CN101981203A - 肿瘤细胞恶性程度的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种评价肿瘤细胞的恶性程度的方法,该方法是从含有肿瘤细胞的试样中制备含有受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞膜级分,在有及没有RTK活性抑制剂情况下测定此细胞膜的RTK的酶活性,通过比较所得结果来评价肿瘤细胞的恶性程度。
Description
技术领域:
本发明涉及一种肿瘤细胞恶性程度的评价方法。具体而言,本发明涉及的方法是从含有肿瘤细胞的试样制备含受体酪氨酸激酶(receptor typetyrosine kinase,以下称“RTK”)的细胞膜级分,在有RTK活性抑制剂和无RTK活性抑制剂的条件下测定该细胞膜级分中的RTK酶活性,通过比较所得结果评价肿瘤细胞恶性程度的方法。
背景技术:
细胞的细胞膜中存在被称为RTK的激酶。已知这种激酶在细胞分化和增殖中发挥着重要作用。作为RTK,已知有胰岛素样生长因子受体(IGFR)、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)、人类表皮细胞生长因子受体(HER)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)等。
根据迄今为止的研究,已发现某个特定的RTK会在某个特定的肿瘤细胞中过度表达。比如已知HER中的一种——HER2在乳腺癌中基因和蛋白质的表达量增加。因此,一般认为,通过调查乳腺癌患者的HER2的存在量可预测乳腺癌的复发可能性。据报告,作为HER2抑制剂的抗体药物赫赛汀(注册商标;通用名:曲妥珠单抗)对乳腺癌有治疗效果。
同样,对其他RTK的基因和/或蛋白质的表达量与肿瘤细胞增殖和转移的关系也在进行研究。对RTK靶向的抑制药剂抑制肿瘤细胞增殖的效果和抑制肿瘤细胞转移的效果也在进行研究。
比如,Sirotnak等(临床癌症研究(Clinical Cancer Research),vol.6,p.4885-4892,2000;非专利文献1)用RT-PCR法测定HER之一的HER1(也称“EGFR”)的基因在肺癌和前列腺癌肿瘤细胞中的表达量(参照上述文献的图1)。并对HER1抑制剂易瑞沙(Iressa)(注册商标;通用名:吉非替尼)对肿瘤细胞增殖的影响进行了研究(参考上述文献的图3)。Sirotnak等人根据这些结果报告,HER1表达量最高的肿瘤细胞株(A-431)的增殖因易瑞沙得到了最大程度的抑制。此结果显示,越是HER1表达量多的肿瘤细胞,易瑞沙抑制增殖的效果越高。
对此,Ciardiello等(临床癌症研究(Clinical Cancer Research),vol.7,p.1459-1465,2001;非专利文献2)表示,HER1的表达量与易瑞沙IC50(药物抑制50%细胞增殖的浓度(μM))未必一定相关。具体而言,HER1的表达量在MCF-7ADR、OVCAR-3和SW480株中很高,在ZR-75-1和KATOIII株中很低(参考上述文献的表1)。另一方面,易瑞沙IC50的值在ZR-75-1和KATOIII株中和在MCF-7ADR、OVCAR-3和SW480株中一样低(参考上述文献的表2)。因此可以知道,与HER1的表达量无关,这些细胞株被易瑞沙在同样程度上抑制了增殖。
这些研究结果表明,像HER1这种RTK基因和/或蛋白质的表达量与RTK抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果之间未必一定有相关关系。
非专利文献1:Francis M.Sirotnak等“抑制人类肿瘤异种移植的细胞毒性药物,在通过一种叫做ZD1839(易瑞沙)的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的合成后,其功效明显增强”(“Efficacy of Cytotoxic Agentsagainst Human Tumor XenograftsIs Markedly Enhanced By Coadministration of ZD1839(Iressa),a Inhibitor of EGFR Tyrosine Kinase”),临床癌症研究(Clinical Cancer Research),vol.6,p.4885-4892,2000
非专利文献2:Ciardiello等“通过ZD1839(易瑞沙),一种选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,来抑制增长因子的生成和人体内癌细胞的血管生成”(“Inhibition of Growth Factor Production andAngiogenesis in Human Cancer Cells by ZD1839(Iressa),a SelectiveEpidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor”),临床癌症研究(Clinical Cancer Research),vol.7,p.1459-1465,2001
发明内容:
发明要解决的课题:
本发明者们着眼于测定RTK的酶活性(以下称“RTK活性”),而非RTK的基因和蛋白质的量——即表达量。因此,本发明的课题是提供一种根据RTK活性的测定结果评价肿瘤细胞恶性程度的方法。
解决问题的手段
本发明提供一种评价肿瘤细胞恶性程度的方法,包括以下步骤:
(1)从含有肿瘤细胞的试样中制备含有RTK的细胞膜级分(membrancefraction),
(2)使在步骤(1)获得的细胞膜级分与RTK活性抑制剂接触,
(3)使在步骤(2)获得的与RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与与至少针对二种RTK的底物接触,通过测定被磷酸化的底物,测定在有第一RTK活性抑制剂的情况下的RTK活性(第一RTK活性),
(4)使在步骤(1)获得的细胞膜与在步骤(3)使用的底物同样的底物接触,而不接触第一RTK活性抑制剂,通过测定被磷酸化的底物,测定在没有RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(对照RTK活性),
(5)根据上述第一RTK活性和对照RTK活性,评价有第一RTK活性抑制剂情况下的上述肿瘤细胞的恶性程度。
发明效果:
按照本发明的方法,通过测定含肿瘤细胞的试样的RTK活性,就可方便地评价在RTK活性抑制剂存在的条件下肿瘤细胞的增殖能力、转移能力等恶性程度。根据本发明的方法,从患者身上采集肿瘤细胞,测定该肿瘤细胞的RTK活性,就可以在短时间内简便地知道该患者的癌症恶性程度。因此易于获得决定对患者的有效治疗方针(如所用抗癌药的种类)等的指标。
附图说明:
图1为显示实施例1结果的雷达图。
图2为显示实施例1结果的雷达图。
图3为关于细胞增殖能力的比较例1的结果图。
图4为关于肿瘤大小的比较例2的结果图。
图5为关于细胞生存能力的比较例3的结果图。
图6为关于细胞VEGF分泌能力的比较例4的结果图。
图7为关于细胞浸润能力的比较例5的结果图。
图8为关于细胞趋化能力的比较例6的结果图。
具体实施方式:
本发明者们着眼于测定RTK活性,而非RTK的基因和蛋白质的表达量。而且,本发明者们还着眼于这样的报告:
--RTK有很多种类,
--RTK受配体的刺激而形成同型二聚体,进行信号传递。但是,RTK不仅如此,还形成包括异型二聚体或四聚体在内的多聚体,这些都参与肿瘤细胞的增殖,
--HER1和HER2以外的RTK也参与癌细胞增殖和/或转移。
