WO2005116241A1 - 哺乳動物細胞の性質判定方法及びこれを用いた癌の診断方法 - Google Patents

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cdk
cyclin
dependent kinase
ratio
specific activity
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Hideki Ishihara
Tomoko Matsushima
Yuko Kawasaki
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the properties of mammalian cells and a method for diagnosing cancer using the same.
  • the present invention relates to the sensitivity to stimulants such as cancer, tumor malignancy, and anticancer drugs, based on the ratio between the activity level of CDK, including the specific activity of cyclin-dependent kinase (CDK), and the expression level.
  • the present invention relates to a method for determining sex and a method for diagnosing cancer using the method. Background art
  • Tumor markers are substances such as proteins, glycoproteins, and lipids that are expressed in tumor cells by genes that are no longer expressed during the development and maturation of individuals. Serum diagnosis detects tumor markers. By doing so, the stage and malignancy of the tumor are determined. However, many of the currently used tumor markers are not very specific for cancer. In early cancers, the expression sensitivity is low because the expression level is very small. For these reasons, at present, the reliability of cancer diagnosis using tumor markers is not so high in medical practice.
  • TNM classification has been devised as a method for standardizing diagnostic methods, and is being diverted worldwide.
  • the TNM classification of cancer is a method used by the International Union for Cancer Research (UICC) to describe the degree of malignancy progression, where "T” is the size of the primary tumor, ⁇ is the level of lymph metastasis, and ⁇ is the distant metastasis. Is shown. Then, for ⁇ , the degree of progress is classified into 1 (the extent to which the tumor is localized in the tissue) to 4 (the extent to which tumor formation outside the tissue appears). The degree of progress was classified into 0 (no local lymph node metastasis) to 3 (nodal metastasis was histologically recognized).
  • the grade was 0 (no distant metastasis) to 1 (distant metastasis). Metastasis). The larger the value in any of T, ⁇ , and ⁇ , the lower the prognosis and the higher the grade of malignancy.
  • Such ⁇ classification is generally used because it is useful for decision of treatment and prognosis. However, even in patients who are judged to have early cancer by ⁇ classification, about 10 At present, ⁇ 20% of patients will relapse due to distant metastases and die within 5 years, which is a major clinical problem. In addition, ⁇ judgment based on classification can grasp the pathological condition at the time of diagnosis, but has not yet been able to accurately predict the prognosis.
  • Patent Document 1 proposes a diagnostic method using the expression levels of CDK1 and CDK4 in a sample and, if necessary, the p53 mutation status as an index.
  • Patent Document 2 proposes a method for diagnosing cancer and precancerous conditions using overexpression of CDK4, CDK6, and cyclin-dependent kinase inhibitor (CDK inhibitor) as an index.
  • Cyclin-dependent kinase (CDK) expression is known to be high and high in cells in which growth is induced by growth factors, but is generally present in a certain amount in cells. In addition, it shows activity at a specific stage of the cell cycle according to the type of CDK because it is bound to a cyclin molecule to form a complex of CDK and cyclin after being subjected to an activity such as phosphoridation. It is also known that CDK inhibitors bind to CDK and Z or cyclin'CDK complexes and inhibit CDK activity. Thus, since the actual regulation of the cell cycle is complicated, a mere judgment based on the expression levels of CDKs, cyclins, and CDK inhibitors is not sufficient as an indicator of the regulation state of the cell cycle.
  • Patent Document 3 discloses a diagnostic method using CDK activity as an indicator of cancer malignancy, and a method of measuring CDK activity without using a radioactive substance, in consideration of the binding to cyclin and the effects of inhibitors. It has been disclosed. However, the data on the activity measured by this method does not have sufficient diagnostic accuracy to substitute for cancer diagnosis currently performed in clinical practice.
  • MTT Atssay method means that MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) is present in mitochondria when incorporated into living cells. That can be cleaved by reductase (succinate dehydrogenase), which is not able to cleave MTT in dead cells.
  • Non-Patent Document 1 It is reported to be 5% (Non-Patent Document 1).
  • the above-mentioned deviation method also has a positive prediction rate of less than 70%, which is insufficient as an index for judging whether or not it is possible to take the anticancer drug treatment.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Publication No. 2002-504683
  • Patent Literature 2 JP-T 2002-519681
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-335997
  • Non-patent document l Weisenthal, L.M. and Nygren.P (2002) Current status of cell culture drug resistance testing (CCDRT) ⁇ http: / / linithal.org/ oncol- t.htm
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and an object of the present invention is to determine the degree of malignancy of cancerous tissues in the clinic (small metastasis, poor recurrence, poor prognosis). Another object of the present invention is to provide a judgment method capable of making an accurate and stable judgment by eliminating a variation in diagnosis between medical institutions and individuals, and a method of molecular diagnosis of cancer using the method.
  • the sensitivity of mammalian cells to stimulants such as anticancer drugs can be used as an index for determining whether to take drug treatment such as anticancer drug treatment. High !, also provides a judgment method.
  • the present inventors focused on the specific activity of cyclin-dependent kinases and conducted various studies on the relationship with tissue pathological judgment. As a result, the specific activities of two types of cyclin-dependent kinases (CDKs) or their specific activities were examined. They found that there was a high correlation between the CDK profile, including the reciprocal, and the cell proliferation ability and tissue malignancy (relapse), and completed the method for determining the properties of the present invention. I let you. The inventors also found that the sensitivity of mammalian cells to stimulants was correlated with the two types of CDK profiles, and completed the method for determining sensitivity according to the present invention.
  • CDKs cyclin-dependent kinases
  • the method for determining the properties of a mammalian cell of the present invention includes the ratio of the activity value and the expression level of the first cyclin-dependent kinase (first CDK) and the second cyclin-dependent kinase in a mammalian cell. This is a method for judging the above-mentioned properties of mammalian cells based on a CDK profile including a ratio between the activity value and the expression level of ze (second CDK).
  • the property may be determined by comparing the CDK profile with a CDK profile of a standard cell.
  • the property of the mammalian cell may be determined by comparing the ratio of the activity value of the dependent kinase (second CDK) to the expression level (A2) with a predetermined threshold value corresponding to the ratio.
  • the cyclin-dependent kinase is preferably selected from the group consisting of CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, cyclin A-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, and cyclin D-dependent kinase, and more preferably.
  • the first cyclin-dependent kinase is CDK1
  • the second cyclin-dependent kinase is CDK2.
  • the property may be the proliferative ability of the mammalian cell or the malignancy of the mammalian cell.
  • the malignancy includes the metastasis, recurrence, and poor prognosis.
  • the metastasis includes lymph node metastasis and distant metastasis.
  • the method for diagnosing cancer of the present invention is a method for diagnosing the malignancy of a cancer based on the above-described determination method of the present invention for cells from which the strength of a living tissue has also been collected.
  • the method for determining the sensitivity of a mammalian cell to a stimulant includes the step of determining the ratio between the activity value and the expression level of a first cyclin-dependent kinase (first CDK) in a mammalian cell and the second cyclin-dependent kinase. Based on the CDK profile including the ratio between the activity value and the expression level of the kinase (second CDK), the sensitivity of the cells to the stimulator is determined.
  • first CDK first cyclin-dependent kinase
  • second CDK Based on the CDK profile including the ratio between the activity value and the expression level of the kinase
  • the first cyclin-dependent kinase (second The ratio between the activity value and the expression level of (1CDK) (A1) and the ratio of the activity value and the expression level of the second cyclin-dependent kinase (second CDK) (A2) corresponds to the ratio.
  • the cyclin-dependent kinase is preferably selected from the group consisting of CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, cyclin A-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, and cyclin D-dependent kinase.
  • the stimulating substance is preferably selected from a growth factor, an anticancer agent, and a mutagenic substance.
  • the CDK profile referred to in the present specification refers to the ratio (eg, specific activity) between the activity value and expression level of at least one kind of CDK possessed by a certain cell, the activity value of Z or a plurality of CDKs, Numerical value calculated from the present amount (for example, the ratio of the activity value of the first CDK to the expression level (A1) and the ratio of the activity value of the second CDK to the expression level (A2) (for example, A1ZA2 or A2ZA1 ) Etc.).
  • the ratio eg, specific activity
  • Numerical value calculated from the present amount for example, the ratio of the activity value of the first CDK to the expression level (A1) and the ratio of the activity value of the second CDK to the expression level (A2) (for example, A1ZA2 or A2ZA1 ) Etc.
  • CDK cyclin-dependent kinase
  • CDK specific activity CDK activity value, CDK expression level
  • the CDK activity value is a unit based on the mass of the phosphorylated substrate, and is a value obtained from the actual measurement value of the cell-containing sample and the activity value of the standard product (versus the activity value).
  • the expression level of CDK refers to the amount (unit of molecular number) of CDK present in an actual cell-containing sample.
  • the term “easiness of metastasis” in the present invention refers to the high probability that cancer cells move from a primary focus to a distant tissue and form a metastatic focus. High probability! ⁇ It is known that the biological characteristics (ease of metastasis) of cancer cells are indicated by their invasive and migratory abilities.
  • the likelihood of recurrence refers to the frequency of recurrence of a cancer patient group classified according to a certain classification (eg, stage classification). For example, Stage III has a 50% recurrence rate and Stage II (Relapse rate) (20%).
  • Poor prognosis refers to the frequency of death within 5 or 10 years of a group of cancer patients classified according to a certain classification (eg, stage classification). For example, stage III has a mortality rate of 50%, and is said to have died and a poor prognosis sooner than stage II (mortality rate of 20%).
  • stage III has a mortality rate of 50%, and is said to have died and a poor prognosis sooner than stage II (mortality rate of 20%).
  • the specific activity is used as an index to avoid errors and noise due to the method for preparing the measurement sample.
  • the CDK specific activity profile that takes into account the specific activities of the two CDKs, and particularly the ratio of the specific activities of the two CDKs, which is used as a judgment index in the present invention, is determined based on the ratio of the cells present in the cell cycle, Since it is highly correlated with cancer and other properties such as several media, highly reliable molecular diagnosis is possible.
  • the index based on the cell cycle since the index based on the cell cycle is used, it is possible to judge the biological characteristics of the current cell, clinical characteristics (typically malignancy) that can be determined only by their characteristics, drugs such as anticancer drugs, and external stimulation. It is also possible to determine the susceptibility or the resistance to. Especially in the determination of susceptibility, the rate of correct answers for the determination of susceptibility (positive) is high, so when taking anticancer drug treatment, it is excellent as a criterion!
  • FIG. 1 is a diagram for explaining a cell cycle.
  • FIG. 2 is a view showing the results of measuring the DNA content of various cultured cells.
  • FIG. 3 is a view for explaining the results of DNA content data.
  • FIG. 4 is a graph showing the abundance ratio of various culture cells in the S phase.
  • FIG. 5 is a graph showing measurement results of CDK1 specific activity and CDK2 specific activity of various cultured cells.
  • FIG. 6 is a view showing a CDK specific activity profile of a specimen determined as low risk among tissues derived from a breast cancer patient.
  • FIG. 7 is a view showing a CDK specific activity profile of a specimen determined as high risk among tissues derived from a breast cancer patient.
  • FIG. 8 is a graph showing the measurement results of CDK1 specific activity and CDK2 specific activity of breast cancer patients A to I.
  • Breast cancer patients AI receive treatment with the anticancer drug docetaxel, The change in size was examined.
  • FIG. 9 is a graph showing the measurement results of CDK1 specific activity and CDK2 specific activity of breast cancer patients J to P.
  • Breast cancer patients JP received treatment with the anticancer drug paclitaxel, and the change in tumor size after administration was examined.
  • the method of the present invention for determining the properties of a mammalian cell comprises measuring the expression level and activity of two or more cyclin-dependent kinases in the mammalian cell, and determining the activity of the first cyclin-dependent kinase.
  • This is a method for determining the properties of the mammalian cell based on a CDK profile including a ratio between the expression level and the ratio between the expression value and the activity value of the second cyclin-dependent kinase.
  • the mammal targeted by the determination method of the present invention is not particularly limited, but the determination method of the present invention requires determination of a human, particularly a clinical condition, more specifically, a condition for cancer. Useful for humans.
  • the cells targeted by the method of the present invention include mammalian living tissues, that is, supporting tissues such as fibrous connective tissues, cartilage tissues, bone tissues, blood, and lymph; epithelial tissues; muscle tissues; Cells that break the harmony as an individual and cause abnormalities in the control mechanism of proliferation! / Obtained pathological information, such as tumor cells in rutile tissue! is there .
  • mammalian living tissues that is, supporting tissues such as fibrous connective tissues, cartilage tissues, bone tissues, blood, and lymph; epithelial tissues; muscle tissues; Cells that break the harmony as an individual and cause abnormalities in the control mechanism of proliferation! / Obtained pathological information, such as tumor cells in rutile tissue! is there .
