０では同程度でリン酸化された（図１５Ａ）。ＩＧＦ−１（図１５Ｂ）またはインスリン（図１４Ｃ）による刺激後は、ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢαはＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３を含むペプチドでリン酸化されるようになり、これら部位のリン酸化の程度は少なくとも野生型ＰＫＢα程度に高い。これらペプチドのアミノ酸配列決定によれば、これらはＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３それぞれでリン酸化されたことを実証した。上記実施例は、ＰＫＢはＧＳＫ3 活性に影響すること；Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３は、インスリンまたはＩＧＦ−１に応答してリン酸化されるようになるＰＫＢα中の主要残基であること（図２および５）；また高レベルのＰＫＢα活性を生成するのには両残基のリン酸化が必要であることを実証した。このようにＴｈｒ−３０８またはＳｅｒ−４７３いずれかのＡｌａへの変異は２９３細胞中でインスリンまたはＩＧＦ−１によりトランスフエクションされたＰＫＢ αの活性化を顕著に低減させる（図８）。そのうえＰＫＢαは、Ｔｈｒ−３０８またはＳｅｒ−４７３のいずれかがＡｓｐに変化したり、またはＳｅｒ−４７３が in vitro でＫＡＰＭＡＰキナーゼ−２によりリン酸化された場合には in vi tro で部分的に活性になり、かつＰＫＢαのＤ３０８変異体がＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２によりリン酸化されたり、またはＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３両方共にＡｓｐに変異（図１２）した場合には、なお一層活性になる。くわえて、Ｄ３０８／Ｄ４７３二重変異体はインスリンによる細胞の剌激ではそれ以上は活性化され得なかった（図１３）。これらの観察は、Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ −４７３のリン酸化が相乗的に作用して高レベルのＰＫＢα活性を生ずることを証明している。Ｔｈｒ−３０８、およびそれを取り巻くアミノ酸配列は、ラットＰＫＢβおよびＰＫＢγ中に保存されるが、興味あることにＳｅｒ−４７３（およびそれを取り巻く配列）はＰＫＢβ中にのみ保存される。ラットＰＫＢγでは、Ｓｅｒ−４７３はＣ末端２３残基が削除されるので消失する。このことは、ＰＫＢγの調節がラットにおけるＰＫＢαおよびＰＫＢβの調節から著しく異なり得ることを暗示しいている。Ｔｈｒ−３０８は多くの他のプロテインキナーゼで見いだされる活性化性リン酸化部位と同位置、すなわち保存Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕモチーフの９残基上流、キナーゼ触媒領域のサブ領域ＶＩＩＩ中に位置する。しかしＳｅｒ−４７３は、ｐ７０Ｓ6 キナーゼ、ＰＫＣおよびｐ９０ｒｓｋ（Personら、1995）等の、成長因子刺激のキナーゼカスケードに関与するいくつかのプロテインキナーゼ中に存在する共通配列Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ／Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ −Ｐｈｅ／Ｔｙｒ中の触媒領域に向かってＣ末端に置かれている。しかし、通常のプロテインキナーゼは次の理由ですべての酵素中でこのモチーフをリン酸化するとは考え難い。先ず、ｐ７０Ｓ6 キナーゼ中の対応部位のリン酸化は、インスリンによるＰＫＢαの活性化を阻止しない（Cross ら、1995）免疫抑圧薬物ラパマイシン（Pearson ら、1995）により阻止されるか、またはＳｅｒ−４７３におけるリン酸化である（D．Alessi、未公開研究）。次に、プロテインキナーゼＣ中の対応残基は構成的にリン酸化され、したがって成長因子による刺激によっては誘発されない（Tsutakawa ら、1995）。ＭＡＰＫＡＰキナゼ−２は、細胞がインターロイキン−１または腫瘍壊死因子で刺激されたり，細胞性ストレスを受けた場合（Rouse ら、1994；Cuendaら、19 95）に活性化されるようになるプロテインキナーゼカスケードの１成分である。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２はＳｅｒ−４７３で化学量論的にＰＫＢαをリン酸化（図１１）するが、この発見はＰＫＢα活性の調節におけるＳｅｒ−４７３リン酸化の役割を確認する上で有用であった。しかし、ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２活性はＬ6 細胞中のインスリンにより少しは刺激されるが、インスリンまたはＩＧＦ−１に応答する２９３細胞中ではなんらの活性化も検出できなかった。そのうえ、Ｌ6 細胞または２９３細胞を化学的ストレス（０．５ｍＭ亜ヒ酸ナトリウム）に曝露すると他の細胞で見られるように（Rouse ら、1994; Cuendaら、1995 ）ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２を強力に活性化した（D.Alessi、未公開研究）が、ＰＫＢαは全く活性化しなかった。そのうえ、ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２の直上流に位置するプロテインキナーゼの特異的阻害剤である薬剤ＳＢ２０３５８０（Cuendaら、1995）は亜ヒ酸塩によるＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２の活性化は阻止するが、インスリンまたはＩＧＦ− １によるＰＫＢαの活性化には影響しない。最後に，ＰＫＢαの活性化はwortma nnin により阻止されるが（図６および９）、wortmannin はＬ6 または２９３細胞中のＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２の活性化には影響を与えない。ＰＫＢα（ＨＦＰＱＦＳＹ）のＳｅｒ−４７３を取り巻く配列は、位置ｎ−３における残基Ａｒｇおよび位置ｎ−５における疎水性嵩高残基（ｎはリン酸化残基の位置）を必要とするＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２によるリン酸化の場合の最適コンセンサスには従がわない。残基４６５−４７８を含む合成ペプチドのリン酸化に対するＫm は、標準ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２基質ペプチドの場合のＫm より約１００も倍高い（データは示さず）。したがって、ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２が invivo でＳｅｒ−４７３のリン酸化を仲介するとは考え難い。Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３を in vivo でリン酸化する酵素（単数または複数）はＰＫＢα自体ではないらしい。このように、部分活性Ａｓｐ−３０８変異体のＭｇＡＴＰとの保温はＳｅｒ−４７３のリン酸化を引き起こさず、ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２を添加した際にのみ後者残基のリン酸化を引き起こす（図１１Ａ、図１２）。同様にＴｈｒ−３０８は、部分活性Ｄ４７３変異体、またはＰＫＢαの部分活性Ｓｅｒ−４７３リン酸化形のいずれかをＭｇＡＴＰと保温した際にはリン酸化されない。ホスフアチジルセリンおよびＰＩＰ3 を含む脂質小胞にＰＫＢαが結合した際もＭｇＡＴＰとの保温に際して活性化できず（Al essiら、1996）、かつ２９３細胞へのトランスフエクション後、ＰＫＢαの”ki nase dead”変異体はインスリンまたはＩＧＦ−１に応答してＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３上でリン酸化されるようになる（図１４）。さらに、未刺激またはインスリン刺激された２９３細胞のいずれかからのＨＡ−ＰＫＢαはアミノ酸４６７−４８０を含む合成Ｃ末端ペプチドのリン酸化ができない。未刺激Ｌ6 筋管では、この内性ＰＫＢαは多数の部位で低レベルでリン酸化されたが（図６Ａ）、未剌激２９３細胞ではトランスフエクションされたこの酵素はＳｅｒ−１２４およびＴｈｒ−４５０（図１０）で著しくリン酸化された。Ｓｅｒ−１２４およびＴｈｒ−４５０の両方がプロリン残基を従えることは、”プロリン指向”プロテインキナーゼの関与を暗示している。Ｓｅｒ−１２４のリン酸化は”kinase dead”ＰＫＢαが２９３細胞中にトランスフエクションされた場合には著しく低減するが（図１４）、Ｃ末端プロリンの存在はＰＫＢαによる合成ペプチドのリン酸化を放棄するので、ＰＫＢα自体によりＳｅｒ−１２４がもしリン酸化されるとなれば驚きである（D.Alessiら、未開示研究）。