JP2005528924A5 - - Google Patents
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細胞形質転換および癌に関与した遺伝子、すなわち癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子のほとんどの産物は、シグナル伝達経路の構成要素であることが、過去十年かけて徐々に明らかになってきた(HanahanおよびWeinberg、Cell、2000年、100巻、57〜70頁)。タンパク質キナーゼB(PKB)は、重要なシグナル伝達媒介物として十分に確立され、その調節不全は、ヒト癌および糖尿病の発生に関与している(BrazilおよびHemmings、Trends Biochem Sci 26巻:(2001年)、657〜64頁で概説される)。
腫瘍サプレッサーPTEN(脂質フォスファターゼ)を欠く細胞中で、Thr308およびSer473でのリン酸化の増大の結果として、PKBは、より活性化されている(CantleyおよびNeel、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1999年、96巻、4240〜4245頁;VazquezおよびSellers、Biochim Biophys.Acta、2000年、1470巻、M21−M35)。PHドメインを含むキナーゼであるキナーゼPDK1は、インビボでPKBのThr−308をリン酸化できることが示された(Alessiら、Curr.Biol.、1997年、7巻、261〜269頁;Stokoeら、Science、1997年、277巻、567〜570頁;Stephensら、Science、1998年、279巻、710〜714頁)。PDK1が、PKB Thr308キナーゼと同定されるにもかかわらず、インビボでSer473をリン酸化する原因であり、しばしば、PDK2あるいはSer473キナーゼと呼ばれるキナーゼは、解明できないままに残されている。
いくつかのキナーゼがSer473リン酸化活性を保有することが報告されており、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ活性化キナーゼ−2(MAPKAPK−2)(Alessiら、EMBO J.、1996年、15巻、6541〜6551頁)、インテグリン連結キナーゼ(Delcommenneら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1998年、95巻、11211〜11216頁)、PDK1(Balendranら、Curr.Biol.、1999年、9巻、393〜404頁;国際公開00/36135号)およびPKB(TokerおよびNewton、J Biol Chem(2000年)、275巻:8271〜8274頁)を含む。しかし、生理学的PKB Ser473キナーゼとしての、これらのキナーゼに反論する証拠が示された。たとえば、MAPKAPK−2の活性化は、P13−キナーゼ依存性であるのに対して、PKB Ser473リン酸化は、PI3−キナーゼ阻害剤に感受性がある(Alessiら、EMBO J.、1996年、15巻、6541〜6551頁)。PDK1−ヌル細胞は、Ser473リン酸化を受け、PDK1が、Ser473リン酸化に必要ではないことを示唆する(Williamsら、Curr.Biol.、2000年、10巻、439〜448頁)。さらに、Ser473リン酸化が、PDK1、したがってPKB活性を阻害するスタウロスポリン処置に感受性がないため、インスリンで刺激されたPKB Ser473リン酸化は、PDK1またはPKBの活性化を必要としない(Hillら、J Biol Chem(2001年)276巻:25643〜25646頁)。
別のキナーゼ、ILKは、PKBのグリコーゲンシンターゼキナーゼ−3、ならびにSer473をリン酸化することが示された(Delcommenneら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1998年、95巻、11211〜11216頁)。しかし、所定のキナーゼドメイン突然変異体の過剰発現が、Ser473リン酸化を誘発する際に野生型ILKを擬態できるので、ILKが、PKBリン酸化に間接的に影響を及ぼすことも示唆された(Lynchら、Oncogene(1999年)18巻:8024〜8032頁)。さらに、Drosophila melangasterでのILKノックアウトは、PKBノックアウトよりインテグリン・ノックアウトにより類似した表現型を有するので、PKBリン酸化を調節する際にILKの生理学的役割が疑問視されてきた(Zervasら、J Cell Biol(2001年)、152巻:1007〜1018頁)。
PKB Ser473キナーゼ活性を調節する方法の開発は、精製PKB Ser473キナーゼ源を必要とする。たとえば、精製PKB Ser473キナーゼは、PKB Ser473キナーゼ活性の測定用アッセイの開発および試験に、そのアッセイの評価に、およびそのアッセイでの基準として使用するために有用である。PKB Ser473キナーゼについてのアッセイは、PKB Ser473キナーゼ活性によって、PKBシグナル伝達または他のシグナル伝達経路のモジュレーターについてスクリーニングする上で有用である。精製PKB Ser473キナーゼは、インビトロアッセイでのPKB Ser473キナーゼ活性のモジュレーター、阻害剤またはアクチベーターを識別および試験するのに、粗細胞よりも有用である。PKB Ser473キナーゼ活性のこのようなモジュレーターは、癌、糖尿病、または神経変性症状もしくは勃起機能障害のような他のPKB依存性症状のような、PKBシグナル伝達経路と関連した症状、たとえば、細胞成長の異常、またはインスリン調節の異常の処置に有用である。
さらに、精製PKB Ser473キナーゼは、キナーゼの機構の綿密な生化学的分析を促進し、それは、メカニズムに基づくレギュレーターの開発について洞察力を供し得る。精製PKB Ser473キナーゼも、ホスホ特異的抗体を含めた、PKB Ser473キナーゼに対する抗体の作製に有用である。このような抗体は、次に、ヒトPKB Ser473キナーゼを精製する試薬として特に有用であり、癌診断または予後診断に有用である可能性がある。精製PKB Ser473キナーゼは、PKB Ser473キナーゼの種々の突然変異体またはフラグメントを設計する上で有用なアミノ酸配列情報を提供する助けにもなる。
PKB Ser473キナーゼの特徴付けおよび精製の必要がある一方で、ヒト酵素の精製は、技術的問題をもたらした。ヒト細胞は、ヒト細胞からのPKB Ser473キナーゼの精製を特に困難にするPKB Ser473キナーゼに類似のクロマトグラム精製特性を有し得る他のキナーゼを高レベルで保有する。さらに、特異的アッセイは、インビボでのPKBリン酸化の要因であるPKB Ser473キナーゼ活性を追跡するために開発されなければならなかった。したがって、特に、精製PKB Ser473キナーゼおよび精製ヒトPKB Ser473キナーゼが必要である。
得られたPKB Ser473キナーゼ製剤のさらなる精製は、1またはそれ以上の下記段階を使用することによって達成され得る:たとえば、トリトンX−100不溶性タンパク質を再懸濁させ、ショ糖浮遊勾配分析にかけることによる浮遊勾配分析;分子サイズ、形状、または浮揚性密度による他の有機生物分子からのPKB Ser473キナーゼの分離、たとえば、Superdex 200HR10/30上でのサイズゲル濾過による分子の分離およびPKB Ser473キナーゼの収集;または特定のリガンド(たとえば、ATP、抗体、スタウロスポリンおよびペプチド)についての電荷(イオン交換クロマトグラフィー)、疎水性または親和性(または親和性の欠如)に基づく分子の分離。
PKB Ser473キナーゼは、ゲル電気泳動によりさらに単離することによって、相当な純度まで精製できる(たとえば、少なくとも100,000倍)。PKB Ser473キナーゼは、精製プロトコールでの任意の段階の順番を変化、変動させるか、またはそのいずれかを排除することによって、様々のレベルの純度に単離され得る。精製を改善するために、ATPアガロース親和性クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない当業界で周知の他の精製段階を加えてよい。
本発明は、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞の粗細胞抽出物に比べて、相対純度を少なくとも2000倍、好ましくは少なくとも3000、5000、10,000または20,000倍、最も好ましくは少なくとも50,000または100,000倍増大させたPKB Ser473キナーゼを包含する組成物も提供し、それは細胞タンパク質と結合したときに、キナーゼ活性を示し、40〜1,000kDaの分子量を有する。
本発明は、さらに、たとえば、PKBのSer473部位を包含するペプチド基質を、標識ホスフェートでリン酸化させ、標識された基質を検出する、キナーゼアッセイで定量した場合、0.2μgの総タンパク質中で測定可能なPKB Ser473キナーゼ活性を有する精製細胞抽出物を包含する。好ましくは、キナーゼは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画されるときに、40〜1,000kDa、最も好ましくは約550kDaの見かけの分子量で溶出し、キナーゼは、HEK293細胞の粗抽出物と比較して、3,000倍乃至50,000倍以上富化されている。
別の態様では、本発明は、動物に、精製PKB Ser473を、またはタンパク質成分のようなその免疫原性フラグメントを接種することを包含する、PKB Ser473キナーゼに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。これは、抗体の産生を導く体液性免疫応答ならびに細胞仲介免疫応答の誘導を含む。
別の態様では、本発明は、免疫原として動物に提示された場合、体液性または細胞仲介免疫応答を誘発するヒトPKB Ser473キナーゼのタンパク質構成要素のポリペプチドフラグメントも提供する。