  • tumor cells that can be located in breast, lung, liver, stomach, large intestine, spleen, skin, uterus, testis, ovary, thyroid, parathyroid, lymphatic system, bone marrow and the like are suitable targets.
  • These cells may be cells obtained by directly collecting the power of the corresponding biological tissue, or cells obtained by separating the power of excretion from the living body such as urine and sputum. Alternatively, subcultured cells may be used. When it is desired to obtain information on cancer, cells collected from tumor tissue are preferably used.
  • the properties of the mammalian cell to be determined include the proliferation ability and malignancy of the cell to be measured.
  • the proliferative capacity of a cell refers to the level of proliferative activity of the cell, the power of abnormalities in the control mechanism of proliferation (presence or absence of canceration), and information on aneuploidy.
  • the malignancy of a cell refers to the severity of metastasis, recurrence, poor prognosis, etc. No.
  • recurrence refers to the case where the same malignant tumor is reproduced in the remaining organ after partial resection of the organ in order to remove the malignant tumor, or the case where tumor cells are separated from the primary tumor and distant tissue (distant tissue). (Organ)), where it grows autonomously there (metastatic recurrence).
  • distal tissue distant tissue
  • metastatic recurrence Generally, if recurrence is observed within 5 years, it is said to be “prone to recurrence”.
  • stage III has a recurrence rate of 50%, which is more likely to occur than stage II (relapse rate of 20%).
  • Prognosis is the prediction of the course and end of the disease.The higher the mortality after 5 or 10 years, the worse the prognosis.For example, stage III has a mortality of 50% and stage II has a mortality of 20%. The prognosis is worse.
  • the cyclin-dependent kinase is a generic term for a group of enzymes that are activated by binding to cyclin, and function at a specific time in the cell cycle according to the type.
  • CDK inhibitor is a generic term for a group of factors that bind to the cyclin'CDK complex and inhibit its activity.
  • the cell cycle which is the cycle from the start of proliferation of a cell, through events such as DNA replication, chromosome distribution, nuclear division, and cytokinesis, to becoming two daughter cells and returning to the starting point, is as follows: As shown in Figure 1, there are four phases: G1, S, G2, and M phases.
  • the S phase is the DNA replication phase
  • the M phase is the mitotic phase.
  • the G1 phase is a preparatory inspection period from the completion of mitosis to the start of DNA synthesis to enter the M phase. Beyond the critical point in the G1 phase (point R in animal cells), the cell cycle starts and usually goes around without stopping.
  • the G2 phase is also the end of DNA synthesis and the start of mitosis.
  • the major checkpoints in the cell cycle are the G1 phase and the G phase phase, just before entering the S phase.
  • the G1 checkpoint is especially important because it triggers the start of the S phase. This is because beyond a certain point in the G1 phase, the cell progresses through the cell cycle in the order of S ⁇ G2 ⁇ M ⁇ G1 without stopping proliferation even if the proliferation signal is lost.
  • the cells that have stopped growing have a resting phase (GO) with a G1 phase DNA content and are out of the cell cycle. Induction of proliferation allows the cells to progress to the S phase a little longer than the G1 phase in the cell cycle.
  • the cyclin-dependent kinase (CDK) used in the method of the present invention is selected from the group consisting of CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, cyclin A-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, and cyclin D-dependent kinase.
  • Cyclin A dependence Sex kinases are CDKs that show activity by binding to cyclin A and, as currently known, refer to both CDK1 and CDK2.
  • Cyclin B-dependent kinase is a CDK that shows activity by binding to cyclin B, and CDK1 corresponds to what is currently known.
  • Cytalin D-dependent kinase refers to a CDK that binds to cytalin D and shows activity.
  • both CDK4 and CDK6 correspond.
  • CDKs are now known to have a cyclin-CDK complex bound to the corresponding cyclin (hereinafter sometimes referred to as "active CDK").
  • active CDK the specific period of the cell cycle as shown in Table 1 is activated.
  • CDK1 binds to cyclin A or B
  • CDK2 binds to cyclin A or E
  • CDK4 and CDK6 bind to cyclin D1, D2, or D3 to become active.
  • CDK activity may be inhibited by CDK inhibitors as shown in Table 1.
  • p21 inhibits CDK1,2, p27 inhibits CDK2,4,6 and pl6 inhibits CDK4,6.
  • CDK specific activity CDK activity value
  • CDK expression level CDK expression level
  • CDK profile examples include a profile containing CDK specific activity (CDK specific activity profile) and a profile containing the reciprocal of CDK specific activity (reciprocal profile of CDK specific activity).
  • the CDK activity value refers to the number of substrates that bind to a specific cyclin (for example, activated CDK1, activated CDK2 is histone Hl, activated CDK4 and activated CDK6 are Rb (retinoblastoma)
  • activated CDK1 activated CDK2 is histone Hl
  • activated CDK4 and activated CDK6 are Rb (retinoblastoma)
  • the ability to phosphorylate a protein (Retinoblastoma protein)) and the level of enzymatic kinase activity (unit is expressed in U (unit)) can be measured by a conventionally known enzyme activity measuring method.
  • papermaking samples containing cell lysate mosquito ⁇ Luo activated CDK of the measurement sample tone, 32 P-labeled ⁇ ( ⁇ - [32 P] - ATP) using the 32 P into the substrate protein There is a method that measures the amount of labeled phosphorylation substrate after incorporation and quantifies it based on a calibration curve created with a standard product.
  • a method without using a radioactive label a method disclosed in JP-A-2002-335997 can be mentioned.
  • the cell-solubility of the measurement sample is determined by preparing a sample containing the desired activated CDK and reacting adenosine 5, -0- (3-thiotrifosfate) (ATP- ⁇ S) with the substrate.
  • a monothiophosphate group is introduced into the serine or threonine residue of the substrate protein, and a labeling fluorescent substance or a labeling enzyme is bound to the sulfur atom of the introduced monothiophosphate group to label the substrate protein.
  • This method measures the labeling amount of the obtained thiophosphoric acid substrate (the amount of fluorescence when a labeled fluorescent substance is used) and quantifies it based on a calibration curve created with a standard product.
  • a sample to be used for activity measurement is prepared by specifically collecting a target CDK from a soluble solution of cells to be measured.
  • a target CDK from a soluble solution of cells to be measured.
  • it may be prepared using an anti-CDK antibody specific for the target CDK, or may be prepared using a specific cyclin-dependent kinase (for example, cyclin-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, cyclin E-dependent kinase).
  • a specific cyclin-dependent kinase for example, cyclin-dependent kinase, cyclin B-dependent kinase, cyclin E-dependent kinase.
  • an anti-cyclin antibody for activity measurement, use an anti-cyclin antibody to prepare.
  • the sample will contain CDKs other than the active CDK.
  • a complex in which a CDK inhibitor is bound to a cyclin'CDK complex is also included.
  • an anti-CDK antibody When an anti-CDK antibody is used, it includes CDK alone, a complex of CDK and cyclin and Z or a CDK inhibitor, and a complex of CDK and another compound. Therefore, the activity value is determined by the active, inactive, and various competitive reactions. It is measured as phosphorylated substrate units (U) under mixed conditions.
  • the CDK expression level is a target CDK level (a unit corresponding to the number of molecules) for which the cell solubilizability is also measured, and is a conventionally known method for measuring the target protein level from a protein mixture. Can be measured. For example, an ELISA method, a Western blot method, or the like may be used, or the measurement may be performed by the method disclosed in JP-A-2003-130871.
  • the target protein (CDK) may be captured using a specific antibody.
  • use of an anti-CDK1 antibody indicates that all of the CDK1 present in the cell (including CDK alone, complexes of CDK with cyclins and Z or CDK inhibitors, complexes of CDK with other compounds) Can be captured.
  • the specific activity calculated by the above equation corresponds to the ratio of the CDK exhibiting the activity among the CDKs present in the cells, and the CDK activity level based on the growth state of the animal cell to be determined is I can say.
  • the CDK specific activity thus determined does not depend on the preparation method of the measurement sample. Measurement sample preparation methods, especially measurement samples (cell lysates) prepared from biopsies, are susceptible to the effects of non-cellular tissues, such as extracellular matrix, in the tissues actually collected. Therefore, the significance of using the specific activity or the reciprocal thereof after subtracting such effects is significant, and the correlation with the clinical character is higher than that of the conventional simple activity value.
  • the type of CDK for which specific activity is measured may be appropriately selected according to the type of property to be known.
  • cancer cells deviate from normal growth control and proliferate actively.Thus, it is considered that the proportion of cells in the S phase and G2 phase is high, and it is considered that cancer occurs in such cases.
  • aneuploidy may have passed abnormal M phase or progressed to G1 phase without M phase, Therefore, it is also considered malignant if the proportion of cells present in the M phase is small.
  • CDK1 was used as the first cyclin-dependent kinase and CDK2 was used as the second cytaline-dependent kinase, and they were classified into groups according to the magnitude of CDK1 specific activity.
  • the specific activity value reflects the cell ratio in S phase. When there are many cells in the S phase, it can be determined that the tissue in which the cells are constituent cells is clinically malignant, that is, a malignant cancer with a poor prognosis that easily metastasizes.
  • the existence ratio of the cell cycle at a specific time is estimated from the CDK specific activity profile including two or more types of CDK specific activity, and the degree of malignancy of the cell is determined.
  • the specific activity profile of two or more types of CDKs which have been measured in advance using the corresponding normal tissue cells as standard cells, may be determined, and the degree of malignancy may be determined by comparison with the normal cells.
  • the ratio of the specific activities of two cyclin-dependent kinases it is preferable to employ the ratio of the specific activities of two cyclin-dependent kinases.
  • the property of the cell is determined by comparing the ratio of the specific activities of the two cyclin-dependent kinases to a predetermined threshold value corresponding to the ratio.
  • the threshold value used in the cell property determination method of the present invention is appropriately determined depending on the type of the cell to be measured and the determination item.
  • the threshold value can be set by selecting a value of the ratio of the specific activity serving as a border for the relevant item from a database of a large number of cells and individuals related to the target item and a database of CDK specific activities of the cell. For example, the ratio of the specific activities of two types of CDKs, which are considered to be correlated, was calculated for tumor cells from multiple patients whose tumors were known by the pathologist to determine the degree of malignancy of the cancer. The median value at which the population can be divided into two equal parts by arranging the ratios in ascending order can be used as the threshold value.
  • the determination method of the present invention can also be applied to the sensitivity of a cell to an irritant, not only to the properties of the cell such as proliferation ability and malignancy.
  • differences in the efficacy of drugs such as anticancer drugs due to the genetic constitution of patients, which have been pointed out in recent years, are caused by differences in sensitivity of cells to stimulants.
  • the intrinsic properties of cells include whether they are sensitive or insensitive to stimulants! / Ivy, and the ratio of the specific activities of the two CDKs is also related to their sensitivity to stimulants. ing.
  • the acceptability determination method is based on a CDK profile including a ratio between the expression level and the activity value of the first CDK and a ratio between the expression level and the activity value of the second CDK, and the sensitivity of the cell to the stimulant is determined.
  • a CDK profile including a ratio between the expression level and the activity value of the first CDK and a ratio between the expression level and the activity value of the second CDK, and the sensitivity of the cell to the stimulant is determined.
  • Examples of the CDK profile include a profile containing CDK specific activity (CDK specific activity profile) and a profile containing a reciprocal of CDK specific activity (reciprocal profile of CDK specific activity).
  • the ratio of the specific activity of the first cyclin-dependent kinase to the specific activity of the second cyclin-dependent kinase is compared with a predetermined threshold value.
  • the stimulating substance is selected from the group consisting of growth factors, anticancer agents, and mutagenic substances.
  • the content of determination and the content of sensitivity differ depending on the type of the stimulus substance. For example, it is determined whether or not an anticancer agent is effective, and whether or not there is a response to a mutagenic substance or a growth factor.
  • the threshold value used as a criterion for determination in the cell sensitivity determination method of the present invention is appropriately set according to the type of the stimulant.
  • the threshold is set by examining the correlation between the specific activity value of CDK, which serves as a judgment index for cells that have been stocked in advance, and data on whether or not these cells are sensitive to stimulants.
  • a threshold that is a boundary is selected.
  • the threshold is set based on the relationship between the ratio of the specific activities of the two types of CDKs, which is divided into the group of patients exposed to the stimulant and the group of susceptibility to the stimulus.
  • cultured cells of various tumor cells may be stimulated with a stimulant, and the proliferation level and response level to the stimulant may be measured to separate the cells into a sensitive group and a non-sensitive group. It may be set based on the relationship with the ratio of two types of CDK specific activities measured separately! / ⁇
  • the value of one or both CDK specific activities itself for determination is very small! /, Or conversely, one or both specific activities. In some cases, the value is so large that the specific activity ratio value is far from the threshold value.