トランスフエクションされたＰＫＢαは未刺激２９３細胞（図１２）中では不活性なので、Ｓｅｒ−１２４およびＴｈｒ−４５０のリン酸化はＰＫＢαを直接活性化しないことは明らかである。Ｓｅｒ−１２４は哺乳類ＰＫＢαイソ型のＰＨ領域（do main）と触媒領域との間のリンカー領域（region）に位置しているが、Ｔｈｒ− ４５０とは異なり、Drosophia 同族体（homologue）中には保存されない（Andje lkovic ら、1995）。仮説に拘泥することは好まないが上記結果は、ＰＩ３−キナーゼを活性化するアゴニストが次の機構の１つを経てＰＫＢα活性を刺激するらしいことを暗示している。先ず、ＰＩＰ３またはＰＩ３，４−ビスＰは１つまたは２つ以上のプロテインキナーゼを活性化でき、このものは次いでＴｈｒ−３０８およびＳｅｒ −４７３でＰＫＢαをリン酸化する。第２に、ＰＩＰ３の形成は膜随伴プロテインキナーゼ（単数または複数）により活性化される原形質膜へのＰＫＢαの補充（recruitment）を引き起こすことができる。Ｔｈｒ−３０８およびＳｅｒ−４７３キナーゼを随伴するこの膜はそれ自体がＰＩＰ３により活性化され、かつＴｈｒ−３０８および／またはＳｅｒ−４７３がＰＩ３キナーゼにより直接リン酸化される可能性もまた排除できない。その理由は、この酵素はそれ自体および他のプロテインをセリン残基上でリン酸化することが知られているからである（La m ら、1994）。実施例８：ＰＫＢの基質特異性に対する分子的基礎ＰＫＢαはＧＳＫ3 活性に影響することは示されている。ＧＳＫ3 αおよびＧＳＫ3 βは、インスリン刺激された２つの他のプロテインキナーゼ、すなわちｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ−１（ＭＡＰＫＡＰ−ＫＩ、ｐ９０Ｓ６キナーゼとしても公知）により、Ｓｅｒ−２１およびＳｅｒ−９でそれぞれリン酸化される。しかしこれらの酵素は、これらの活性の特定阻害剤（ラパマイシン−ｐ７０Ｓ６キナーゼ；ＰＤ９８０５９−ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１）が効果を有しないために、Ｌ6 筋管中のインスリンによるＧＳＫ3 の阻害に対しては速度限定的ではない（Cross ら、1995）。グルコース輸送の刺激、脂肪酸合成およびＤＮＡ合成、アポプトシス（apopto sis）およびアクチン細胞骨格転移（rearrangements）に対する細胞の保護（Cap enterら、1996）を包含する、インスリンおよび成長因子の効果の多くに対してＰＩ３−キナーゼの活性化は必須である。これらの観察は、他のプロテインをリン酸化することによりＰＫＢαがこれらの出来事のいずれかを仲介するするか否かの疑問を提起する。本問題を解明するために、本発明者らはＰＫＢαの基質特異性必要条件を特徴ずけた。発明者らは、ＰＫＢαによるリン酸化に対する最適共通配列はモチーフＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄ［ここでＹａａおよびＺａａは小さなアミノ酸（グリシン以外の）であり、Ｈｙｄは大きな疎水性残基（ＰｈｅまたはＬｅｕ等の）］であることを見いだした。発明者らはまた、ＰＫＢαがＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｈｙｄモチーフ中に存るＳｅｒ−３６においてヒストンＨ２Ｂ（in vitro でＰＫＢα評価にしばしば使用される基質）をリン酸化することも立証した。これらの研究では、さらなるＰＫＢα基質（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ）を確認したが、この基質は他のペプチドとは異なり、ｐ７０Ｓ６キナーゼまたはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１のいずれによっても有意な程度にはリン酸化されない。結果プロテインキナーゼＢαの調製ＰＫＢαの基質特異性を調べるためには、他のプロテインキナーゼ活性のいずれにも汚染されていないキナーゼ製剤を得ることが先ず必要であった。したがって２９３細胞を、赤血球凝集素ラベルＰＫＢα（Ｈａ−ＰＫＢα）発現ＤＮＡ構築体を用いて過渡的にトランスフエクションし、ＩＧＦ−１で刺激し、ＨＡ−ＰＫＢαが溶解物から免疫沈降した。ＩＧＦ−１刺激によりＰＫＢαの３８倍活性化が起こり（図１６）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による免疫沈降物の分析結果によれば、赤血球凝集体モノクロナール抗体の重鎖および軽鎖とは別にクーマシーブルーで染色された主要プロテインは６０ｋＤａＰＫＢαであったことが明らかになった（図１６、レーン２および３）。少ない汚染物が空ｐｃＭＶ５ベクターを用いてトタンスフエクションされた２９３細胞由来の対照免疫沈降物中に存在したが、ＨＡ−ＰＫＢ活性には欠けていた（図１６、レーン４）。さらに、ＩＧＦ−１刺激２９３細胞の溶解物から免疫沈降した触媒的に不活性な変異体ＨＡ−ＰＫＢαは、なんらのクロスチド（Crosstide）キナーゼ活性を有さなかった（Alessiら、1996）。かくして、ＨＡ−ＰＫＢ免疫沈降物中の全てのクロスチド（Crostide）活性はＰＫＢαにより活性化される。ＰＫＢαによりリン酸化されたヒストンＨ２Ｂ中の残基の識別現在では異なった研究所で、３つの基質すなわちヒストンＨ２Ｂ、ＭＢＰおよび Crosstide がＰＫＢα活性の評価に使用される。ＰＫＢαは４μＭのＫm および２６０Ｕ／ｍｇのＶmax で Crosstide をリン酸化し（表７．１Ａ、ペプチド１）、５μＭのＫm および６８Ｕ／ｍｇのＶmax でヒストンＨａＢを、および５μｍのＫm および２５Ｕ／ｍｇのＶmax でＭＢＰをリン酸化した。このように、ヒストンＨ２ＢおよびＭＢＰのＶmax は Crosstide の場合のそれぞれ１／４および１／１０である。ＰＫＢαによりリン酸化されたヒストンＨ２Ｂ中の残基を識別するために、³²ＰラベルヒストンＨ２Ｂをトリプシンで消化し（方法参照）、生成ペプチドをｐＨ１．９においてＣ18カラム上でクロマトグラフイーに処した。１９．５％アセトニトリルで溶離する唯一の主要³²Ｐラベルペプチド（Ｔ１と呼称）が観察（図１７Ａ）された。そのペプチドはホスフォセリンを含んでおり（データ示さず）、その配列はヒストンＨ２Ｂの残基３４で始まり、および単一放射能バーストは、エドマン分解（図１７Ｂ）の第３サイクル後に生起しており、このことは、配列Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ− Ｔｙｒ以内のＳｅｒ−３６においてＰＫＢαがヒストンＨ２Ｂをリン酸化することを示している。かくして、Crosstide においてリン酸化されたセリンの様に、ヒストンＨ２ＢのＳｅｒ−３６はＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ− Ｓｅｒ−Ｈｙｄモチーフ（ここでＨｙｄは嵩高疎水性残基−Crosstide中のＰｈｅ、Ｈ２Ｂ中のＴｙｒ）中に存在する。ＰＫＢαの基質特異性に対する分子的基礎ＰＫＢαに対する基質特異性必要条件をさらに特性化するために、発明者はCr osstide のＣ末端およびＮ末端から引き続いて残基を除去することにより、ＰＫＢαにより効果的にリン酸化された最少配列を先ず決定した。Ｎ末端グリシンおよびＣ末端から３残基までの除去は、ＰＫＢαによるリン酸化の反応速度には影響しなかった（表７．１Ａ、ペプチド１および５の比較）。しかしＮまたはＣ末端のいずれかをさらに切り詰めると、リン酸化は事実上廃止する(abolished) （表７．１Ａ、ペプチド８および９）。ＰＫＢα（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）により効果的にリン酸化された最少ペプチドは期待通り第２セリン残基で専らリン酸化されることが判った。この発見と一致するように、このセリンがアラニンに変わった場合のペプチドはＰＫＢαによりリン酸化されなかった（表７．１Ａ、ペプチド７）。したがつて、さらなる全ての研究は、表７．１Ａ（下記参照）中のペプチド５の変異体を用いて実施した。ペプチド５（表７．１Ａ）の第２セリンをスレオニンにより置換した場合のペプチドは３０μＭのＫm および不変のＶmax でリン酸化された（表７．１、ペプチド６）。取り入れられた全ての³²Ｐ放射能はホスホスレオニンとして存在し、かつ固相配列決定によれば、このペプチドは期待通り第２スレオニン残基においてのみリン酸化されることが明らかになった（データ示さず）。かくしてＰＫＢ αはセリン残基はもとよりスレオニンもリン酸化できるが、セリンの方を優先する。次に発明者らはペプチド５中の２つのアルギニンのいずれかをリシンに変えた。これらの置換はＰＫＢαによるリン酸化の速度を著しく低減させ（表７．１Ａ、ペプチド１０および１１）、両位置におけるアルギニン（単に任意の塩基性残基ではなく）の必要性を実証した。次いで発明者らは、Ｃ末端に接近して位置する残基をペプチド５中のリン酸化セリンに変えた場合の効果を試験した（表７．１Ｂ）。このデータによれば、この位置における大きな疎水性残基の存在が有効なリン酸化には必須であり、漸進的にＫm が増加するにつれて、この位置におけるこの残基の疎水性が減少することを明瞭に示している（表７．