因此,本发明者们认为,不仅测定特定的RTK(比如HER1和HER2),也测定多种RTK(如PDGFR、VEGFR等)的活性对于更正确地获得有关肿瘤细胞增殖和转移的信息是很重要的。
因此,本发明提供的方法用对至少二种RTK有特异性的底物测定有RTK活性抑制剂时和没有RTK活性抑制剂时的RTK活性,以此能够测定多种RTK活性。
在本说明书中,所谓“肿瘤细胞的恶性程度”包括肿瘤细胞的增殖能力、转移能力等。最好肿瘤细胞的恶性程度就是肿瘤细胞的增殖能力和/或转移能力。上述“增殖能力”包括细胞生存的能力、细胞通过增大其体积而生长的能力等。上述“转移能力”包括肿瘤细胞从原病灶移走,依附于其他组织和器官的能力、肿瘤细胞分泌VEGF(血管内皮细胞生长因子)的分泌能力、肿瘤细胞的趋化性(游走性;肿瘤细胞移动的能力)及浸润能力(肿瘤细胞浸润到组织的能力)等。
在本说明书中,RTK是存在于细胞膜的受体型酪氨酸激酶,也称跨膜型酪氨酸激酶。RTK包括胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、人类表皮细胞生长因子受体(HER)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)等。
这些受体分别已知有几个亚族,比如HER已知有HER1、HER2、HER3、HER4等。
在本发明的方法中,首先是从含有肿瘤细胞的试样制备含有RTK的细胞膜级分。
上述含有肿瘤细胞的试样可以来源于生物体的样本,也可以来源于培养细胞系肿瘤细胞获得的培养物。来自生物体的样本比如有从生物体(患者)采集的组织(肿瘤组织、器官组织、淋巴结组织、血液等)或体腔清洗液等。
含有RTK的细胞膜级分的制备可以采取从含有上述肿瘤细胞的试样中分离细胞质的方法、即从细胞质分离出RTK结合的细胞膜级分的方法。最好方法中包括将上述肿瘤细胞在适当的缓冲液(以下称“均质化试剂”)中破碎,从所得破碎液中获取非溶性级分,将该非溶性级分和含有表面活性剂的增溶剂混合,从所得混合液中获取可溶性级分。
使用上述均质化试剂破碎获得的破碎液用离心分离等适当方法可以区分出可溶性级分(如上清)和非溶性级分(如沉淀物)。该可溶性级分包括来源于细胞质的蛋白质等,该非溶性级分包括保持有各种RTK的细胞膜碎片。
可以通过比如离心分离等适当的方法将上述混合液区分为可溶性级分(如上清)和非溶性级分(如沉淀物)。该可溶性级分包含被表面活性剂溶解(胶粒化)的、保持有各种RTK的细胞膜,该非溶性级分含有非溶性蛋白质和DNA等。
含有RTK的细胞膜级分最好所含RTK可以形成同型二聚体和异型二聚体这种多聚体、在保持立体结构的状态下保持在细胞膜中。最好这种RTK在保持在细胞膜中的状态下被表面活性剂胶粒化,分散在溶液中。
如上所述,制备含有RTK的细胞膜级分可以测定肿瘤细胞所具有的各种RTK的酶活性。
上述细胞破碎可以通过能将细胞膜断成片的方法进行。比如一些众所周知的方法:吸移管吸入排出、通过冷冻溶解破碎细胞、涡动搅拌器搅拌、用搅切器破碎、用杵加压、用超声波处理装置进行超声波处理等。
上述均质化试剂在破碎细胞时为防止RTK变性而使用。均质化试剂的pH以不使RTK变性和失活、可以在稳定状态下回收的范围即可,无特别限定。均质化试剂的pH以pH4.0-9.0为宜,pH4.5-8.5更好,最好是pH 5.0-8.0。
均质化试剂最好含有缓冲剂。缓冲剂有磷酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、MOPS(3-吗啉代丙烷磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、tricine(N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸))等。
上述增溶剂中所含表面活性剂无特别限定,只要能够胶粒化已断片化的细胞膜、不使细胞膜中所含RTK分解和变性即可。带电荷的表面活性剂有可能与RTK结合使其立体结构发生变化,因此,最好使用不与RTK结合的非离子型表面活性剂。这种非离子型表面活性剂比如可列举出基本构造有十二烷基醚、十六烷基醚、十八烷基醚、p-t-辛基苯基醚等的活性剂。具体而言,非离子型表面活性剂有乙基苯基聚乙二醇(NP-40,壳牌国际石油有限公司(Shell International Petroleum Company Limited)的注册商标)、曲拉通(Triton)-X(联合碳化化学品及塑料公司(Union Carbide Chemicals&PlasticsInc.)的注册商标)、吐温(Tween)(ICI美国公司(ICIAmericasInc.)的注册商标)、Brij(ICI美国公司(ICIAmericas Inc.)的注册商标)、Emulgen(花王的注册商标)等。增溶剂中的表面活性剂浓度以0.05-5%为宜,0.1-3%更好,最好是0.1-1%。
上述增溶剂最好含有与用于均质化试剂的缓冲剂同样的缓冲剂。该增溶剂最好有与均质化试剂同样的pH值。
上述均质化试剂和增溶剂也可以含有蛋白酶抑制剂、脱磷酸化酶抑制剂、防止SH基氧化的试剂(以下称“SH基稳定剂”)等。
蛋白酶抑制剂可以用于防止RTK被细胞中所含蛋白酶分解。蛋白酶抑制剂比如有:诸如乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)那样的金属蛋白酶抑制剂;苯甲基磺酰氟(PMSF)、胰朊酶抑制剂、胰凝乳朊酶等丝氨酸蛋白酶抑制剂;碘代乙酰胺和E-64等半胱氨酸蛋白酶抑制剂等。这些蛋白酶抑制剂可单独使用也可混合使用。
也可以使用蛋白酶抑制剂混合液(SIGMA公司)那种事先将多种蛋白酶抑制剂混合在一起的市场销售品。
脱磷酸化酶抑制剂可以用于防止RTK的活性因细胞内所含脱磷酸化酶而下降。脱磷酸化酶抑制剂比如有正钒酸钠(Na3VO4)、氟化纳(NaF)和冈田酸等。脱磷酸化抑制剂既可单独使用也可混合使用。
SH基稳定剂可用于防止RTK失活。酶所具有的SH基被氧化,易于形成稳定的二硫化物。二硫化物的形成会引起酶的立体结构发生变化,有时会成为酶失活的原因。用于防止SH基的氧化的SH基稳定剂可以使用含有SH基的试剂。SH基稳定剂比如有二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸、辅酶A和二氢硫辛酸等。
当SH基稳定剂为DTT时,上述均质化试剂和/或增溶剂中的SH基稳定剂浓度应为0.05~2mM,0.07~1.7mM更好,最好为0.1~1.5mM。比如,如果SH基稳定剂为2-巯基乙醇,则以0.1~15mM为宜,0.3~13mM更好,最好为0.5~12mM。
使按以上所述制备的、含RTK的细胞膜级分与RTK活性抑制剂接触。RTK活性抑制剂只要能抑制RTK的活性即可,无特别限定。RTK活性抑制剂已知有与RTK的三磷酸腺苷(ATP)结合位点结合的抑制剂(以下称“ATP竞争抑制剂”或“ATP竞争RTK活性抑制剂”)、与RTK的底物结合位点结合的抑制剂、与RTK胞外域(如配体结合位点)结合的抑制剂等。最好RTK活性抑制剂是RTK的ATP竞争抑制剂。
RTK的ATP竞争抑制剂比如有易瑞沙(阿斯利康公司)、格列卫(GLIVEC,NOVARTIS公司)、特罗凯(tarceva,OSI公司)、PD153035(Calbiochem公司)、AG1478(Calbiochem公司)、4557W(EGFR/ErbB-2抑制剂)(Calbiochem公司)、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(Calbiochem公司)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(Calbiochem公司)等。