  • cells that are judged to be insensitive to the stimulant may have a very small specific activity value of CDK, which is a measurement item.
  • the stimulus may be determined by considering the magnitude of the specific activity value of CDK, which is used for the judgment that cannot be made only by the ratio of the specific activity values.
  • quality sensitivity is determined. Specifically, a threshold value serving as a judgment index is set for the specific activity value itself, and a judgment is made in consideration of a result of comparison with the threshold value.
  • the order of these comparisons is not particularly limited. It is preferable to appropriately determine the handling according to the type. For example, the specific activity value may be compared with a threshold value to determine those which can be clearly determined to be sensitive or insensitive, and then the remaining cells may be determined by comparing the specific activity ratio with the corresponding threshold value. Alternatively, if the cell to be measured is a cell having a very small specific activity value of one or both !, or a cell having a very large specific activity value of one or both, and if the cell is a cell, first determine the specific activity ratio of CDK.
  • the specific activity of one or both cells is very small, and the specific activity of one or both cells is very small.
  • the determination result based on the comparison between the specific activity ratio and the corresponding threshold may be modified. ,.
  • the specific activity value differs depending on the method for measuring the activity and expression level, the type of antibody used for the measurement, and the like. Therefore, the determination method of the present invention based on the comparison with the threshold value includes a method for measuring the specific activity at the time of preparing the database when setting the threshold value and a method for measuring the specific activity of the cell to be determined. Must be matched with
  • Surgically collected tissues (2 mm 3 ) or cultured tumor cells shown in Table 2 were used as the biological samples to be measured.
  • the biological sample was prepared by adding 0.1 lwZv% Noded P-40 (NP-40) (manufactured by Calbiochem), 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 50 mM FDTA, sodium
  • the cell lysate was removed by aspirating 10 times with a 5 ml syringe equipped with a 23G needle in an ice bath in a lysis buffer containing 100% sodium orthovanadate and 100 ⁇ l Zml of the protease inhibitor cocktail (Sigma).
  • the cultured cells were prepared so as to be 1 ⁇ 10 7 cells / 5 ml.
  • the insoluble matter was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant (cell lysate) was used as a sample for measurement.
  • Sepharose beads manufactured by Bio-Rad
  • protein ⁇ specific antibody polyclonal anti-CDK1 antibody or polyclonal anti-CDK2 antibody from Santa Cruz Biotechnology
  • the beads were washed three times with a buffer solution (0.1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0), and 15 The sample was resuspended in the solution to obtain a sample containing beads to which the target sample containing CDK was bound.
  • This sample contains all of CDK alone, cyclin-bound activated CDK, a complex of activated CDK and CDK inhibitor, and a complex of CDK and CDK inhibitor (hereinafter referred to as "CDK group Is captured and bound to the beads.
  • CDK group Is captured and bound to the beads.
  • the activity of such a CDK group was measured by the following method.
  • Histone HI manufactured by Upstate Biotechnology
  • a substrate corresponding to CDK1 and CDK2 10 ⁇ g, 5 mM adenosine 5, -0- (8-thiotriphosphate) (ATP-yS, Sigma
  • a buffer solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1% Triton X-100) was prepared, and this substrate solution was added to the above CDK sample solution to make 501, and 37 ° Incubate with shaking at C for 10 minutes.
  • the serine or threon residue of the substrate is phosphorylated by the activated CDK to obtain a monothiophosphorylated substrate.
  • the beads were precipitated by centrifugation at 100,000 rpm for 10 seconds, and a supernatant 301 in which monothiophosphoric acid was dissolved was collected.
  • incubating at room temperature for 90 minutes at room temperature in a 10 mM eodoacetylfluorescein solution 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), ImM EDTA
  • the thiophosphoric acid of the monothiophosphoric acid substrate was obtained.
  • the sulfur in was fluorescently labeled.
  • the reaction between iodoacetylfluorescein and thiophosphoric acid was stopped by adding 6-mercaptoethanol.
  • the calibration curve was prepared by measuring the CDK activity using different concentrations of only the active CDK of interest contained in K-562 chronic myeloid leukemia cells. Therefore, the measured CDK activity of 1 U refers to the amount of an enzyme showing an activity equivalent to the enzyme activity (the amount of an enzyme that changes a certain amount of substrate) when 1 ⁇ g of the total protein of K-562 cells is used.
  • suction was applied from the bottom surface of the gel, that is, the back surface of the membrane, at a negative pressure of about 200 mmHg for about 15 seconds to adsorb the sample to the membrane.
  • a solution of a heron anti-CDK1 antibody or a heron anti-CDK2 antibody (primary antibody) that specifically binds to a sample is injected into each well, and left at room temperature for about 30 minutes.
  • a vacuum was applied at a negative pressure of 500 mmHg for about 15 seconds, followed by washing with TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl).
  • the FITC-labeled streptavidin reagent was injected in an amount of 40 ⁇ l each, and allowed to stand at room temperature for about 30 minutes to label the secondary antibody with FITC. ⁇ Suction at bottom pressure 500mmHg for about 15 seconds Then, the plate was washed with TBS (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl).
  • the PVDF membrane was removed from the plate, washed with distilled water, and immersed in 20% methanol for 5 minutes. After drying at room temperature for about 15 minutes, the fluorescence intensity of the protein adsorbed on the membrane is analyzed and measured with an image analyzer (Bio-Rad), and the protein is labeled with FITC based on the calibration curve created in advance.
  • the protein (CDK1 or CDK2) was quantified (the amount corresponding to the number of CDKs was converted to the weight (mg) of the standard protein).
  • the amount of CDK measured in this way is the total amount of CDK group (CDK alone, complex of CDK and cyclin and Z or CDK inhibitor, complex of CDK and other compounds) present in the cells. is there.
  • the calibration curve was obtained by preparing solutions of pure recombinant CDK proteins at five concentrations in TBS containing 0.005% NP-40 and 50 ⁇ g / ml BSA in the same manner as described above. The wells that had been treated were injected with 50 1 each, labeled with FITC in the same manner as above, measured for fluorescence intensity, and a relationship between fluorescence intensity and amount was prepared to create a standard curve.
  • the CDK specific activity (mUZng or UZng) was calculated from the measured values of the CDK activity and CDK expression amount measured as described above according to the following formula.
  • CDK specific activity CDK activity value, CDK expression level
  • the target cells were dispersed by trypsin ZEDTA treatment, washed twice with PBS, and centrifuged at 10 OX g at 4 ° C. for 5 minutes to collect cells (2 10 5 to 1 10 6 cells). While stirring the collected cells with a vortex mixer, lml of 70% ethanol pre-cooled to 20 ° C is gradually added to fix the cells, and allowed to react at 4 ° C or -20 ° C for 2 hours or more.
  • lml of 70% ethanol pre-cooled to 20 ° C is gradually added to fix the cells, and allowed to react at 4 ° C or -20 ° C for 2 hours or more.
  • PI Providiziodide
  • FIG. 2 shows the measurement results.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity corresponding to the number of cells
  • the horizontal axis represents the DNA content.
  • the relationship between the DNA content of animal cells and the number of cells is generally linked to the cell cycle, as shown in FIG.
  • ModFit manufactured by Verity Software House
  • the abundance ratio of cells in the S phase and the G1 phase was examined, and the results are shown in FIG. 2 and 4, KATOIII, K562, and Colo205 cells showed a high S-phase abundance, and ⁇ , Colo205, and HeLa cells showed aneuploidy (particularly aneuploi dy).
  • a thin black bar indicates CDK2 specific activity
  • a thick white bar indicates CDK1 specific activity
  • a left vertical axis indicates CDK1 specific activity
  • a right vertical axis indicates CDK2 specific activity.
  • the CDK1 specific activity Focusing on the magnitude of the CDK1 specific activity value, the CDK1 specific activity is relatively low, and the group ( ⁇ , K—562, Colo205, HeLa, MCF-7 Itoda vesicle) and it relatively high ⁇ group (SW480, SKBr3, T47D).
  • the magnitude of the CDK2 specific activity and the ability to measure the DNA content correspond to the large proportion of cells in the S phase at which the ability to measure the DNA content is also obtained.
  • the magnitude of CDK2 specific activity alone cannot correspond to the S phase abundance, but first, after grouping based on CDK1 specific activity, the magnitude of CDK2 specific activity was large. Can be associated with cellular malignancy.
  • Example 2 Relationship between the judgment of a pathologist and the CDK specific activity profile of a biopsy sample
  • Results of biopsy samples from 77 actual breast cancer patients (No. 1 to 77) determined by a pathologist (TNM classification, lymph node metastasis status, cancer tissue size, presence or absence of recurrence for 5 years after surgery, Table 3 and Table 4 show the recurrence locations). All 77 have early stage breast cancer (Stagel or ⁇ ).
  • a measurement sample was prepared according to the above method from a biopsy sample collected from 126 breast cancer patients, and CDK1 specific activity and CDK2 specific activity were measured.
  • the CDK2 specific activity / CDK1 specific activity of the measured cancer population was also sorted in order of decreasing power, and the value that allowed the population to be divided into 63:63 was defined as the ratio threshold.
  • the threshold value is 46, and the CDK2 specific activity value is determined as ZCDK1 specific activity value is smaller than the threshold value (46), the risk of recurrence is low (low risk), and the CDK2 specific activity ZCDK1 specific activity value ) In the above cases, the risk of recurrence is determined to be high (high risk).
  • the scale of the CDK2 specific activity was set to be approximately 46 times the CDK specific activity.
  • a graph showing the results of the CDK specific activity profile was created.
  • Fig. 6 shows the results of the CDK profiles of patients No. 1 to 42 judged to be in the low-risk group
  • Fig. 7 shows the results of CDK profiles of patients No. 43 to 77 judged to be in the high-risk group
  • CDK1 Low specific activity High CDK2 specific activity indicates high cancer malignancy.
  • specific activity of CDK2 is low and the specific activity of CDK1 is high, the malignancy of the cancer is low.
  • CDK2 specific activity is as high (eg, No. 38 and No. 67)
  • cancer with relatively large CDKl specific activity is said to have low malignancy.
  • the characteristics and malignancy of the cancer can be known from the comparison result with a predetermined threshold value determined in advance.
  • a measurement sample was prepared according to the above-mentioned method using the breast cancer tissue collected before the anticancer drug treatment from 1000 breast cancer patients treated with the taxane-based anticancer drug, and the activity and expression level of each of CDK1 and CDK2 were measured to determine the specific activity. Calculated.
  • the tumors are classified into cases where the tumor has shrunk and cases where the tumor has not shrunk.
  • CDK2 specific activity / CDK1 specific activity ratio threshold was set. The specific activity ratio threshold was 16.
  • the tumor size is reduced or not reduced based on the CDK1 specific activity value or CDK2 specific activity value.
  • a threshold was set so that the groups could be classified.
  • the threshold values for the CDK1 specific activity value were 20, and the threshold values for the CDK2 specific activity value were 500 and 10,000.
  • CDK1 specific activity and CDK2 specific activity are compared with a threshold value. If the CDK1 specific activity is less than 20 (CDK1 specific activity value 20) and the CDK2 specific activity value is less than 00 (CDK2 specific activity value 500) Is judged as insensitive, and the insensitive prediction group Classified as a loop. On the other hand, if the CDK2 specific activity value exceeds 10,000 (CDK1 specific activity value> 10000), it is determined to be susceptible and is classified into a susceptibility prediction group.
  • the CDK2 specific activity / CDK1 specific activity was compared with a threshold (16), and the value of the ratio was 16 or more.
  • the case of is judged as a susceptible group, and the case of less than 16 is judged as an insensitive group.
  • the specific activity of CDK2 was determined to be infinite for convenience. In other words, in this case, since the specific activity ratio threshold was 16 or more, the sensitivity was determined.
  • a measurement sample is prepared according to the above method using breast cancer tissues collected from breast cancer patients A to I, and the activity and CDK expression level of each of CDK1 and CDK2 are measured to determine the specific activity. Calculated.
  • FIG. 8 shows a CDK specific activity profile showing the relationship between CDK1 specific activity and CDK2 specific activity (vertical axis) for patients A to I (horizontal axis).
  • the vertical axis scale of CDK2 specific activity was set to 16 times the vertical axis scale of CDK1 specific activity.
  • Docetaxel-insensitive predictive group patients A, B, C
  • Docetaxel Susceptibility Prediction Group Patients D, E, F, G, H, I
  • the anticancer drug docetaxel (manufactured by Aventice Co., Ltd.) was administered four times at an interval of 3 to 4 weeks at a dose of 60 mgZm 2 (body surface area). After the administration, the size of the tumor was reduced, and it was examined whether the size of the tumor was reduced.
  • a measurement sample is prepared according to the above method using breast cancer tissues collected from breast cancer patients J to P, and the activity and expression level of each of CDK1 and CDK2 are measured to calculate the specific activity. did.