別の態様では、本発明は、(a)ここで上に記載される通りの精製PKB Ser473キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし;PKB Ser473キナーゼ活性を測定し;その化合物が不在であるときに比較して、化合物の存在下で、PKB Ser473キナーゼ活性における改変を検出する段階を含み、その改変が、PKB Ser473キナーゼ活性のモジュレーターを示す、PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターについてスクリーニングをする方法を提供する。PKB Ser473キナーゼ活性の減少は、抗増殖性または抗腫瘍化合物として使用され得る、PKB Ser473キナーゼ阻害剤の存在と相関する。PKB Ser473キナーゼ活性の増大は、限定せずに、糖尿病、神経変性症状、および勃起機能障害を含めて、PKB Ser473キナーゼ活性が増大されることを必要とする疾患または症状の内のいずれか1つ以上の処置に有用な可能性のあるPKB Ser473キナーゼアクチベーターの存在と相関する。
したがって、本発明は、腫瘍細胞成長の潜在的モジュレーター、特に、腫瘍細胞成長の阻害剤、ならびにPKB Ser473キナーゼ活性のモジュレーターをスクリーニングする方法も提供する。
図面
図1は、5〜40%ショ糖浮遊勾配でのSer473キナーゼ活性(棒)の概略図である。
図2は、Superdex 200カラムでのゲル濾過にかけた0.5M NaClで抽出された原形質膜分画の模式図である。標準は、矢印によって示される。
図1は、5〜40%ショ糖浮遊勾配でのSer473キナーゼ活性(棒)の概略図である。
図2は、Superdex 200カラムでのゲル濾過にかけた0.5M NaClで抽出された原形質膜分画の模式図である。標準は、矢印によって示される。
発明の詳細な記載
タンパク質キナーゼBの全活性化(PKB/Akt)は、残基Thr308とSer473でのリン酸化を必要とする。現在まで、Ser473キナーゼの同定は、不明なままである。本発明者らは、PKBと3−ホスホイノシチド依存性キナーゼ−1(PDK−1)の細胞質ゲルの分布と異なった、浮揚性の洗剤不溶性原形質膜ラフト中で富化された、構造的に活性なPKB Ser473キナーゼ活性を単離、精製および特徴付けした。このSer473キナーゼ活性は、高塩によって膜から放出され、ゲル濾過分析は、原因であるキナーゼが、約500kDaの大型複合体中に存在することを示す。48kDaと58kDaの2つの主要なホスホプロテインを、部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼ製剤で検出した。先の観察と対照的に、本発明者らは、インテグリン連結キナーゼ(ILK)免疫沈澱物が、Ser473キナーゼ活性を保持しないことを証明できた。したがって、本発明者らは、PKBシグナル伝達に役割を果し、ILKと異なるラフト結合PKB Ser473を同定した。
タンパク質キナーゼBの全活性化(PKB/Akt)は、残基Thr308とSer473でのリン酸化を必要とする。現在まで、Ser473キナーゼの同定は、不明なままである。本発明者らは、PKBと3−ホスホイノシチド依存性キナーゼ−1(PDK−1)の細胞質ゲルの分布と異なった、浮揚性の洗剤不溶性原形質膜ラフト中で富化された、構造的に活性なPKB Ser473キナーゼ活性を単離、精製および特徴付けした。このSer473キナーゼ活性は、高塩によって膜から放出され、ゲル濾過分析は、原因であるキナーゼが、約500kDaの大型複合体中に存在することを示す。48kDaと58kDaの2つの主要なホスホプロテインを、部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼ製剤で検出した。先の観察と対照的に、本発明者らは、インテグリン連結キナーゼ(ILK)免疫沈澱物が、Ser473キナーゼ活性を保持しないことを証明できた。したがって、本発明者らは、PKBシグナル伝達に役割を果し、ILKと異なるラフト結合PKB Ser473を同定した。
本発明は、精製PKB Ser473キナーゼ、およびそれの製造の方法を提供する。特に、この発明は、精製された哺乳類またはヒトPKB Ser473キナーゼ、および組換え体PKB Ser473キナーゼに向けられる。本発明は、PKB Ser473キナーゼを発現するいずれかの細胞から、たとえば、正常な細胞、癌細胞、不死化細胞、ヒトまたは動物組織、腫瘍の粗抽出物、または組換えでPKB Ser473キナーゼを発現する細胞から単離された精製PKB Ser473キナーゼを提供する。
本発明は、細胞タンパク質と結合したときに、Ser473キナーゼ活性を有し、Superdex 200上でのゲル濾過により約550kDaの見かけの分子量を有する、293細胞の粗細胞抽出物に比較して、少なくとも2000倍、少なくとも3000倍、少なくとも5000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも20,000倍、少なくとも50,000倍、または少なくとも100,000倍増大した相対純度を有するPKB Ser473キナーゼを包含する組成物を提供する。当業者に明らかである通り、見かけの分子量における変動は、使用されるクロマトグラフィー条件およびマトリックスに依存して見られる。典型的には、Ser473キナーゼは、450乃至650kDaのサイズに対応し、さらに詳細には、500乃至600kDaのサイズに対応して、溶出すると予想される。
「精製PKB Ser473キナーゼ」は、粗HEK293細胞抽出物より少なくとも2000倍に増大した相対純度を有するPKB Ser473キナーゼ製剤を示す。本明細書で使用される場合、PKB Ser473キナーゼ製剤は、その製剤でのPKB Ser473キナーゼの特異的活性が、本明細書で以下に記載され、実施例1において後記したようなインビトロキナーゼアッセイによって測定して、懸濁可能な293細胞の粗全細胞抽出物のPKB Ser473キナーゼの特異的活性より、少なくとも2000倍大きい場合、2000倍増大した相対純度を有する。「実質的に純粋な」は、目的種が、存在する主要な種である(すなわち、モル基準で、組成物中の他のあらゆる個々の有機生物分子種より豊富である)こと、および実質的に精製された分画は、目的種が、存在する全ての有機生物分子種の少なくとも約50%(モル基準で)を包含する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する約80%から90%まで、またはそれ以上の有機生物分子種が、目的の精製された種であることを意味する。組成物が、基本的に単一の有機生物分子種から構成される場合、目的種を、基本的に均質(通常の検出方法により、混入種を、組成物中に検出できないこと)になるまで精製する。「有機生物分子」は、生物学的起源の有機分子、たとえば、タンパク質、核酸、炭化水素または脂質を示す。溶媒種、小分子化合物(<500ダルトン)、安定化剤(たとえば、BSA)、および元素イオン種(elemental ion species)は、この定義の目的のための有機生物分子種と考えられない。
得られたPKB Ser473キナーゼ製剤のさらなる精製は、以下の段階の1つ以上を使用することによって達成され得る:たとえば、トリトン(TRITON)X−100不溶性タンパク質を再懸濁させ、ショ糖浮遊勾配分析にかけることによる浮遊勾配分析;分子サイズ、形状、または浮揚性密度により他の有機生物分子からの、PKB Ser473キナーゼの分離、たとえば、Superdex 200HR10/30上でのサイズゲル濾過による分子の分離およびPKB Ser473キナーゼの収集;または荷電(イオン交換クロマトグラフィー)、特定のリガンド(たとえば、ATP、抗体、スタウロスポリンおよびペプチド)についての疎水性または親和性(または親和性の欠如)に基づく分子の分離。したがって、PKB Ser473キナーゼは、精製プロトコールでの段階のいずれかの順番を改変、変更するか、または削除することによって、様々のレベルの純度まで単離され得る。
PKB Ser473キナーゼは、親和性段階を加えること、たとえば、スタウロスポリン親和性クロマトグラフィーを使用して、感受性および感受性のないキナーゼ活性を分離することによって、少なくとも50,000倍の純度まで単離され得る。したがって、PKB Ser473キナーゼは、特異的マトリックスに結合するそれの能力のなさによって、さらに精製され、それにより、類似の混入する生物有機分子を、マトリックスに対する結合を通して除去し得る。限定せずに、ATP−アガロース(Agarose)親和性クロマトグラフィー、またはPKB Ser473キナーゼに特異的な抗体を用いて作製される親和性マトリックスを含めた当業界で周知の他の親和性精製段階を加えて、精製をさらに改善し得る。したがって、PKB Ser473キナーゼは、特異的親和性マトリックス、およびPKB Ser473キナーゼの溶出の前に除去される混入材料に結合する。PKB Ser473キナーゼは、ゲル電気泳動によりそれをさらに単離することによって、相当な純度まで精製できる(たとえば、少なくとも100,000倍)。
使用される特異的精製段階およびそれらの順番は、実施者の判断による。しかし、以下の指針が提供される。一般に、高許容量で比較的低い選択性を有する段階で始まり、続いて、中間の許容性および/または選択性を有する段階、続いて低い許容量および高い選択性を有する段階を行うことが好ましい。実質的精製が、細胞分画を通して達成される場合、細胞の原形質膜分画を使用し、細胞の細胞質ゲルまたは核分画を使用しないことが好ましい。
中間の選択性および許容量を有する精製段階は、高許容量段階の後であるのが好ましい。これらは、分子サイズ、形状または浮揚性密度に基づいた中間の選択性のマトリックスおよび分離を包含する。中間の選択性の樹脂を用いた精製は好ましくは最初であるが、中間の精製段階は、何らかの特定の順序または数に限定される必要はない。
特異的親和性マトリックスは、許容量が比較的低いが、選択性が高いことを示し、PKB Ser473キナーゼが、少数の混入材料と共に存在する場合、精製過程の後期にあるのが好ましい。この段階は、PKB Ser473キナーゼが、少なくとも40倍増大した相対純度を有する場合、唯一の精製段階であることができ、最も有用である。
PKB Ser473キナーゼの精製は、好ましくはPKB Ser473キナーゼ活性に富んだ、粗細胞抽出物のような、不純源組成物を用いて始まる。細胞系は、それらが、大量に培養および収集され、それにより大規模PKB Ser473キナーゼ製剤についての細胞分画を提供し得るので、粗PKB Ser473キナーゼ製剤の特に有用な源である。特に、精製ヒトPKB Ser473キナーゼの作製で、293細胞が好ましい。293細胞は、アデノウイルス5型DNAのフラグメントで形質転換されたヒト胚性腎臓起源のものである(Grahamら、J.Gen.Virol.、1977年、36巻:59〜77頁)。単層培養で成長する該細胞系は、StillmanおよびGluzman、Mol.and Cell Bio、(1985年)、5巻、2051〜2060号による懸濁液中での成長のために適合させた。それらは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手可能である(受託番号ATCC CRL1573号)。