与RTK底物结合位点结合的抑制剂有酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin;Calbiochem公司)等。
与RTK胞外域结合的抑制剂有赫赛汀(Genentech公司)、爱必妥(Cetuximab;英克隆(ImClone)公司)、帕妥珠单抗(pertuzumab;Genentech公司)等。
上述接触通常在溶液中进行。
溶液中的RTK活性抑剂浓度可以根据该抑制剂的种类、底物的浓度、后述磷酸基供应体(如ATP)等适当设定。比如当使用ATP竞争抑制剂作为RTK活性抑制剂时,抑制剂的浓度可以设定为是磷酸基供应体(具体地说就是ATP)的浓度的0.1~10倍。
在本发明的方法中,让与上述RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与至少针对二种RTK的底物接触,通过测定磷酸化底物,测定有RTK活性抑制剂存在条件下RTK活性(第一RTK活性)。
该测定最好是混合上述细胞膜级分、上述底物和磷酸基供应体,测定被RTK活性磷酸化的底物。通过此RTK介入的反应,磷酸基供应体的磷酸基被取入底物,测定磷酸化的底物就可以测定RTK的活性。
上述至少针对二种RTK的底物最好是对RTK种类特异性低的底物(以下称“通用底物”)或者对特定RTK特异性高的底物几种组合在一起的底物混合物。用这种底物测定RTK活性,可以测定试样中所含数种RTK的活性。
对特定RTK特异性高的底物,比如可以是对HER1特异性高的底物Grb2、髓鞘碱性蛋白(MBP)、组朊H2B(HH2B)、磷脂酶C-γ等。像GST-EGFR基板(GST-EGFR substrate)(Stratagene公司)这种市场出售的底物也可以作为对HER1有高特异性的底物使用。GST-EGFR基板(GST-EGFR substrate)是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和被HER1的酶活性磷酸化的合成底物的融合蛋白质。
上述通用底物对RTK种类的特异性很低,即是针对多种RTK的底物。因此,合成的通用底物最好是对RTK种类的特异性很低的众所周知的合成肽。合成肽具体而言最好是由含谷氨酸残基和酪氨酸残基的氨基酸序列组成,该合成肽比如有聚(Poly)(Glu4-Tyr)(生物素共轭(biotin conjugate),UPSTATE公司)这种市场销售的合成肽。此外,合成肽,如有Norio Sasaki等,1985,生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry),Vol.260,No.17,9793~9804、Sergei Braun等,1984,生物化学杂志(The Journal ofBiological Chemistry),Vol.259,No.4,2051~2054以及M.Abdel-Ghany等,1990,国家科学院项目(Proceeding of The National Academy ofScience),Vol.87,7061~7065等文献中作为酪氨酸激酶的底物列举的合成肽。这些文献记载的合成肽由含谷氨酸残基(Glu)和酪氨酸残基(Tyr)的氨基酸序列组成,合成为Tyr被二种以上酪氨酸激酶磷酸化。
上述合成肽的氨基酸序列具体而言可举出以下序列:
由四个Glu和一个Tyr组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨基酸序列a”);
由一个Glu和一个Tyr组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨基酸序列b”);
由六个Glu、一个Tyr和三个氨基丙酸残基(Ala)组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨基酸序列c”);
由一个Glu、一个Tyr和一个Ala组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨基酸序列d”);
由二个Glu、一个Tyr、六个Ala和五个赖氨酸残基(Lys)组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨基酸序列e”)。Tony Hunter,1982,生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry),Vol.257,No.9,4843~4848的文献中,有报告说酸性氨基酸残基对酪氨酸激酶磷酸化Tyr很重要。因此,用含有大量酸性氨基酸残基Glu的氨基酸序列a和氨基酸序列c作为上述底物特别理想。
上述磷酸基供应体如有:腺苷三磷酸(ATP)、腺苷5’-O-(3-硫代三磷酸)(ATP-γS)、32P标记的腺苷5’-O-(3-三磷酸)(γ-〔32P〕-ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷单磷酸(AMP)等。
上述磷酸化底物的测定最好是从其他蛋白质分离出磷酸化底物,检测该底物。
为要从其他蛋白质分离出磷酸化底物,上述底物可以有亲和标记。通过使用有亲和标记的底物和有可与亲和标记结合的物质(以下称“结合物”)的固相可以使从其他蛋白质分离出磷酸化底物并加以回收这一操作变得很容易。具体而言,回收磷酸化底物与上述固相的复合物,分解该复合物中的亲和标记和固相所具有的结合物之间的结合,即可回收底物。
上述亲和标记只要具有相应结合物、且不妨碍底物与RTK的结合和底物磷酸化即可,无特别限定。亲和标记比如可用多肽、半抗原等。具体而言,可以使用GST、组氨酸、麦芽糖结合蛋白质、FLAG肽(SIGMA公司)、Myc标记、血凝素(HA)标记、链球菌(Strep)标记(IBA GmbH公司)、生物素、亲和素和链亲和素等。
有上述亲和标记的底物比如可以是上述底物和上述亲和标记进行化学结合的产物。或者,当亲和标记是多肽时,也可以将含有编码底物和亲和标记的融合蛋白质的重组基因的载体导入宿主,回收宿主产生的融合蛋白质进行使用。
对于与上述亲和标记相应的结合物,没有特别限定,只要是能与亲和标记可逆性结合的物质即可,如有:谷胱甘肽、镍、直链淀粉、抗FLAG抗体(SIGMA公司)、抗Myc抗体、抗HA抗体、Strep-Tactin(IBA GmbH公司)等。
上述固相只要是能与上述结合物结合的载体即可,无特别限定。固相材质如有多糖类、塑料、玻璃等。固相的形态如微球(Beads)、凝胶等。固相具体来说如有琼脂糖凝胶球、琼脂糖球、磁性微球、玻璃微球、硅凝胶等。这些固相也可填充到柱中使用。
亲和标记与有结合物的固相的组合举例如下:
当选择GST为亲和标记时,固相可以用谷胱苷肽琼脂糖凝胶球(以下称“谷胱苷肽球”)。在此组合情况下的具体的RTK活性测定比如可如下进行。使与RTK活性抑制剂接触过的细胞膜级分与GST所结合的底物接触,在此加入谷胱苷肽球,获得磷酸化底物结合的谷胱苷肽球。回收此谷胱苷肽球后,添加还原型谷胱苷肽,则得以分解GST与谷胱苷肽球的结合,回收底物。
或者先让GST结合的底物与谷胱苷肽球接触,获得该底物与谷胱苷肽球的复合物。让已与RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与该复合物接触并将其回收。在此添加还原型谷胱苷肽,分解GST和谷胱苷肽球的结合,也可以回收到底物。
如果选择组氨酸作为亲和标记,则有结合物的固相可以用镍琼脂糖球。组氨酸与镍的结合比如可以用甘氨酸-HCl等酸或咪唑分离。