  • FIG. 9 shows a CDK specific activity profile showing the relationship between CDK1 specific activity and CDK2 specific activity (vertical axis) for patients J to P (horizontal axis).
  • the vertical axis scale of CDK2 specific activity was set to 16 times the vertical axis scale of CDK1 specific activity.
  • the results of the classification of patients J to P into the group that is predicted and determined as paclitaxel susceptibility and the group that is predicted and determined as insensitive are as follows.
  • Paclitaxel Susceptibility Prediction Group Patients L, M, N, O, P
  • an anticancer drug paclitaxel (manufactured by Bristol Pharmaceutical Co., Ltd.) was gZm 2 (body surface area) was administered once a week, and this was continued for 12 weeks before examining the power of the reduction in tumor size. The determination of whether the tumor size was reduced or not was based on the same criteria as for docetaxel.
  • the determination result regarding the characteristics of cells, particularly the malignancy of cancer based on the determination method of the present invention has a high correlation with the determination result of a clinician in the medical field, it is possible to prevent cell proliferation control dysfunction such as cancer. It is applicable as a definitive diagnosis of the disease caused. In addition, it can be used for research on dysregulation of the proliferation function of various mammalian cells other than human diseases.
  • the method of the present invention for determining the sensitivity of animal cells to stimulants can be used as a method for examining the effects of cell proliferation on various drugs and drugs, such as anticancer agents, growth factors, and mutagenic substances. It can be used to determine the efficacy of a drug such as an anticancer drug depending on the type of cancer cells, or the efficacy of a drug such as an anticancer drug depending on the individual. This makes it possible to predict whether it is effective to select an anticancer drug treatment before actually administering the treatment to a patient, and thus the method for determining sensitivity according to the present invention can be used as a guide for selecting an appropriate treatment method. Can be used as a mark.

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Abstract

　２種のサイクリン依存性キナーゼの比活性の比などのＣＤＫプロファイルは、臨床における癌組織の悪性度や、抗癌剤などの刺激物質に対する感受性の有無との相関性が高い。従って、ＣＤＫプロファイルに基づいて、あるいは２種類のＣＤＫ比活性の比を所定の閾値と比較することにより、癌の悪性度や細胞の増殖能や抗癌剤等の刺激物質に対する感受性等の哺乳動物細胞の性質を判定することができる。本発明の感受性判定方法は、特に感受性（陽性）についての判定正答率が高く、抗癌剤治療の有効性判断に有用である。

Description

明 細 書
哺乳動物細胞の性質判定方法及びこれを用いた癌の診断方法 技術分野
[0001] 本発明は、サイクリン依存性キナーゼ (CDK)の比活性をはじめとする CDKの活性 値と発現量との比に基づいて、癌、腫瘍の悪性度、抗癌剤等の刺激物質に対する感 受性を判定する判定方法、及び当該判定方法を用いた癌の診断方法に関する。 背景技術
[0002] 現在、臨床で行われている癌診断としては、血清中の腫瘍マーカーを調べる血清 診断、生検 (バイオプシィ）による組織診、細胞診がある。
[0003] 腫瘍マーカーとは、個体の発生、成熟の過程で発現されなくなった遺伝子が腫瘍 細胞において発現したことによるタンパク、糖タンパク、脂質等の物質であり、血清診 断は、腫瘍マーカーを検出することにより腫瘍の病期、悪性度を判定している。しか しながら、現在用いられている腫瘍マーカーの多くは、癌特異性がそれ程高くない。 また、早期癌では発現量が微量であることから診断感度が低い。このような理由から 、腫瘍マーカーによる癌診断の信頼性は、医療現場ではそれ程、高くないのが現状 である。
[0004] 一方、組織診、細胞診は、病理医及びセルスクリーナーが、採取された生体組織切 片、細胞を染色後、顕微鏡観察し、その形態、染色の様子から、自らの経験に基づ いて判定する診断方法である。しかし、染色方法が医療機関により区々であり、また 最終的判定は観察者個々人が自らの経験に基づくことから、中分化型、ステージ 1と いった微妙な段階では、確定診断が難しぐ治療の選択を誤って、重篤な癌の進行 を招く例も珍しくない。
[0005] このような状況に鑑み、診断方法を画一化する方法として、 TNM分類が考案され、 世界的に流用されつつある。癌の TNM分類は、国際対癌連合 (UICC)が採用する 悪性腫瘍の進展度を表す方法で、「T」は原発腫瘍の大きさ、 Νはリンパ転移のレべ ル、 Μは遠隔転移を示している。そして、 Τについて、進展度を 1 (腫瘍が組織内に限 局している程度）〜 4 (組織外への腫瘍形成があらわれる程度）に分類し、 Νについて 、進展度を、 0 (局所リンパ節転移認められない）〜 3 (リンパ節転移を組織学的に認 められる）に分類し、 Mについて進展度を、 0 (遠隔転移なし)〜 1 (遠隔転移）に分類 している。 T、 Μ、 Νのいずれにおいても数値が大きい程、予後が低ぐ悪性度が高い 癌である。
[0006] このような ΤΜΝ分類は治療法の決定や予後判定に有用であるとして、一般に使用 されているが、 ΤΝΜ分類により早期癌であると判断された患者においても、乳癌の 場合、約 10〜20%の患者が 5年以内に遠隔転移による再発を起こし、死亡するのが 現状であり、臨床上の大きな問題点となっている。また、 ΤΜΝ分類に基づく判定は、 診断時での病態を把握することはできても、予後を正確に予測するまにでは至って いない。
[0007] 上記診断方法の他に、癌組織では、 3倍体、 4倍体と 、つた倍数体の細胞が多く存 在することに着目して、蛍光標示式細胞ソーター (FACS)を用いて DNA含量を測 定し、その測定結果力 癌の悪性度を診断する方法がある。し力しながら、採取した 組織を FACSにかけるためには、単細胞にばらばらにする必要がある力 生検試料 を単細胞の集団にすることは、一般に容易でなぐ熟練した技術を要する。このような 理由から、 FACSを用いた癌診断の医療現場での実用化は、現在のところ難しいと 考えられている。
[0008] 以上のような実情から、単細胞化と!/、う面倒な試料調製を要求しな 、方法で、且つ 臨床現場において、個々人の判断や医療機関の判定方法の差によるばらつきが少 なぐ確定診断に至ることができる診断方法の確立が望まれている。
[0009] 近年、診断医によるバラツキが少ない癌の画一的診断方法として、装置を用いた分 子診断が期待されている。
[0010] 分子診断としては、 DNAチップを用いて、遺伝子転写物の発現について、標準と の比較結果から、癌の悪性度を判定する方法がある。し力しながら、単なる転写物の 発現は、生体内で発現されるタンパク質発現との相関性がそれ程高くないことから、 臨床現場では、その有効性が疑問視されている。
[0011] 一方、生体で発現されるタンパク質に基づく分子診断の開発検討も進められている 例えば、特許文献 1に、試料の CDK1及び CDK4の発現量、さらには必要に応じ て p53の突然変異状態を指標とする診断方法が提案されている。また、特許文献 2 では、 CDK4、 CDK6、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（CDKインヒビター）の 過剰発現を指標とする癌及び前癌状態の診断方法が提案されている。
[0012] サイクリン依存性キナーゼ (CDK)の発現は、増殖因子によって増殖が誘導される 細胞にぉ 、て高 、ことが知られて 、るものの、一般には細胞内で一定量存在して ヽ て、リン酸ィ匕等の活性ィ匕をうけ、サイクリン分子と結合して CDKとサイクリンの複合体 となること〖こより、 CDKの種類に応じた細胞周期の特定段階で活性を示している。ま た、 CDKインヒビターが CDK及び Z又はサイクリン 'CDK複合体に結合して、 CDK 活性を阻害することも知られている。このように、実際の細胞周期の調節は複雑であ ることから、単なる CDK、サイクリン、 CDKインヒビターの発現量に基づく判定では、 細胞周期の調節状態の指標としては不十分である。
[0013] 特許文献 3では、サイクリンとの結合、阻害因子の影響を考慮し、 CDKの活性を癌 の悪性度の指標とする診断方法、及び放射性物質を用いずに CDK活性を測定する 方法が開示されている。しかしながら、当該方法で測定される活性に関するデータで は、現在、臨床現場で行われている癌診断の代用となる程の診断精度が得られてい ない。
[0014] また、抗癌剤治療の有効性の指標として、腫瘍細胞の抗癌剤感受性をインビトロで 知りた 、場合がある。インビト口での腫瘍細胞の抗癌剤等の薬剤感受性試験としては 、例えば、 MTTアツセィ法と DISC法が知られている。 MTTアツセィ法とは、 MTT( 3- (4, 5—ジメチルチアゾールー 2—ィル）ー 2, 5—ジフエ-ルテトラゾリゥムブロミド )が生細胞に取り込まれたときはミトコンドリア内に存在する還元酵素（コハク酸デヒド ロゲナーゼ）により開裂できる力 死細胞では MTTを開裂できないことを利用したも ので、 MTT及び測定対象となる薬剤添加のもとに、 3時間癌細胞を培養し、吸光度（ コハク酸デヒドロゲナーゼ活性)を測定して、生細胞数を定量ィ匕する方法である。この 方法では、実際の抗癌剤治療による再発の有無と照合した場合、正答率 (正確度） は 80%と報告されており、そのうちインビト口での判定が抗癌剤感受性（陽性予測)で 、実際の抗癌剤治療で再発しな力つたもの（陽性予測率)の正答は 68%であったと 報告されて ヽる (非特許文献 1)。
[0015] DISC法は、癌細胞を 4日間、抗癌剤に接触させた後、死細胞を fast greenで染 色し、生細胞をへマトキシリンェォジンで染色することにより識別し、癌細胞の生死を 判定する方法である。正答率 (正確度）は 82. 7%であり、陽性予測率の正答は 62.