１Ｂ、残基１から４）。Ｃ末端残基をＬｙｓで置換するとＫm が１８倍増加し、かつこの位置をＧｌｕまたはＰｒｏのいずれかで置換するとリン酸化は殆ど廃止する（表７．１Ｂ、ぺプチド５−７）。２残基Ｎ末端に位置するＴｈｒをリン酸化セリンで置換すると、試験したアミノ酸のいずれもＫm が増加した（表７．１Ｃ）。Ａｌａで置換するとＫm は僅か２−３倍増加しただけであったが、他の残基で置換すると一層有害であり、Ａｓｎ（Ｔｈｒ同様のサイズで親水性の残基）で置換するとリン酸化は殆ど廃止した（表７．１Ｃ）。１残基Ｎ末端に位置するＳｅｒをリン酸化セリンで置換しても、試験したアミノ酸のいずれに関してもＫm を増加させるが、その効果は位置ｎ −２（表７．１Ｃ）におけるよりも厳しくない。残基ｎ−２およびｎ−１を両方共Ａｌａに変えると、生成ペプチドＲＰＲＡＡＳＦはＰＫＢαによりリン酸化されるが、Ｋm のみはＲＰＲＴＳＳＦよりも５倍高かった。対照的にペプチドＲＰＲＧＧＳＦ、ＲＰＲＡＧＳＦ、およびＲＰＲＧＡＳＦのリン酸化の効果はより低かった（表７．１Ｃ）。ＰＫＢαの基質特異性のＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１およびｐ７０Ｓ６キナーゼとの比較ＭＡＲＫＡＰ−Ｋ１およびｐ７０Ｓ６キナーゼはＰＫＢαによりリン酸化されたＧＳＫ3 中の同じ残基をリン酸化し、合成ペプチドを用いた研究によれば、ＭＡＲＫＡＰ−Ｋ１およびｐ７０Ｓ６キナーゼも塩基性残基が位置ｎ−３およびｎ−５に存在するペプチドを優先的にリン酸化する（Leightonら、1995）ことが判明したので、発明者らはＭＡＲＫＡＰ−Ｋ１、ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＰＫＢαａの特異性を詳細に比較した。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ１およびｐ７０Ｓ６キナーゼはそれぞれ０．２−３．３μＭという著しく低いＫm 値でペプチドＫＫＫＮＲＴＬＳＶＡおよびＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡをリン酸化する（表７．２）。しかしこれらのペプチドはＰＫＢ αにより５０−９００倍高いＫm 値でリン酸化された（表７．２Ａ、ペプチド１および２）。ｐ７０Ｓ６キナーゼに対する比較的特異的な基質であるペプチドＫＫＲＮＲＴＬＴＶ（Leightonら、1995）もＰＫＢαにより著しく不十分にリン酸化された（表７．２Ａ、ペプチド４）。 Crosstide はＰＫＢαと同様の効率でｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１によりリン酸化された（(Leinghton ら、1995)；表７．２Ｂ −ペプチド１および図１８）。しかし、ペプチドＲＰＲＴＳＳＦを生じさせるための Crosstide の切り詰めはＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１によるリン酸化にとり有害で、ｐ７０Ｓ６キナーゼの場合一層悪い（表７．２Ｂ−ペプチド１および２ならびに図１８）。その上、ＲＰＲＴＳＳＦ中のリン酸化セリンをスレオニンに変更するとｐ７０Ｓ６キナーゼによるリン酸化の場合のＫm をＰＫＢαの場合よりも一層増加させ、かつＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１によるリン酸化を殆ど廃止させた（表７．２Ｂ−ペプチド３および図１８）。このペプチドＲＰＲＡＡＳＦはＰＫＢα の速度と本質的に同じ速度でＭＡＰＫＡＰによりリン酸化された；しかし、ｐ７０Ｓ６によるリン酸化は事実上破棄された（表７．２Ｂ−ペプチド４および図１８）。これらの観察に基ずいて発明者らはペプチドＲＰＲＡＡＴＦを合成した。このペプチドはＰＫＢαにより２５μｍのＫm およびＲＰＲＴＳＳＦに類似のＶmat でリン酸化されたが、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはｐ７０Ｓ６キナーゼのいずれによっても十分にはリン酸化されなかった（表７．２Ｂ−ペプチド５、図１８）。図１８では、Crosstide の場合の評価におけるプロテインキナーゼ濃度は０．２Ｕ／ｍｌであり、かつ各ペプチド基質は濃度３０μＭで評価した。充填バーはＰＫＢα活性を示し、ハッチングのバーはＭＡＲＫＡＰキナーゼ−１活性を、グレーのバーはｐ７０Ｓ６キナーゼ活性を示す。各プロテインキナーゼの活性は Crosstide（１００）に対して比較したそれらの活性を示す。結果は、それぞれ３回繰り返した２回の実験の場合の±ＳＥＭを示す。議論発明者らは、ＰＫＢαによる有効なリン酸化に対する最少共通配列はＡｒｇ− Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ｓｅｒ−Ｈｙｄ［ここでＸａａは任意のアミノ酸、ＹａａおよびＺａａはグリシン以外の小さなアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ）であり、Ｈｙｄは嵩高疎水性残基（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ）である］であることを確認した（表７．１）。最低Ｋm 値を有するヘプタペプチドはＲＰＲＴＳＳＦであり、そのＫm ５μＭなる値は他のプロテインキナーゼの場合に確認された最良ペプチド基質の多くに匹敵する。このペプチド（２５０ｎｍｏｌｅｍｉｎ −１ｍｇ−１）の場合のＶmax は、ＰＫＢαがこのプロテインキナーゼを過剰発現するＩＧＦ−１刺激２９３細胞の抽出物から免疫沈降により得られたことから、過小評価の可能性もあり、またこのＰＫＢαの重要部分がＩＧＦ−１処理により活性化されなかった可能性もある。位置ｎ−３とｎ−５（このでｎはリン酸化の部位を示す）の両アルギニン残基の必要性は重要であり、これはいずれかの残基をリシンで置換するとリン酸化が劇的に減少するからである。セリンとスレオニン残基の両方をＡｌａに変えるとＫm 値は約５倍と僅かに増えるだけであるが、位置ｎ−１およびｎ−２ではセリンとスレオニンが好まれた。位置ｎではセリンが好まれたが、これはセリンをスレオニンに変えると６倍ほどＫm 値が増えるからである。したがって、Ｋm ２５ μｍおよびＲＰＲＴＳＳＦに類似のＶmax でリン酸化されたペプチドＲＰＲＡＡＴＦは、部分精製調製物でＰＫＢαを評価する場合のより良い基質となろう。これはクロスチド（Crosstide）とは異なって、１つのリン酸化可能残基のみを含み、かつＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはｐ７０Ｓ６キナーゼによっては顕著にリン酸化されないからである（表７．２、図１８および下記参照）。この研究では位置ｎ−４のプロリンは変更しなかったが、これはこの残基がＰＫＢαの特異性に対して臨界的ではないことが既に明瞭であったからである。残基ｎ−４はＧＳＫ3 βではプロリンであるが、ＧＳＫ3 αではアラニンである。両ＧＳＫ3 イソ型は in vitro では等しく良好な基質であり（Cross ら、1995）、ペプチドＧＲＡＲＴＳＳＦＡ（ＧＳＫ3 αにおける配列に該当）は１０μＭのＫm およびＶmax ２３０Ｕ／ｍｇでＰＫＢαによりリン酸化される（表７．１、ペプチド２）。そのうえヒストンＨ２Ｂでは、ＰＫＢαリン酸化部位に対して４アミノ酸Ｎ末端に位置する残基はセリン（図１７）である。位置ｎ−１およびｎ −２にＧｌｕおよびＬｙｓが存在することは、ヒストンＨ２ＢがペプチドＲＰＲＴＳＳＦの１／４のＶmax でＰＫＢαによりリン酸化される理由を説明できる。インスリンおよび他の成長因子であるｐ７Ｓ６キナーゼおよびＭＡＰＫＡＰ− Ｋ１により活性化される他の２つのプロテインキナーゼは、位置ｎ−３およびｎ −５において塩基性残基を必要とし（Leightonら、1995）、これらもまたＧＳＫ 3 を in vitro でリン酸化し、かつ不活性化する理由も説明している（Sutherla ndら、1993）。実際のところ、ＰＩ３−キナーゼの阻害剤により阻止されるインスリンによる阻害とは異なり、ＥＧＦによるＧＳＫ3 の阻害はＰＩ３キナーゼの阻害剤によって部分的に弱められるだけであるから、ＭＡＰＫＡＰＫ１はＥＧＦによるＧＳＫ3 の阻害においてある種の役割を演じている証拠がある。その上、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＥＧＦによるＧＳＫ3 αおよびＧＳＫ3 βの阻害はＭＡＰキナーゼキナーゼ−１（Elder ら、1995）の優性ネガテイブ変異体の発現により著しく阻止される。反対に、ｐ７０Ｓ６キナーゼはこれまでに試験した細胞中ではＧＳＫ3 の阻害に対して速度限定的ではなく、その理由はＥＧＦまたはインスリンによるｐ７０Ｓ６キナーゼの活性化を阻止するラパマイシンがこれらのアゴニストによるＧＳＫ3 の阻害に影響しないためである（Cross ら、 1995、および Saitoら、1994）。さらに、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ＭＡＰＫＡＰＫ１およびＰＫＢα間の類似性の中には、位置ｎ＋１のＰｒｏを含むペプチドのリン酸化ができず、同位置のリシンを好まないことが包含される。