JP4989127B2 - チロシンキナーゼの活性測定方法及びチロシンキナーゼの基質 - Google Patents
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Description
本発明の他の目的は、種々のチロシンキナーゼによりリン酸化されうる基質であって、スロットブロットの工程を含むチロシンキナーゼの測定方法に適応可能な基質を提供することである。
本発明はさらに、細胞に含まれるチロシンキナーゼを、チロシンキナーゼの基質及びリン酸基ドナーと混合する工程と、リン酸化された基質を、スロットブロットにより検出する工程と、を含むチロシンキナーゼの活性測定方法に使用するためのチロシンキナーゼの基質であって、グルタミン酸残基及びチロシン残基からなり、グルタミン酸残基とチロシン残基との比率が4:1であるアミノ酸配列からなるペプチドと、グルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を含む、チロシンキナーゼの基質を提供する。
本発明のチロシンキナーゼの基質は、Glu及びTyrからなり、GluとTyrとの比率が4:1であるアミノ酸配列からなるペプチドとグルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質である。ペプチドに上記したグルタチオン−S−トランスフェラーゼを融合させることにより、得られた融合タンパク質は、従来の市販の合成ペプチドでは適用できなかったスロットブロットを含むチロシンキナーゼの活性測定に適用することが可能となる。
4つのグルタミン酸残基と1つのチロシン残基からなる配列が5回繰り返されたアミノ酸配列(配列番号1)からなるペプチド(以下、poly(Glu、Tyr)ペプチドとする)とGSTタンパク質との融合タンパク質を作製し、この融合タンパク質を、複数種類のチロシンキナーゼによりリン酸化されうる基質として用いた。以下、この融合タンパク質をGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質とする。
ここでは、市販の受容体型チロシンキナーゼの細胞内ドメイン(intracellular domain;ICD)を用いて、実施例1で作製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質をリン酸化し、ウエスタンブロッティングによりリン酸化されたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。なお、受容体型チロシンキナーゼは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインから構成されており、細胞内ドメインにチロシンキナーゼの活性を示す部位が存在する。
緩衝液1(20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1% NP40、1mM DTT、0.2%プロテアーゼインヒビター(以下、PIとする)、10% グリセロール、200μM Na3VO4及び50mM NaFを含む)50μlと市販の受容体型チロシンキナーゼのICD 0.5pmolとを混合し、これを反応用試料として以下の酵素反応に用いた。本実施例では、ICDとして、PDGF Recepter β Kinase(以下、PDGFR-βとする)、VEGF Recepter 1 Kinase(以下、VEGFR1とする)、VEGF Recepter 2 Kinase(VEGFR2)、EGF Recepter 1 Kinase(以下、HER1とする)、ErbB2 Kinase(以下、HER2とする)、ErbB4 Kinase(以下、HER4とする)、IGF-1Receptor Kinase(IGF1R)(全てCell Signaling Technology社)を用いた。なお、緩衝液1とPDGFR-βとを混合したものを反応用試料iとし、緩衝液1とVEGFR1とを混合したものを反応用試料ii、緩衝液1とVEGFR2とを混合したものを反応用試料iii、緩衝液1とHER1とを混合したものを反応用試料iv、緩衝液1とHER2とを混合したものを反応用試料v、緩衝液1とHER3とを混合したものを反応用試料vi、緩衝液1とIGF1Rとを混合したものを反応用試料viiとする。
反応用試料i 25μlと、実施例1において調製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を含む基質溶液1(20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、1% NP40、0.2% PI、10% グリセロール、200μM Na3VO4、50mM NaF、40μM ATP、及び5μg GST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を含む)25μlとを混合し、25℃で60分間インキュベートした。この反応液に、SDSサンプルバッファー pH6.8(200mM Tris、40% グリセロール、8% SDS、及び10% 2−メルカプトエタノールを含む)25μlを加え、100℃で5分間ボイルして酵素反応を停止した。このようにして調製された溶液をSDS用試料i(+)とする。同様にして、反応用試料ii〜viiからSDS用試料ii(+)〜vii(+)を調製した。