他の細胞型、特に懸濁培養(大規模培養を促進する)で十分に成長するものも、ヒトPKB Ser473キナーゼを精製するために有用である。候補としては、Namalwa(Burkittのリンパ腫)、Daudi(Burkitt)のリンパ腫)、Jurkat(急性T細胞白血病)およびHUT78(皮下T細胞リンパ腫)ラインのようなBまたはT細胞系統の細胞系が挙げられる。HeLa細胞(頸部癌)も、PKB Ser473キナーゼ活性の源として使用され得る。それにもかかわらず、胎盤のような組織は、PKB Ser473キナーゼの源としても使用され得る。
PKB Ser473キナーゼを精製するために必要とされる不純な製剤の量は、部分的に、細胞中のPKB Ser473キナーゼの量、各段階で失われるPKB Ser473キナーゼの量、および所望の精製の最終的な程度および量による。
精製が進むにつれ、PKB Ser473キナーゼは、より純粋になり、かつより希釈される。この状態で、PKB Ser473キナーゼは、管、管系、チップなどに付着するPKB Ser473キナーゼにより失われ得る。この損失は、0.1% Nonidet P−40、1% Tween−20またはその他のような洗剤、好ましくは非イオン性洗剤を加えることによって最小限にできる。
原形質膜中で富化された細胞成分分画の濃縮は、PKB Ser473キナーゼの精製での好ましい最初の段階であるが、本発明の方法で使用される哺乳類細胞からの粗細胞抽出物は、全細胞抽出物であり得る。PKB Ser473キナーゼを特徴付け、精製するために、本発明者らは、原形質膜が富化された分画を製造する細胞成分分画プロトコール(実施例1を参照)を開発した。この手段の有効性を測定するために、2つのPKB構築物の分画作用を試験した。しかし、プロトコールが樹立されたのであるから、制御が望まれない限り、細胞成分分画の後にPKBの分配を続ける必要はない。明らかに、他の対照マーカーは、PKBの代わりに有効に使用され得る。
本発明は、原形質膜とのSer473キナーゼの結合の特性を決定する方法も提供する。高イオン強度緩衝液(0.5M NaCl)を用いた原形質膜分画の抽出は、脂質二層からSer473キナーゼを放出し、活性は主に上清で検出され、それはSer473キナーゼが内在性膜タンパク質でなく、むしろ、タンパク質/タンパク質または静電気相互作用を介して原形質膜と結合されることを示す。
本発明の精製プロトコールの別の選択肢段階は、原形質膜分画を、Triton X−100または高イオン強度の緩衝液(たとえば、0.5M NaClを有する緩衝液;実施例1を参照)のような洗剤、好ましくは非イオン性洗剤で処理することを包含する。原形質膜分画を、1% Triton X−100で処理するときに、Ser473キナーゼ活性は、不溶性分画で非常に富化されているのに対して、高イオン強度緩衝液は、脂質二層からSer473キナーゼを放出し、活性は、上清で主に示される(遠心分離の後)。あるいは、これらの段階を、連続して組合せてよい。
本発明の精製プロトコールの別の段階では、たとえば、上に記載される洗剤不溶性タンパク質の再懸濁の後に実施例2に記載される通り、原形質膜分画のショ糖浮遊勾配を包含する。追加のまたは代替的精製段階は、グリセロールのような、調製物中の分子の分離を生じる様々の組成の勾配でのPKB Ser473キナーゼの勾配遠心分離を包含し得る。
PKB Ser473キナーゼを精製する方法での別の中間精製段階は、分子サイズ、形状、または浮揚性密度による他の有機生物分子から、PKB Ser473キナーゼを分離し、そしてPKB Ser473キナーゼを収集することを包含する。これは、好ましくは、高イオン強度緩衝液により、原形質膜から放出されたPKB Ser473キナーゼを用いて行われる段階であり、ゲル濾過クロマトグラフィーによるPKB Ser473キナーゼ製剤を分画することを包含する。40kDから1000kDまでのサイズ範囲でタンパク質を分離するサイジング・ゲルマトリックスが、ヒトPKB Ser473キナーゼ精製に最も有用である。特に、FPLCシステムに付随したSuperdex 200HR10/30カラムが、非常に有効であると示された(実施例3を参照)。他の適切なマトリックスは、当業界で周知であり、HW65(TosoHaas, Montgomeryville, Pa.)、Superose RTM.6(Pharmacia)、Uppsala,Sweden)およびTSK−Gel *G5000PWXLが挙げられる。
本発明の別の態様では、精製手段は、所望により、ゲル電気泳動の使用を包含してもよく、それは、それらの荷電、サイズおよび形状により分子を分離し得る。ゲル組成物は、この実施態様で広範に変化し得る。好ましいゲルは、ヒトPKB Ser473キナーゼの生来の複合体と活性を保存する傾向にある、緩衝液強度とpHの生理的条件下で行われる、アガロース、ポリアクリルアミド、またはその両方から構成される天然ゲルである。あるいは、ある種のタンパク質は、SDS−PAGEの後に容易に復元され得るが、(たとえば、配列決定するのに)キナーゼ活性の保持があまり重要性でないときSDS−ゲル電気泳動が、望まれ得る。
好ましくは、高許容性および中間精製段階の後に、PKB Ser473キナーゼを、PKB Ser473キナーゼについて特異的親和性を有する親和性剤と接触させ、親和性剤に結合しない他の有機生物分子から、PKB Ser473キナーゼを分離し、親和性剤からPKB Ser473キナーゼを収集することによって、PKB Ser473キナーゼは、さらに精製され得る。精製方法のこの段階での親和性剤は、本方法の他の段階でのその薬剤より、他の有機生物分子を超えてPKB Ser473キナーゼを結合する特異性が数桁大きい。PKB Ser473キナーゼについて特異的親和性を有する親和性剤としては、たとえば、PKB Ser473キナーゼのエピトープまたはPKB Ser473キナーゼ結合タンパク質を認識する抗体、およびPKB Ser473キナーゼを阻害するか、またはその基質(たとえば、ペプチド、ATP)である化合物が挙げられる。好ましくは、親和性剤を、マトリックスに付着させる。その後、親和性剤に結合しなかった分子を、混合物から分離または除去する。親和性剤からPKB Ser473キナーゼを放出することによって、PKB Ser473キナーゼを精製する。あるいは、選択された親和性剤に結合しないPKB Ser473を、マトリックスに結合する混入物から分離させるための、疑われる混入物のための親和性剤を使用できる。したがって、親和性剤は、混入物に特異的な抗体であり得る。典型的には、親和性結合生物有機分子は、たとえば、親和剤または高塩を使用して溶出され得る。
したがって、本発明は、293細胞の粗細胞抽出物に比べて、少なくとも2000倍、少なくとも3000倍、少なくとも5000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも20,000倍、少なくとも50,000倍、または少なくとも100,000倍増大した相対純度を有する精製PKB Ser473キナーゼを提供する。PKB Ser473キナーゼは、動物、哺乳類およびさらに詳細にはヒトであり得る。本発明は、上の精製段階により製造されたPKB Ser473キナーゼも提供する。
本発明は、さらに、たとえば、PKBのSer473部位を包含するペプチド基質が、標識ホスフェート(典型的には放射活性で標識されたホスフェート)でリン酸化され、標識された基質が検出される、キナーゼアッセイで定量するときに、0.2μgの総タンパク質で測定可能なPKB Ser473キナーゼ活性を有する精製細胞抽出物を包含する。好ましくは、キナーゼは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画されるときに、40〜1,000kDa、最も好ましくは約550kDaの見かけの分子量で溶出し、キナーゼは、HEK293細胞の粗抽出物と比較して、3,000倍乃至50,000倍またはそれ以上富化されている。
別の態様では、本発明は、動物に、精製PKB Ser473キナーゼを、またはそれの免疫原性フラグメントを接種することを包含する、PKB Ser473キナーゼに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。これは、抗体の産生に至る体液性免疫応答ならびに細胞仲介免疫応答の誘導を含む。
別の態様では、本発明は、免疫原として動物に存在する場合、体液性または細胞仲介免疫応答を引き出すヒトPKB Ser473キナーゼのタンパク質構成要素のポリペプチドフラグメントも提供する。
別の態様では、本発明は、ヒトPKB Ser473キナーゼのタンパク質構成要素に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを包含する組成物を提供する。
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、または被検体(抗原)を特異的に結合および認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントを示す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに多免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。抗体は、たとえば、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用いた消化により産生される多数の十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。たとえば、このようなフラグメントとしては、それに限定されないが、抗体分子のペプシン消化により産生され得るF(ab’)2フラグメント、およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって発生され得るFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で簡便な同定を可能にするように構築され得る(Huseら、Science、(1989年)、256巻、1275頁)。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、全抗体の修飾により産生される抗体フラグメント、または組換えDNA方法論を使用してデノボ(de novo)で合成されたもののいずれかも含む。
モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を供するあらゆる技術を使用して作製され得る。これらとしては、それに限定されないが、KoehlerおよびMilsteinによって最初に記載されるハイブリドーマ技術(KoehlerおよびMilstein、Nature、(1975年)、256巻:495〜497頁)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら、Immunol Today(1983年)、4巻:72頁;Coteら、Proc Natl Acad Sci(1983年)、80巻:2026〜2030頁)、およびEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R Liss Inc.、New York, NY、(1985年)77〜96頁)が挙げられる。免疫アッセイで使用するための多量のモノクローナル抗体は、当業者によく知られている種々の技術によって得られ得る。簡潔には、所望のタンパク質で免疫化された動物から得られる脾臓細胞を、骨髄腫細胞との融合により一般に不死化させる。不死化の代替法としては、Epstein Barr Virus、癌遺伝子、またはレトロウイルスを用いた形質転換、または当業界で周知の他の方法が挙げられる。単一不死化細胞から生じるコロニーを、フィブロネクチン分子、その変異体またはフラグメント、テネイシンまたはシンデカンについての所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングする。このような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注入を含めた種々の技術により増強され得る。あるいは、DNAライブラリーを、適切な、すなわち、一般的プロトコールによって免疫化されたヒトB細胞からスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするDNA配列を単離し得る。
フロイントアジュバントのような標準アジュバント、および標準免疫化プロトコールを使用して、動物(たとえば、マウスまたはウサギの同系繁殖系)を、免疫原を用いて免疫化させ得る。あるいは、担体タンパク質に接合した合成ペプチドを、免疫原として使用し得る。ポリクローナル血清を収集し、免疫アッセイ、たとえば、固形支持体で固定された免疫原を用いた固相免疫アッセイで免疫原について力価測定する。たとえば、104またはそれより大きな力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、たとえば、競合結合免疫アッセイを使用して、他の生物から得られる相同なタンパク質および/または非免疫原タンパク質に対するそれらの架橋反応性について試験した。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、通常、少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM以上、および最も好ましくは0.01μM以上のKDで結合する。
抗体は、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導するか、または組換え体免疫グロブリンライブラリーまたは非常に特異的に結合する数団の試薬をスクリーニングすることによっても産生され得る(Orlandiら、Proc Natl Acad Sci、(1989年)、86巻、3833頁;およびWinterおよびMilstein、Nature、(1991年)、349巻:293頁)。
PKBは、完全活性化のために残基Thr308(活性化ループで)およびSer473(C末端調節ドメインで)上の両方でリン酸化されることが要求される。したがって、PKBをリン酸化するPKB Ser473キナーゼの能力を調整することによって、細胞増殖およびインスリンシグナル伝達のように一般的に、PKBの効果を調整することが可能である。同様に、それの他のインビボ基質をリン酸化するPKB Ser473キナーゼの能力を調整することによって、それらの影響は、同様に調整される。
したがって、PKBのような他のタンパク質とのPKB Ser473キナーゼの相互作用を調整することを包含する、細胞におけるPKB Ser473キナーゼ活性を調整する方法の提供がある。好ましくは、その方法は、細胞を、PKB Ser473キナーゼ活性のアクチベーターまたは阻害剤と接触させることを包含する。PKB Ser473キナーゼ摸倣体を含むアクチベーターおよび阻害剤は、まとめてモジュレーターと称される。阻害剤は、PKB Ser473キナーゼと相互に作用して、PKB上のSer473(または等価物)のリン酸化を阻害し得る。アクチベーターと称される他のモジュレーターは、PKB Ser473キナーゼ活性を増大でき、したがって、Ser473上のPKB(または等価物)のリン酸化を増大でき、結果として、一般に、特異的シグナル伝達(たとえば、PKBシグナル伝達)を増大し得る。
別の態様では、本発明は、(a)以下に記載される通り精製PKB Ser473キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし;(b)PKB Ser473キナーゼ活性を測定し;そして(c)上記化合物が不在である場合と比較して、化合物の存在下で、PKB Ser473キナーゼ活性における改変を検出する段階を含み、上記改変が、PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターを示す、PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターについてスクリーニングする方法を提供する。PKB Ser473キナーゼ活性の減少は、抗増殖性または抗腫瘍化合物として有用なPKB Ser473キナーゼ阻害剤の存在に相関するのに対して、PKB Ser473キナーゼ活性の増大は、限定せずに、糖尿病、神経変性症状、または勃起機能障害を含めた、PKB Ser473活性が増強されることを必要とする疾患または症状の内のいずれか1つ以上の処置で有用なPKB Ser473アクチベーターの存在と相関する。
本発明は、腫瘍細胞成長の潜在的モジュレーター、特に腫瘍細胞成長の阻害剤である化合物をスクリーニングする方法も提供する。本発明によってさらに提供されるのは、PKB Ser473キナーゼ活性のモジュレーターである。
本発明の別の態様では、本スクリーニング法によって同定される化合物は、対象に、医薬上有効な量のPKB Ser473キナーゼモジュレーターを投与することを包含する、細胞成長の異常に関連した疾患を処置するために使用される。他の実施態様では、化合物は、インスリン調節の異常に関連した疾患を処置するために提供される。
感染した細胞および組織へのモジュレーターの送達は、適切なパッケージングまたは投与システムを使用して達成され得る。たとえば、モジュレーターは、タンパク様剤の医薬的投与(pharmaceutical administration)に許容される剤と共に、治療使用のために製剤化され、そしてたとえばリポソームを介して、許容される経路により対象に送達され得る。あるいは、小分子化合物類似体は、PKB Ser473キナーゼ阻害剤またはアクチベーターとして作用し、この手段で、所望の生理学的効果を生じるために使用および投与され得る。
スクリーニング系は、好ましくは、PKB Ser473キナーゼ機能の、特にその機能がPKB活性に関連するときのモジュレーターである化合物についてスクリーニングするために使用される。その系は、小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、または天然産物ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
PKB Ser473キナーゼ活性の理解を増大し、PKB Ser473キナーゼモジュレーターを改善する可能性があるために、単離PKB Ser473キナーゼは、全タンパク質または少なくとも酵素的活性および調節の原因である領域の二次および三次構造を樹立するために使用され得る。3次元構造を同定するための従来の方法は、たとえば、X線研究またはNMR研究である。これら、または同等な方法によって得られたデータは、PKB Ser473キナーゼのモジュレーターの同定または改善のために直接または間接的に使用され得る。この点で一般に使用される方法は、たとえば、コンピュータ支援薬剤設計または分子モデル設計である。本発明の別の実施態様は、処置方法で使用するための、本発明のポリペプチドで、またはそこから導かれる3次元構造の助けを借りて同定されたモジュレーターを考慮する。
このような化合物をスクリーニングするために有用なキットは、本発明によっても作製され得て、スクリーニングのために有用なPKB Ser473キナーゼまたはそのフラグメント、および指示を基本的に包含する。典型的には、PKB Ser473キナーゼポリペプチドは、PKB Ser473キナーゼ活性の化合物誘導調整を決定するための手段と一緒に提供される。本発明によるキットで使用するためのPKB Ser473キナーゼは、たとえば、溶液、懸濁液または凍結乾燥物の、タンパク質の形態で提供され得る。
さらに別の実施態様では、本発明は、PKB Ser473キナーゼまたはそれのフラグメントと直接的または間接的に相互作用する化合物、好ましくはPKB Ser473キナーゼ活性を調整する化合物を提供する。このような化合物は、無機または有機、たとえば、抗生物質または抗体であり得、好ましくは、細胞間シグナル伝達に関与したタンパク様化合物である。
本発明による化合物は、以下に記載される技術を使用してスクリーニングすることにより同定され得、確立された手段により天然の源からの抽出により、または特に低分子量化合物の場合には合成により作製され得る。タンパク様化合物は、組換え発現系、たとえば、バキュロウイルス系で、または細菌系での発現により作製され得る。タンパク様化合物は、治療適用を有し得るが、主に、シグナル伝達経路の機能への研究のために有用である。
他方では、低分子量化合物は、好ましくは、確立した手段による化学合成により生成される。それらは、処置剤として第一に示される。低分子量化合物および有機化合物は、一般に、細胞成長に関連した症状の処置で使用するために抗増殖剤として、または糖尿病を処置するために有用であり得る。
