JP5197931B2

JP5197931B2 - 悪性腫瘍の性質の判定方法

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Publication number: JP5197931B2
Application number: JP2006185213A
Authority: JP
Inventors: 聡田中; 英幹石原
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Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2005-08-01
Filing date: 2006-07-05
Publication date: 2013-05-15
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Description

本発明は、悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞のタンパク質を分析し、分析結果に基づいて悪性腫瘍の性質を判定する方法に関する。

悪性腫瘍の性質を判定するため、増殖因子受容体の発現量を測定することが行われている。例えば、非特許文献１では、早期乳がんの予後予測をＨＥＲ２の発現量に基づいて行うことが開示されている。ＨＥＲ２はチロシンキナーゼ活性を有する増殖因子受容体の一種であり、ＨＥＲ２高発現の悪性腫瘍は再発の危険性が高く、ＨＥＲ２低発現の悪性腫瘍は再発の危険性が低いと考えられている。しかしながら、ＨＥＲ２低発現の悪性腫瘍であっても再発する場合などがあり、ＨＥＲ２の発現量に基づく悪性腫瘍の予後予測の精度は決して高いとはいえない。

Joensuu H., et al., Clinical Cancer Research, vol.9, 2003, 923-930.

本発明の目的は、悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞で発現している分子の分析結果に基づいて悪性腫瘍の再発リスクを精度良く判定することのできる方法を提供することである。

本発明は、悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ１の比活性（ＣＤＫ１比活性）と、サイクリン依存性キナーゼ２の比活性（ＣＤＫ２比活性）との比（比活性の比）から得られるパラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、前記腫瘍細胞のＨＥＲ２の発現量を、第二の閾値と比較する第二比較工程と、第一比較結果及び第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の再発リスクを判定する工程と、を含み、前記判定工程において、前記パラメータが前記第一の閾値未満であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値未満である場合に、前記再発リスクが低いと判定し、前記パラメータが前記第一の閾値未満であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値以上である場合、または前記パラメータが前記第一の閾値以上であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値未満である場合に、前記再発リスクが中程度であると判定し、前記パラメータが前記第一の閾値以上であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値以上である場合に、前記再発リスクが高いと判定する、悪性腫瘍の再発リスクの判定方法を提供する。

本発明によると、悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞で発現しているＣＤＫ１、ＣＤＫ２およびＨＥＲ２の分析結果に基づいて、悪性腫瘍の再発リスクを精度良く判定することのできる方法が提供される。

本実施形態の判定方法は、悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞の第一のサイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二のサイクリン依存性キナーゼ（第二ＣＤＫ）の活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、腫瘍細胞の増殖因子受容体の発現量から得られる第四パラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、第一比較工程の結果及び第二比較工程の結果に基づいて悪性腫瘍の性質を判定する工程と、を含む悪性腫瘍の性質の判定方法である。

上記判定方法が適用される悪性腫瘍は、造血器由来の悪性腫瘍、上皮細胞由来の癌腫、肉腫などである。造血器由来の悪性腫瘍としては、白血病や悪性リンパ腫などを例示することができる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がんなどを例示することができる。肉腫としては、骨肉腫や軟部肉腫などを例示することができる。

判定に用いられる腫瘍細胞は、ステージ分類において「ステージＩＩＢ」の悪性腫瘍の細胞であることが好ましい。
ステージ分類とは悪性腫瘍の悪性度を示す分類であり、悪性度の低い順にステージＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶに分類される。このステージ分類は、ＴＮＭ分類に基づいている。ＴＮＭ分類とは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）による悪性腫瘍の病期分類である。「Ｔ」は原発腫瘍の規模を示し、Ｔ０（原発巣が確認できない）〜Ｔ４（腫瘤が体外へ露出）に分けられる。「Ｎ」は近傍リンパ節への浸潤度合いを示し、Ｎ０（リンパ節転移なし）〜Ｎ３（体の正中に近いところにあるリンパ節（胸骨傍リンパ節）に転移が疑われる）に分けられる。「Ｍ」は遠隔転移の有無を示し、Ｍ０（遠隔転移なし）及びＭ１（遠隔転移あり）に分けられる。
ステージＩＩＢの悪性腫瘍とは、ＴＮＭ分類において「Ｔ２，Ｎ１，Ｍ０」又は「Ｔ３，Ｎ０，Ｍ０」である悪性腫瘍を指す。