このことは、in vivo でこれらのキナーゼはＭＡＰキナーゼ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフをリン酸化する）またはプロテインキナーゼＣ（リン酸化部位よりＣ末端塩基性残基を好む）と同じ残基をリン酸化する様子がないことを暗示している。しかし、この度びの研究では、これらの酵素の特異性には著しい差異があることも明瞭になった。特にＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１および（より少ない程度で）ｐ７０Ｓ６キナーゼはリシンによる位置ｎ−５でのＡｒｇの置換に耐え得るのに反して、ＰＫＢαは耐え得ない［表７．１参照、表７．２および（Leightonら、1995）］。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびｐ７０Ｓ６キナーゼも位置ｎ−３でのＬｙｓによるＡｒｇの置換にはある程度は耐え得る。例えばペプチドＫＫＲＮＫＴＬＳＶＡは、ペプチドＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ（表７．２参照）の場合のＫm 値０．７および１．５μＭに比べて、それぞれＫm 値１７および３４μＭでＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびｐ７０Ｓ６キナーゼによりリン酸化される。対照的にＰＫＢαは、ぺプチドＫＫＲＮＫＴＬＳＶＡを（表７．２Ａ）、または位置ｎ−３でＡｒｇを欠く他のいずれのぺプチドをもリン酸化しない。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１ではなくてＰＫＢαおよびｐ７０Ｓ６キナーゼはＳｅｒはもとよりＴｈｒをリン酸化し（表７．１Ａ）、かつ位置ｎ＋２におけるいずれかの残基を欠くぺプチドをリン酸化できる［（Leighton 、ら、1995）および表７．２Ａ］のに反して、ｐ７０Ｓ６ではなくてＭＡＰＫＡＰ −Ｋ１はペプチドＲＰＲＴＳＳＦのｎ−１およびｎ−２両位置のＡｌａによる置換に耐え得る（表７．２Ｂ）。これらの差異はぺプチドＲＰＲＡＡＴＦがＰＫＢ αに対するかなり特異的な基質であることの理由を説明している。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１およびｐ７０Ｓ６キナーゼ（ＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ）に対する最良ぺプチド基質の１つは、位置ｎ−３およびｎ−５にＡｒｇが存在するにも係わらず、ＰＫＢα（表７．２、ぺプチド２）に対しては不充分な基質であった。位置ｎ−１のＬｅｕおよび位置ｎ＋１のＶａｌの存在は、ＰＫＢαが前者位置の小さな親水性残基および後者位置の大きな疎水残基を好むので、リン酸化に対する高いＫm 値を多分説明できそうである（表７．１および７．２）。実施例９：この実施例は、野生型または構成的に（constitutively）活性化されたＰＫＢのいずれかと共にＧＳＫ3 が２９３細胞中で共発現すると、ＧＳＫ3 がリン酸化され、かつ不活性化されるようになることを示す。しかし、Ｓｅｒ−９がＡｌａ残基に変異しているＧＳＫ3 変異体の共発現の場合、これらの条件下では不活性化されない。これらの実験は、ＰＫＢα活性化が細胞性環境中でＧＳＫ3 のリン酸化および不活性化を仲介できるので、特異的ＰＫＢ阻害剤を捜す評価系として利用できる根拠を提供する。配列ＥＦＭＰＭＥ（ＥＥ）抗体およびその（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）ｃ−Ｍｙｃを認識するモノクロナール抗体は Boehringer（Lewis、ＵＫ）から購入した。発現ベクターの構築および２９３細胞中へのトランスフエクションＨＡ−ＰＫＢα、ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢおよび３０８Ｄ／４７３ＤＨＡ−ＰＫＢαについては先の記載がある（Alessiら、1996）。Ｎ末端にＥＦＭＰＭＥ（ＥＥ）エピトープ標識を有するヒトＧＳＫ3 Ｂを発現するＤＮＡ構築体を次のように調製した：pBluescript ＳＫ+ベクター、およびオリゴヌクレオチド GCGGAGATCTGCCACCATGGAGTTCATGCCCATGGAGTCAGGGCGGCCCAGAACC および［ｂｇｌＩＩ部位（下線）およびＢｓｐｅＩ部位（二重下線）を伴う］中でヒトＧＳＫ3 β ｃＤＮＡクローンを鋳型として標準ＰＣＲ反応を実施した。次いで三法連結（three-way ligation）を開始して生成ＰＣＲ産物をＢｇ１ＩＩ −ＢｓｐｅＩ断片としてＧＳＫ3 βのC末端BｓｐｅＩ−ＣｌａＩ断片と共にｐＣＭＶ5 ベクター（Andersonら、1985）のＢｇ１ＩＩ−ＣｌａＩ部位中にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定によりこの構築体を確認し、メーカーの指示に従って Quiagen プラスミド Mega キットを用いて精製した。このｃ−ＭｙｃＧＳＫ3、ＢＡ９構築体はＳｅｒ−９がＡｌａに変異しているＧＳＫ3βをコードし、かつＣ末端にｃ−ｍｙｃエピトープラベルを有し、かつSperberらの記載のように調製した。次いでこのｃ−０ＭｙｃＧＳＫ3β Ａ9遺伝子をｐｃＭＶ5 真核発現べクターのｘｂａＩ／ＥＣＯＲＩ部位中にサブクローンした。ＰＫＢαとＧＳＫ3 βとの共トランスフエクションおよびその評価径１０ｃｍ皿上に成育した２９３細胞を、Alessi ら（1996）の記載に正確に準拠してＨＡ−ＰＫＢ、ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢまたはＨＡ−３０８Ｄ／４７３Ｄ− ＰＫＢの存在または不在下にＥＥ−ＧＳＫ3、Ｍｙｃ−ＧＳＫ3 Ａ9を発現するＤＮＡ構築体１０μｇを用いてランスフエクションした。溶解に先立ちこの細胞を血清の存在なしに１６時間成育させ、次いで１．０ｍｌの氷冷緩衝液Ａ［50mM Tris/HCl pH 7.5、1mM EDTA、1mM EGTA、1％（容量）Triton X100、1m Mオルトペルバナジン酸塩ナトリウム、 10mM ナトリウムグリセロホスフエート、 50mM NaF、 5mM ナトリウムピロホスフエート、 1 μM Microcystin-LR 、 0.27M スクロース、 1mM ベンズアミジン、 0.2mM フエニルメチルスルホニルフルオライド、 10μg/ml leupeptin、および 0.1%(容量)2-メルカプトエタノール］１．０ｍｌ中で溶解した。この溶解物を１３，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離し、上澄みのアリコット（１００ｕｇプロテイン）をＥＥモノクロナール抗体１ｕｇに結合したプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ５μｌと共に震盪台上で３０分間保温した。この懸濁物を１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−抗体−ＥＥ−ＧＳＫ3 β複合体を０．５ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａ１．０ｍｌで２回洗浄し、緩衝液Ｂ［50mM Tris pH 7.5、0.1mM EGTA、0.01 %(容量) Brij-35および 0.1% （容量）2-メルカプトエタノール］で３回洗浄し、さらに前記（Cross ら、1994）の通りＰＰ２Ａまたは microcystin 不活性化ＰＰ２Ａのいずれかと保温後、この免疫沈降物のＧＳＫ3 を評価した。結果ＰＫＢαとのＧＳＫ3 βの２９３細胞中での共トランスフエクションは結果としてＧＳＫ3 のリン酸化および不活性化を起こす野生型ＰＫＢαを発現するＤＮＡ構築体、触媒的に不活性なＰＫＢαまたは構成的に活性なＨａ−（３０８Ｄ／４７３Ｄ）−ＰＫＢαの存在または不在のいずれかで、ＥＥ−エピトープ標識ＧＳＫ3 β発現ＤＮＡ構築体を用いてヒト胎児腎２９３細胞をトランスフエクションした。細胞を１６時間血清枯れ状態に置いた。トランスフエクション後３６時間、細胞を溶解し、モノクロナールＥＥ抗体を用いて溶解物からＧＳＫ3βを免疫沈降させ、ＰＰ２Ａ処理前または後でＧＳＫ3 β活性を測定した。ＥＥＧＳＫ3 βが単独で発現された場合または触媒的に不活性なＰＫＢαの存在下で発現された場合、ＥＥ−ＧＳＫ3 βのＰＰ２Ａによる処理は単に活性の約１２％増加という結果になった（図１９Ａ）。しかし、ＥＥ− ＧＳＫ3 βを野生型ＰＫＢαまたは構成的に活性化された３０８Ｄ／４７３Ｄ− ＨＡ−ＰＫＢαのいずれかと共発現させると、これらの細胞溶解物からのＥＥ− ＧＳＫ3 のＰＰ２Ａによる処理はＧＳＫ3 活性がそれぞれ６８％および８５％もの増加という結果になった。ＨＡ−ＰＫＢまたは構成的に活性な３０８Ｄ／４７３Ｄ−ＨＡ−ＰＫＢαとのＭｙｃ−ＧＳＫ3 βＡ9 の共発現は、ＰＰ２Ａ（図１９Ｂ）により再活性化されるべきその能力により判定されるように、結果としてこのＧＳK3変異体の有意な不活性化を起こさなかった。