若选麦芽糖结合蛋白质作为亲和标记,则有结合物的固相可以用直链淀粉磁球。麦芽糖结合蛋白质与直链淀粉的结合可以添加游离的直链淀粉来分解。
如果选FLAG肽作为亲和标记,则有结合物的固相可以用FLAG亲和凝胶(SIGMA公司)。FLAG肽与FLAG亲和凝胶的结合比如可以用甘氨酸-HCl等酸或3×FLAG肽(SIGMA公司)来分解。
如果选Myc标记作为亲和标记,则有结合物的固相可以用结合了抗Myc抗体的琼脂糖球。
如果选择HA标记作为亲和标记,则有结合物的固相可以用结合了抗HA抗体的琼脂糖球。
Myc标记和抗Myc抗体的结合、HA标记和抗HA抗体的结合都可以通过例如添加酸或碱使蛋白质变性来使之分解。此时,最好选择可以将变性的蛋白质还原的酸或碱,具体而言,如酸可用盐酸等,碱可用苛性钠等。
如果选择Strep标记作为亲和标记,则有结合物的固相可以用Strep-Tactin固相凝胶柱(IBA GmbH公司)。Strep标记和Strep-Tactin的结合比如可以用与链亲和素可逆性反应的脱硫生物素来分解。
也可以在让RTK与上述底物接触后,在回收磷酸化的底物之前用加热处理、冷却处理或添加EDTA等酶抑制剂等处理停止酶反应。酶反应再进行下去有可能造成各个试样的测定结果参差不齐,如上所述停止酶反应,可以避免出现这种情况。
最好让标记物结合到如上所述从固相分离出来的、磷酸化的底物,通过检测该标记物,来测定磷酸化的底物。标记物如有荧光物质、酶、放射性同位素等,但不限于此。荧光物质如有荧光素、香豆素、曙红、菲绕啉、芘、若丹明等。酶如有碱性磷酸酶、过氧化物酶等。放射性同位素如有32P、33P、131I、125I、3H、14C、35S等。
如果以酶为标记物,上述检测可以通过检测与这些酶的底物反应产生的显色来实现。当酶是碱性磷酸酶时,底物可以是氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)的混合物等。如果酶是过氧化物酶(PO),底物则可以是二氨基联苯胺(DAB)。
磷酸化底物与标记物的结合可以采用通常的方式。比如可以使用有标记物并能够与磷酸化底物特异性结合的抗体(以下称“磷酸化底物识别抗体”),使标记物与磷酸化底物结合。
磷酸化底物与标记物的结合还可以使用磷酸化底物识别抗体和能与该磷酸化底物识别抗体结合且有标记物的抗体(以下称“二次抗体”)。此时,通过磷酸化底物识别抗体和二次抗体可以将标记物结合到磷酸化底物。
磷酸化底物和标记物的结合还可以使用磷酸化底物识别抗体、有生物素的二次抗体和有标记物的亲和素。此时可以通过磷酸化底物识别抗体、二次抗体、生物素和亲和素使标记物结合到磷酸化底物。二次抗体可以有亲和素,生物素可以有标记物。
磷酸化底物和标记物的结合还可以使用有生物素的磷酸化底物识别抗体和有标记物的亲和素或用有亲和素的磷酸化底物识别抗体和有标记物的生物素。
使用以上标记物,检测该标记物产生的信号,以此可检出磷酸化底物,测定RTK活性。
上述磷酸化底物识别抗体和二次抗体可以是用众所周知的方法制备的的抗体。获得抗体的方法,比如有从接种抗原进行免疫的动物血液获得、重组基因获得等。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体中任意一种,也可以是抗体的碎片及其诱导体。也可以将这些抗体二种以上混合起来使用。抗体碎片及其诱导体如有:Fab碎片、F(ab’)碎片、F(ab)2碎片、sFv碎片等(Blazar等,1997,免疫学杂志(Journal of Immunology),159:5821-5833及Bird等,1988,科学(Science),242:423-426)等。抗体的类型可以是IgG、IgM等。
检测磷酸化底物的方法可根据标记物种类适当选择。例如,当标记物是荧光物或酶时,可用免疫印迹法检测磷酸化底物。将SDS-PAGE等电泳分离的磷酸化底物印迹到膜上,在含有磷酸化底物识别抗体的缓冲液中培养该膜,使该抗体与磷酸化底物结合,再让有标记物的二次抗体与磷酸化底物识别抗体结合,通过检测此标记物即可测定磷酸化底物。当磷酸化底物有上述亲和标记时,可以使用该亲和标记分离磷酸化底物,通过狭线印迹法取代免疫印迹法,和用免疫印迹法时同样地测定磷酸化底物。
当标记物是荧光物时,也可以将含磷酸化底物的溶液装入试管,加入有荧光物的磷酸化底物识别抗体并使其与磷酸化底物结合,测定荧光强度,以此检测磷酸化底物。
如果标记物是酶,则可以用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测磷酸化底物。ELISA法含直接吸附法和夹心法。
直接吸附法是一种包括将磷酸化底物直接吸附于固相的方法,如将磷酸化底物吸附于固相表面,使含酶的磷酸化底物识别抗体与磷酸化底物结合,用酶的底物使磷酸化底物识别抗体含有的所述酶显色,检测该显色即可。
夹心法是一种用识别磷酸化底物不同位点的二种磷酸化底物识别抗体检测磷酸化底物的方法。这种方法比如可以让磷酸化底物识别抗体结合到固相(以后称“固相抗体”),让磷酸化底物与固相抗体结合。让含有酶的磷酸化底物识别抗体(以后称“标记抗体”)与该磷酸化底物结合,该标记抗体所具有的酶与该酶的底物发生反应而显色,检测该显色即可。
如果标记物为放射性同位素,则可以用放射线免疫分析法(RIA)检测磷酸化底物。具体而言,可以使有放射性同位素的磷酸化底物识别抗体与磷酸化底物结合,用闪烁计数器等测定放射线,检测磷酸化底物。
本发明的方法中所包含的测定没有RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(对照RTK活性)的步骤除不让上述细胞膜级分与上述RTK活性抑制剂接触这一点外,均与上述第一RTK活性的测定步骤相同。
本发明的方法包括根据上述第一RTK活性和对照RTK活性评价在有RTK活性抑制剂条件下的肿瘤细胞恶性程度的步骤。
上述评价步骤最好根据述第一RTK活性和对照RTK活性,算出肿瘤细胞所含RTK活性的相对值,通过比较该相对值和阈值(以下将详述)来评价在有RTK活性抑制剂条件下的该肿瘤细胞的恶性程度。
上述相对值应为最好是第一RTK活性和对照RTK活性的差或第一RTK活性除以对照RTK活性的商(第一RTK活性/对照RTK活性),最好是第一RTK活性除以对照RTK活性的商。
上述所谓阈值可以根据RTK活性抑制剂种类和肿瘤细胞种类适当设定。阈值比如可以用已在临床上评价过其恶性程度的肿瘤细胞和某种特定RTK活性抑制剂,按照与本发明方法同样的方法测定第一RTK活性和对照RTK活性,通过计算其相对值求出。
在上述评价步骤中,当上述相对值为从对照RTK活性减去第一RTK活性的差时,比较相对值和阈值,如果相对值高于阈值,则可以评价为在RTK抑制剂存在的条件下肿瘤细胞恶性程度低。当上述相对值为第一RTK活性除以对照RTK活性的商(第一RTK活性/对照RTK活性)时,比较相对值和阈值,如果相对值低于阈值,则可以评价为在RTK抑制剂存在的条件下肿瘤细胞恶性程度低。
本发明的方法最好还包括以下步骤:
(a)让含有从含有上述肿瘤细胞的试样制备的RTK的细胞膜级分与不同与第一RTK活性抑制剂的第二RTK活性抑制剂接触;
(b)让在步骤(a)获得的与上述第二RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与在上述第一RTK活性测定中使用的底物同样的底物接触,通过测定磷酸化底物,测定在有上述第二RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(第二RTK活性)。
在本发明测定第二RTK活性的方法中,评价步骤是根据第一RTK活性、第二RTK活性和对照RTK活性评价在有各种RTK活性抑制剂情况下的肿瘤细胞的恶性程度。