上記判定方法で判定される悪性腫瘍の性質としては、腫瘍細胞の増殖能、再発リスク（再発のしやすさ）などが挙げられる。この判定方法は特に再発リスクの判定を行なうために用いることが好ましい。再発とは、生体から腫瘍を摘出して一定期間経過した後、同じ部位に悪性腫瘍が再現する場合及び腫瘍細胞が原発巣から分離して遠隔組織へ運ばれそこで自立的に増殖する場合をいう。再発が起こるか否かは腫瘍細胞の増殖能、生存能、移動能などに左右される。

第一比較工程では、第一ＣＤＫの第一パラメータと第二ＣＤＫの第二パラメータから得られる第三パラメータを求め、これを閾値（以下、第一の閾値とする）と比較する。
ＣＤＫとは、サイクリンというタンパク質が結合することによって活性化される酵素の総称で、その種類に応じて細胞周期の特定時期で機能している。ＣＤＫの種類としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７などが挙げられる。本実施形態では少なくとも二種類のＣＤＫ（第一ＣＤＫ及び第二ＣＤＫ）が用いられ、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の組み合わせを用いることが好ましい。即ち、第一ＣＤＫがＣＤＫ１であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ２であるか、第一ＣＤＫがＣＤＫ２であり、第二ＣＤＫがＣＤＫ１であることが好ましい。

第一パラメータは第一ＣＤＫの活性値及び発現量から得られるパラメータであり、第二パラメータは第二ＣＤＫの活性値及び発現量から得られるパラメータである。これらのパラメータとして、活性値及び発現量の何れかを単独で用いてもよいし、活性値と発現量とを加減乗除などして計算される値を用いてもよいが、活性値と発現量との比を用いることが好ましい。活性値と発現量との比としては、活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）、発現量を活性値で除することにより得られる値（発現量／活性値＝比活性の逆数）などを用いることができる。

第三パラメータは第一パラメータと第二パラメータに基づいて得られるパラメータである。第三パラメータとしては、第一パラメータと第二パラメータとを加減乗除などして計算される値を用いることができるが、第一パラメータと第二パラメータとの比を用いることが好ましい。第一パラメータと第二パラメータの比としては、第一パラメータを第二パラメータで除することにより得られる値、第二パラメータを第一パラメータで除することにより得られる値などを用いることができる。

第一の閾値は、腫瘍細胞のどのような性質を判定するかによって適宜設定される。例えば、腫瘍細胞の再発リスクを判定する場合、複数の患者から採取された乳がん細胞のうち摘出手術後５年間の再発の有無が既知の細胞について、第三パラメータを算出し、算出された値を小さい順に並べて、患者集団を一定比率で高値群と低値群とに分離できる値を第一の閾値とすることができる。分離比率としては、例えば、乳がんの場合、摘出手術後５年間の再発率が約３０％であるため、高値群の分離比率が少なくとも患者集団の３０％であることが好ましいが、低値群に分類された患者が再発を起こすということのないようにするため、高値群を３０％よりも高い割合とすることがより好ましい。即ち、第一の閾値として、患者集団を、高値群：低値群が３０：７０となる値、好ましくは４０：６０となる値、より好ましくは５０：５０となる値（中央値）や６０：４０となる値を用いることができる。なお、正確に患者集団を５０：５０や６０：４０に分離できる値が存在しないことも考えられるため、分離比率は厳密に設定する必要はない。例えば、患者集団を構成する患者数が９９である場合は患者集団を５０：５０に分離できる値が存在しない。このような場合は分離比率を５０：４９などに設定してもよい。

腫瘍細胞によっては、第一パラメータ、第二パラメータ又はこれら両方の値が非常に小さい場合や、逆に、非常に大きい場合があり、第三パラメータが第一の閾値とはかけ離れた値となることがある。このような場合、第一の閾値だけでなく、第一パラメータ及び第二パラメータのそれぞれに対しても閾値を設定することが好ましい。具体的には、第一比較工程において、第一パラメータとこれに対応する閾値との比較、第二パラメータとこれに対応する閾値との比較、及び第三パラメータと第一の閾値との比較を実行することが好ましい。