これらのデータは、細胞性環境下でさえもＰＫＢαは、Ｓｅｒ−９におけるＧＳＫ3 βのリン酸化およびこの酵素の不活性化が可能であることを実証している。ＥＥ−ＧＳＫ3 βおよびＨＡ−ＰＫＢαの相対的レベルを判断するために、ＥＥ−ＧＳＫ3 およびＨＡ −ＰＫＢαを等容量の細胞溶解物から免疫沈降させ、免疫沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に流し、ゲルをクーマシーブルーで染色した。これらの実験は、野生型ＨＡ−ＰＫＢαおよび３０８Ｄ／４７３Ｄ−ＰＫＢαの両方がＧＳＫ3 αよりも２０倍から３０倍もの高いレベルで発現されるのに反して、ＫＤ− ＰＫＢαは野生型ＰＫＢαの約１／５のレベルであることを明らかにした。免疫沈降に用いた条件下、ＰＫＢαはＧＳＫ3 βとは共免疫沈降せず、またはＧＳＫ３βはＰＫＢαとは共免疫沈降しなかった（データは示さず）。すべての形のＰＫＢαとＥＥ−ＧＳK3 βとの共発現は、結果として細胞中単独で発現した場合に比べてＥＥ−ＧＳK3 βの発現レベルが約１／２−１／３に減少する結果になった。実施例１０：ＰＫＢの活性に影響する薬剤を識別するための基本的評価５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５、０．１ｍＭＥＧＴＡ、０．１％（容量）２−メルカプトエタノール、２．５μＭＰＫＩ、プロテインキナーゼ基質（３０μＭ）中にプロテインキナーゼ（０．２Ｕ／ｍｌ）、および表示濃度のＲｏ−３１８２２０またはＧＣ１０９２０３Ｘ（テスト阻害剤）を含む４０μ ｌ検定ミックスを調製した。氷上で１０分間保温後、５０ｍＭ酢酸マグネシウム１０μおよび０．５ｍＭ［γ³²Ｐ］ＡＴＰ（１００−２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）の添加により反応を開始させた。ＰＫＣの混合イソ型評価のために、この保温物中には２０μＭジアシルグリセロール、０．５ｍＭＣａＣｌ₂および１００μＭホスフアチジルセリンも存在させた。３０℃で１５分間評価し、次いで反応を終了し、文献記戦のように分析した（Alessiら、1995）。活性の１単位は、１分間に基質１ｎｍｏｌのリン酸化を触媒した酵素量であった。各評価におけるＤＭＳＯの最終濃度は１容量％であった。このＤＭＳＯ濃度は、これらの酵素のいずれをも阻害しない。ＰＫＣの混合イソ型はヒストンＨ１を基質として用いて評価し、一方、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１βおよびｐ７０Ｓ６キナーゼはペプチドＫＫＲＮＲＴＬＳＶＡ（Leighton ら、1995）を用いて評価した。プロテインキナーゼＢはペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ［９］を用いて評価し、およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２はペプチドＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ（Stokoeら、1993）を用いて評価した。ｐ４２ＭＡＰキナーゼはＭＢＰおよびＭＡＰＫＫ−１を用いて評価し、かつｃ−ＲａｆｌはAlessi 1995 記載のように評価した。結果成長因子、サイトカインおよび細胞性ストレスにより活性化されたプロテインキナーゼに及ぼすＲｏ３１８２２０およびＧＦ１０９２０３Ｘの影響。発明者らの評価（図２０Ａ）における５ｎＭのＩＣ₅₀を用いて、ＰＫＣの混合イソ型がＲｏ３１８２２０により強力に阻害された。対照的に、成長因子（ｃ− Ｒａｆ１、ＭＡＰＫＫ−１、ｐ４２ＭＡＰキナーゼ）により活性化された多数のプロテインキナーゼ、ならびに細胞性ストレスおよび前炎症性サイトカイン（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２）により活性化された１つのプロテインキナーゼはinvitro ではＲｏ３１８０２２によって顕著には阻害されなかった（図２０Ａ）。インスリンおよび成長因子に応答して活性化される酵素すなわちプロテインキナーゼＢはＰＫＡの場合のＩＣ₅₀同様にＲｏ３１８２２０（１μＭのＩＣ₅₀、図２０Ｂ）により阻害された。しかし驚いたことに、ｐ42およびｐ44 ＭＡＰキナーゼの直下流に在り、かつこの経路を刺激するすべてのアゴニストに応答して活性化される酵素ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１Ｂは、混合ＰＫＣイソ型より一層強力にＲｏ３１８２２０により阻害された（ＩＣ₅₀＝３ｎｍ、図２０Ｂ）。ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１Ｂから明瞭に区別される、成長因子刺激シグナル経路上に在るｐ７０Ｓ６キナーゼもまたＲｏ３１８２２０により強力に阻害されたＩＣ₅₀＝１５ｎＭ、図２０Ｂ）。Ｒｏ３１８２２０の代わりにＧＦ１０９２０３Ｘを用いても同様の結果が得られた。以前報告されたように（Toullec ら、1991）、ＧＣ１０９２０３Ｘは、プロテインキナーゼＢ（図２１）もしくはｃ−Ｒａｆ、ＭＡＰＫＫ−１およびｐ42 ＭＡＰキナーゼを阻害することなくＰＫＣの混合イソ型を阻害した（ＩＣ₅₀＝３０ｎＭ）。しかし、ＭＡＰＫＡＰ−ＫＩＢおよびｐ70 Ｓ6キナーゼはＩＣ₅₀値がそれぞれ５０ｎＭおよび１００ｎＭでこの化合物により強力に阻害された（図２１）。一般材料および方法組織培養試薬、myelin 塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミクロシスチン−ＬＲ、およびＩＦ−１は Life Technologies Inc．（Paisley，UK）から入手、インスリンは Novo-Nordisk (Bagsvaerd，Denmark)から、無リン酸塩 Dulbecco′smi nimal essential medium（DMEM）は（ICN，0xen，UK）から、プロテインG-Sepha rose および CH-Sepharose は Pharmacia（MiltonKeynes．UK）から、アルキル化トリプシンは romega（Southampton，UK）から、４−ビニルピリジン、wortma nnin およびヤギからのフルロイソチオシアネートラベル抗マウスIgG は Si gma-Aldrich（Poole，Dorset，UK）から入手し、ポリクロナール抗体はペプチド RPHFPQFSYSASGTA（げっ歯類ＰＫＢαの最後１５残基に該当）およびMTSALATMRV DYEQIK （ヒトＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２の残基３５２から３６７に該当）に対してヒツジ中で生成し、ペプチド-CH-Sepharose 上で親和精製した。モノクロナールＨＡ抗体は組織倍地 12CA5 ハイブリドーマから精製し、Protein GSeph arose 上でクロマトグラフイーにより精製した。ＰＫＢαの残基４６５−４７８に該当するペプチド RPRHFPQFSYSAS は Applied Biosystems 430A ペプチドシンテサイザーで合成した。ヒトＭＡＲＫＡＰキナーゼ−２の残基４６−４００をコードするｃＤＮＡはグルタチオンＳ−トランスフエラーゼ融合タンパク質として E．Coli 中に発現させ、前記（Ben-Levyら、1995）に従いM r．A．Clifton （University of Dundee）により p38/RK MAP KINASE を用いて活性化した。赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ配列 YPYDVPDYA を認識するモノクロナール抗体、Protein G-Sepharose およびヒストンＨ２Ｂは Boehringer（Lewes，UK ）から入手した。ＭＡＲＫＡＰキナーゼ−１（Sutherlandら、1993）およびｐ７０Ｓ６キナーゼ（Leightonら、1995）はウサギ骨格筋およびラット肝からそれぞれ精製した。発現ベクターの構築ヒトＨＡＰＫＢαおよび kinase − dead（K179A）ＨＡ−ＫＤ−ＰＫＢαをコードするｐＥＣＥ構築物については既に述べた（Andjelkovicら、1996）。Ｓｅｒ−４７３（ＨＡ−４７３ＡＰＫＢαおよびＨＡ−４７３ＤＰＫＢαにおける変異体はアミノ酸４０６−４１４をコードする５’オリゴヌクレオチドを用い、かつアミノ酸４６８−４８０をコードする３’オリゴヌクレオチドを変異させてＰＣＲにより創り、生じたＰＣＲ産物はCelII-EcoRI 断片としてｐＥＣＥ．ＨＡ−ＰＫＢα中にサブクローンした。Ｔｈｒ−３０８変異体（ＨＡ−３０８ＡＰＫＢαおよびＨＡ３０８ＤＰＫＢα）は２段階ＰＣＲ技法（Noら、1989）により創り、NotI-EcoRI 断片としてｐＥＣＥ．ＨＡ−ＰＫＢ中にサブクローンした。二重変異体ＨＡ−３０８Ｄ／４７３ＤＰＫＢは４７３ＤをコードするCelI I-EcoRI 断片をｐＥＣＥ．ＨＡ−３０８ＤＰＫＢα中にサブクローンして作った。サイトメガロウイルス由来の発現構築体の構築は、適当なｐＥＣＥ構築体からのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片をｐＣＭＶ5ベクター（Andersson ら、1989）の同じ制限部位中にサブクローンした。