本発明の医薬組成物の投与は、経口または非経口で達成され得る。非経口送達の方法としては、局所、動脈内(たとえば、腫瘍に直接的に)、筋肉内、皮下、骨髄内、硬膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が挙げられる。活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、賦形剤、および製薬的に使用でき、活性化合物の製剤への加工を容易にする他の化合物を含む適切な製薬上許容される担体を含むことができる。製剤化および投与についての技術におけるさらに詳細は、レミントンの製薬化学の最新版で見られ得る(Maack Publishing Co、Easton PA)。
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適する投与量で、当業界で周知の製薬上許容される担体を使用して製剤化され得る。このような担体は、医薬組成物を、患者が摂取するのに適切な錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。
経口使用のための医薬製剤は、活性成分と固体賦形剤を合わせ、所望により、得られる混合物を粉砕し、所望される場合、適切な追加の化合物を加えた後に、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得ることができる。適切な賦形剤は、炭化水素またはタンパク質フィラーであり、それに限定されないが、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖;コーン、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物から得られる澱粉;メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース・ナトリウムのようなセルロース;およびアラビアゴムおよびトラガカントのようなゴム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質が挙げられる。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなそれらの塩のような崩壊または可溶化剤を添加し得る。
糖衣錠コアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタンも含み得る濃厚ショ糖溶液、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物のような適切なコーティングを施すことができる。染料または色素は、製品識別のために、または活性化合物の量(すなわち、投与量)を特徴づけるために錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口で使用され得る製薬製剤としては、ゼラチンから作られるプッシュ−フィット・カプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングから作られる軟質の封入カプセルが挙げられる。プッシュ−フィット・カプセルは、ラクトースまたはスターチのようなフィラーまたは結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性成分を含み得る。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪酸油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に、安定化剤を用いるか、またはなしで溶解または懸濁され得る。
非経口投与のための医薬製剤は、活性化合物の水性溶液を包含する。注射については、本発明の医薬組成物は、水性溶液で、特にハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的に緩衝化された生理食塩水のような生理学的に適合性のある緩衝液で製剤化され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を増大する物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として作製され得る。適切な親油性溶媒または媒体としては、ごま油のような脂肪酸油、またはエチルオレートまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。所望により、懸濁液は、適切な安定化剤、または非常に濃厚な溶液の作製を可能にするために化合物の溶解性を増大させる剤も含み得る。
局所または鼻腔内投与については、浸透すべき特定のバリアに適切な浸透剤を製剤化に使用する。このような浸透剤は、一般に当業界で知られている。
本発明の医薬組成物は、実質的に当業界で知られる標準製造手段(たとえば、慣用的混合、溶解、造粒、糖衣化、水簸、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥工程の手段により)に従い作製され得る。
実施例
発現構築物、トランスフェクション、および細胞の処理
HAタグ付PKBについての発現構築物は、先に記載されている(HillおよびHemmings、2002年を参照)。インテグリン結合キナーゼを、公表された配列(NIDg2648173/U40282、Hanniganら、Nature、1996年、379巻:91〜96頁)に基づいてポリメラーゼ連鎖反応によりヒト胎盤cDNAライブラリーからクローン化させ、pCMV5ベクターにサブクローニングした。修飾リン酸カルシウム法を使用したHEK293細胞の培養およびトランスフェクションは、先に記載されている(Andjelkovicら、Mol Cell Biol、1999年、19巻:5061〜5072頁)。分析的実験のために、細胞を処置の前に一夜飢餓状態にさせた。ペルバナデートを用いた作製および細胞処理を、先に記載される通り行い、総細胞溶解物を、NP−40溶解緩衝液中に収集した(Andjelkovicら、Proc Natl Acad Sci USA、1996年、93巻:5599〜5704頁;Andjelkovicら、Mol Cell Biol、1999年、19巻:5061〜5072頁)。
発現構築物、トランスフェクション、および細胞の処理
HAタグ付PKBについての発現構築物は、先に記載されている(HillおよびHemmings、2002年を参照)。インテグリン結合キナーゼを、公表された配列(NIDg2648173/U40282、Hanniganら、Nature、1996年、379巻:91〜96頁)に基づいてポリメラーゼ連鎖反応によりヒト胎盤cDNAライブラリーからクローン化させ、pCMV5ベクターにサブクローニングした。修飾リン酸カルシウム法を使用したHEK293細胞の培養およびトランスフェクションは、先に記載されている(Andjelkovicら、Mol Cell Biol、1999年、19巻:5061〜5072頁)。分析的実験のために、細胞を処置の前に一夜飢餓状態にさせた。ペルバナデートを用いた作製および細胞処理を、先に記載される通り行い、総細胞溶解物を、NP−40溶解緩衝液中に収集した(Andjelkovicら、Proc Natl Acad Sci USA、1996年、93巻:5599〜5704頁;Andjelkovicら、Mol Cell Biol、1999年、19巻:5061〜5072頁)。
PKB Ser473キナーゼの細胞内局在化
PKB Ser473キナーゼを特徴付および精製するために、我々は、キナーゼが原形質膜(PM)で構造的に活性でなければならないと判断した。この目的のために、PMが富化された分画を生じるための細胞成分分画プロトコールを開発した。この方法の効率を決定するために、2つのPKB構築物の産物の分画行動を試験した:ヘマグルチニン(HA)タグ付PKBα(HA−PKBα)、およびミリストイル化/パルミチル化シグナルを含むHA−PKBα(m/p−HA−PKBα)。
PKB Ser473キナーゼを特徴付および精製するために、我々は、キナーゼが原形質膜(PM)で構造的に活性でなければならないと判断した。この目的のために、PMが富化された分画を生じるための細胞成分分画プロトコールを開発した。この方法の効率を決定するために、2つのPKB構築物の産物の分画行動を試験した:ヘマグルチニン(HA)タグ付PKBα(HA−PKBα)、およびミリストイル化/パルミチル化シグナルを含むHA−PKBα(m/p−HA−PKBα)。
PKB構築物で一時的にトランスフェクトしたHEK293細胞を、血清欠乏させ、37℃で10分間、0.1mMペルバナデートで刺激するかまたはせずに、細胞成分分画を発生させた。簡潔には、HEK293細胞を、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、20mM HEPES−NaOH(pH7.4)、250mMショ糖、ホスファターゼ阻害剤(10mMフッ化ナトリウム、1mMピロリン酸ナトリウム、0.1mMオルトバナデート・ナトリウム、2μMミクロシスチンLR[Alexis])、およびプロテアーゼ阻害剤(1mM PMSFおよび1mMベンズアミジン)を含む氷冷分画緩衝液中にこすり取って入れた。26ゲージの針を10回通過させることによるか、またはKenematica 均質化装置(スピード2で10ストローク、続いてスピード10で30ストローク)を使用することによるかのいずれかの均質化の後、細胞成分分画を、先に記載される通り作製した(HillおよびHemmings、Methods Enzymol、(2002年)、345巻:448〜463頁)。原形質膜ペレットを、上に記載される通りプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む50mMトリス−HCl(pH7.4)に再懸濁させた。基準としてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード(Bradford)法(Bio−Rad)によって、細胞成分分画のタンパク質濃度を測定した。分画を、液体窒素で急速凍結させ、さらなる使用のために−80℃で保存できる。