SDS−PAGEにて、SDS用試料i(+)〜vii(+)及びSDS用試料i(−)〜vii(−)に含まれるタンパク質の分離を行った。各SDS用試料15μlをポリアクリルアミドゲル(PAGミニ「第一」4/20(13W)(第一化学薬品株式会社))の別々のウェルに注入し、泳動槽(カセット電気泳動槽「第一」DPE−1020(ミニ2連式)(第一化学薬品株式会社))を用いて25mAで70分間電気泳動した。電気泳動によって分離したタンパク質を、ミニトランスブロットセル(バイオラッド社)を用いて100Vで1時間電圧をかけ、ポリアクリルアミドゲルからポリビニリデンフロライド(PVDF)メンブレン(Immobilon−FL 0.45μm pore size(ミリポア社))に転写した。このPVDFメンブレンを、4%ブロックエース(大日本住友製薬株式会社)溶液で60分間ブロッキングした。ブロッキングしたPVDFメンブレンを、一次抗体溶液(0.4%ブロックエース及び0.5μg/ml Anti−Phosphotyrosine clone 4G10(upstate社)を含む)2ml中で60分間振蕩した後、TBS−T(25mM Tris、150mM NaCl及び0.1% Tween−20を含む)で3回洗浄した。次に、このPVDFメンブレンを、二次抗体溶液(0.4%ブロックエース及び2.7μg/ml抗マウスイムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体 FITC標識(DAKO社)を含む)2ml中で60分間振蕩した後、TBS−Tで3回洗浄した。このPVDFメンブレンを乾燥させ、画像解析装置(Pharos FX system(バイオラッド社))を用いて解析し、蛍光を検出した。
図1は、ウエスタンブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図中のiはチロシンキナーゼとしてPDGFR-βを、iiはVEGFR1を、iiiはVEGFR2を、ivはHER1を、vはHER2を、viはHER4を、viiはIGF1Rを用いた場合の結果を示す。また、i〜viiの各写真において、−はATPを含まない基質溶液2を用いて調製したSDS用試料から得られた結果である。+はATPを含む基質溶液1用いて調製したSDS用試料から得られた結果である。P-ICDは、自己リン酸化したチロシンキナーゼが出現する位置を示し、P-GST-poly(Glu、Tyr)はリン酸化したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質が出現する位置を示す。
ここでは、乳癌由来の培養細胞の細胞膜から抽出した受容体型チロシンキナーゼを用いて、実施例1で作製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質をリン酸化し、ウエスタンブロッティングによりリン酸化されたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。
乳癌由来の培養細胞(MDA−MB231)を、225cm2のフラスコにおいて80%コンフルエント(約107個)となるよう培養した。この培養細胞と緩衝液2(20mM HEPES pH7.4、0.2% PI、10% グリセロール、200μM Na3VO4、及び50mM NaFを含む)1mlとを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を破壊し、細胞溶液を調製した。得られた細胞溶液を遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物と、緩衝液3(20mM HEPES pH7.4、1% NP40、0.2% PI、10% グリセロール、200μM Na3VO4、及び50mM NaFを含む)とを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を可溶化し、遠心分離して上清を回収した。この上清を、反応用試料として以下の酵素反応に用いた。同様にして、乳癌由来の培養細胞であるMDA−MB468及びSKBr3から、それぞれ反応用試料を調製した。ここで、MDA−MB231から調製したものを反応用試料i、MDA−MB468から調製したものを反応用試料ii、SKBr3から調製したものを反応用試料iiiとする。なお、いずれも反応用試料も、含有されるタンパク質濃度が0.8mg/mlになるように調製された。
上記の方法で得た反応用試料i 25μlと、基質溶液3(20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl2、2mM DTT、1% NP40、0.2% PI、10% グリセロール、200μM Na3VO4、50mM NaF、100μM ATP、及び5μg GST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を含む)25μlとを混合し、25℃で30分間インキュベートした。この反応液に、実施例2で使用したSDSサンプルバッファー25μlを加え、100℃で5分間ボイルして酵素反応を停止した。このようにして調製された溶液をSDS用試料iとする。同様にして、反応用試料ii及び反応用試料iiiからSDS用試料ii及びSDS用試料iiiを調製した。
実施例2と同様にして、ウエスタンブロッティングにより、SDS用試料(i〜iii)に含まれるリン酸化されたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。
図2は、ウエスタンブロッティングの結果を示す蛍光写真である。図中のiはMDA−MB231の細胞膜から抽出した受容体型チロシンキナーゼを、iiはVEGFR1をMDA−MB468の細胞膜から抽出した受容体型チロシンキナーゼを、iiiはSKBr3の細胞膜から抽出した受容体型チロシンキナーゼを用いた場合の結果を示す。P-GST-poly(Glu、Tyr)はリン酸化したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質が出現する位置を示す。