すべての構築体は制限分析により確認し、かつ配列決定し、さらにQuiagen Pl asmid Maxi Kit を使用しメーカーの指示に従って精製した。すべてのオリゴヌクレオチド配列は依頼時入手できる。Ｌ6 筋管の³²ＰラベルおよびＰＫＢαの免疫沈降Ｌ6 細胞を径１０ｃｍ皿上の筋管中に分化した（Hundalら、1992）。この筋管はＤＭＥＭ中に一夜放置した血清由来のもので、無リン酸塩ＤＭＥＭ中で３回洗浄し、この媒体５ｍｌを用いてさらに１時間保温した。次いでこの筋管を無リン酸塩ＤＭＥＭで２回洗浄し、無担体［³²Ｐ］オルトリン酸塩（１ｍＣｉ／ｍｌ）を用いて４時間保温した。１００ｎＭ wortmannin の存在または不在条件で１０分間保温後、この筋管を１００ｎＭインスリンの存在または不在条件下、３７℃ で５分間刺激し，氷上に置き、媒体を吸引し、筋管を氷冷ＤＭＥＭ緩衝液で２回洗浄し、次いで氷冷緩衝液Ａ（50mM Tris/HCl pH7.5、１mM EDTA １mM EGTA、1% (容量) Triton XI00、lmM ナトリウムオルソペルバナジン酸塩、10mM ナトリウムグリセロリン酸、 50m1NaF、 5mM ナトリウムピロホスフエート、 1 μM Microcystin-LR 、 0.27 M スクロース、 1M ベンズアミジン、 0.2mM フエニルメチルスルホニルフルオライド、 10 μg/ml ロイペプチン、および 0.1％（容量）2-メルカプトエタノール）の１．０ｍｌを用いて溶解した。この溶解物を１３，０００×ｇにおいて４℃で１０分間遠心分離し、震盪台上で３０分間、50μｇの前免疫ヒツジＩｇＧに結合した Protein G-Sepharose ５０μｌと共に保温した。この懸濁液を１３，０００×ｇで２分間遠心分離し、上澄み液を６０μｇのＰＫＢα抗体（Harl ow および Lane、1988）に共有結合した３０μｌのProtein G-Sepharose で６０分間保温した。この Protein G-Sepharose- 抗体- ＰＫＢα複合体を０．５ＭＮａＣｌを含有する１．０ｍｌの緩衝液Ａで８回、50mM ris/HCl pH.7.5、0.1 mM EGTA および 0.1％（by vol）2-メルカプトエタノール（緩衝液Ｂ）を用いて２回洗浄した。免疫沈降したＰＫＢαの評価およびタンパク質決定各免疫沈降物（それぞれ免疫沈降した全ＰＫＢαの僅か５％を含む）の３アリコットのそれぞれについてペプチド GRPRTSSFAEG のＰＫＢα活性を前記のように評価した（Cross ら、1995）。活性の１単位は１分間に基質１ｎｍｏｌのリン酸化を触媒する量であった。プロテイン濃度は Bradford 、1976の方法により決定した。リン酸化したＰＫＢαの in vivo でのトリプシン消化２質量％ＳＤＳおよび２容量％２−メルカプトエタノールの等容量中に上記免疫沈降ＰＫＢαを添加し、１００℃で５分間保温した。室温に冷却後、４−ビニルピリジンを最終濃度２容量％になるように添加し，混合物を震盪台上で３０℃ 、１時間保温し，次いで１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動した。オートラジオグラフイー後、ラットＰＫＢαに該当する６０ｋＤａバンドを切り取り、ゲル片を０．１％質量ＳＤＳおよび５容量％の２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭＮ-エチルモルホリン・ＨＣｌ pH 7.7の５容量中に均一化した。この懸濁液を震盪台上で３７℃で１分間保温し、次いで１３，００×ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を捕集した。ペレットを同一緩衝液５容量でさらに１時間保温し、、１３，０００×ｇで１分間遠心分離した。２つの上澄み液（８０−９０％の³² Ｐ放射能を含む）を併合し、１００質量％トリクロロ酢酸０．２容量を添加、次いでこの試料を氷上で１時間保温した。この懸濁液を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄し、ペレットを水０．２ｍｌで５回洗浄した。次いでペレットを１μｇのアルキル化トリプシンを含む 50M Tris/HCl pH 8.0、 0.1%(by vol) Triton X100の０．３ｍｌを用いて３０℃で保温した。３時間後、トリプシンをさらに１μｇ添加し，上澄み液をさらに１２時間放置した。グアニジニウム・塩酸塩（８Ｍ）を添加して最終濃度１．０Ｍとして残ったＳＤＳのいずれも沈殿させ、氷上に１０分間放置ご、懸濁液を１３，０００×ｇで５分間遠心分離した。³²Ｐ放射能の９０％を含む上澄み液を図２の説明の記載に準拠してＶｙｄａｃＣ１８上でクロマトグラフイーにかけた。２９３細胞のトランスフエクションおよびＨＡ標識ＰＫＢαの免疫沈降ヒト胎児腎２９３細胞を５％ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で径１０ｃｍ皿上で１０％胎児子牛血清含有ＤＭＥＭ中で培養した。細胞を１０ｃｍ皿当たり密度２×１０６に分割し、３７℃で２４時間後に、媒体を吸引し、１０％胎児子牛血清を含む新規調製ＤＭＥＭ１０ｍｌを添加した。この細胞は改変カルシウムリン酸法（ Chenおよび Okayama、1988）により１μｇ／ｍｌＤＮＡ／皿でトランスフエクションされた。０．４５ｍｌ滅菌水中の１０μｇプラスミドＤＮＡを５０μｌの滅菌２．５ＭＣａＣｌ２中に添加し、次いで０．５ｍｌの５０ｍＭＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸／ＨＣｌｐＨ６．９６、０．２８ＭＮａＣｌおよび１．５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄を添加した。生成混合物を１分間渦巻回転に処し（vortexed）、室温に２０分間放置し、次いで２９３細胞の１０ｃｍ皿に滴下した。この細胞を３％Ｃ０2 雰囲気下に３７℃で１６時間放置し、次いで媒体を吸引し、１０％胎児子牛血清含有新鮮ＤＭＥＭで置き換えた。この細胞を５％ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で１２時間保温し、さらに血清不在下でＤＭＥＭ中、１２時間保温した。細胞を０．１％ＤＭＳＯの存在下、または０．１％ＤＭＳＯ中の１００ｎＭ wortmannin の存在下に１０分間前保温し、次いで１００ｎＭインスリンまたは５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１のいずれかで wortmarnnin の連続的存在下で１０分間刺激した。氷冷ＤＭＥＭで２回洗浄後、細胞を氷冷緩衝液Ａ１．０ｍｌ中に溶菌し、溶解物を１３，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上澄み液のアリコット（１０μｇプロテイン）を２μｇのＨＡモノクロナール抗体に結合した５μｌのProtein G-Sepharoseを用いて震盪台上で６０分間保温した。この懸濁液を１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−抗体−ＨＡ−ＰＫＢα複合体を０．５ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａ１．０ｍｌで２回、緩衝液Ｂで２回洗浄し、さらに上記のようにＰＫＢα活性を評価した。ＨＡ−ＰＫＢαでトランスフエクションされた２９３細胞の³²ＰラベリングＨＡ−ＰＫＢａＤＮＡ構築体でトランスフエクションした２９３細胞を無リン酸塩ＤＭＥＭで洗浄し、Ｌ6 筋管の場合に記載したように［３２ｐ］オルトホスフエート（１ｍＣｉ／ｍｌ）と共に保温し，次いでインスリンまたはＩＧＦ１で刺激し、溶解し、さらに上記のようにＰＫＢαを免疫沈降させた。この³²ＰラベルＨＡ−ＰＫＢα免疫沈降物を洗浄し、４−ビニルピリジンでアルキル化し、電気泳動し、ラットＬ6 筋管中に存在する内因性ＰＫＢαの場合に記載したようにトリプシンで消化した。ＣＯＳ−１細胞のトランスフエクションおよびＨＡ−ＰＫＢαの免疫沈降ＣＯＳ−１細胞を５％ＣＯ₂雰囲気下、１０％ＦＣＳで補給したＤＭＥＭ中に３７℃で保持した。７０−８０％融合細胞をＤＥＡＥデキストラン法（Seed &Ar uffo、1987）によりトランスフエクションし、４８時間後に２４時間血清枯れさせた。この細胞を、50mM Tris-HCl 、pH 7.5、120mM NaCl 1% Nonidet p-40、25m MNaF 、 40mM ナトリウム-β- グリセロホスフエート、 0.1mM ナトリウムオルソバナジン酸塩、1mM EDTA、1mM ベンズアミジン、 1mM フエニルメチルスルホニルフルオライドを含む緩衝液中で溶解し、溶解物を１３，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上澄み液を０．１容量の 50%Sepharos e 4B/25% Pansorbin（それぞれPharmacia および Calbiochem）を用いて４℃で３０分に１回予備清澄化し、次いでＨＡ−ＰＫＢαを Protein A Sepharoseビーズに結合した１２ＣＡ5 を用いて抽出物Ｉｍｇから免疫沈降させた。