第二比較工程では、増殖因子受容体の発現量から得られる第四パラメータを、このパラメータに対応する閾値（以下、第二の閾値とする）と比較する。
増殖因子受容体は、増殖因子をリガンドとする受容体であり、細胞の増殖や分化の制御において重要な役割を果たしている。本実施形態では、増殖因子受容体としてＨＥＲ(Human Epidermal growth factor Receptor)ファミリーに属するタンパク質を用いることが好ましい。ＨＥＲファミリーに属するタンパク質は、現在のところＨＥＲ１、ＨＥＲ２，ＨＥＲ３及びＨＥＲ４が知られており、これらのうちＨＥＲ２を用いることが特に好ましい。

第四パラメータは、発現量から得られるパラメータである。第四パラメータとして、発現量を単独で用いてもよいし、発現量と活性値とを加減乗除などして計算される値を用いてもよいが、発現量を用いることが好ましい。

第二の閾値は、腫瘍細胞のどのような性質を判定するかによって適宜設定される。例えば、腫瘍細胞の再発リスクを判定する場合、一定期間経過後の再発の有無が既知である腫瘍細胞について、上記の第一比較工程の結果と組み合わせて再発リスクを判定する際に再発の有無と高確率で合致する第二の閾値を設定することができる。

活性値や発現量の測定に供される測定用試料は、患者から採取した腫瘍細胞を用いて調製される。ＣＤＫ及び増殖因子受容体の活性値や発現量が測定できれば、その調製方法は特に限定されない。測定用試料としては、細胞可溶化液を用いることができる。細胞可溶化液とは、患者から採取した腫瘍細胞に緩衝液を添加し、緩衝液中で腫瘍細胞を物理的及び／又は化学的に破砕することにより得られる試料のことである。ＣＤＫの活性値又は発現量を測定する場合、細胞可溶化液を遠心分離して得られる上清を測定用試料として用いることが好ましい。また、増殖因子受容体としてＨＥＲファミリーに属するタンパク質を用いる場合、細胞可溶化液を遠心分離して得られる沈殿物を測定用試料として用いることが好ましい。ここで用いられる緩衝液には、界面活性剤やプロテアーゼ阻害剤などを適宜含有させてもよい。

ＣＤＫや増殖因子受容体の活性値の測定方法は特に限定されず、従来公知の方法で測定することができる。例えば、^３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔^３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いる方法が挙げられる。この方法によると、測定用試料と、基質と、γ−〔^３２Ｐ〕−ＡＴＰとを混合し、キナーゼの作用によって基質に^３２Ｐを導入する。次に、^３２Ｐで標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、キャリブレータで作成された検量線をもとにリン酸化基質を定量する。定量されたリン酸化基質量に基づいてキナーゼの活性値を算出する。また、放射性物質を用いない方法として、特開２００２−３３５９９７号公報に開示の方法を用いることができる。この方法によると、先ずこれらキナーゼの何れか又は両方を含む試料と、基質と、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）とを混合し、キナーゼの作用によって基質にモノチオリン酸基を導入する。導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質を標識し、標識されたモノチオリン酸化基質の標識量を測定し、キャリブレータで作成された検量線を基にモノチオリン酸化基質を定量する。定量されたモノチオリン酸化基質量に基づいてキナーゼの活性値を算出する。測定は、抗ＣＤＫ抗体を含む試薬、ＣＤＫの基質を含む試薬、ＡＴＰ−γＳを含む試薬及びリン酸化された基質に結合可能な標識物質を含む試薬を備えた試薬キットを用いて行うことができる。なお、ＣＤＫの基質及びＡＴＰ−γＳは同一の容器に収容されていてもよい。

ＣＤＫや増殖因子受容体の発現量の測定方法は特に限定されず、従来公知の方法で測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、特開２００３−１３０８７１号公報に開示の方法などを用いることができる。