上述第一RTK活性抑制剂和第二RTK活性抑制剂的组合,可以从上面列举的PTK活性抑制剂中任意选择,最好是从上述RTK的ATP竞争抑制剂的例示中选择数种。
上述评价步骤最好包括以下步骤:
(a)根据上述第一RTK活性和上述对照RTK活性,算出关于上述肿瘤细胞所具有的RTK活性的第一相对值;
(b)根据上述第二RTK活性和上述对照RTK活性,算出关于上述肿瘤细胞所具有的RTK活性的第二相对值;
(c)将步骤(a)和(b)算出的各相对值与其对应的各阈值进行比较,据此评价在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的恶性程度。
上述第一相对值和第二相对值应当是第一RTK活性或第二RTK活性和对照RTK活性的差、或者是第一RTK活性或第二RTK活性除以对照RTK活性的商(第一RTK活性或第二RTK活性/对照RTK活性),最好是第一RTK活性或第二RTK活性除以对照RTK活性的商。
决定上述阈值时的方式可以与本发明中测定第一RTK活性和对照RTK活性的方式相同。
如此,用多种RTK活性抑制剂评价肿瘤细胞的恶性程度,可以进行更精密的全面的评价。以此可以更确切地获得指标,并据此指标决定对患者的有效的治疗方针(比如所用抗癌药的种类)等,有可能使临床上的治疗选择更加广泛。
实施例
下面以实施例更详细地说明本发明,但本发明不受这些实施例所限定。
(至少针对二种RTK的底物)
使用了聚(Glu4-Tyr)(生物素共轭(biotin conjugate),UPSTATE公司)作为至少针对二种RTK的底物。此聚(Glu4-Tyr)是一种对跨膜型酪氨酸激酶种类特异性很低的底物,具体而言,是由四个谷氨酸残基和一个酪氨酸残基构成的序列重复5次而形成的氨基酸序列所构成的肽和生物素的融合蛋白质(以下称“生物素-聚(Glu、Tyr)[Biotin-Poly(Glu、Tyr)]底物”)。
实施例1:ATP竞争抑制剂对RTK的影响
在本实施例中,不是从培养肿瘤细胞中提纯RTK,而是制备含有RTK的细胞膜级分。使所得细胞膜级分与RTK活性抑制剂——ATP竞争RTK抑制剂接触或不接触,用上述生物素-聚(Glu、Tyr)底物测定RTK活性。
(制备细胞膜级分)
将13种培养细胞(A-431、KF、MDA-MB-468、RMUG-L、BT-474、ES2、MDA-MB453、SK-Br-3、SNG-S、K-562、MDA-MB-231、MCF7和T47D)分别与1ml均质化试剂(含20mM HEPES pH7.4、0.2%蛋白酶抑制剂(PI)、10%甘油、200μMNa3VO4、和50mMNaF)混合,用杵加压来破坏细胞膜,制备细胞破碎液。离心分离(20000×g、20分钟)所得细胞破碎液,弃上清,回收沉淀物。在回收的沉淀物中添加增溶剂(含20mM HEPES pH7.4、1%NP40、0.2%PI、10%甘油、200μM Na3VO4、和50mM NaF)并混合,用杵加压使细胞膜可溶化,进行离心分离(20000×g、20分钟)。回收上清作为细胞膜级分,调制至总蛋白质量为40μg/ml后,将该细胞膜级分用于以下实验。
A-431为来源于鳞状细胞癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分A-431。
KF是来源于卵巢癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分KF。
MDA-MB-468是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分MDA-MB-468。
RMUG-L是来源于卵巢癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分RMUG-L。
BT-474是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分BT-474。
ES2是来源于卵巢癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分ES2。
MDA-MB-453是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分MDA-MB-453。
SK-Br-3是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分SK-Br-3。
SNG-S是来源于子宫癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分SNG-S。
K-562是来源于白血病的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分K-562。
MDA-MB-231是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分MDA-MB-231。
MCF7是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分MCF7。
T47D是来源于乳腺癌的培养细胞,由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分T47D。
(生物素-聚(Glu、Tyr)底物结合到ELISA板)
ELISA试验用板使用的是亲和素包被板[具有SuperBlock封闭缓冲液的NeutrAvidin HBC白色96孔板(NeutrAvidin HBC White 96-Well Plates WithSuperBlock Blocking Buffer(PIERCE公司))]。首先用TBS-T(含25mM Tris、150mM NaCl和0.05%Tween-20)清洗该板的各孔三遍。再将50μl含上述生物素-聚(Glu、Tyr)底物的底物溶液1(含1μg/ml的生物素-聚(Glu、Tyr)底物的TBS)注入各孔,边轻摇,边在25℃培养1小时30分钟。培养后各孔用TBS-T清洗三遍。如此使生物素-聚(Glu、Tyr)底物结合到ELISA板的孔的表面。用此ELISA板进行以下酶反应。
(RTK与ATP竞争抑制剂接触)
本例使用了ATP竞争RTK活性抑制剂PD153035(HER1抑制剂)(Calbiochem公司)、AG1478(HER1抑制剂)(Calbiochem公司)、4557W(HER1/HER2抑制剂)(Calbiochem公司)、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(以下称“PDGFR抑制剂”)(Calbiochem公司)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III(以下称“VEGFR抑制剂”)(Calbiochem公司)。还使用了对非受体型酪氨酸激酶Src的ATP竞争抑制剂Src抑制剂(inhibi tor)(以下称“Src抑制剂”)(Calbiochem公司)。各抑制剂的结构式如下。
[化1]
先将25μμl的上述各肿瘤细胞的细胞膜级分分别装入7支试管中,在6支试管中分别添加25μl含100μM PD153035的处理液(20mM HEPES pH7.4、20mM MnCl2、2mM DTT、1%NP40、10%甘油、200μM Na3VO4、50mM NaF、100μMATP、400μM PPI(BIOMOL公司))、25μl含100μM AG1478的处理液、25μl含100μM 4557W的处理液、25μl含100μM Src抑制剂的处理液、25μl含100μMPDGFR抑制剂的处理液、或25μl含100μM VEGFR抑制剂的处理液,使RTK活性抑制剂与细胞膜级分接触。并在余下的1支管内添加25μl不含抑制剂的处理液。以如此获得的溶液为反应液。为抑制RTK酶活性,此作业在4℃以下环境下进行。