免疫沈降物を０．５ＭＮａＣｌ含有溶解緩衝液で２回、溶菌緩衝液で１回洗浄した。免疫ブロッテイングおよびＰＫＢα発現レベルの定量細胞抽出物を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、Immobilon 膜（Milli pore）に移した。フイルターを１ｘｚＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００および０．５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％スキムミルクを含む阻止緩衝液中で３０分間ブロックし、次いで同一緩衝液中に１０００倍希釈した１２ＣＡ５上澄み液を用いて２時間保温した。この第２抗体をヤギからの抗−マウスＩｇ（Southem Biotechnology Associates，Inc）にアルカリ結合し、その緩衝液中で１０００倍希釈した。Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手したＡＰ発色試薬を用いてメーカーの指示に従って検出を行った。ＰＫＢα発現レベルの定量は、ヤギからのフルロイソチオシアネートラベル抗−マウスＩｇＧを第２抗体として用いた化学発光、および Molecular Dynamics から市販の Storm 840/860 および ImageQua nt ソフトウエアを用いて遂行した。ＰＫＢαの評価に使用するすべてのペプチドおよび TTYADFIASGRTGRRNAIHD（サイクリックＡＭＰ依存プロテインキナーゼ−ＰＫＩの特異性ペプチド阻害剤）は Applied Biosystems 431A ペプチドシンテサイザーを使用して合成した。これらの純度（＞９５％）はＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより確認し、かつそれらの濃度は定量アミノ酸分析により決定した。ＰＫＢαの調製と評価ヒト赤血球凝集をエピトープ標識野生型（ＨＡ−ＰＫＢα）のサイトメガロウイルスベクター（ｐＣＭＶ５）の構築は前記のようである（Alessiら、1996）。１０ｃｍ皿上で成育した２９３細胞が、改変カルシウムホスフエート法（Alessi ら、1996）を用いてＨＡ−ＰＫＢα発現ＤＮＡ構築体でトランスフエクションした。この細胞は溶解に先立って１６時間血清を奪われ、ＰＫＢαの活性化のために５０ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−１の存在下、１０分間刺激された。この細胞を１．０ｍｌ氷冷緩衝液Ａ（50mM Tris/HCl pH 7.5、1mM EDTA、1mM EGTA、1%(容量)Tr iton x-100 、 1mM ナトリウムオルトバナジン酸塩、 10mM ナトリウム β- グリセロホスフエート、 50mM NaF、 5mM ナトリウムピロホスフエート、 1 μM Microcystin-LR、 0.27M スクロース、 1mM ベンズアミジン、 0.2 mM フエニルメチルスルホニルフルオライド、 10μg/ml ロイペプチン (leupeptin)、および 0.1%（容量）2-メルカプトエタノール）中に溶解し、溶解物を１３，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離し、細胞（２−３ｍｇプロテイン）の１０ｃｍ皿１つから得た上澄み液をＨＡモノクロナール抗体１０μｇに結合した２０μｌのプロテイン G-Sep haroseと共に震盪台上で６０分間保温した。この上澄み液を１３，０００×ｇで１分間遠心分離し、この rotein G-Sepharose- 抗体-HA-PKBα複合体を０．５ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａ１．０ｍｌで２回、かつ緩衝液Ｂ（50mM ris/HCl pH7.5 、 0.1mM EGTA、 0.015（by vol）Brij-35 および 0.1%（容量）2-メルカプトエタノール）を用いて２回洗浄した。このＰＫＢα免疫沈降物を Crosstide ペプチドGRPR TSSFAEG に対する活性２．０Ｕ／ｍｌになるまで緩衝液Ｂ中で希釈し、０．１ｍｌアリコットを液体窒素中で急速凍結し−８０℃で貯蔵した。ＰＫＢα免疫沈降物の解凍に際し、または−８０℃での３月以内貯蔵に際してもＰＫＢα活性の顕著な損失は生起しなかった。標準ＰＫＢαアッセイ（５０μｌ）は次のものを含有した：50mM Tris/HCl pH7.5 、 0.1mM EGTA、0.1%（容量）2-メルカプトエタノール、 2. 5 μMPKI、 0.2U/ml PKB α、 Crosstide(30 μM)、 10mM 酢酸マグネシウムおよび0.1mM ［Ｙ³²Ｐ］ATP（100-200 cpm/pmol）。この評価を３０℃で１５分間行い、アッセイ管は連続的に撹拌して免疫沈降物を懸濁状に保持し、次いで終了して文献記載のように分析した（Alessiら、1995）。活性１単位は１分間に rosstide１ｎｍｏｌのリン酸化を触媒する酵素の量であった。他のペプチド、ヒストンＨ２ＢおよびＭＢＰのリン酸化も同様な態様で実施した。ＨＡ−ＰＫＢα疫沈降物における Crosstide活性のすべてはＰＫＢαにより触媒され（結果参照）、免疫沈降物中のＰＫＢα濃度は標準としてウシ血清アルブミンを使用して、クーマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルのデンシトメータースキャニングにより推定した。タンパク質濃度は標準としてウシ血清アルブミンを用い、Bradford法により決定した（Bradfordら、1976）。ミカエリス定数（Ｋm）およびＶmax値は１／Ｖ対１／Ｓの二重逆数プロット（ここで、Ｖはリン酸化の初期速度、およびＳは基質濃度を示す）から決定した。報告した全ての動的恒数に対する標準誤差は＜± ２０％以内であり、かつデータは３回の独立決定の場合の平均値として報告した。図１６に結果を未刺激ＰＫＢαの場合に得られた結果と対比して示す。ＰＫＢαによりリン酸化されたヒストン２Ｂの典型的消化ヒストンＨ２Ｂを０．２Ｕ／ｍｌＨａ−ＰＫＢαを用いてリン酸化した。６０分後、０．２容量の１００質量％トリクロロ酢酸を添加し、試料を氷上で１時間保温した。この懸濁物を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄し、ペレットを０．２ｍｌの氷冷アセトンで５回洗浄した。このペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ８．０、アルキル化トリプシン２μｇを含む０．１容量％還元Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の０．３ｍｌ中に再懸濁し、３０℃ で１６時間保温後、消化物を１３，０００Ｘｇで５分間遠心分離した。³²Ｐ放射能の９５％を含む上澄み液を、０．１容量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を用いて平衡状態に置いたＶｙｄａｃＣ18カラム上でクロマトグラフイーにかけた。図１７に示した結果については、このカラムは流速０．８ｍｌ／分における直線的アセトニトリル濃度（斜線）を利用して展開し、フラクション０．４ｍｌを採取した。（Ａ）³²ＰラベルヒストンＨ２Ｂのトリプシンペプチドマップ、このカラムに適用した放射能の７０％が１９．５％アセトニトリルにおいて溶離した主要³²Ｐぺプチドから回収された。（Ｂ）この主要³²Ｐぺプチド（５０ｐｍｏｌ）の一部を Applied Biosystems 476A シークエンサーにより分析し、かつエドマン分解の各サイクル後に識別されたフエニルチオヒダントイン（Ｐｔｈ）アミノ酸をアミノ酸の一文字コードを用いて示す。次いでこの主要³²Ｐ−プチド（１０００ｃｐｍ）の一部を Sequelon アリールアミン膜に共有結合させ、Stok oe らが1992に記載した修飾プログラムを使用して Applied Biosystems 470Aシークエンサーで分析した。³²Ｐ放射能はエドマン分解の各サイクル後に測定した。表７．１ＰＫＢαの基質特異性に対する分子的基礎リン酸化残基は肉太活字で示し、変更された残基はアンダーラインで示す。Ｖ（１００μＭ）はペプチド１に対する０．１ｍＭペプチドにおけるリン酸化の相対速度である。ＮＤは未測定。＊発明者らはプロリンで終結するペプチド合成は困難であったので、ペプチドＲＰＲＴＳＳＰのＣ末端にアラニン残基を付加した。次の資料を引用によって本明細書に包含する。参考文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月２日（１９９８．３．２）【補正内容】請求の範囲１．グリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成を調節する医薬を製造するための、ＰＫＢ、その類似体、イソ型、阻害剤、賦活剤、および／またはそれらの機能的同等物の組成物の使用。２．グリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成が異常を示す疾病状態と闘うための、請求項１に記載の使用。