抗−HA抗体(12CA5)を用いた免疫ブロッティングによって、各分画中のPKBの存在を測定した。さらに、HA抗体を用いた免疫沈降の後に、ホスホ特異的PKB抗体を用いて免疫ブロッティングすることによって、各分画でのPKBのリン酸化状態を評価した。簡潔には、SDS−PAGEに続いて、タンパク質を、イモビロン−P膜(Millipore)に移動させた。室温で、1時間、5%スキムミルクを含むTBST緩衝液(50mMトリス−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.1% Tween−20)中で膜をインキュベートすることによって、非特異的シグナルを遮断した。4℃で、一夜、ホスホ特異的抗体用のTBST、ポリクローナル抗体用の1%スキムミルクを含むTBST、およびモノクローナル抗体用の5%スキムミルクを含むTBST中で、抗体を用いたインキュベーションを行った。Thr308でのリン酸化されたPKBに特異的な抗体は、商品として入手可能である(Cell Signalling Technologies)。Ser473でPKBリン酸化されたPKBに特異的な抗体を、先に記載される通り産生させ、精製した(HillおよびHemmings、Methods Enzymol、2002年、345巻:448〜463頁)。Pan−PKB抗体は、先に記載されている(Jonesら、Proc Natl Acad Sci USA、1991年、88巻:4171〜4175頁)。
野生型PKBαは、主に、飢餓状態細胞の細胞質ゲル分画に存在した。PKBαの一部は、ペルバナデート刺激によりPM分画に転位し、そこでは、リン酸化PKBαの大半が検出された。膜標的m/p−HA−PKBαは、PM分画と粗核分画の両方で見られ、刺激の後に転位は見られなかった。先に報告(Andjelkovicら、J Biol Chem、1997年、272巻:31515〜31524頁)された通り、m/p−HA−PKBαは、刺激および未刺激の両方の細胞中で、Thr308およびSer473の両方でリン酸化された。Ser473キナーゼが、PMで構造的に活性であるという了解の下に、m/p−HA−PKBαは、アゴニスト依存的方法で、Thr308およびSer473の両方で、PM分画中で高度にリン酸化された。
分画手段が既知タンパク質の局在化に基づいて確立されると、PKB Ser473キナーゼの細胞下局在化を測定した。PKB Ser473キナーゼ活性は、構造的に活性であるが、しかしPI3−キナーゼ阻害に感受性がある原形質膜分画で富化されていることが分かった。簡潔には、野生型HEK293細胞から生じた細胞成分分画でのSer473キナーゼ活性を、基質として2つのペプチド:PKBαの最後の16個のアミノ酸に対応するRRPHFPQFSYSASSTA(FSYペプチド;配列番号:1)、およびSer473がアラニンに変更される対照ペプチドRRPHFPQFAYSASSTA(配列番号:2)(FAYペプチド)を使用してインビトロで測定した。これらの2つのペプチドを、いくつかの理由で基質として使用した。FSYおよびFAYペプチドを使用することにより、Ser473部位に特異的なキナーゼ活性は、都合よく同定され得た。FAYを用いた結果は、この配列における他のSer/ThrまたはThr残基をリン酸化する能力のある部分的に精製された分画での非特異的キナーゼ活性の存在を示した。単離されたキナーゼ活性がPKBの疎水性部位内でSer473に特異的であったことを確認するために、バキュロウイルスPKB産生タンパク質を、基質としても試験し、続いてホスホ部位免疫ブロッティングを行った。
50mMトリス−HCl(pH7.4)、1mM DTT、10 MgCl2、1μM PKI、50mM ATP、0.15μCi [γ32P]ATP、0.1mg/ml基質(FSY)または対照(FAY)ペプチドを含む緩衝液中で50μl反応体積にてアッセイを行った。60分間、30℃で、振盪しながらインキュベートした後、反応を、5μlの100%(w/v)トリクロロ酢酸を添加することによって停止した。室温で、10分間、15,000gでの遠心分離により、タンパク質をペレット化した。適量(35μl)の上清を、四角のP81ペーパー(Whatmann)にスポット付けし、1%リン酸で徹底的に洗浄した。アセトンでの最終洗浄の後、P81ペーパーを、空気乾燥させ、シンチレーション計数によって分析した。いくつかの実験では、従来の方法(Yangら、2002年)を使用してバキュロウイルス系で産生される組換えΔPH−PKBβを、基質として使用し、基本的に上に記載される通り、ホスホ特異的抗体で免疫ブロッティングすることによって、リン酸化を検出した。
細胞質ゾル分画での総タンパク質は、通常は、原形質膜分画でのものより10倍多かった。さらに、Ser473リン酸化についての特異的酵素活性は、HEK293細胞のPM分画で非常に富化されており、Ser473キナーゼについての有効な精製手段を提供することが分かった。対照的に、PKBおよびPDK1は、未刺激細胞の細胞質ゾル分画で主に配置される(Parkら、J Biol Chem、2001年、276巻:37459〜37471頁)。Ser473キナーゼは、原形質膜分画で非常に富化されているので、PKBまたはPDK1のいずれかが、インビボでSer473キナーゼである可能性はない。さらに、部分的に精製されたSer473キナーゼ製剤が、PKBαのキナーゼ不活突然変異体を含めた種々のPKBイソ型をリン酸化できた条件下で、PKBは、Ser473で自己リン酸化しない。
次に、膜結合Ser473キナーゼ活性が、PI3キナーゼシグナル伝達によるかどうかを試験した。血清欠乏HEK293細胞を、0.1マイクロMインスリン、インスリン擬態ペルバナデート(0.1mM、10分)、PI3−キナーゼ阻害剤LY294002(50マイクロM、30分)で処理するか、または未処理のままにした。Ser473キナーゼ活性についてPM分画を分析し、ホスホ−PKBおよび総PKBについて免疫ブロッティングによっても分析した。先の結果(Alessiら、EMBO J.、1996年、15巻、6541〜6551頁;Andjelkovicら、Proc Natl Acad Sci USA、1996年、93巻:5599〜5704頁)と一致して、インスリンおよびペルバナデートは、PKBが、Thr308とSer473の両方でリン酸化を誘導し、ペルバナデートは、インスリンよりPKBリン酸化のさらに強力なアクチベーターであった。しかし、いずれの刺激も、基準線よりSer473キナーゼ活性を増大させたものはなかった。PI3キナーゼ阻害剤LY294002での血清欠乏細胞の処置は、Ser473キナーゼの活性を弱めた。LY294002処置に続く細胞質ゾル分画でのSer473キナーゼ活性における増大は観察されず、膜に、または膜に局在化したそのコファクターに結合しないときに、Ser473キナーゼが不活性であることを示唆した。
したがって、原形質膜とのSer473キナーゼの結合の特性をさらに特徴付けした。HEK293細胞から作製された原形質膜分画を解凍し、30分間、100,000gでペレット化した。上清を除いた後、膜ペレットを、1%トリトン(Triton)X−100または0.5M NaClのいずれかを含む50mMトリス−HCl(pH7.4)中に再懸濁させた。4℃での30分のインキュベーションに続いて、30分間、100,000gで遠心分離することによって、不溶性タンパク質をペレット化した。
高イオン強度緩衝液(0.5M)を用いたPM分画の抽出が、脂質二層からSer473キナーゼを放出し、活性を、主に上清で検出した。これは、Ser473キナーゼが、内在性膜タンパク質でないが、しかし、タンパク質/タンパク質または静電気相互作用を介して原形質膜と結合する可能性を示唆する。興味深いことに、PM分画が、1% Triton X−100で処理したときに、Ser473キナーゼ活性は、不溶性分画で非常に富化された。4℃で、1% Triton X−100への不溶性は、脂質ラフトと称される原形質膜のコレステロールおよびグリコスフィゴ脂質に富んだミクロドメインの特徴である(SimonsおよびToomre、Nature Rev.、2000年、1巻:31〜39頁;Galbiatiら、Cell、2001年、106巻:403〜411頁)。
ILKは、原形質膜に配置されると報告される候補Ser473キナーゼであるので、これらの分画も、ILKに対する抗体(たとえば、UBIから商品として入手可能)と免疫ブロットに付した。ILKは、洗剤および塩抽出の両方から上清およびペレット分画の両方で検出されたが、しかし高いPKBSer473キナーゼ活性を有する分画で僅かに富化されているように見える。これらのデータは、合わせて、PKBSer473キナーゼが、細胞中の脂質ラフトと結合されることを示唆する。
ショ糖浮遊勾配分析
4℃で、Triton X−100への不溶性に加えて、脂質ラフトも、ショ糖密度勾配でのそれらの浮揚性によって特徴づけられる(SimonsおよびToomre、Nature Rev.、2000年、1巻:31〜39頁)。PKB Ser473キナーゼの脂質ラフト結合をさらに確認するために、原形質膜のTriton X−100不溶性分画を、5%〜35%段階ショ糖勾配にかけ、その後、PKB Ser473キナーゼ活性について分析した。簡潔には、Triton X−100不溶性タンパク質を、40%(w/v)ショ糖を含む1.5mlの緩衝液A(50mMトリス−HCl(pH7.4)、150mM NaCl)中で再懸濁させ、13.2ml超遠心管に入れた。段階勾配は、35%、30%、25%、20%、15%、10%および5%のショ糖を含む緩衝液1.5mlの連続的重層による充填の上に形成された。残りの体積を、緩衝液Aで充填した。18時間、250,000gの遠心分離(Beckman Sw41ローターで39,000rpm)の後、1ml分画を、管の頂部から収集し、基本的に上に記載される通りキナーゼ活性についてアッセイを行った。
4℃で、Triton X−100への不溶性に加えて、脂質ラフトも、ショ糖密度勾配でのそれらの浮揚性によって特徴づけられる(SimonsおよびToomre、Nature Rev.、2000年、1巻:31〜39頁)。PKB Ser473キナーゼの脂質ラフト結合をさらに確認するために、原形質膜のTriton X−100不溶性分画を、5%〜35%段階ショ糖勾配にかけ、その後、PKB Ser473キナーゼ活性について分析した。簡潔には、Triton X−100不溶性タンパク質を、40%(w/v)ショ糖を含む1.5mlの緩衝液A(50mMトリス−HCl(pH7.4)、150mM NaCl)中で再懸濁させ、13.2ml超遠心管に入れた。段階勾配は、35%、30%、25%、20%、15%、10%および5%のショ糖を含む緩衝液1.5mlの連続的重層による充填の上に形成された。残りの体積を、緩衝液Aで充填した。18時間、250,000gの遠心分離(Beckman Sw41ローターで39,000rpm)の後、1ml分画を、管の頂部から収集し、基本的に上に記載される通りキナーゼ活性についてアッセイを行った。