(测定RTK活性)
将各反应液50μl注入如上制备的ELISA板的各孔,25℃培养约30分钟,使与RTK活性抑制剂接触或未接触的细胞膜级分与底物接触。培养后在各孔中添加100μl反应停止液(含5mM EDTA的TBS-T),再用TBS-T清洗三遍。然后用300μl开始锁定T20(TBS)封闭缓冲液(Start ingBlock T20(TBS)Blocking Buffer)(PIERCE公司)清洗各孔。清洗后,将用开始锁定T20(TBS)封闭缓冲液(Start ingBlock T20(TBS)Blocking Buffer)稀释了1000倍的HRP标记的初级抗体(p-Tyr(PY20),sc-508HRP(SANTA CruzBiotechnology公司)、识别磷酸化酪氨酸残基的抗体)注入各孔100μl,25℃边轻摇边培养1小时30分钟。培养后,用TBS-T清洗五遍各孔。清洗后在各样孔注入150μl化学发光底物(超强信号(SuperSignal)ELISA PICO(PIERCE公司)),五分钟后用GENios酶标仪(TECAN公司)测定发光,以此测定RTK活性。
(结果)
根据用与抑制剂接触的细胞膜级分获得的RTK活性(第一RTK活性)除以用未与抑制剂接触的细胞膜获得的RTK活性(对照RTK活性)所得商(相对值),绘制成图1和图2所示雷达图。在图1和图2中,显示了在抑制剂使用了I:PD153035、II:AG1478、III:4557W、IV:Src抑制剂、V:PDGF抑制剂及VI:VEGF抑制剂的情况下第一RTK活性与对照RTK活性的相对值。
从图1和图2的结果可以看出,可以将实施例1使用的12种肿瘤细胞分成在某个特定RTK活性抑制剂存在的情况下RTK活性相对值较低的细胞群(A-431、KF、MDA-MB-468、RMUG-L、BT-474、ES2、MDA-MB-453、SK-Br-3和SNG-S)和在任何RTK活性抑制剂存在的情况下RTK活性相对值都较高的细胞群(K-562、MDA-MB-231、MCF7和T47D)。以相对值较低的细胞群为1组显示在图1上。以相对值都较高的细胞群为2组显示在图2上。
从图1的1组结果得知,在本实施例使用的Src抑制剂(对非受体型酪氨酸激酶Src的抑制剂)抑制RTK活性。
比较例:直接评价肿瘤细胞的恶性程度
从实施例1的结果,根据第一RTK活性与对照RTK活性,可将肿瘤细胞分成1组和2组。在此,分别从1组中选择MDA-MB-468和BT-474,从2组选择MCF7和MDA-MB-231。为了证明基于在实施例1获得的RTK活性的相对值与在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的恶性程度相关,用这四种培养细胞进行了以下各实验。
比较例1:评价肿瘤细胞的增殖能力
(用RTK活性抑制剂处理并培养细胞)
向培养板(96孔白色平底TC表面的聚苯乙烯培养板,CORNING公司)各孔中分别播撒以上四种细胞,平均每孔1000个,在培养基(10%FBS)37℃培养。24小时后,换为含有0.078、0.156、0.313、0.625、1.25或2.5μM浓度的PD153035或AG1478RTK活性抑制剂的培养基,再37℃培养3天。
(测定活细胞)
测定活细胞使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测(Promega公司)。此试剂盒是一种能定量来自培养基中具有代谢活性的细胞的ATP、测定活细胞的试剂盒。
首先,按照试剂盒所附实验设计(protocol)制备测定用试剂。如上所述,向含有在RTK活性抑剂剂存在情况下培养的肿瘤细胞的各孔中添加100μl该测定用试剂,用搅拌器搅拌培养板2分钟,搅拌后,板静置10分钟,用GENios系列酶标仪(TECAN公司)测定发光。发光与来自培养基中具有代谢活性的细胞的ATP量成正比,因此,测定该发光就可以测定培养基中的活细胞数目。
就各种条件分别获取三个孔的结果,求出平均值和标准差。
从如此获得的结果评价肿瘤细胞的增殖能力。
(结果)
以上测定结果见图3。在图3中,纵坐标是将没有抑制剂情况下肿瘤细胞的活细胞数设为100%时的、有抑制剂情况下的肿瘤细胞活细胞数的相对值,横坐标为抑制剂的浓度(μM)。在图3中“PD”表示用PD153035处理的细胞的结果,“AG”表示用AG1478处理的细胞的结果。
从图3的结果得知,MCF7和MDA-MB-231即使在有RTK活性抑制剂的情况下活细胞数也没太减少,而MDA-MB-468和BT-474在有RTK活性抑制剂的情况下活细胞数有减少。由此可以知道,MCF7和MDA-MB-231即使在有RTK活性抑制剂的情况下,增殖能力也没怎么下降,而MDA-MB-468和BT-474在有RTK活性抑制剂的情况下,增殖能力下降。
根据图2的雷达图,MCF7和MDA-MB-231在有PD153035和AG1478的情况下,RTK活性均无下降,而根据图1的雷达图,MDA-MB-468和BT-474在有PD153035和AG1478的情况下,RTK活性分别下降了。这显示出与图3的肿瘤细胞增殖能力的结果相同的倾向。由此得知,用本发明的方法可以评价在有RTK活性抑制剂情况下的肿瘤细胞的增殖能力。
比较例2:评价肿瘤细胞尺寸增加
为了调查RTK活性抑制剂对小鼠体内肿瘤细胞(MDA-MB-468)的增殖能力的效果,进行了以下实验。
(肿瘤在小鼠体内形成)
在培养液(含10%FBS(Hyclone公司)的DMEM-F12(希SIGMA公司))中培养MDA-MB-468细胞,使之在225cm2试剂瓶(Flask)中达到80%融合度。将所得培养细胞在100μl DMEM-F12中悬浮到约1×107个,制备MDA-MB-468细胞液。
在10周大的母鼠(BALB/c nu/nu)的脂肪垫(fat pad)内注射100μlMDA-MB-468细胞液。得知14天后在小鼠体内肿瘤变大。如此在3只小鼠体内形成肿瘤。
(用RTK活性抑制剂处理)
注射MDA-MB-468细胞液14天后,给产生肿瘤的小鼠注射抑制剂溶液。具体而言,将AG1478溶解到100μl二甲基亚砜(DMSO、SIGMA公司),配制抑制剂溶液1。向小鼠注射抑制剂溶液1,使抑制剂剂量达到30mg/kg/日,连续注射7天。将4557W溶解到DMSO,配制抑制剂溶液2。以与上述抑制剂溶液1同样方法向另一只小鼠注射抑制剂溶液2。再同样向另一只小鼠只注射DMSO作为阴性对照。
(测定肿瘤的体积)
以第一次给小鼠注射抑制剂溶液的日子为注射后第一天,并在注射后第一天、第三天、第五天和第八天分别测定小鼠体内肿瘤的体积(mm3)。测定肿瘤的长径和短径,假设肿瘤为椭圆形,根据其长径和短径计算肿瘤的体积。
对于注射DMSO的小鼠也用上述同样方法测定肿瘤的体积。
(结果)
测定结果见图4。图4以注射后第一天的体积为1,显示注射后第三天、第五天和第八天的体积变化。在图4中,“DMSO”表示阴性对照,“AG1478”表示注射AG1478的小鼠的结果,“4557W”表示注射4557W的小鼠的结果。
从图4可以看出,MDA-MB-468细胞引起的肿瘤体积增加在有AG1478或4557W的情况下得到了控制。
根据图1的雷达图,MDA-MB-468细胞在有AG1478或4557W的情况下RTK活性下降。这显示出与图4肿瘤体积增加得到控制的结果相同的倾向。因此,本发明的方法可以评价在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的体积增加能力、即增殖能力。