ここでは、市販の受容体型チロシンキナーゼのICDを用いて、実施例1で作製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質をリン酸化し、ELISAによりリン酸化されたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。
まず、緩衝液4(20mM HEPES pH7.4、10mM MnCl2、1mM DTT、1% NP40、0.2% PI、10% グリセロール、200μM Na3VO4、50mM NaF、200μM ATP)50μlと市販の受容体型チロシンキナーゼのICD 0.125pmolとを混合して反応用試料を調製した。次に、調製した反応用試料を、上記緩衝液4を用いて2倍希釈、4倍希釈、8倍希釈、16倍希釈、32倍希釈及び64倍希釈した。このようにして調製した各反応用試料(1倍希釈〜64倍希釈)及びICDを含有しない反応用試料として緩衝液4を以下の酵素反応に用いた。また、本実施例では、ICDとして、実施例2で使用したHER1及びIGF1R(全てCell Signaling Technology社)を用いた。
ELISA用のプレートとして、グルタチオンコートプレート(Reacti-Bind Clear Glutathione Coated Plates, 8-well Strip(PIERCE社))を用いた。まず、プレートの各ウェルをTBS−T(25mM Tris、150mM NaCl及び0.05% Tween−20を含む)で3回洗浄した。次に、各ウェルに、実施例1において調製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を含む基質溶液3(10μg/mlのGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を含むTBS)50μlを入れ、軽く震蕩しながら25℃で1時間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルをTBS-Tで2回洗浄し、さらに20mM HEPES pH7.4(0.05% Tween20を含む)で1回洗浄した。このようにして、ELISA用プレートのウェルの表面にGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を結合させた。このELISA用プレートを以下の酵素反応に使用した。
各反応溶液 50μlをELISA用プレートの別々のウェルに入れ、25℃でおよそ30分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに反応停止液(1mM EDTAを含むTBS-T)100μlを添加し、さらにTBS-Tで3回洗浄した。次に、各ウェルをStartingBlock T20 (TBS) Blocking Buffer(PIERCE社)300μlで洗浄した後、StartingBlock T20 (TBS) Blocking BufferでHRP標識一次抗体(p-Tyr (PY20), sc-508 HRP(SANTA Cruz Biotechnology社))を1000倍希釈した一次抗体液を各ウェルに100μl入れ、25℃でおよそ1時間30分間軽く震蕩しながらインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルをTBS-Tで5回洗浄し、TMB溶液(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA (Sigma-Aldrich社))150μlを各ウェルに入れ、室温で遮光しながら5〜30分の間で適度に呈色させたのち、VersaMax(Molecular Device社)で吸光度(650nm)を測定した。
図3は、ELISAの結果を示すグラフである。図中の縦軸は吸光度(650nm)を、横軸は1ウェルあたりのチロシンキナーゼ量(pmol)を示す。
ここでは、乳癌由来の培養細胞の細胞膜から抽出した受容体型チロシンキナーゼを用いて、実施例1で作製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質をリン酸化し、ELISAによりリン酸化されたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。
乳癌由来の培養細胞(MDA−MB468)を、225cm2のフラスコにおいて80%コンフルエント(約107個)となるよう培養した。この培養細胞と実施例3で使用した緩衝液2 1mlとを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を破壊し、細胞溶液を調製した。得られた細胞溶液を遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物と、実施例3で使用した緩衝液3とを混合し、ペッスルを用いて加圧することにより細胞膜を可溶化し、遠心分離して上清を回収した。この上清を緩衝液4で希釈し、タンパク質濃度が0.02mg/ml、0.04mg/ml及び0.08mg/mlとなる反応用試料それぞれ調製した。このようにして調製した各反応用試料及びタンパク質を含有しない反応用試料として緩衝液3を以下の酵素反応に用いた。
実施例4と同様の方法で、ELISA用プレートのウェルの表面にGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を結合させ、ELISA用プレートを以下の酵素反応に使用した。