大半のTriton X−100不溶性タンパク質は、勾配の底部(充填位置)に残り、小さなタンパク質ピークは、分画9で検出された。対照的に、PKB Ser473キナーゼ活性の主要ピークは、勾配の分画5および6に高まり、些細な活性が、分画9および13で検出された(図1)。適量の分画3から13までを、インビトロ・リン酸化反応にかけて、これらの分画内にキナーゼの活性を検出した。1mM DTT、10mM MgCl2、1μM PKI(最終濃度)および0.5〜1μCi [γ32P]ATPを、20μlの各分画に添加し、振蘯しながら30℃で、60分間インキュベートすることによって、浮遊勾配分画のインビトロ・リン酸化を行った。Laemmli サンプル緩衝液の添加により反応を停止させ、5分間、95℃で加熱し、その後SDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析した。興味深いことに、分画4から10までは、50乃至60kDaのいくつかのホスホタンパク質に加えて、40kDaと80kDaのホスホタンパク質を包含するリン酸化タンパク質の際立って類似したパターンを示した。浮揚分画(4から10まで)のホスホタンパク質プロファイルにおける類似性にもかかわらず、フロチリンは、分画7、8でのみ検出され、いくつかの物質は、充填位置に残っていた(分画13)。実験で使用されたショ糖勾配が、ラフトを、異なる浮揚性で分離させるが、しかしSer473でのリン酸化は、分画5および6でのみ検出されたように、この見かけの相違は、脂質ラフトでの不均一性による可能性がある。明らかに、PKB Ser473キナーゼ活性が分画5および6で富化されているが、一方ILKは、全ての分画で検出された。
ゲル濾過分析
実施例2は、PKB Ser473キナーゼ活性が、原形質膜の洗剤不溶性の浮揚密度分画で富化されており、膜とのこのキナーゼの結合は、高イオン強度により破壊され得ることを証明する。この相互作用の特性をさらに調査するために、Superdex−200カラムを使用したゲル濾過分析による原形質膜のNaCl抽出分画を分析した。FPLCシステム(Amersham Pharmacia Biotech)に付属したSuperdex−200HR10/30カラムを用いて、ゲル濾過を行った。簡潔には、カラムを、緩衝液B(20mMトリス−HCl(pH7.4)、0.5M NaCl、1mM DTTおよび1mMベンズアミジン)で平衡化した。0.5M NaCl処理から得られた上清(0.5ml)を、カラムにかけた。緩衝液Bを、流速0.5ml/分でポンプ輸送し、分画を、毎分ごとに収集した。ゲル濾過クロマトグラフィー用の分子量マーカーは、Sigmaから得て、ブルー・デキストラン(2000kDa)、アポフェリチン(443kDa)およびベータ−アミラーゼ(200kDa)を含んだ。
実施例2は、PKB Ser473キナーゼ活性が、原形質膜の洗剤不溶性の浮揚密度分画で富化されており、膜とのこのキナーゼの結合は、高イオン強度により破壊され得ることを証明する。この相互作用の特性をさらに調査するために、Superdex−200カラムを使用したゲル濾過分析による原形質膜のNaCl抽出分画を分析した。FPLCシステム(Amersham Pharmacia Biotech)に付属したSuperdex−200HR10/30カラムを用いて、ゲル濾過を行った。簡潔には、カラムを、緩衝液B(20mMトリス−HCl(pH7.4)、0.5M NaCl、1mM DTTおよび1mMベンズアミジン)で平衡化した。0.5M NaCl処理から得られた上清(0.5ml)を、カラムにかけた。緩衝液Bを、流速0.5ml/分でポンプ輸送し、分画を、毎分ごとに収集した。ゲル濾過クロマトグラフィー用の分子量マーカーは、Sigmaから得て、ブルー・デキストラン(2000kDa)、アポフェリチン(443kDa)およびベータ−アミラーゼ(200kDa)を含んだ。
溶出液のPKB Ser473キナーゼ活性を、基本的に実施例2で記載される通りに監視した。キナーゼ活性の主要ピークは、およそ〜550kDaの質量で溶出し、本キナーゼが、大型タンパク質複合体の一部であることを示唆した。このキナーゼも、PKBタンパク質をリン酸化することを立証するために、組換えΔPH−PKBβタンパク質を基質として使用して、Superdex−200カラムから得られた分画を分析した。ΔPH−PKBβタンパク質は、質量分光測定法およびホスホ免疫ブロッティングによって測定して、Ser473でリン酸化されなかった。Superdex200カラム分画によるΔPH−PKBβのリン酸化を、ホスホ−Ser473特異的抗体を使用して監視した。ペプチドキナーゼアッセイで観察される通り、PKB Ser473キナーゼ活性は、分画17から20までで溶出した(図2)。明らかに、非常に精製された結晶化等級PKBを使用して、PKBの自己リン酸化を見ることはできなかった。PKBβ製剤のSer473のリン酸化は、部分的に精製されたSer473キナーゼの添加に依存した。
Superdex−200カラムから得られるピーク活性分画のインビトロのリン酸化反応は、48kDaと58kDaの2つの顕著なホスホタンパク質を示し、それは、PKB Ser473キナーゼ活性と一致した。ILKタンパク質レベルも、ゲル濾過プロファイルでのPKB Ser473キナーゼ活性のものと密に一致した。
モノ(Mono)Q FPLCカラムクロマトグラフィー
Superdex−200Ser−473キナーゼ分画をさらに単離するためのモノQ FPLCを使用したイオン交換クロマトグラフィー。Superdex 2000カラムから得た分画を、緩衝液A(20mMトリス/HCL、pH7.5、1mM DTT、1mM EDTA、5%グリセロール、1mMベンズアミジン、および1mM PMSF)中で希釈(10回)させ、緩衝液Aで平衡化したMONO Q HR5/5カラムにかけた。カラムを、緩衝液Aで洗浄し、緩衝液A中の0から0.6M NaClまでの30ml直線状勾配で展開させた。カラムから溶出する0.5mlの分画を収集し、上に記載される通りSer473キナーゼ活性についてアッセイした。
Superdex−200Ser−473キナーゼ分画をさらに単離するためのモノQ FPLCを使用したイオン交換クロマトグラフィー。Superdex 2000カラムから得た分画を、緩衝液A(20mMトリス/HCL、pH7.5、1mM DTT、1mM EDTA、5%グリセロール、1mMベンズアミジン、および1mM PMSF)中で希釈(10回)させ、緩衝液Aで平衡化したMONO Q HR5/5カラムにかけた。カラムを、緩衝液Aで洗浄し、緩衝液A中の0から0.6M NaClまでの30ml直線状勾配で展開させた。カラムから溶出する0.5mlの分画を収集し、上に記載される通りSer473キナーゼ活性についてアッセイした。
部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼ活性の特徴付け
全長PKBα、PKBβおよびPKBγ、ならびにPKBαのキナーゼ不活性(K179A)およびリン酸化部位突然変異体(T308AおよびS473A)をリン酸化する、部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼの能力を試験した。HAタグ付きPKB構築物をHEK293細胞で発現させ、HAタグ付きPKBタンパク質を、プロテイン(Protein)A−セファロース(Sepharose)に予め結合された12CA5抗体(Roche Biochemicals)を使用して、NP−40溶解緩衝液中の溶解物から免疫沈降した。2時間、4℃でインキュベートした後、0.5M NaClで補足された溶解緩衝液中で1回、溶解緩衝液で1回、およびその後最終的に50mMトリス−HCl(pH7.4)で、ビーズを洗浄した。キナーゼ反応の前に、γ−ホスファターゼ(Cell Signaling Technologies)を用いた脱リン酸化を、製造業者の指示によって、30℃で、30分間行った。先に記載された通りに、ビーズを洗浄し、その後、30℃で、60分間、貯蔵Superdex−200分画を用いて/用いないで、キナーゼ反応緩衝液でインキュベートした。対照として、Superdex−200カラムから得られる貯蔵されたピーク活性分画を加えることなく、免疫沈降PKBタンパク質の半分を、キナーゼ反応緩衝液中でインキュベートした。キナーゼ反応の後、NP−40溶解緩衝液中で2回、ビーズを洗浄し、その後、SDS−PAGEサンプル緩衝液中で95℃に加熱してから、SDS−PAGEおよび免疫ブロッティングにより分析した。PKB Ser473リン酸化を、ホスホ−Ser473特異的抗体を用いた免疫ブロッティングによって検出した。
全長PKBα、PKBβおよびPKBγ、ならびにPKBαのキナーゼ不活性(K179A)およびリン酸化部位突然変異体(T308AおよびS473A)をリン酸化する、部分的に精製されたPKB Ser473キナーゼの能力を試験した。HAタグ付きPKB構築物をHEK293細胞で発現させ、HAタグ付きPKBタンパク質を、プロテイン(Protein)A−セファロース(Sepharose)に予め結合された12CA5抗体(Roche Biochemicals)を使用して、NP−40溶解緩衝液中の溶解物から免疫沈降した。2時間、4℃でインキュベートした後、0.5M NaClで補足された溶解緩衝液中で1回、溶解緩衝液で1回、およびその後最終的に50mMトリス−HCl(pH7.4)で、ビーズを洗浄した。キナーゼ反応の前に、γ−ホスファターゼ(Cell Signaling Technologies)を用いた脱リン酸化を、製造業者の指示によって、30℃で、30分間行った。先に記載された通りに、ビーズを洗浄し、その後、30℃で、60分間、貯蔵Superdex−200分画を用いて/用いないで、キナーゼ反応緩衝液でインキュベートした。対照として、Superdex−200カラムから得られる貯蔵されたピーク活性分画を加えることなく、免疫沈降PKBタンパク質の半分を、キナーゼ反応緩衝液中でインキュベートした。キナーゼ反応の後、NP−40溶解緩衝液中で2回、ビーズを洗浄し、その後、SDS−PAGEサンプル緩衝液中で95℃に加熱してから、SDS−PAGEおよび免疫ブロッティングにより分析した。PKB Ser473リン酸化を、ホスホ−Ser473特異的抗体を用いた免疫ブロッティングによって検出した。
キナーゼ反応緩衝液のみでインキュベートした後、PKBイソ型および突然変異体は、Ser473上でリン酸化されず、PKBが、これらの条件下ではSer473上で自己リン酸化しないことを示唆した。部分的に精製されたSer473キナーゼを用いたインキュベートの後、S473A突然変異体を除いて全てのPKBタンパク質は、Ser473上でリン酸化された。特に、ATP結合部位突然変異体K179A、および活性化合物ループ・リン酸化部位突然変異体T308Aは、Ser473上でリン酸化されるそれらの能力が損なわれず、PKBキナーゼ活性が最大Ser473キナーゼ活性のために必要ではないことを示唆する。