測定用試料は患者から採取した腫瘍細胞から調製されるため、測定用試料によって含まれる腫瘍細胞数が異なる。このため、増殖因子受容体などのタンパク質の発現量の測定値は測定用試料に含まれる腫瘍細胞の多寡によって変動してしまう。従って、発現量の測定値を補正することが好ましい。発現量の測定値の補正としては、例えば、ハウスキーピング遺伝子によってコードされるタンパク質（以下、ハウスキーピングタンパク質とする）の発現量を用いて行なうことができる。ハウスキーピングタンパク質はどの細胞でも常に一定量発現しているタンパク質であり、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）やアクチンなどを例示することができる。具体的には、測定用試料のタンパク質の発現量だけでなく、ハウスキーピングタンパク質の発現量も測定し、測定用試料のタンパク質の発現量をハウスキーピングタンパク質の発現量で除することにより発現量の測定値を補正することができる。なお、第一パラメータとして発現量又は活性値と発現量との比を用い、第二パラメータとして発現量又は活性値と発現量との比を用い、第三パラメータとして第一パラメータと第二パラメータとの比を用いる場合、第一ＣＤＫの発現量及び第二ＣＤＫの発現量が測定されるが、ハウスキーピングタンパク質の発現量は計算上相殺されるため上記のような補正は必要ない。

判定工程では、第一ＣＤＫの活性値及び発現量から得られる第一パラメータと、第二ＣＤＫの活性値及び発現量から得られる第二パラメータとに基づいて得られる第三パラメータを対応する第一の閾値と比較した結果と、増殖因子受容体の発現量から得られる第四パラメータを対応する第二の閾値と比較した結果とに基づいて悪性腫瘍の性質を判定する。例えば、悪性腫瘍の性質として再発リスクの判定を行う場合、これらの結果に基づいて、判定対象の悪性腫瘍を再発リスクの程度の異なる三群（例えば、高、中及び低）の何れかに分類することができる。判定の具体的な方法としては、例えば、下記に示す第一の判定方法〜第五の判定方法の何れかを用い、再発リスクを判定することができる。

第一の判定方法では、第三パラメータを第一の閾値と比較した結果と、第四パラメータを第二の閾値と比較した結果とを組み合わせて再発リスクを判定する。これらの比較結果の両方で閾値未満の場合には再発リスクが低いと考えられ、「Ａ１」と判定する。これらの比較結果の何れか一方が閾値以上、他方が閾値未満の場合には、「Ａ１」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｂ１」と判定する。これらの比較結果の両方が閾値以上の場合には、「Ｂ１」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｃ１」と判定する。

第二の判定方法は、図１に示すフローチャートに基づいた判定方法である。第二の判定方法では、第三パラメータを第一の閾値と比較し（ステップ１）、第三パラメータが閾値以上の場合には「Ｃ２」と判定する。第三パラメータが閾値未満の場合には、第四パラメータを第二の閾値と比較し（ステップ２）、第四パラメータが閾値以上の場合には、「Ｃ２」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ｂ２」と判定する。第四パラメータが閾値未満の場合には、「Ｂ２」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ａ２」と判定する。この判定方法は、ＣＤＫを用いた比較を重視した方法である。

第三の判定方法は、図２に示すフローチャートに基づいた判定方法である。第三の判定方法では、第四パラメータを第二の閾値と比較し（ステップ１）、第四パラメータが閾値以上の場合には、「Ｃ３」と判定する。第四パラメータが閾値未満の場合には、第三パラメータを第一の閾値と比較し（ステップ２）、第三パラメータが閾値以上の場合には、「Ｃ３」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ｂ３」と判定する。第三パラメータが閾値未満の場合には、「Ｂ３」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが低い「Ａ３」と判定する。この判定方法は、増殖因子を用いた比較を重視した方法である。

第四の判定方法では、第三パラメータを第一の閾値と比較し、第三パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ４」と判定する。第三パラメータが閾値以上の場合には、第四パラメータを第二の閾値と比較し、第四パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ４」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｂ４」と判定する。第四パラメータが閾値以上の場合には、「Ｂ４」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｃ４」と判定する。

第五の判定方法では、第四パラメータを第二の閾値と比較し、第四パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ５」と判定する。第四パラメータが閾値以上の場合には、第三パラメータを第一の閾値と比較し、第三パラメータが閾値未満の場合には、「Ａ５」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｂ５」と判定する。第三パラメータが閾値以上の場合には、「Ｂ５」と判定された腫瘍細胞よりも再発リスクが高い「Ｃ５」と判定する。