5%であると報告されている（非特許文献 1)。
[0016] 上記 、ずれの方法も、陽性予測率につ!、ては 70%未満であり、抗癌剤治療に踏 み切る力否かの判断指標としては不十分である。
[0017] 特許文献 1 :特表 2002— 504683号
特許文献 2 :特表 2002— 519681号
特許文献 3：特開 2002— 335997号
非特許文献 l :Weisenthal, L. M. and Nygren. P (2002) Current status of cell culture drug resistance testing (CCDRT) ^ http： / / weisenthal. org/ oncol― t. htm
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、臨床にお ける癌組織の悪性度 (転移のしゃすさ、再発のしゃすさ、予後の悪さ）の判断を行な うものであり、さらには医療機関や個々人による診断のばらつきをなくし、正確かつ安 定に判定し得る判定方法及び当該方法を用いた癌の分子診断方法を提供すること にある。
[0019] さらに、抗癌剤をはじめとする刺激物質に対する哺乳動物細胞の感受性の判定に ついて、抗癌剤治療などの薬剤治療に踏み切るかの判断指標として利用できるよう に、従来の薬剤感受性試験よりも精度の高!、判定方法も提供する。
課題を解決するための手段
[0020] 本発明者らは、サイクリン依存性キナーゼの比活性に着目して、組織の病理判定と の関係を種々検討した結果、 2種類のサイクリン依存性キナーゼ (CDK)の比活性又 はその逆数を含む CDKプロファイルと、細胞の増殖能及び組織悪性度 (再発のしゃ すさ）との間に高度な相関性があることを見出し、本発明の性質の判定方法を完成さ せた。また、刺激物質に対する哺乳細胞の感受性についても、 2種類の CDKプロフ アイルと相関性があることを見出し、本発明の感受性の判定方法を完成させた。
[0021] 本発明の哺乳動物細胞の性質の判定方法は、哺乳動物細胞の第 1のサイクリン依 存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との比及び第 2のサイクリン依存性キナ ーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比を含む CDKプロファイルに基づ 、て、前 記哺乳動物細胞の性質を判定する方法である。
[0022] 前記 CDKプロファイルを標準細胞の CDKプロファイルと比較することにより、前記 性質を判定してもよい。
[0023] また、前記 CDKプロファイルに基づく判定方法の一態様として、哺乳動物細胞の 第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との比 (A1)と、第 2 のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比 (A2)との比を、該 比に対応する所定の閾値と比較することにより、前記哺乳動物細胞の性質を判定し てもよい。
[0024] 前記サイクリン依存性キナーゼは、 CDK1、 CDK2、 CDK4、 CDK6、サイクリン A 依存性キナーゼ、サイクリン B依存性キナーゼ、及びサイクリン D依存性キナーゼから なる群より選ばれることが好ましぐより好ましくは、前記第 1のサイクリン依存性キナー ゼが CDK1であり、第 2のサイクリン依存性キナーゼが CDK2である。
[0025] 前記性質は、前記哺乳動物細胞の増殖能であってもよ!、し、哺乳動物細胞の悪性 度であってもよい。
[0026] 前記悪性度には、転移のしゃすさ、再発のしゃすさ、予後の悪さが含まれる。また、 前記転移には、リンパ節転移及び遠隔転移が含まれる。
[0027] 本発明の癌の診断方法は、生体組織力も採取した細胞について、上記本発明の 判定方法に基づ ヽて、癌の悪性度を診断する方法である。
[0028] 本発明の刺激物質に対する哺乳動物細胞の感受性判定方法は、哺乳動物細胞の 第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との比及び第 2のサイ クリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比を含む CDKプロファイル に基づ!/、て、前記細胞の刺激物質に対する感受性を判定する方法である。
[0029] 本発明の感受性判定方法の一態様としては、第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との比 (A1)と、第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CD K)の活性値と発現量との比 (A2)との比を、該比に対応する所定の閾値と比較する ことにより、前記哺乳動物細胞の刺激物質に対する感受性を判定する方法がある。
[0030] さらに、第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との比 (A1) 及び Z又は第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比 (A 2)を、それぞれに対応する所定の閾値と比較することにより、前記哺乳動物細胞の 刺激物質に対する感受性を判定することが好ましい。
[0031] 前記サイクリン依存性キナーゼは、 CDK1、 CDK2、 CDK4、 CDK6、サイクリン A 依存性キナーゼ、サイクリン B依存性キナーゼ、及びサイクリン D依存性キナーゼから なる群より選ばれることが好まし ヽ。
[0032] 前記刺激物質は、増殖因子、抗癌剤、及び変異原性物質から選ばれることが好ま しい。
[0033] 尚、本明細書にいう CDKプロファイルとは、ある細胞が有する少なくとも 1種類の C DKの活性値と発現量との比（例えば比活性)及び Z又は複数の CDKの活性値、発 現量より計算される数値 (例えば、第 1CDKの活性値と発現量との比 (A1)と、第 2C DKの活性値と発現量との比 (A2)との比（例えば、 A1ZA2又は A2ZA1)など）を 含む情報のことである。
[0034] また、本明細書にいうサイクリン依存性キナーゼ (CDK)の比活性とは、所定量の酵 素あたりの酵素活性を 、 、、下記式で求められる値である。
CDK比活性 = CDK活性値, CDK発現量
式中、 CDK活性値とは、リン酸化された基質量に基づく単位で、実際の細胞含有試 料の測定値と標準品の活性値カゝら求められる値湘対活性値)である。また、 CDK発 現量とは、実際の細胞含有試料に存在して ヽる CDKの量 (分子個数単位)を ヽぅ。
[0035] さらに、本発明にいう転移しやすさとは、癌細胞が原発巣から遠隔組織に移動し、 転移巣を構築する確率の高さを ヽぅ。確率の高！ヽ癌細胞の生物学的特徴 (転移のし やすさ）は浸潤能、移動能で示されることが知られている。
[0036] 再発しやすさとは、ある分類 (例えばステージ分類）に従って分類された癌患者群 の再発の頻度をいう。例えば、ステージ IIIは、再発率 50%であり、ステージ II (再発率 20%)に比して再発しやすい。
[0037] 予後の悪さとは、ある分類 (例えばステージ分類）に従って分類された癌患者群の 5 年もしくは 10年以内の死亡の頻度をいう。例えば、ステージ IIIは、死亡率 50%であ り、ステージ II (死亡率 20%)に比較して死亡しやすぐ予後が悪いとされる。
発明の効果
[0038] 本発明の哺乳動物細胞の性質の判定方法は、比活性を指標とすることにより、測 定試料の調製方法による誤差、ノ ツキを回避できる。また、本発明において判定指 標として用いられる、 2種の CDKの比活性を参酌した CDK比活性プロファイル、特 に 2種の CDKの比活性の比は、細胞周期に存在する細胞存在割合、異数媒体性な どの癌をはじめとする性質と相関性が高いので、信頼性の高い分子診断が可能とな る。さらに、細胞周期に基づく指標を用いていることから、現在の細胞の生物学的性 格、性状だけでなぐ臨床的性格の判定 (代表的には悪性度)、抗癌剤等の薬剤、外 部刺激に対する感受性若しくは耐性の判定も可能である。特に感受性の判定にっ 、 ては、感受性（陽性)との判断について正答率が高いので、抗癌剤治療に踏み切ると V、つた判断指標として優れて!/、る。
図面の簡単な説明
[0039] [図 1]細胞周期を説明するための図である。
[図 2]各種培養細胞の DNA含量の測定結果を示す図である。
[図 3]DNA含量データの結果を説明するための図である。
[図 4]各種培養細胞の S期の存在比率を示すグラフである。
[図 5]各種培養細胞の CDK1比活性及び CDK2比活性の測定結果を示すグラフで ある。
[図 6]乳癌患者由来組織のうちローリスクと判定された検体の CDK比活性プロフアイ ルを示す図である。
[図 7]乳癌患者由来組織のうちハイリスクと判定された検体の CDK比活性プロフアイ ルを示す図である。
[図 8]乳癌患者 A〜Iの CDK1比活性及び CDK2比活性の測定結果を示すグラフで ある。乳癌患者 A〜Iは、抗癌剤ドセタキセルの投与治療を受け、投与後の腫瘍のサ ィズの変化が調べられた。
[図 9]乳癌患者 J〜Pの CDK1比活性及び CDK2比活性の測定結果を示すグラフで ある。乳癌患者 J〜Pは、抗癌剤パクリタキセルの投与治療を受け、投与後の腫瘍の サイズの変化が調べられた。
発明を実施するための最良の形態
[0040] 本発明の哺乳動物細胞の性質を判定する判定方法は、哺乳動物細胞の 2種以上 のサイクリン依存性キナーゼの発現量及び活性値を測定し、第 1のサイクリン依存性 キナーゼの活性値と発現量との比及び第 2のサイクリン依存性キナーゼの活性値と 発現量との比を含む CDKプロファイルに基づ 、て、該哺乳動物細胞の性質を判定 する方法である。腫瘍細胞を含む組織に本発明の判定方法を適用することにより、 腫瘍細胞の性質、癌の悪性度を診断することができる。
[0041] 本発明の判定方法が対象とする哺乳動物は特に限定しないが、本発明の判定方 法は、ヒト、特に臨床状態、より具体的には癌についての状態の判定が求められてい るヒトに有用である。
[0042] 本発明の方法が対象とする細胞は、哺乳動物の生体組織、すなわち繊維性結合 組織、軟骨組織、骨組織、血液、リンパ等の支持組織;上皮組織;筋組織;神経組織 を構成する細胞であればよいが、特に個体としての調和を破り、増殖の制御機構に 異常を来して!/、る組織の腫瘍細胞のように、病理的情報を得た!、細胞に好適である 。例えば、乳、肺、肝臓、胃、大腸、脾臓、皮膚、子宮、精巣、卵巣、甲状腺、副甲状 腺、リンパ系統、骨髄などの位置にできる腫瘍の細胞が好適な対象となる。
[0043] これらの細胞は、該当する生体組織力も直接採取した細胞であってもよ 、し、尿、 喀痰などの生体からの排出物力も分離して得られた細胞であってもよ 、し、継代培養 された培養細胞であってもよい。癌に関する情報を得たい場合には、腫瘍組織から 採取した細胞が好ましく用いられる。
[0044] 判定する哺乳動物細胞の性質には、測定対象となる細胞の増殖能、悪性度が含ま れる。細胞の増殖能とは、細胞の増殖活性レベルで、増殖の制御機構に異常を来し ている力否力 (癌化の有無）、さらには異数倍体性などに関する情報が該当する。細 胞の悪性度とは、具体的には、転移のしゃすさ、再発のしゃすさ、予後の悪さなどが 挙げられる。
[0045] ここで、再発とは、悪性腫瘍を摘出するために臓器を部分切除した後、残存臓器に 同じ悪性腫瘍が再現する場合、及び原発巣から腫瘍細胞が分離して遠隔組織 (遠 隔臓器)へ運ばれ、そこで自立的に増殖する場合 (転移再発)をいう。一般に 5年以 内に再発が認められる場合に「再発しやすい」という。また、ステージ分類ではステー ジ IIIは再発率 50%であり、ステージ II (再発率 20%)に比して再発しやすい。予後と は、疾病の経過及び終末を予知することで、 5年又は 10年後の死亡率が高い程予 後は悪ぐ例えばステージ IIIは死亡率 50%で、ステージ II (死亡率 20%)より予後が 悪い。
[0046] サイクリン依存性キナーゼとは、サイクリンと結合して活性ィ匕される酵素群の総称で 、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。また、 CDKインヒビター とは、サイクリン 'CDK複合体に結合し、その活性を阻害する因子群の総称である。
[0047] ここで、細胞が増殖を開始し、 DNA複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂な どの事象を経て、 2つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期 は、図 1に示すように、 G1期、 S期、 G2期、 M期の 4期に分けられる。 S期は DNAの 複製期であり、 M期は分裂期である。 G1期は有糸分裂の完了から DNA合成の開始 までの間で、 M期にはいるための準備点検期である。 G1期にある臨界点（動物細胞 では R点）をすぎると、細胞周期は始動し、通常途中でとまることなぐ一巡する。 G2 期は、 DNA合成の終了力も有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポ イントは、 G1期力も S期にはいる直前、 G2期力も有糸分裂への入り口である。特に G 1期チェックポイントは S期開始の引き金をひくため、重要である。 G1期のある点をす ぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなぐ S→G2→M→ G1と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、 G1期の DNA 含量をもった休止期（GO)があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導によ り細胞周期内の G1期よりやや長い時間の後に S期へ進行することができる。
[0048] 本発明の方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（CDK)は、 CDK1、 CDK2 、 CDK4、 CDK6、サイクリン A依存性キナーゼ、サイクリン B依存性キナーゼ、及び サイクリン D依存性キナーゼカもなる群より選ばれることが好ましい。サイクリン A依存 性キナーゼとは、サイクリン Aと結合して活性を示す CDKのことで、現在判明している ところでは、 CDK1及び CDK2の双方をいう。またサイクリン B依存性キナーゼとはサ イクリン Bと結合して活性を示す CDKのことで、現在判明しているところでは CDK1が 該当する。サイタリン D依存性キナーゼとはサイタリン Dと結合して活性を示す CDK のことで、現在判明しているところでは CDK4及び CDK6の双方が該当する。