比较例3:评价肿瘤细胞的增殖能力
使用各抑制剂浓度为1μM的PD153035、AG1478、4557W、PDGFR抑制剂和VEGFR抑制剂的混合物,取代上述比较例1中使用的PD153035或AG1478,除此之外均与比较例1同样测定肿瘤细胞的活细胞数。
(结果)
设在没有抑制剂情况下肿瘤细胞的活细胞数为100%时,在有抑制剂情况下肿瘤细胞的活细胞数相对值如图5所示。
与在比较例1获得的结果同样,MCF7和MDA-MB-231即使在有RTK活性抑制剂的情况下活细胞数也没太减少,而MDA-MB-468和BT-474在有RTK活性抑制剂的情况下活细胞数有减少。由此可以知道,MCF7和MDA-MB-231即使在有RTK活性抑制剂的情况下,增殖能力也没怎么下降,而MDA-MB-468和BT-474在有RTK活性抑制剂的情况下,增殖能力下降。
比较例4:评价细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌能力
VEGF是一种已知参与肿瘤血管新生和转移的糖蛋白质。肿瘤细胞分泌出VEGF时,该肿瘤细胞就能新生血管,获取新的养分而增殖,再通过新生的血管转移。因此,VEGF的分泌能力是表示易转移程度的指标。
如下测定肿瘤细胞的VEGF分泌能力。
向6孔板(Corning公司)各孔中分别接种MDA-MB-468、BT-474、MCF7和MDA-MB-231培养细胞,平均每孔1×106个,在培养基(10%FBS)37℃培养。24小时后,将各孔中的培养基换为无血清培养基,再培养18小时。无血清培养基使用的是添加了抗生素——抗生素-抗真菌(100×)(Antibiotic-Antimycotic(100×))(GIBCO公司)的DMEM/F12(SIGMA公司)或RPM11640(SIGMA公司)。然后,换为含有溶解在DMSO中的1μM抑制剂(PD153035、AG1478、PDGFR抑制剂或VEGFR抑制剂)的培养基(10%FBS),培养4小时。再回收细胞上清。用人VEGF Quantikine ELISA试剂盒(HumanVEGF Quantikine ELISA Kit)(R&D system公司)按照试剂盒附带的实验设计测定了上清中的VEGF量。
作为对照,仅用DMSO取代抑制剂进行了同样实验。
(结果)
结果见图6。在图6中,纵坐标表示VEGF浓度(pg/ml),这反映了从细胞分泌出的VEGF量。在图6中,“DMSO”表示对照品,“PD”表示用PD153035处理过的细胞的结果,“AG”表示用AG1478处理过的细胞的结果,“PDGFR”表示用PDGFR抑制剂处理过的细胞的结果,“VEGFR”表示用VEGFR抑制剂处理过的细胞的结果。
从图6的结果得知,MDA-MB-468和BT-474细胞用PD153035或AG1478处理后,VEGF分泌量比对照值有所下降。即可以认为,这些细胞在有PD153035或AG1478的情况下血管新生能力(即转移能力)下降。
这些细胞根据图1的雷达图,在有PD153035和AG1478的情况下RTK活性分别有所下降。这显示出与图6的VEGF分泌量的结果相同的倾向。由此得知,用本发明的方法可以评价在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的血管新生能力(即转移能力)。
比较例5:评价细胞的浸润能力
肿瘤细胞浸润血管壁而进入血管内,通过血流而移动,转移到其他组织。因此,细胞的浸润能力是显示细胞易转移程度即转移能力的指标。
在此,如下测定MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的浸润能力。
浸润能力的测定实验原理如下。此实验用Cultrex 96孔细胞侵袭检测试剂盒(Cultrex 96 well Cell Invasion Assay)(Trevigen公司)所含有上下层板的96孔板(chamber)进行。上层板的底面有基底膜(基底膜提取物(Basement membrane extract;BME)),在其上面放置血清饥饿状态的细胞。在下层板放入血清培养基。在此状况下培养细胞,则细胞为获得营养(血清)而向下层板迁移。移到下层板的细胞用活细胞特异性荧光染色试剂(钙黄绿素AM(calcein AM))染色,测定其荧光强度,即可求出移到下层板的细胞数量。以此可测定细胞分解基底膜的能力、即浸润能力。
(用RTK活性抑制剂处理并培养细胞)
在培养板培养皿表面(Nunclon Surface)(Nunc公司)中,以培养基(10%FBS)37℃培养上述细胞,直至达到80%融合度。再将孔中的培养基换为无血清培养基,再培养24小时,使细胞处于血清饥饿状态。无血清培养基使用的是添加了抗生素——抗生素-抗真菌(100×)(Antibiotic-Antimycotic(100×))(GIBCO公司)的DMEM/F12(SIGMA公司)。然后,用0.05%胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)(GIBCO公司)将细胞从孔剥离,用Quentin缓冲液(含有5%BSA的无血清培养基)回收细胞,离心分离,除胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA),用上述无血清培养基稀释至每1ml 1×106个细胞,获得细胞悬浮液。
将溶解在DMSO中的抑制剂混合物(PD153035、AG1478、4557W、PDGFR抑制剂及VEGFR抑制剂)加入细胞悬浮液,使各抑制剂分别为1μM。
作为对照,在细胞悬浮液仅加入DMSO取代抑制剂。
(反应板的准备)
此实验使用了含有有上下层板的、96孔板的试剂盒即Cultrex 96孔细胞侵袭检测试剂盒(Cultrex 96well CellInvasion Assay)(Trevigen公司)。
首先,按照试剂附带的配方,制备各种试剂(0.1×BME溶液(BMEsolution)、洗涤液、细胞裂解液和钙黄绿素AM溶液(calcein AMsolution))。向上层板各孔各加入试剂盒所附的0.1×BME溶液(BMEsolution)50μl,将上下层板和盖组合起来,在CO2培养箱内37℃培养4小时以上。如此在上层板底面形成BME。
(浸润能力实验)
在下层板各孔加入含有各抑制剂浓度为1μM的DMSO中溶解的抑制剂混合物(PD153035、AG1478、4557W、PDGFR抑制剂及VEGFR抑制剂)的培养基(10%FBS)或只含有DMSO的培养基150μl。
将除去残留的BME液的上层板组装到下层板,在上层板各孔加入含有抑制剂或不含的细胞悬浮液50μl。当下层板的孔含有抑制剂混合物时,上层板相应位置的孔也含有含抑制剂混合物的细胞悬浮液,当下层板的孔没有抑制剂混合物时,上层板相应位置的孔也不含抑制剂混合物。
盖上盖,在CO2培养箱中37℃培养40小时。
去上层板的细胞悬浮液,用100μl洗涤缓冲液清洗孔。再去下层板培养基,用200μl洗涤缓冲液清洗孔。将混合10ml细胞裂解液和12μl钙黄绿素AM(calcein AM)液获得的混合液150μl加入下层板各孔,与上层板和盖组合在一起,37℃培养1小时。用酶标仪GENios(TECAN公司)测定下层板各孔的荧光。
(结果)
当设只加入DMSO时迁移到下层板的细胞数为100%时的结果见图7。在图7中,“MB231”表示MDA-MB-231细胞,“MB468”表示MDA-MB-468细胞,“DMSO”表示添加对照品,“5化合物”表示添加抑制剂混合物的情况。