以上、第一の判定方法〜第五の判定方法の何れを用いるかは、悪性腫瘍の種類、パラメータの種類、臨床データとの相関などを考慮して決定することができる。悪性腫瘍の再発リスクを判定する場合、第一の判定方法〜第三の判定方法の何れかを用いることが好ましい。

ＣＤＫは細胞の増殖に深く関わるため、ＣＤＫを用いて比較工程を実行することにより、腫瘍細胞の増殖能を精度良く捉えることができる。前述のように細胞の増殖能は細胞の再発リスクを左右する一つの大きな要素である。
増殖因子受容体は主に細胞の増殖シグナル経路の活性化に関わるため、増殖因子受容体を用いて比較工程を実行することにより、腫瘍細胞の再発の可能性を予測することができる。しかしながら、増殖シグナル経路は、増殖シグナルを伝達する途中で複雑な調節を受けるため、再発の可能性を精度良く予測することができない。
本実施形態の判定方法を用いると、これらの比較工程の結果を組み合わせることにより精度良く再発リスクを予測することができる。

上記のような悪性腫瘍の性質の判定結果は、治療方法を選択する際の指標となり得る。例えば、悪性腫瘍を患う患者に対して抗がん剤療法などのアグレッシブな治療を行なうか、ホルモン療法などのマイルドな治療を行なうかなどを決定する一助となる。また判定結果によって抗がん剤の投与量や種類を調節することも可能である。

上記本実施形態の方法は、コンピュータにおいて実行されることが好ましい。以下、上記の方法を実施するためのコンピュータシステム（図３）及び判定フロー（図４）について説明する。

図３に示すシステム１００は、コンピュータ本体１１０、必要データをコンピュータ本体１１０に入力する入力デバイス１３０、及び入出力データ等を表示するディスプレイ１２０を備え、さらに必要に応じて外部記録媒体１４０が含まれ得る。ここで、本実施形態のプログラム１４０ａは、外部記録媒体１４０に記録されていてもよいし、コンピュータ本体１１０に備え付けのメモリ１１０ｂ〜１１０ｄに保存されていてもよい。コンピュータ本体１１０内において、ＣＰＵ１１０ａ、メモリ１１０ｂ〜１１０ｄ、入出力インターフェイス１１０ｆ、画像出力インターフェイス１１０ｈ、読出装置１１０ｅは、それぞれバス１１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。

図４は、上記第一の判定方法による再発リスク判定を実行するためのプログラムの動作を示すフローチャートであり、このプログラムはメモリ１１０ｄに格納されている。
まず、入力デバイス１３０により検体のＣＤＫ２比活性とＣＤＫ１比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性：第三パラメータ）及びＨＥＲ２発現量（第四パラメータ）が入力されると、ＣＰＵ１１０aが入出力インターフェイス１１０ｆを介してこれらのパラメータデータを取得し、ＲＡＭ１１０ｃに記憶させる（ステップＳ１１）。

ＣＰＵ１１０aは、予めプログラムのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶されていた第三パラメータに対応する閾値、および第四パラメータに対応する閾値を呼び出して、これらの閾値とパラメータデータとの比較を実行する（ステップＳ１２）。

次に、ＣＰＵ１１０aは、比較結果に基づいて再発リスクの予測判定を行う（ステップＳ１３）。ＣＰＵ１１０aは、第三パラメータが閾値以上であり、且つ第四パラメータが閾値以上である場合には、再発リスク「高」と判定する。第三パラメータが閾値以上であり、且つ第四パラメータが閾値未満である場合には、再発リスク「中」と判定する。第三パラメータが閾値未満であり、且つ第四パラメータが閾値以上である場合には、再発リスク「中」と判定する。第三パラメータが閾値未満であり、且つ第四パラメータが閾値未満である場合には、再発リスク「低」と判定する。

そして、ＣＰＵ１１０aは、上記の判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介してディスプレイ１２０に出力する（ステップＳ１４）。

なお、本実施形態においては、各種パラメータデータや活性値、発現量などを、入力デバイス１３０を用いて入力したが、これに限定されるものではなく、例えば、操作者による入力ではなく、各種パラメータデータや活性値、発現量などが測定装置から入出力インターフェイス１１０ｆを介して自動的に取得されるようにしてもよい。また、第三パラメータとして、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を入力したが、ＣＤＫ１の発現量と活性値およびＣＤＫ２の発現量と活性値を入力し、ＣＰＵ１１０ａがこれらの値からＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の値を算出して、この値を閾値との比較に用いてもよい。