実施例4と同様の方法で、各反応用試料中のチロシンキナーゼによってリン酸化されたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。
図4は、ELISAの結果を示すグラフである。図中の縦軸は吸光度(650nm)を、横軸は1ウェル(50μl)あたりのタンパク質量(μg)を示す。
ここでは、スロットブロットの手法に従って、実施例1で作製したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を膜へ吸着させ、膜に吸着したGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を検出した。
実施例1で得られたGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0μg/mlの濃度でTBS(25mM Tris pH7.4, 150mM NaCl)に溶かしたものを調製し、これらをスロットブロット用試料とした。さらに、比較のために、市販の合成ペプチド(STG200(CHEMICON社))を、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0μg/mlの濃度でTBS(25mM Tris pH7.4, 150mM NaCl)に溶かしたものを調製し、これらをスロットブロット用試料とした。ここで使用した市販の合成ペプチド(STG200)は、配列番号1のアミノ酸配列(Glu−Glu−Glu−Glu−Tyr)が複数回繰り返されたポリペプチドにビオチンを結合させた合成ペプチドである。
底面にPVDFメンブレン(Immobilon-PSQ 0.2μm pore size(ミリポア社))を有するスロットブロッター(BIO−DOT SF(バイオラッド社))の別々のウェルに上記スロットブロット用試料を100μlずつ収容した。PVDFメンブレンの裏側からスロットブロット用試料を、真空ポンプを用いて吸引し、各スロットブロット用試料に含まれるタンパク質をPVDFメンブレンに吸着させた。この後、PVDFメンブレンをスロットブロッターから取り外し、CBB染色液(ページブルー83染色液(CBB-R250)(第一化学薬品株式会社))でPVDFメンブレン中のタンパク質を染色した。
図5は、スロットブロットの膜の写真である。AはGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質を含有する試料をブロッティングした結果であり、Bは市販の合成ペプチド(STG200)を含有する試料をブロッティングした結果である。さらに、Aの各バンドは、ブロッティングした試料に含まれるGST-poly(Glu、Tyr)融合タンパク質の濃度が異なっており、上から10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0μg/mlである。同様に、Bの各バンドは、試料中の合成ペプチド(STG200)の濃度が異なっており、上から10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0μg/mlである。
Claims (6)
- 細胞に含まれるチロシンキナーゼを、前記チロシンキナーゼの基質及びリン酸基ドナーと混合する工程と、
リン酸化された前記基質を、スロットブロットにより検出する工程と、を含み、
前記基質は、グルタミン酸残基及びチロシン残基からなり、グルタミン酸残基とチロシン残基との比率が4:1であるアミノ酸配列からなるペプチドと、グルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を含む、チロシンキナーゼの活性測定方法。 - 前記アミノ酸配列が、4つのグルタミン酸残基と1つのチロシン残基とからなる配列が2回以上繰り返されたアミノ酸配列である請求項1に記載のチロシンキナーゼの活性測定方法。
- 前記チロシンキナーゼが、受容体型チロシンキナーゼである請求項1又は2に記載のチロシンキナーゼの活性測定方法。
- 前記受容体型チロシンキナーゼが、インシュリン様増殖因子受容体(insulin-like growth factor receptor;IGFR)、血小板由来増殖因子受容体(platelet-derived growth factor receptor;PDGFR)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体(human epithelial growth factor receptor;HER)及び血管内皮増殖因子受容体(vascular endothelial growth factor;VEGFR)から選択される少なくとも一つである請求項3に記載のチロシンキナーゼの活性測定方法。
- 前記ペプチドと前記グルタチオン−S−トランスフェラーゼとが、1以上のアミノ酸残基を介して融合されている請求項1〜4のいずれか1つに記載のチロシンキナーゼの活性測定方法。
- 細胞に含まれるチロシンキナーゼを、前記チロシンキナーゼの基質及びリン酸基ドナーと混合する工程と、リン酸化された前記基質を、スロットブロットにより検出する工程と、を含むチロシンキナーゼの活性測定方法に使用するためのチロシンキナーゼの基質であって、
グルタミン酸残基及びチロシン残基からなり、グルタミン酸残基とチロシン残基との比率が4:1であるアミノ酸配列からなるペプチドと、グルタチオン−S−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を含む、チロシンキナーゼの基質。
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