[0049] これらの CDKは、現在判明しているところ、表 1に示すように、それぞれ対応するサ イクリンと結合したサイクリン · CDK複合体 (以下「活性型 CDK」と 、うことがある）とな つて、表 1に示すような細胞周期の特定時期を活性ィ匕している。例えば、 CDK1はサ イクリン A又は Bと、 CDK2はサイクリン A又は Eと、 CDK4及び CDK6はサイクリン D 1、 D2、又は D3と結合して活性型となる。一方、 CDK活性は表 1に示すような CDK インヒビターによって活性が阻害されることもある。例えば、 p21は CDK1, 2を阻害、 p27は CDK2, 4, 6を阻害、 pl6力 CDK4, 6を阻害する。
[0050] [表 1]
Figure imgf000012_0001
[0051] 上記 CDKのうち、 2種類以上の CDKの発現量と活性値を測定し、各 CDKにおけ るこれらの比（すなわち、下記式で表される CDK比活性またはその逆数)を求めて、 CDKプロファイルを得る。 CDKの比活性 = CDK活性値, CDK発現量
[0052] 従って、 CDKプロファイルとしては、具体的には、例えば、 CDK比活性を含むプロ ファイル（CDK比活性プロファイル）や CDK比活性の逆数を含むプロファイル（CDK 比活性の逆数プロファイル)などが挙げられる。
[0053] CDK活性値とは、特定のサイクリンと結合して、どれだけの基質 (例えば、活性型 C DK1、活性型 CDK2はヒストン Hl、活性型 CDK4及び活性型 CDK6は Rb (網膜芽 細胞腫タンパク、 Retinoblastoma protein) )をリン酸化する力と 、うキナーゼ活性 のレベル (単位を U (ユニット）で現す)を ヽ、従来より公知の酵素活性測定方法で 測定できる。具体的には、測定試料の細胞溶解液カゝら活性型 CDKを含む試料を調 製し、 32P標識した ΑΤΡ ( γ— [32P]— ATP)を用いて、基質タンパク質に32 Pを取り込 ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもと に定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開 2002 — 335997号に開示の方法が挙げられる。この方法は、測定試料の細胞可溶ィ匕液 力も、 目的の活性型 CDKを含む試料を調製し、アデノシン 5， -0- (3—チオトリホ スフエート） (ATP- γ S)と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオ ニン残基にモノチォリン酸基を導入し、導入されたモノチォリン酸基の硫黄原子に標 識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識さ れたチォリン酸基質の標識量 (標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量)を測定し、 標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
[0054] 活性測定に供する試料は、測定対象となる細胞の可溶ィ匕液から目的の CDKを特 異的に採取することにより調製する。この場合、 目的の CDKに特異的な抗 CDK抗体 を用いて調製してもよ 、し、特定のサイクリン依存性キナーゼ (例えばサイクリン Α依 存性キナーゼ、サイクリン B依存性キナーゼ、サイクリン E依存性キナーゼ)活性測定 の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型 CDK以外 の CDKが試料に含まれることになる。例えばサイクリン 'CDK複合体に CDKインヒビ ターが結合した複合体も含まれる。また、抗 CDK抗体を用いた場合には、 CDK単体 、 CDKとサイクリン及び Z又は CDKインヒビターの複合体、 CDKとその他の化合物 との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が 混在する状態下で、リン酸化された基質の単位 (U)として測定される。
[0055] CDK発現量とは、細胞可溶ィ匕液力も測定される目的の CDK量 (分子個数に対応 する単位)であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知 の方法で測定できる。例えば、 ELISA法、ウェスタンブロット法などを使用してもよい し、特開 2003— 130871号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク 質 (CDK)は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗 CDK1抗体を用い ること〖こより、細胞内に存在する CDK1のすベて（CDK単体、 CDKとサイクリン及び Z又は CDKインヒビターの複合体、 CDKとその他の化合物との複合体を含む）を捕 捉できる。
[0056] 従って、上記式により算出される比活性は、細胞に存在している CDKのうち、活性 を示す CDKの割合に相当し、判定対象である動物細胞の増殖状態に基づく CDK 活性レベルといえる。このようにして求められる CDK比活性は、測定試料調製方法 に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される測定試料 (細胞可 溶化液）は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質 の多寡による影響をうけやすいことから、このような影響を控除した比活性又はその 逆数を用いる意義は大きぐ従来の単なる活性値と比べて、臨床的性格との相関性 が高い。
[0057] 2種類以上の CDK比活性又はその逆数を含む CDKプロファイルを知ることにより、 いずれの CDK活性が優位になっているかを知ることができ、これにより細胞周期の V、ずれの時期にある細胞割合がどの程度である力、あるいは 、ずれの時期の細胞割 合が優勢かなどを知ることができる。
以下、 CDK比活性を含む CDK比活性プロファイルを中心に、本発明の方法を説 明する。
[0058] 比活性を測定する CDKの種類は、知りたい性質の種類に応じて適宜選択すれば よい。一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行われていること から、 S期、 G2期にある細胞割合が多いと考えられ、このような場合に癌化していると 考えられる。また、このような癌は、進行が早ぐ悪性であるといえる。さらに、異数媒 体性は、異常な M期を経過したか、又は M期を経ずに G1期へ進んで、 S期にはいつ たときに起ると考えられているため、 M期に存在する細胞割合が少ないことも悪性で あるといえる。従って、第 1のサイクリン依存性キナーゼとして CDK1、第 2のサイタリ ン依存性キナーゼとして CDK2を使用し、 CDK1比活性の大きさに従い群に分類し 、類似した CDK1比活性を持つ群の中では CDK2比活性値が S期の細胞比率を反 映する値となる。 S期にある細胞が多い場合、当該細胞が構成細胞となっている組織 が臨床的に悪性、すなわち転移しやすい予後の悪い悪性の癌であると判定すること ができる。
[0059] 尚、 CDKの種類、判明している作用から、 2種類以上の CDK比活性を含む CDK 比活性プロファイルにより細胞周期の特定時期の存在割合を推測し、細胞の悪性度 を判定してもよ ヽし、予め対応する正常組織細胞を標準細胞として測定した 2種類以 上の CDKの比活性プロファイルを求め、正常細胞との比較から悪性度を判定しても よい。
[0060] CDK比活性プロファイルとして、 2種類のサイクリン依存性キナーゼの比活性の比 を採用することが好ましい。この場合、 2種類のサイクリン依存性キナーゼの比活性の 比を、該比に対応する所定の閾値と比較することにより、細胞の性質を判定する。
[0061] 本発明の細胞の性質判定方法で用いられる閾値は、測定対象の細胞の種類、判 定項目により適宜決められる。閾値の設定は、対象となる項目に関する多数の細胞、 個体のデータベースと、当該細胞の CDK比活性のデータベースとから、該当項目に 対してボーダーとなる比活性の比の値を選択すればよい。例えば、癌の悪性度につ いて病理医の判定が既知の複数の患者力も採取された腫瘍細胞について、相関性 があるとされる 2種類の CDKの比活性の比をそれぞれ求め、求められた比を小さい 順に並べて集団を 2等分できる中央値を閾値とすることができる。
[0062] 本発明の判定方法は、細胞の増殖能、悪性度といった性質だけでなぐ細胞の刺 激物質に対する感受性についても適用できる。例えば、近年指摘されている、患者 の遺伝的体質による抗癌剤等の薬物の効き方の違 、が、細胞の刺激物質に対する 感受性の違いに起因する。つまり、細胞が本来もっている性質には、刺激物質に対し て感受性か非感受性であるかと!/、つた性質も含まれ、 2種類の CDKの比活性の比は 、刺激物質に対する感受性とも関連している。従って、本発明の哺乳動物細胞の感 受性判定方法は、第 1の CDKの発現量と活性値との比及び第 2の CDKの発現量と 活性値との比を含む CDKプロファイルに基づ 、て、前記細胞の刺激物質に対する 感受性を判定する方法である。前記 CDKプロファイルとしては、 CDK比活性を含む プロファイル（CDK比活性プロファイル）や CDK比活性の逆数を含むプロファイル（ CDK比活性の逆数プロファイル)などがある。 CDK比活性プロファイルを用いる態 様としては、例えば、第 1のサイクリン依存性キナーゼの比活性と第 2のサイクリン依 存性キナーゼの比活性との比を、所定の閾値と比較することにより、該細胞の刺激物 質に対する感受性を判定する方法がある。
[0063] 刺激物質としては、増殖因子、抗癌剤、及び変異原性物質からなる群より選ばれる 。刺激物質の種類に応じて、判定する内容、感受性の内容は異なる。例えば、抗癌 剤に対しては効き方の有無、変異原性物質や増殖因子に対しては応答性の有無な どを判定することになる。
[0064] 本発明の細胞の感受性判定方法で判定の基準となる閾値は、刺激物質の種類に より適宜設定される。閾値の設定は、予めストックされている細胞の判定指標となる C DKの比活性の値と、これらの細胞の刺激物質に対する感受性の有無に関するデー タとの相関性を調べ、感受性と非感受性の境界となる閾値が選ばれる。閾値の設定 は、実際に刺激物質に曝された患者集団を、当該刺激物質に対する感受性群と非 感受性群とに分別し、別途測定された 2種類の CDKの比活性の比との関係に基づ いて行なってもよいし、種々の腫瘍細胞の培養細胞を、刺激物質で刺激し、その増 殖レベルや刺激物質に対する応答レベルを測定して、感受性群と非感受性群とに分 別し、別途測定された 2種類の CDK比活性の比との関係に基づ ヽて設定してもよ!/ヽ
[0065] 測定対象となる細胞の種類、あるいは刺激物質の種類によっては、判定のための 一方又は双方の CDK比活性の値自体が大変小さ!/、場合や、逆に一方又は双方の 比活性値が大変大きくて、比活性の比の値が閾値とはかけはなれた値となる場合が ある。また、該当刺激物質に対して非感受性と判断されるような細胞には、測定項目 となる CDKの比活性値自体が大変小さい場合がある。このような場合、比活性値の 比で判断するだけでなぐ判定に用いる CDKの比活性値の大小も考慮して刺激物 質の感受性を判定することが好ましい。具体的には、比活性値自体についても、判 定指標となる閾値を設定し、当該閾値との比較結果を加味して判定する。
[0066] 刺激物質の感受性の判定にあたり、 CDK比活性値及び CDK比活性の比それぞ れを指標として閾値と比べる場合、これらの比較の順番については特に限定しない 力 刺激物質の種類、細胞の種類に応じて、適宜取り扱いを決めることが好ましい。 例えば、まず比活性値を閾値と比較して明らかに感受性又は非感受性と判断できる ものについて判定した後、残りの細胞について、比活性の比について該当する閾値 と比較して判定してもよい。あるいは、測定対象となる細胞が、一方若しくは双方の比 活性値の大変小さ!、細胞又は一方若しくは双方の比活性値の大変大き!、細胞であ る場合、まず CDKの比活性の比について該当する閾値と比較して感受性か非感受 性かを判定した後、一方若しくは双方の比活性値が大変大きい細胞又は一方若しく は双方の比活性値が大変小さ 、細胞にっ 、てのみ、比活性値自体を該当する閾値 と比較して感受性か非感受性かを判定しなおすことによって、比活性の比とこれに該 当する閾値との比較に基づ 、た判定結果を修正してもよ 、。
[0067] 尚、比活性値は、活性及び発現量の測定方法、測定に使用する抗体の種類等に よって異なる。従って、本発明の判定方法で閾値との比較に基づいて判定する方法 については、閾値を設定するときのデータベース作製時の比活性の測定方法と、判 定対象となる細胞の比活性の測定方法とは一致させておく必要がある。
実施例
[0068] はじめに下記実施例で用いた測定試料の調製方法及び CDK比活性、 CDK発現 量の測定方法について説明する。
〔測定用試料の調製〕
測定しょうとする生体試料として、外科的に採取した各組織（2mm3)又は表 2に示 す腫瘍の培養細胞を用いた。
[0069] [表 2] 培養細胞 腫瘍の種類
KA T O I I I 胃癌
K 5 6 2 白血病
C o 1 o 2 0 5 大腸癌
H e L a 子宮頸癌
M C F - 7 乳癌
S W- 4 8 0 大腸癌
S K B r 乳癌
T 4 7 D 乳癌
[0070] 生体試料を、 0. lwZv%ノ-デット P— 40 (NP— 40) (カルビオケム社製）、 50m Mのトリス塩酸（pH7. 4)、 5mMの EDTA、 50mMのフツイ匕ナトリウム、 ImMのオル トバナジン酸ナトリウム及び 100 μ lZmlのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を 含む溶解緩衝液中で、氷浴中で 23G針をつけた 5mlのシリンジで 10回吸引排出を 繰り返し、細胞溶解液を調製した。培養細胞については、 1 X 107細胞 /5mlとなるよ うに調製した。
不溶物を 15000rpmで 5分間、 4°Cで遠心除去し、上清 (細胞可溶ィ匕液)を、測定 用試料とした。
[0071] 〔CDK活性の測定〕