（実施例１）
（１）測定用試料の調製
ステージＩＩＢの乳がん患者１２名（患者i〜xii）から摘出した腫瘍細胞塊１２検体（１３〜９２ｍｇ）から下記のようにして測定用試料i〜xiiを調製した。
先ず、緩衝液中の腫瘍細胞塊が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む）と腫瘍細胞塊とをチューブに収容した。
電動ホモジナイザを用いて、緩衝液Ａ中で腫瘍細胞塊をホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、沈殿物をＨＥＲ２測定用試料とし、上清をＣＤＫ測定用試料として用いた。

（２）ＨＥＲ２及びＧＡＰＤＨ発現量の測定
ＨＥＲ２測定用試料に緩衝液Ｂ（１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）を含む）を添加して１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行なった。遠心分離後、上清を採取し、ここに上清の１／３量のＳＤＳローディングバッファ（２００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ６．８）、４０％のグリセロール、８％のＳＤＳ及び１０％の２−メルカプトエタノールを含む）を加え、１００℃で５分間加熱した。
加熱後のＨＥＲ２測定用試料１０μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルを室温で１５分間トランスファーバッファー（１９２ｍＭのグリシン、２５ｍＭのトリス及び２０％のメタノールを含む）に浸漬して平衡化した。
ゲル中のタンパク質を、Mini Trans-Blot cell transfer system（バイオラッド社）を用いて１００Ｖ、４℃、一時間でImmobilon FL membrane（ミリポア社）に転写した。
メンブレンを、ブロッキング試薬Ａ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で３７℃、１時間ブロッキングを行い、さらに洗浄液Ａ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で洗浄した。
洗浄後、メンブレンに、ウサギ抗ＨＥＲ２抗体（一次抗体：アップステイト社）溶液５ｍｌをブロットし、メンブレンのＨＥＲ２と一次抗体とを反応させた。
メンブレンを２０ｍｌの洗浄液Ａで洗浄した後、メンブレンに、ビオチン標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｂ（二次抗体：サンタクルズ社）溶液５ｍｌをブロットし、メンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた。
メンブレンを２０ｍｌの洗浄液Ａで洗浄した後、メンブレンに、蛍光色素であるAlexa fluor 488 conjugated streptabidin（モレキュラープローブ社）の溶液５ｍｌをブロットして、メンブレンの二次抗体と蛍光色素とを反応させた。
メンブレンを２０ｍｌの洗浄液Ａで洗浄した後、メンブレンに吸着されたＨＥＲ２の量を蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）によって分析、測定した。

ＧＡＰＤＨ発現量の測定は、測定用試料として細胞可溶化液の上清を用い、一次抗体としてウサギ抗ＨＥＲ２抗体ではなくウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いること以外は上述のＨＥＲ２の発現量測定と同様の実験手順で行なった。

ＧＡＰＤＨの発現量は、ＨＥＲ２の発現量の測定値を補正するために用いられた。以下でＨＥＲ２の発現量とされる値は、ＧＡＰＤＨの発現量による補正後の値（ＨＥＲ２発現量／ＧＡＰＤＨ発現量の値）である。

ＨＥＲ２発現量の測定結果は、下記表１及び図５のグラフに示される。

（３）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、ＣＤＫ測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンにＣＤＫ測定用試料中のタンパク質を吸着させた。
ウェルに洗浄液Ｂ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにビオチン化した抗ウサギＣＤＫ１抗体（二次抗体：サンタクルズ社）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。
ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で約３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノール約５分間濯ぎ、約２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）によって分析、測定した。測定値は検量線をもとに算出した。

検量線は、０．００５％のノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表すことにより検量線を作成した。

ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行なった。

（４）ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらにＣＤＫ測定用試料を添加した。ＣＤＫ測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。
ここに抗ＣＤＫ１抗体（サンタクルズ社）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社）を加えて４℃、１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。
反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０及び５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．０）を含む）で三回洗浄し、１５μｌの溶解緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー社）１０μｇ、５ｍＭのＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間震蕩してキナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。
この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．２）及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを添加して９０分間、室温、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基を導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。
ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールの添加により行なった。
ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で一時間反応させた。
反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで三回洗浄した。
洗浄後、蛍光イメージアナライザMolecular Imager FX（バイオラッド社）を用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行なった。活性値は、検量線に基づいて算出された。