３．糖尿病と闘うための、請求項１または２に記載の使用。４．ＰＫＢがＰＫＢα、βもしくはγ、類似体、イソ型、阻害剤、賦活剤、またはそれらの機能的同等物である、請求項１から３のいずれかに記載の使用。５．ＰＫＢ、その類似体、イソ型、または機能的同等物が、アミノ酸３０８および４７３の一方もしは両方でリン酸化および／または突然変異により修飾されている、請求項１から４のいずれかに記載の使用。６．ＰＫＢの活性に影響を与える作用薬を確認する方法であって、この方法がａ．試験物質をＰＫＢ含有試料に曝露して混合物を形成させ；ｂ．アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄ［ここで、Ｘａａはいずれかのアミノ酸、ＹａａおよびＺａａはいずれかのアミノ酸、およびＨｙｄは大きな疎水性残基］を有する、もしくは含むペプチドまたはかかるペプチドの機能的同等物；任意に上記アミノ酸配列［ここで、ＨｙｄはＰｈｅもしくはＬｅｕ］を有する、もしくは含むペプチドまたはその機能的同等物；または上記アミノ酸配列［ここで、ＹａａもしくはＺａａまたは両方がグリシン以外のアミノ酸］を有する、もしくは含むペプチド；またはアミノ酸配列ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧを有するペプチドまたはそれらの機能的同等物；に上記混合物を曝露し、上記ペプチドがリン酸化されているかどうか（および、任意にその程度）を検出する、ことを含む、ＰＫＢの活性に影響を与える作用薬の確認方法。７．基質またはペプチドのリン酸化の程度を測定する、請求項６に記載の方法。８．ＰＫＢ上のアミノ酸３０８および４７３の１つまたは両方のリン酸化状態を測定することにより、ＰＫＢの活性化を測定する方法。９．試験物質がＰＫＢの類似体、イソ型、阻害剤、または賦活剤である、請求項６または７に記載の方法。１０．工程ａもしくはｂ（または両方）を２価カチオンおよびＡＴＰの存在下で行う、請求項６から７のいずれか１つに記載の方法。１１．医薬用のためのＰＫＢ、その類似体、阻害剤、刺激剤、または機能的同等物。１２．リン酸化または突然変異によりアミノ酸３０８および／または４７３のリン酸化を修飾することにより、ＰＫＢ、そのイソ型、類似体および／または機能的同等物の活性に影響を与え得る作用薬であって、インスリン、wortmannin 、ＰＤＧＦ、ＥＧＦまたはｂＦＧＦではない作用薬。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡＣ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 (31)優先権主張番号９６１５０６６．９ (32)優先日平成８年７月18日(1996．7．18) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダリオ、アーレッシイギリス国ダンディー、バールドバン、テラス、45 (72)発明者ダーレン、クロスイギリス国ダンディー、ピットカーロ、ロード、５

Claims

【特許請求の範囲】１．グリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成を調節するための、ＰＫＢ、その類似体、イソ型、阻害剤、賦活剤、および／またはそれらの機能的同等物の組成物の使用。２．グリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成を調節するために医薬を製造するための、ＰＫＢ、その類似体、イソ型、阻害剤、賦活剤、および／またはそれらの機能的同等物の組成物の使用。３．グリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成が異常を示す疾病状態と闘かわせるための、請求項１または２に記載の使用。４．糖尿病と闘かわせるための、請求項１、２または３に記載の使用。５．がんと闘かわせるための、請求項１から３のいずれかに記載の使用。６．がんが、乳がん、膵臓がん、または卵巣がんである、請求項５に記載の使用。７．ＰＫＢがＰＫＢα、βもしくはγ、類似体、イソ型、阻害剤、賦活剤、またはそれらの機能的同等物である、請求項１から６のいずれかに記載の使用。８．ＰＫＢ、その類似体、イソ型、または機能的同等物が、アミノ酸３０８および４７３の一方もしは両方でリン酸化および／または突然変異により修飾されている、請求項１から７のいずれかに記載の使用。９．ＰＫＢ、その類似体、イソ型、阻害剤、賦活剤、および／またはそれらの機能的同等物の組成物。１０．アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄ［式中、Ｘａａはいずれかのアミノ酸、ＹａａおよびＺａａはいずれかのアミノ酸、ならびにＨｙｄは大きな疎水性残基である］を有するか、もしくは含むペプチド、またはかかるペプチドの機能的同等物。１１．ＨｙｄがＰｈｅもしくはＬｅｕである請求項１０に記載のペプチド、またはそれらの機能的同等物。１２．ＹａａもしくはＺａａまたは両者がグリシン以外のアミノ酸である、請求項１０または１１に記載のペプチド。１３．アミノ酸配列ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧを有する請求項１０に記載のペプチド、またはその機能的同等物。１４．ＧＳＫ3 の活性に影響を与え得る作用薬の確認方法であって、上記方法が：ａ．試験する物質をＧＳＫ3 の基質に曝露し；ｂ．上記基質がリン酸化されているかどうかを検出する；ことを含む方法。１５．ＰＫＢの活性に影響を与える作用薬の確認方法であって、上記方法が：ａ．試験する物質をＰＫＢ含有試料に曝露して混合物を形成させ；ｂ．上記混合物を請求項１０、１１、１２または１３に記載のペプチドに曝露し；ｃ．上記ペプチドがリン酸化されているかどうか（および任意にその程度）を検出する；ことを含む方法。１６．ペプチドのリン酸化の程度を測定する、請求項１４または１５に記載の方法。１７．ＰＫＢ上のアミノ酸３０３および４７３の１つまたは両方のリン酸化状態を測定する、請求項１５に記載の方法。１８．試験する物質が、ＰＫＢのアナログ、イソ型、阻害剤、または賦活剤である、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の方法。１９．工程ａもしくはｂ（または両方）が２価カチオンおよびＡＴＰの存在下で実施される、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。２０．ヒトまたは非ヒト動物身体の治療方法であって、この方法がＰＫＢ、そのアナログ、阻害剤、剌激剤、またはそれらの機能的同等物を上記身体に投与することを含む方法。２１．グリコーゲン代謝および／またはタンパク質合成が異常を示す疾病状態と闘うための、請求項２０に記載の方法。２２．糖尿病と闘うための、請求項２０または２１に記載の方法。２３．がんと闘うための、請求項２０または２２に記載の方法。２４．がんが、乳がん、膵臓がん、卵巣がんである、請求項２３に記載の方法。２５．ＰＫＢがＰＫＢα、βもしくはγ、アナログ、イソ型、阻害剤、賦活剤、またはそれらの機能的同等物である、請求項２０から２４のいずれか１つに記載の方法。２６．リン酸化または突然変異によりアミノ酸３０８および／または４７３を修飾することにより、ＰＫＢ、そのイソ型、アナログおよび／またはそれらの機能的同等物の活性に影響を与え得る作用薬。２７．ＰＫＧの活性または活性化に影響を与える物質の能力を測定する方法であって、この方法が；この物質をＰＫＢおよびホスフアチジルイノシトールポリホスフエートに曝露し、ＰＫＢとホスフアチジルイノシトールポリホスフエート間の相互作用を測定することを含む方法。２８．糖尿病、がん、またはタンパク質合成もしくはグリコーゲン代謝の不規則性を伴う任意の疾患と闘う物質の能力を測定する方法であって、この方法が；この物質をＰＫＢおよびホスフアチジルイノシトールポリホスフエートに曝露し、ＰＫＢとホスフアチジルイノシトールポリホスフエート間の相互作用を測定することを含む方法。２９．ＰＫＢとホスフアチジルイノシトールポリホスフエートと間の相互作用を、ＰＫＢのリン酸化状態を評価することにより測定する、請求項２７または２８に記載の方法。３０．Ｔ３０８および／またはＳ４７３におけるＰＫＢのリン酸化状態を評価する、請求項２９に記載の方法。３１．試験する物質をＧＳＫ3 に曝露し、ＧＳＫ3 の活性化状態を測定することを含む、ＧＳＫ3 の賦活剤または阻害剤の確認方法。３２．ＧＳＫ3 の活性化状態を、そのリン酸化の評価により測定する、請求項３１に記載の方法。３３．糖尿病、がん、またはタンパク質合成もしくはグリコーゲン代謝の不規則性を伴う任意の疾患と闘うのに使用するための試験物質の適合性を決定方法であって、この方法が；試験する物質をＧＳＫ3 に曝露し、ＧＳＫ3 の活性化状態を測定することを含む方法。３４．ＰＫＢのリン酸化を触媒する酵素の阻害剤または賦活剤をスクリーニングする方法であって、この方法が、試験する物質を −ＰＫＢの上流の１つまたは２つ以上の酵素 −ＰＫＢ；および（任意に） −ヌクレオシドトリホスフェートに曝露し、ＰＫＢがＴ３０８および／またはＳ４７３上でリン酸化されているかどうか（および任意にその程度）を測定することを含む方法。