上記で調製した試料から、 1. 5ml容量のエツペンドルフチューブに、 500 1の溶 解緩衝液中に溶解物の全タンパク質量が 100 μ gとなる量をカ卩えてサンプルを調製 した
活性測定しょうとする CDKに特異的抗体 (サンタクルズバイオテクノロジー社のポリ クローナル抗 CDK1抗体又はポリクローナル抗 CDK2抗体） 2 μ g及び 20 μ 1のプロ ティン Αをコートしたセファロースビーズ (バイオラッド社製)を、上記サンプルに加え て 4°Cで 1時間反応させた後、ビーズを緩衝液（0. 1%NP— 40、 50mMのトリス塩酸 、pH7. 0)で 3回洗浄し、 15 1のキナーゼ緩衝液中に再懸濁させて、 目的の CDK 含有試料が結合したビーズを含む試料を得た。
[0072] この試料は、 CDK単体、サイクリン結合した活性型 CDK、活性型 CDKと CDKイン ヒビターの複合体、 CDKと CDKインヒビターの複合体の全て（以下、これらを区別し ないときは「CDK群」という）が捕捉され、ビーズに結合している。このような CDK群の 活性を、下記方法により測定した。
[0073] CDK1及び CDK2に対応する基質であるヒストン HI (アップステイトバイオテクノロ ジー製） 10 μ g、 5mMのアデノシン 5， -0- (8—チォ 3リン酸）（ATP— y S、シグ マ社製）、及び緩衝液（20mMトリス塩酸（pH7. 4)、 0. l%TritonX- 100)を含む 基質溶液を調製し、この基質溶液を上記 CDK試料液に加えて 50 1とし、 37°Cで 1 0分間振とうしてインキュベートした。下記式に示すように、基質のセリン又はスレオ- ン残基が、活性型 CDKによりリン酸ィ匕され、モノチォリン酸化基質が得られる。
[0074] [化 1]
Figure imgf000019_0001
[0075] 反応後、 lOOOrpmで 10秒間遠心して、ビーズを沈殿させ、モノチォリン酸を溶解し た上澄み液 30 1を採取した。この上澄み液 18 1に、 150mMトリス塩酸、 pH9. 2、 5mMの EDTAを含む結合緩衝液 15 1をカ卩えた。さら〖こ、 10mMのョードアセチル フルォロセイン溶液（lOOmMトリス塩酸（pH7. 5)、 ImM EDTA)中で喑所におい て 90分間室温にてインキュベートすることにより、モノチォリン酸ィ匕基質のチォリン酸 中の硫黄を蛍光標識した。ョードアセチルフルォロセインとチォリン酸との反応の停 止は、 6—メルカプトエタノールの添カ卩により行った。
[0076] 蛍光標識されたチォリン酸ィ匕基質 0. 4 μ gを、スロットブロッターを用いて PVDF膜 上に添加し、吸引した。得られた膜を 1%のゥシ血清アルブミン (BSA)で 30分間プロ ックし、アビジン— FITC (ベクター製)を 37°Cで 1時間反応させた。その後、膜を 50 mM TBS (25mMトリス塩酸（pH7. 4)、 150mMの NaCl)で 10分間 3回洗浄した 。洗浄後、膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー (バイオラッド社製）により分析 した。活性は、検量線に基づいて算出した。
[0077] 尚、検量線は、 K— 562慢性骨髄性白血病細胞に含まれる目的の活性型 CDKの みを含む濃度の異なる溶液を用いて、 CDK活性を測定することにより作成した。 従って、測定される CDK活性 1Uは、 K— 562細胞の総タンパク質 1 μ gのときの酵 素活性 (一定量の基質を変化させる酵素量)と同等の活性を示す酵素量をいう。
[0078] 〔CDK発現量の測定〕
TBS (25mMトリス塩酸（pH7. 4)、 150mMの NaCl)に浸漬して初期化した PVD Fメンブレン（ミリポア社製）をセットしたスロットブロッターの各ゥエル（2 X 2 X 3mm、 許容量 100 1)に、上記で調製した細胞可溶ィ匕液を 50 1ずつ注入した。各ゥエル には、タンパク質が総量で 5〜 15 μ gずつ含まれている。
[0079] 注入後、ゥヱルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約 200mmHgで約 15 秒間吸引し、膜に試料を吸着させた。
[0080] 次 、で、試料に特異的に結合するゥサギ抗 CDK1抗体又はゥサギ抗 CDK2抗体（ 一次抗体)の溶液を、各ゥエルに注入し、室温で約 30分間静置した後、ゥエル底面 力も負圧 500mmHgで約 15秒間吸引して、次いで、 TBS (25mMトリス塩酸（pH7. 4)、 150mMの NaCl)で洗浄した。
[0081] 次に、ピオチンィ匕した抗ゥサギ抗体（二次抗体)の溶液を各ゥエルに注入し、室温で 約 30分間静置した後、ゥエル底面力ゝら負圧 500mmHgで約 15秒間吸引して、その 後、 TBS (25mMトリス塩酸（pH7. 4)、 150mMの NaCl)で洗浄した。
[0082] FITC標識ストレプトアビジン試薬を 40 μ 1ずつ注入し、約 30分間室温で静置して、 二次抗体を FITCで標識した。ゥエル底面力ゝら負圧 500mmHgで約 15秒間吸引して 、その後、 TBS (25mMトリス塩酸（pH7. 4)、 150mMの NaCl)で洗浄した。
[0083] PVDFメンブレンをプレートからとりはずし、蒸留水で洗浄し、 20%メタノールに 5分 間浸漬した。その後、約 15分間室温で乾燥させた後、膜に吸着されたタンパク質の 蛍光強度を、イメージアナライザ (バイオラッド社）によって分析、測定し、予め作成し た検量線をもとに、 FITC標識されたタンパク質 (CDK1又は CDK2)を定量 (CDK 個数に対応する量を標準タンパク質の重量 (mg)で換算)した。このようにして測定さ れる CDK量は、細胞中に存在している CDK群（CDK単体、 CDKとサイクリン及び Z又は CDKインヒビターの複合体、 CDKとその他の化合物との複合体など）の総量 である。
[0084] 尚、検量線は、 0. 005%の NP— 40及び 50 μ g/mlの BSAを含む TBS中に、 5 種類の濃度の純品の組換え CDKタンパク質の溶液を、上記と同様に処理したゥエル に 50 1ずつ注入し、上記と同様の方法で FITC標識し、蛍光強度を測定して、蛍光 強度と量の関係を表すことにより標準曲線を作成した。
[0085] 〔CDK比活性の算出〕
上記で測定した CDK活性及び CDK発現量の測定値から、下記式により、 CDK比 活性 (mUZng又は UZng)を算出した。
CDK比活性 = CDK活性値, CDK発現量
[0086] 〔実施例 1：各種癌細胞の性質〕
各種癌細胞の病理的性格を知るために、表 2に示した培養細胞について、 DNA含 量及び CDK比活性を調べた。
[0087] (l) DNA含量
目的とする細胞をトリプシン ZEDTA処理によって分散後、 PBSで 2回洗浄し、 10 O X g、 4°C、 5分間遠心にょって細胞（2 105〜1 106細胞）を回収した。回収され た細胞をボルテックスミキサーで攪拌しながら、予め 20°Cに冷却した 70%エタノー ル lmlを徐々にカ卩えて細胞固定を行い、 4°C又は— 20°Cで、 2時間以上反応させた 。細胞を PBSで 2回洗浄した後、 20Kユニット Zmlの RNase〔シグマ社）、 50 gZ mlプロビジゥムィオダイド（PI)、 lmgZmlグルコース ZPBSをカ卩え、細胞を十分に 分散させ、室温で 1時間反応させて、 DNAを PIで蛍光染色した。染色後、 35mmナ ィロンメッシュ（FALCON)でゴミを取り除き、 FACScalibur (BD)で励起波長 488 Z536nm、 617nm蛍光を測定し、解析を行った。
[0088] 各測定結果を図 2に示す。図 2において、縦軸は蛍光強度で細胞数に相当し、横 軸は DNA含量である。
[0089] 動物細胞の DNA含量と細胞数の関係は、一般に図 3に示されるように細胞周期に 連動している。図 2の測定結果に基づいて、 ModFit (ベリティソフトウェアーハウス社 製)を用いて、 S期及び G1期の細胞の存在比率を調べ、その結果を図 4に示す。 図 2及び図 4から、 KATOIII, K562、 Colo205細胞については、 S期存在割合が 高ぐまた ΚΑΤΟΠΙ、 Colo205、 HeLa細胞については異数倍体性（特に aneuploi dy)が見られた。
[0090] (2) CDK比活性
表 2に示す培養細胞につ 、て、上記測定用試料の調製方法に基づ!/、て調製した 測定試料について、上記測定方法に従って、 CDK1及び CDK2の活性、発現量を 測定し、それぞれの比活性を求めた。結果を図 5に示す。
[0091] 図 5中、細い黒棒は CDK2比活性であり、太い白棒は CDK1比活性を示し、左縦 軸は CDK1比活性、右縦軸は CDK2比活性を示して 、る。
[0092] CDK1比活性値の大きさに着目すると、 CDK1比活性が比較的低 、群 (ΚΑΤΟΠΙ 、 K— 562、 Colo205、 HeLa, MCF— 7糸田胞）と it較的高 ヽ群（SW480、 SKBr3、 T47D)に大別される。そして、それぞれの群において、 CDK2比活性の大きさ力 D NA含量の測定力も得られる S期にある細胞割合の多さと対応していることがわかる。 つまり、単に CDK2比活性値の大きさだけでは S期の存在割合と対応させることがで きな 、が、まず CDK1比活性値に基づく群分けを行った後であれば CDK2比活性 値の大きさを細胞悪性と関連づけることができる。
[0093] 〔実施例 2：生検試料にっ 、ての病理医の判定と CDK比活性プロファイルとの関係 ]
実際の癌組織力も採取した生検試料について、手術後 5年間の遠隔転移による再 発と、上記方法で測定した CDK1比活性及び CDK2比活性に基づく CDK比活性プ 口ファイルとの関係を調べた。 [0094] (1)病理医の判定
実際の乳癌患者 77人 (No. 1〜77)の生検試料についての、病理医の判定結果（ TNM分類、リンパ節転移の状態、癌組織の大きさ、術後 5年間の再発の有無、再発 場所)を表 3及び表 4に示す。 77人は、いずれも早期乳癌（Stagel又は ΠΑ)である。
[0095] 表 3中、「LN」は、手術時のリンパ節転移の状態を示し、「a」は所属リンパ節に転移 が認められな力つたもの、「b」は所属リンパ節のうち 1〜3個に転移が認められたもの 、「c」は所属リンパ節のうち 4個以上に転移が認められな力つたものに分類される。「 TJは手術時の原発巣のサイズを示し、腫瘍径 2cm以下を「a」、腫瘍径 2cm〜5cm を「b」、腫瘍径 5cm以上を「c」で示す。
[0096] (2)閾値の設定
乳癌患者 126名力 採取した生検試料から、上記方法に従って測定用試料を調製 し、 CDK1比活性、 CDK2比活性を測定した。測定した癌集団（癌患者 126名分)の CDK2比活性/ CDK1比活性を低い方力も順に並べ、集団を 63対 63に分けること ができる値を、比の閾値とした。閾値は 46であり、 CDK2比活性値 ZCDK1比活性 値を比が閾値 (46)より小さ 、場合を再発リスクが低 、（ローリスク）と判定し、 CDK2 比活性 ZCDK1比活性を比が閾値 (46)以上の場合を再発リスクが高い (ハイリスク） と判定する。
[0097] (3) CDK比活性プロフアイリングによる悪性度判定
患者 77名力 採取した生検試料から、上記方法に従って測定用試料を調製し、 C DK1比活性、 CDK2比活性を測定した。測定した癌集団（癌患者 77名分）について 、（2)で設定した閾値に従って、ノ、ィリスク集団とローリスク集団に分類した。比活性 プロファイルによる判定結果を、病理医の判定結果とともに表 3及び表 4に示す。
[0098] また、各患者 (横軸）に対する CDK1比活性及び CDK2比活性を縦軸とする CDK 比活性プロファイルのグラフ作成にあたり、 CDK2比活性のスケールを CDK比活性 のほぼ 46倍のスケールとして、 CDK比活性プロファイルの結果を示すグラフを作成 した。ローリスク群に判定された患者 No. 1〜42の CDKプロファイルの結果を図 6、 ハイリスク群に判定された患者 No. 43〜77の CDKプロファイルの結果を図 7に示す
[ε挲] [6600] .l78600/S00Zdf/X3d ZZ l^9ll/S00Z OAV 患者 No T NM L M T 再発 再発場所 悪性度判定
1 I a a なし Low Risk
2 I a a なし Low Risk
3 I a a なし Low Risk
4 I a a なし Low Risk
5 I a a なし Low Risk
6 I a a なし Low Risk
7 I a a なし Low Risk
8 I a a なし Low Risk
9 I a a なし Low Risk
1 0 I a a なし Low Risk
1 1 I a a なし Low Risk
1 2 I a a なし Low Risk
1 3 I a a なし Low Risk
1 4 Π A a b なし Low RISK
1 5 Π A a b なし Low Risk
1 6 Π Α a b なし Low Risk
1 7 Π A a b なし Low RISK
1 8 Π A a b なし Low RISK
1 9 Π A a b なし Low EIS
2 0 Π A a b なし Low RISK
2 1 Π A a b なし Low RISK
2 2 Π A a b なし Low Risk
2 3 Π A a b ' なし Low RISK
2 4 Π A a b なし Low Risk
2 5 Π A a b なし Low Risk
2 6 Π A a b なし Low Risk
2 7 Π A a b なし Low Risk
2 8 Π A a b なし Low Risk
2 9 Π A a b なし Low Risk
3 0 Π A a b なし Low Risk
3 1 Π A a b なし Low Risk
3 2 Π A a b なし Low Risk
3 3 Π A a b なし Low Risk
3 4 Π A a b なし Low Risk
3 5 Π A a b なし Low Risk
3 6 Π A a b なし Low Risk
3 7 Π A a b なし Low Risk
3 8 Π A a b なし Low Risk
3 9 Π A a b なし Low Risk
4 0 Π A a b なし Low Risk ] 患者 No T NM L N T 再発 再発場所 悪性度判定
4 1 Π A b a なし Low Risk
4 2 Π A b a なし Low Risk
4 3 I a a なし High Risk
4 4 I a a なし High Risk