検量線は、二種類の濃度のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）を含む溶液をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザで測定することによって作成した。従って、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、前記タンパク質１ｎｇのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。

ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ２抗体（サンタクルズ社）を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。

（５）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性値及びＣＤＫ発現量から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性の測定結果は、下記表１及び図６のグラフに示される。

（６）閾値の設定及び再発リスク判定
ＣＤＫ１比活性とＣＤＫ２比活性との比（ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性；以下、比活性の比とする）に対応する閾値を設定し、この閾値と比活性の比とを比較した結果と、ＨＥＲ２発現量を対応する閾値を設定し、この閾値とＨＥＲ２発現量とを比較した結果とを組み合わせて悪性腫瘍の性質の判定を行なった。

比活性の比の閾値は、４６に設定した。この値は、乳がん患者１２９名から採取した腫瘍細胞１２９検体の比活性の比を算出し、比活性の比の値を小さい方から順に並べた際に、１２９検体を６５：６４に分離できる値である。比活性の比の値が４６以上の場合に「Ｈｉｇｈ」とし、４６未満の場合に「Ｌｏｗ」とした。また、ＣＤＫ１比活性が２０未満且つＣＤＫ２比活性が５００未満の場合は比活性の比の値に関わらず「Ｌｏｗ」とした。さらに、ＣＤＫ２比活性が１００００以上の場合は比活性の比の値に関わらず「Ｈｉｇｈ」とした。

ＨＥＲ２発現量の閾値は、０．７に設定した。この値は、患者i〜xiiの再発の有無と、比活性の比と対応する閾値との比較結果を考慮に入れて設定された値である。ＨＥＲ２発現量が０．７以上の場合は「Ｈｉｇｈ」とし、０．７未満の場合は「Ｌｏｗ」とした。

これらの比較結果を用い、下記判定条件に基づいて再発リスク判定を行なった。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であり、ＨＥＲ２発現量と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であった場合は、「再発リスク低」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であり、ＨＥＲ２発現量と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であった場合は、「再発リスク中」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｌｏｗ」であり、ＨＥＲ２発現量と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であった場合は、「再発リスク中」と判定した。
比活性の比と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であり、ＨＥＲ２発現量と閾値との比較結果が「Ｈｉｇｈ」であった場合は、「再発リスク高」と判定した。

再発リスク判定において、「再発リスク低」と判定された腫瘍細胞は、細胞の増殖能が低く、生存能や移動能なども低いと考えられるため、再発の可能性は低いと解される。「再発リスク中」と判定された腫瘍細胞は、「再発リスク低」と判定された腫瘍細胞よりも再発のリスクが高いと解される。「再発リスク高」と判定された腫瘍細胞は、「再発リスク中」と判定された腫瘍細胞よりも再発のリスクが高いと解される。

患者i〜xiiについて、再発の有無（表中、−は「再発無し」を示し、＋は「再発有り」を示す）、上記各分子の測定結果、閾値との比較結果及び再発リスク判定結果を下記表１にまとめて示した。なお、「再発の有無」は、患者i〜xiiから腫瘍細胞塊を摘出した後、各患者を追跡調査し、摘出手術後５年間で再発が認められたか否かを示したものである。

再発リスク低と判定された患者ii及びxは両者とも術後５年間では再発を起こさなかった（再発率０％）。再発リスク中と判定された患者i，iii，iv，v，vi，viii，ix及びxiの八名のうち術後５年間で再発を起こしたのは二名であった（再発率２５％）。再発リスク高と判定された患者vii及びxiiは両者とも、術後５年間で再発を起こした（再発率１００％）。

以上より、ＣＤＫ比活性の比と閾値との比較結果と、ＨＥＲ２発現量と閾値との比較結果とを組み合わせることにより再発リスクの程度の異なる三群に分類することができ、再発を起こすか否かを予測できる。また、この予測結果を、悪性腫瘍患者の治療方針を決定する際の指標とすることができる。