从此结果可以看出,MDA-MB-231细胞在有抑制剂的情况下细胞的浸润能力也没有太大变化,而MDA-MB-468细胞在有抑制剂的情况下细胞的浸润能力下降了。
根据图2的雷达图,MDA-MB-231在有抑制剂的情况下RTK活性几乎没有降低,而根据图1的雷达图,MDA-MB-468在有某种抑制剂的情况下RTK活性降低。这显示出与图7的肿瘤细胞浸润能力的结果相同的倾向。由此得知,用本发明的方法可以评价在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞浸润能力、即转移能力。
比较例6:评价细胞的趋化能力(游走能力)
肿瘤细胞具有细胞自身移动的能力、即趋化能力,因此,可以转移至其他组织。故细胞的趋化能力成为显示细胞迁移能力的指标。
如下测定了MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的趋化能力。
趋化能力的测定实验原理如下。此实验也使用与上述比较例5一样的腔室。在上层板的底面未形成BME,设有孔。在上层板底面放置血清饥饿状态的细胞。在下层板放入血清培养基。在此状况下培养细胞,则细胞为获得营养(血清)而向下层板迁移。移到下层板的细胞用活细胞特异性荧光染色试剂钙黄绿素AM(calcein AM)染色,测定其荧光强度,即可求出移到下层板的细胞数量。以此可测定细胞移动的能力、即趋化能力(游走能力)。
在上述比较例5的浸润能力测定准备反应板时,不用0.1×BME液而用1×包被液(按试剂盒附带的配方调制)培养上层板的底面,除此之外均与上述比较例5浸润能力测定同样进行实验。
(结果)
当设只加入DMSO时迁移到下层板的细胞数为100%时,其结果见图8。在图8中,“MB231”表示MDA-MB-231细胞,“MB468”表示MDA-MB-468细胞,“DMSO”表示添加对照品,“5化合物”表示添加抑制剂混合物的情况。
从此结果可以看出,MDA-MB-231细胞在有抑制剂的情况下细胞的浸润能力也没有太大变化,而MDA-MB-468细胞在有抑制剂的情况下细胞的浸润能力下降了。
根据图2的雷达图,MDA-MB-231在有抑制剂的情况下RTK活性几乎没有降低,而根据图1的雷达图,MDA-MB-468在有某种抑制剂的情况下RTK活性降低。这显示出与图8的肿瘤细胞趋化能力的结果相同的倾向。由此得知,用本发明的方法可以评价在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的趋化能力、即转移能力。
从以上结果得知,通过实施例1所示本发明的方法测定RTK活性,即使不进行比较例1-6那种烦琐的实验,也可以评价在有RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的包括增殖能力和转移能力在内的恶性程度。
本申请与2008年3月28日申请的日本国特许申请特愿2008-087153号相关,该专利申请的权利要求范围、说明书、附图及摘要全部作为本说明书的参考。
Claims (10)
1.一种评价肿瘤细胞恶性程度的方法,包括以下步骤:
(1)从含有肿瘤细胞的试样中制备含有受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞膜级分;
(2)使在步骤(1)获得的细胞膜级分与第一RTK活性抑制剂接触;
(3)使在步骤(2)获得的与RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与至少针对二种RTK的底物接触,通过测定被磷酸化的底物,测定在有第一RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(第一RTK活性);
(4)使在步骤(1)获得的细胞膜与和步骤(3)同样的底物接触,而不接触第一RTK活性抑制剂,通过测定被磷酸化的底物,测定在没有RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(对照RTK活性);
(5)根据所述第一RTK活性和对照RTK活性,评价在有第一RTK活性抑制剂情况下的所述肿瘤细胞的恶性程度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述步骤(1)包含:
(1a)在缓冲液中破碎肿瘤细胞的步骤;
(1b)从步骤(1a)所得破碎液中获取非溶性级分的步骤;
(1c)在步骤(1b)所得非溶性级分中添加含有表面活性剂的增溶剂并加以混合的步骤;
(1d)从步骤(1c)所得混合液中获取可溶性级分的步骤。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法,其特征在于:在所述步骤(3)和(4)中的底物是多种对特定RTK特异性高的底物组合在一起的底物混合物或是对RTK种类特异性低的底物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述对RTK种类特异性低的底物包括由含有谷氨酸残基和酪氨酸残基的氨基酸序列所构成的肽。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的RTK活性抑制剂是针对RTK的三磷酸腺苷(ATP)竞争抑制剂。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述步骤(5)包括以下步骤:
(5a)根据所述第一RTK活性和所述对照RTK活性,算出所述肿瘤细胞具有的RTK活性的相对值;
(5b)通过比较步骤(5a)算出的相对值和阈值,评价在有RTK抑制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:
所述相对值是所述第一RTK活性除以所述对照RTK活性所得商,
当所述相对值低于所述阈值时,评价在有RTK抑制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度低。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述肿瘤细胞的恶性程度指所述肿瘤细胞的增殖能力和/或转移能力。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:还包括步骤(6),使在所述步骤(1)制备的细胞膜级分与不同于所述第一RTK活性抑制剂的第二RTK活性抑制剂接触;
步骤(7),使在步骤(6)获得的与第二RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与同于所述步骤(3)的底物接触,通过测定被磷酸化的底物,测定在有第二RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(第二RTK活性);
所述步骤(5)根据所述第一RTK活性、第二RTK活性和对照RTK活性,评价在有RTK抑制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述步骤(5)还包括以下步骤:
(5a’)根据所述第一RTK活性和所述对照RTK活性,算出关于所述肿瘤细胞所具有的RTK活性的第一相对值;
(5b’)根据所述第二RTK活性和所述对照RTK活性,算出关于所述肿瘤细胞所具有的RTK活性的第二相对值;
(5c’)通过将在步骤(5a’)和(5b’)算出的各相对值与各阈值进行比较,评价在有RTK抑制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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