Ser473キナーゼ活性のスタウロスポリン感受性
Ser473上でのインスリン刺激リン酸化が、スタウロスポリン非感受性キナーゼを介して起こることが、先に示されている(Hillら、J Biol Chem、2001年、276巻:25643〜25646頁)。したがって、部分的に精製されたキナーゼのスタウロスポリン感受性を決定することに興味があった。Superdex−200カラムから得られるピーク活性分画を貯蔵し、その後、種々の濃度のスタウロスポリン(0、0.001、0.01、0.1、1、10および100マイクロM)の存在下で、基本的に上に記載される通りにFSYペプチドを使用してPKB Ser473キナーゼ活性についてアッセイした。このアッセイは、部分的に精製された分画中で2つの別個のキナーゼ活性の存在を示した:一方は、スタウロスポリンに対して急性に感受性があり、阻害は、1nMで観察される一方で、他方は、100μMまでのスタウロスポリンに非感受性である。我々の先の結果は、後者の活性のみが、PKB Ser473キナーゼに対応することを示唆する。
Ser473上でのインスリン刺激リン酸化が、スタウロスポリン非感受性キナーゼを介して起こることが、先に示されている(Hillら、J Biol Chem、2001年、276巻:25643〜25646頁)。したがって、部分的に精製されたキナーゼのスタウロスポリン感受性を決定することに興味があった。Superdex−200カラムから得られるピーク活性分画を貯蔵し、その後、種々の濃度のスタウロスポリン(0、0.001、0.01、0.1、1、10および100マイクロM)の存在下で、基本的に上に記載される通りにFSYペプチドを使用してPKB Ser473キナーゼ活性についてアッセイした。このアッセイは、部分的に精製された分画中で2つの別個のキナーゼ活性の存在を示した:一方は、スタウロスポリンに対して急性に感受性があり、阻害は、1nMで観察される一方で、他方は、100μMまでのスタウロスポリンに非感受性である。我々の先の結果は、後者の活性のみが、PKB Ser473キナーゼに対応することを示唆する。
ILKは、Ser473でのPKBのリン酸化で活発な役割を果さない
ILKは、ショ糖勾配分画およびゲル濾過カラムのピーク分画で検出されたので、ILKの役割を、原形質膜結合PKB Ser473キナーゼ活性で直接的に評価した。ILKを、NaClで抽出された原形質膜分画から免疫沈降させ、その後、免疫沈降と上清の両方を、PKB Ser473キナーゼ活性についてアッセイした。簡潔には、NaClで抽出した原形質膜分画(50mMトリス−HCl、pH7.4、0.5M NaCl中で)を、4℃で、1時間、Sepharose 4Bを使用して前もって浄化し、その後、4℃で2時間、プロテインA−セファロースに予め結合させたILK抗体(UBI)を使用して免疫沈降させた。上清を、アッセイのために回収した。免疫沈降物を、50mMトリス−HCl、pH7.4、0.5M NaCl中で2回、50mMトリス−HCl(pH7.4)で1回洗浄してから、キナーゼアッセイを、基本的に上に記載される通り行った。
ILKは、ショ糖勾配分画およびゲル濾過カラムのピーク分画で検出されたので、ILKの役割を、原形質膜結合PKB Ser473キナーゼ活性で直接的に評価した。ILKを、NaClで抽出された原形質膜分画から免疫沈降させ、その後、免疫沈降と上清の両方を、PKB Ser473キナーゼ活性についてアッセイした。簡潔には、NaClで抽出した原形質膜分画(50mMトリス−HCl、pH7.4、0.5M NaCl中で)を、4℃で、1時間、Sepharose 4Bを使用して前もって浄化し、その後、4℃で2時間、プロテインA−セファロースに予め結合させたILK抗体(UBI)を使用して免疫沈降させた。上清を、アッセイのために回収した。免疫沈降物を、50mMトリス−HCl、pH7.4、0.5M NaCl中で2回、50mMトリス−HCl(pH7.4)で1回洗浄してから、キナーゼアッセイを、基本的に上に記載される通り行った。
免疫沈降の後、ILKまたは正常なラット血清のいずれを免疫沈降に使用したかにかかわらず、PKB Ser473キナーゼ活性を、上清で検出した。ILKの存在が免疫ブロッティングで確認されたILK免疫沈降物で顕著なSer473キナーゼ活性は検出されなかった。さらに、HEK293細胞中のILKの過剰発現により、基底条件下、およびさらにインスリン刺激下の両方で、顕著なPKBのSer473上のリン酸化は観察されなかった。これらのデータは、ILKが、PKB Ser473キナーゼとして役割を果すことができないことを示唆する。
いくつかの系統の証拠が、本発明により単離されたPKB Ser473キナーゼ活性を、ILKと区別する。成長因子によってさらに活性化されない上記した構造的に活性なSer473キナーゼ活性と対照的に、インスリンは、PI3−キナーゼ依存的方法でILKを活性化させた(Delcommenneら、Proc Natl Acad Sci USA、1998年、95巻:11211〜11216頁)。Ser473キナーゼ活性とILKの両方とも原形質膜のトリトンX−100不溶性分画で見ることができるが、それらは、ショ糖浮遊勾配で異なる行動を示した。さらに、Ser473キナーゼ活性が、上清で検出されたが、しかし膜分画から得られるILK免疫沈降物では検出されなかった。最終的に、PKB Ser473リン酸化に対するILK過剰発現の影響は検出できなかった。さらに、ILKノックアウト胚でのDrosophila PKBのSer473リン酸化が、野生型胚に匹敵することが最近判明し、ILKがPKB Ser473キナーゼでないさらなる証拠を提供する。
要約すると、本発明者らは、リン酸化によるPKBの調節を調査し、したがって、細胞培養系からPKB Ser473キナーゼを精製した。本発明者らは、PKB Ser473キナーゼが、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞の原形質膜のラフト様分画に富化されていること、その構造的活性は、PI3−キナーゼに依存することを知見した。原形質膜とのPKB Ser473キナーゼの結合は、それが、高塩抽出物により膜から遊離できるので、タンパク質−タンパク質相互作用を介して起こることがわかった。ILKは、Ser473キナーゼ活性で同時分画することが分かった。しかし、顕著なPKB Ser473キナーゼ活性は、塩抽出原形質膜分画から得られたILK免疫沈降物中で検出できなかった。本発明者らは、ILKそれ自体がPKB Ser473キナーゼでないことを示す。ショ糖密度勾配で、およびゲル濾過による両方で、PKB Ser473キナーゼ活性と同時分画する、それぞれ、48kDaと58kDaの2つの候補ホスホタンパク質を同定した。PKB Ser473キナーゼは、細胞の原形質膜に存在することが示された。
Claims (11)
- 細胞タンパク質に結合したときに、PKB Ser473キナーゼ活性を示し、450〜650kDaの見かけの分子量を示し、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞の粗膜抽出物と比較して少なくとも20,000倍増大した純度を有する、HEK293細胞由来のPKB Ser473キナーゼを含む組成物であって、SDSゲル電気泳動によって概算される場合、48kDaまたは58kDaの分子量を有するタンパク質を含む、組成物。
- 少なくとも50,000倍増大した純度を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、SDSゲル電気泳動によって概算される場合、58kDaの分子量を有するタンパク質を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- PKBペプチド基質を 32P標識ホスフェートでリン酸化するキナーゼアッセイで検出する場合、0.2μgのタンパク質中で測定可能なPKB Ser473キナーゼ活性を有し、前記キナーゼが、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、450〜650kDaの見かけの分子量で溶出し、そしてSDSゲル電気泳動によって概算される場合、48kDaまたは58kDaの分子量を有する、HEK293細胞由来の精製細胞抽出物。
- 前記キナーゼがゲル濾過クロマトグラフィーにより分画される場合、550kDaの見かけの分子量で溶出する、請求項4に記載の精製細胞抽出物。
- 前記キナーゼは、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞の粗抽出物と比較して、少なくとも50,000倍富化されている、請求項4または5に記載の精製細胞抽出物。
- (i)動物に、免疫原性的に有効な量の、請求項1に記載の組成物または請求項4に記載の精製細胞抽出物であるPKB Ser473キナーゼ免疫原を投与し;
(ii)前記動物に、免疫原に対する抗体を産生させ;そして
(iii)前記動物から、またはそこから誘導される細胞培養物から抗体を得る
段階を含む、精製PKB Ser473キナーゼタンパク質に選択的に結合する抗体を産生する方法。 - 請求項7に記載の方法により得られるPKB Ser473キナーゼ特異的抗体。
- i)請求項1に記載の組成物または請求項4に記載の抽出物である精製PKB Ser473キナーゼタンパク質を、化合物とインキュベートし;
ii)PKB Ser473キナーゼ活性を測定し;
iii)前記化合物が不在である場合と比較して、化合物の存在下で、PKB Ser473キナーゼ活性における改変を検出する段階を含み、該改変が、PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターを示す、
PKB Ser473キナーゼ活性の潜在的モジュレーターをスクリーニングをする方法。 - PKB Ser473キナーゼ活性における前記改変がPKB Ser473キナーゼ活性における減少であり、前記減少がPKB Ser473キナーゼの潜在的阻害剤を示す、請求項9に記載の方法。
- PKB Ser473キナーゼ活性における前記改変がPKB Ser473キナーゼ活性における増大であり、前記増大がPKB Ser473キナーゼの潜在的アクチベーターを示す、請求項9に記載の方法。
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