第二の判定方法を示すフローチャートである。第三の判定方法を示すフローチャートである。本実施形態の方法を実施するためのコンピュータシステムの概略図である。第一の判定方法に基づいた判定フローである。患者i〜xiiのＨＥＲ２発現量を示すグラフである。患者i〜xiiのＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性を示すグラフである。

Claims

悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ１の比活性（ＣＤＫ１比活性）と、サイクリン依存性キナーゼ２の比活性（ＣＤＫ２比活性）との比（比活性の比）から得られるパラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、
前記腫瘍細胞のＨＥＲ２の発現量を、第二の閾値と比較する第二比較工程と、
第一比較結果及び第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の再発リスクを判定する工程と、
を含み、
前記判定工程において、
前記パラメータが前記第一の閾値未満であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値未満である場合に、前記再発リスクが低いと判定し、
前記パラメータが前記第一の閾値未満であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値以上である場合、または前記パラメータが前記第一の閾値以上であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値未満である場合に、前記再発リスクが中程度であると判定し、
前記パラメータが前記第一の閾値以上であり、且つ前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値以上である場合に、前記再発リスクが高いと判定する、
悪性腫瘍の再発リスクの判定方法。
前記悪性腫瘍が、ステージ分類においてステージＩＩＢの悪性腫瘍である請求項１記載の判定方法。
前記悪性腫瘍が乳癌である請求項１または２記載の判定方法。
悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ１の比活性（ＣＤＫ１比活性）と、サイクリン依存性キナーゼ２の比活性（ＣＤＫ２比活性）との比（比活性の比）から得られるパラメータを、第一の閾値と比較する第一比較工程と、
第一比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍の再発リスクを判定する第一判定工程と、
前記第一判定工程で判定が確定されなかった悪性腫瘍について、前記腫瘍細胞のＨＥＲ２の発現量を、第二の閾値と比較する第二比較工程と、第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の再発リスクを判定する第二判定工程と、
を含み、
前記第一判定工程において、前記パラメータが前記第一の閾値以上である場合に、前記悪性腫瘍の再発リスクが高いと判定し、
前記第一判定工程で前記パラメータが前記第一の閾値未満である場合に、前記第二比較工程および前記第二判定工程を実行し、
前記第二判定工程において、前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値以上である場合に、前記悪性腫瘍の再発リスクが中程度であると判定し、前記ＨＥＲ２発現量が前記第二の閾値未満である場合に、前記悪性腫瘍の再発リスクが低いと判定する、
悪性腫瘍の再発リスクの判定方法。
悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞のＨＥＲ２の発現量を、第一の閾値と比較する第一比較工程と、
第一比較結果に基づいて、前記悪性腫瘍の再発リスクを判定する第一判定工程と、
前記第一判定工程で判定が確定されなかった悪性腫瘍について、前記腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼ１の比活性（ＣＤＫ１比活性）と、サイクリン依存性キナーゼ２の比活性（ＣＤＫ２比活性）の比（比活性の比）から得られるパラメータを、第二の閾値と比較する第二比較工程と、
第二比較結果に基づいて前記悪性腫瘍の再発リスクを判定する第二判定工程と、
を含み、
前記第一判定工程において、前記ＨＥＲ２発現量が前記第一の閾値以上である場合に、前記悪性腫瘍の再発リスクが高いと判定し、
前記第一判定工程で前記ＨＥＲ２発現量が前記第一の閾値未満である場合に、前記第二比較工程および前記第二判定工程を実行し、
前記第二判定工程において、前記パラメータが前記第二の閾値以上である場合に、前記悪性腫瘍の再発リスクが中程度であると判定し、前記パラメータが前記第二の閾値未満である場合に、前記悪性腫瘍の再発リスクが低いと判定する、
悪性腫瘍の再発リスクの判定方法。
入力デバイスおよびCPUを有するコンピュータを、請求項１〜５の何れか１項に記載の判定方法を実行する装置として機能させるためのコンピュータプログラムであって、
前記入力デバイスにより入力された、前記CDK1の活性値、前記CDK1の発現量、前記CDK２の活性値、前記CDK２の発現量およびHER2発現量のデータに基づき、前記CPUに前記悪性腫瘍の再発リスクの判定を実行させる、
コンピュータプログラム。
請求項６記載のコンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。