4 5 I a a なし High Risk
4 6 Π A a b なし High Risk
4 7 Π A a b なし High Risk
4 8 Π A a b なし High Risk
4 9 Π A a b なし High Risk
5 0 Π A a b なし High Risk
5 1 Π A a b なし High Risk
5 2 Π A a b なし High Risk
5 3 Π A a b なし High Risk
5 4 Π A a b なし High Risk
5 5 Π A b なし High Risk
5 6 Π A a b なし High Risk
5 7 Π A b a なし High Risk
5 8 Π A a b なし High Risk
5 9 Π A b a なし High Risk
6 0 Π A b a なし High Risk
6 1 Π A b a なし High Risk
6 2 Π A b a なし High Risk
6 3 Π A b a なし High Risk
6 4 Π A b a なし High Risk
6 5 Π A b a なし High Risk
6 6 I a a あり 皮膚 High Risk
6 7 I a a あり 肺 High Risk
6 8 Π A a b あり 皮膚 High Risk
6 9 Π A a b あり リンパ節 High Risk
7 0 Π A a b あり 肝 ·骨 High Risk
7 1 Π A a b あり 胸壁 High Risk
7 2 Π A a b あり 肺 High Risk
7 3 Π A a b あり 骨 High Risk
7 4 Π A a b あり 皮膚 High Risk
7 5 Π A & b あり 骨 High Risk
7 6 Π A a b あり リンパ節 High Risk
7 7 Π A a b あり 肺 High Risk [0101] 表 4、図 6、図 7で示すように、悪性度が悪くないといわれる早期乳ガン患者 77例中 35例（No. 43〜77)が CDK比活性プロフアイリングにおいてハイリスクと判定され、 そのうちの 12例 (No. 66〜77)が術後 5年間で再発を起こした。一方、 CDK比活性 プロフアイリングにおいてローリスクと判定された 42例中の再発は 0例であった。この ように、 CDK1比活性値と CDK2比活性値を比較するだけでなぐ両者の比 (本実施 例では CDK2比活性 ZCDK1比活性)を考慮して、乳癌患者由来組織をプロフアイ リングした場合、 CDK1比活性が低ぐ CDK2比活性が大きいときには、癌の悪性度 が高いことがわかる。逆に、 CDK2比活性が低ぐ CDK1比活性が大きいときには、 癌の悪性度が低いことがわかる。換言すると、 CDK2比活性が同程度に高くても（例 えば No. 38と No. 67)、 CDKl比活性が相対的に大きい癌は、悪性度が低いとい える。
また、より具体的には予め定めた所定の閾値と比較し、その比較結果から、癌の性 質、悪性度を知ることができる。
[0102] 〔実施例 3：抗癌剤ドセタキセルに対する感受性〕
(1)閾値の設定及び判定基準
タキサン系抗癌剤治療した乳癌患者 1000検体の、抗癌剤治療前に採取した乳癌 組織を用いて、上記方法に従って測定試料を調製し、 CDK1及び CDK2それぞれ について、活性及び発現量を測定して、比活性を算出した。一方、これらの乳癌患 者にタキサン系抗癌剤投与を行なった結果、腫瘍が縮小した場合と腫瘍が縮小しな カゝつた場合に分類し、腫瘍サイズの縮小群と非縮小群を分類できるように CDK2比 活性/ CDK1比活性 (比の閾値)を設定した。比活性の比の閾値は 16となった。
[0103] また、 CDK1比活性値又は CDK2比活性値が極端に大きい場合又は極端に小さ V、場合に、 CDK1比活性値又は CDK2比活性値に基づ 、て腫瘍サイズの縮小群と 非縮小群を分類できるように、閾値を設定した。 CDK1比活性値の閾値は 20となり、 CDK2比活性値の閾値は 500及び 10000となった。
[0104] 判定は、次のように行なった。まず CDK1比活性及び CDK2比活性の値を閾値と 比較し、 CDK1比活性値が 20未満 (CDK1比活性値く 20)で且つ CDK2比活性値 力 00未満 (CDK2比活性値く 500)の場合を非感受性と判定し、非感受性予測グ ループに分類される。一方、 CDK2比活性値が 10000超（CDK1比活性値〉 1000 0)の場合には感受性と判定し、感受性予測グループに分類される。
次 、で、上記判定で非感受性群にも感受性群にも分類されな力つたものにっ 、て 、 CDK2比活性/ CDK1比活性を閾値（16)と比較し、前記比の値が 16以上の場 合を感受性群、 16未満の場合を非感受性群と判定する。
[0105] 尚、本実施例では、 CDK1比活性値が 0 (CDK1比活性値 =0)となり、且つ CDK 2比活性値が 500以上 10000以下（500≤CDK2比活性値≤ 10000)であった場 合、 CDK2比活性 ZCDK1比活性を便宜上無限大として判定した。つまり、この場 合、比活性の比の閾値 16以上であるため、感受性として判定した。
[0106] (2) CDK比活性プロファイルと感受性予測
抗癌剤治療を行なって ヽな 、乳癌患者 A〜Iから採取した乳癌組織を用いて、上記 方法に従って測定試料を調製し、 CDK1及び CDK2それぞれについて、活性及び CDK発現量を測定して、比活性を算出した。
9名の乳癌患者 (A〜I)の CDK1、 CDK2比活性の値、及び CDK2比活性 ZCD Kl比活性の比に基づいて、（1)で設定した閾値と比較し、感受性群及び非感受性 群に分類した。また、患者 A〜I (横軸）に対して、 CDK1比活性及び CDK2比活性（ 縦軸）の関係を示す CDK比活性プロファイルを図8に示す。ここで、 CDK2比活性の 縦軸スケールは、 CDK1比活性の縦軸スケールの 16倍に設定した。
[0107] 上記閾値に従って、患者 A〜Iのドセタキセル感受性と予測判定されるグループと 非感受性と予測判定されるグループに分類した結果は下記のようになる。
ドセタキセル非感受性予測グループ:患者 A, B, C
ドセタキセル感受性予測グループ： 患者 D, E, F, G, H, I
[0108] (3)抗癌剤ドセタキセルの治療効果
上記乳癌患者 A〜Iについて、抗癌剤ドセタキセル (アベンテイス社製)を、 1回あた り 60mgZm2 (体表面積)として、 3〜4週間間隔で 4回投与した。投与後、腫瘍のサ ィズが縮小して 、た力どうかを調べた。
[0109] 腫瘍が縮小したか否かの判断は、病理医の触診により、 Therasse P, Arbuck S G、 Eisenhauer EA, Wanaers J, Kaplan R¾, Rubinstein L, Verweij J, V an Glabbeke M, van Oosterom AT, Christian MC, and Gwyther SG ： New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tu mors. J. Natl. Cancer Inst 2000 ; 92 : 205— 216に記載された判定基準に基 づいて、「Complete responsej及び「Partial responsejと判定された場合を腫 瘍縮小と判断し、「Stable DiseaseJ及び「Progressive DiseaseJと判定された場 合を腫瘍非縮小と判断した。
[0110] 腫瘍縮小と判断されな力つた患者: A, B, C, D
腫瘍が縮小したと判断された患者: E, F, G, H, I
9名中 8名の患者について、予測判定結果と一致し、特に実際の治療効果が認め られる場合（陽性予測率）については、 100%—致していた。
[0111] 〔実施例 4：抗癌剤パクリタキセルに対する感受性〕
(1)閾値の設定及び判定基準
実施例 3で設定した閾値及び判定基準を援用した。
[0112] (2) CDK比活性プロファイルと感受性予測
抗癌剤治療を行なって ヽな 、乳癌患者 J〜Pから採取した乳癌組織を用いて、上記 方法に従って測定試料を調製し、 CDK1及び CDK2それぞれについて、活性及び 発現量を測定して、比活性を算出した。
7名の乳癌患者 (！〜 P)の CDK1、 CDK2比活性の値、及び CDK2比活性値 ZC DK1比活性値の比に基づいて、（1)で設定した閾値と比較し、感受性群及び非感 受性群に分類した。また、患者 J〜P (横軸）に対して、 CDK1比活性及び CDK2比 活性 (縦軸）の関係を示す CDK比活性プロファイルを図 9に示す。ここで、 CDK2比 活性の縦軸スケールは、 CDK 1比活性の縦軸スケールの 16倍に設定した。
[0113] 上記閾値に従って、患者 J〜Pのパクリタキセル感受性と予測判定されるグループと 非感受性と予測判定されるグループに分類した結果は下記のようになる。
ノ タリタキセル非感受性予測グループ:患者 J, K
パクリタキセル感受性予測グループ：患者 L, M, N, O, P
[0114] (3)抗癌剤パクリタキセルの治療効果
上記乳癌患者 A〜Iについて、抗癌剤パクリタキセル (ブリストル製薬社製)を、 80m gZm2 (体表面積)で週 1回投与し、これを 12週間続けた後、腫瘍のサイズが縮小し ていた力どうかを調べた。腫瘍サイズが縮小した力否かの判断は、ドセタキセルの場 合と同様の基準に基づいて行なった。
[0115] 判断結果は、下記のようになった。
腫瘍縮小しな力つた患者: J
腫瘍が縮小した患者: K, L, M, N, O, P
8名中 7名の患者について、予測判定結果と実際に抗癌剤治療による判断結果が 一致し (正確度： 87. 5%)、本発明の方法で陽性と判定した患者については 100% 腫瘍縮小が認められた。
産業上の利用可能性
[0116] 本発明の判定方法に基づく細胞の性格、特に癌の悪性度に関する判定結果は、 医療現場における臨床医の判定結果との相関性が高いので、癌などの細胞増殖調 節機能障害に起因する病気の確定診断として適用可能である。また、ヒトの病気だけ でなぐ各種哺乳動物細胞の増殖機能調節障害に関する研究に利用できる。
[0117] さらに、本発明の刺激物質に対する動物細胞の感受性の判定方法は、抗癌剤、増 殖因子、変異原性物質といった各種薬剤、薬物に対する細胞増殖の影響の有無を 調べる方法として利用でき、特に癌細胞の種類による抗癌剤等の薬剤の効き方、個 体の差異による抗癌剤等の薬剤の効き方の判定に利用することができる。これにより 、抗癌剤治療を選択することが有効であるか否かを、実際に患者に投与する前に予 測することができるので、本発明の感受性の判定方法を、適格な治療方法の選択指 標として利用できる。

Claims

請求の範囲
[I] 哺乳動物細胞の第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との 比及び第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比を含む CDKプロファイルに基づ 、て、前記細胞の性質を判定する哺乳動物細胞の性質の 判定方法。
[2] 前記 CDKプロファイルと標準細胞の CDKプロファイルとを比較することにより、前記 性質を判定する請求項 1に記載の判定方法。
[3] 哺乳動物細胞の第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との 比 (A1)と、第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比 (A
2)との比を、該比に対応する所定の閾値と比較することにより、前記哺乳動物細胞の 性質を判定する哺乳動物細胞の性質の判定方法。
[4] 前記サイクリン依存性キナーゼは、 CDK1、 CDK2、 CDK4、 CDK6、サイクリン A依 存性キナーゼ、サイクリン B依存性キナーゼ、及びサイクリン D依存性キナーゼカ な る群より選ばれる請求項 1〜3のいずれかに記載の判定方法。
[5] 前記第 1のサイクリン依存性キナーゼは CDK1であり、第 2のサイクリン依存性キナー ゼは CDK2である請求項 4に記載の判定方法。
[6] 前記性質は、前記哺乳動物細胞の増殖能である請求項 1〜5のいずれかに記載の 判定方法。
[7] 前記性質は、前記哺乳動物細胞の悪性度である請求項 1〜6のいずれかに記載の 判定方法。
[8] 前記悪性度は、転移のしゃすさである請求項 7に記載の判定方法。
[9] 前記悪性度は、再発のしゃすさである請求項 7に記載の判定方法。
[10] 前記悪性度は、予後の悪さである請求項 7に記載の判定方法。
[II] 前記転移は、リンパ節転移及び遠隔転移である請求項 8に記載の判定方法。
[12] 生体組織力 採取した細胞について、請求項 1〜11のいずれかに記載の判定方法 に基づいて、癌の悪性度を診断する癌の診断方法。
[13] 哺乳動物細胞の第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との 比及び第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比を含む CDKプロファイルに基づ 、て、前記細胞の刺激物質に対する感受性を判定する哺 乳動物細胞の感受性判定方法。
[14] 哺乳動物細胞の第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との 比 (A1)と、第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比 (A 2)との比を、該比に対応する所定の閾値と比較することにより、前記細胞の刺激物質 に対する感受性を判定する哺乳動物細胞の感受性判定方法。
[15] さらに、第 1のサイクリン依存性キナーゼ (第 1CDK)の活性値と発現量との比 (A1) 及び Z又は第 2のサイクリン依存性キナーゼ (第 2CDK)の活性値と発現量との比 (A 2)を、それぞれに対応する所定の閾値と比較することにより、前記哺乳動物細胞の 刺激物質に対する感受性を判定する請求項 13又は 14に記載の感受性判定方法。
[16] 前記サイクリン依存性キナーゼは、 CDK1、 CDK2、 CDK4、 CDK6、サイクリン A依 存性キナーゼ、サイクリン B依存性キナーゼ、及びサイクリン D依存性キナーゼカ な る群より選ばれる請求項 13〜 15のいずれかに記載の判定方法。
[17] 前記刺激物質は、増殖因子、抗癌剤、及び変異原性物質から選ばれる請求項 13〜 16のいずれかに記載の判定方法。
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