ES2354616T3

ES2354616T3 - Método para evaluar la malignidad de una célula de mamífero cancerosa.

Info

Publication number: ES2354616T3
Application number: ES05743830T
Authority: ES
Inventors: Hideki Ishihara; Tomoko Matsushima; Yuko Kawasaki
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2025-05-30
Also published as: CN1957088A

Abstract

Un método para evaluar una probabilidad de metástasis, probabilidad de recaída o para estimar el pronóstico de una célula de mamífero que comprende: evaluar la probabilidad de metástasis, la probabilidad de recaída o estimar el pronóstico de una célula de mamífero basándose en una información que contiene una proporción de A1 frente a A2, en la que A1 es una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de proteína de quinasa 1 dependiente de ciclina (CDK1) contenido en la célula y A2 es una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de proteína de quinasa 2 dependiente de ciclina (CDK2) contenido en la célula.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a un método como se define en las reivindicaciones 1-9.

TÉCNICA ANTERIOR 5

Como ejemplos de diagnósticos para el cáncer, actualmente realizados en entornos clínicos, se conoce un diagnóstico serológico para identificar un marcador tumoral en suero sanguíneo, un diagnóstico tisular por biopsia y una citodiagnosis.

El marcador tumoral es una sustancia tal como una proteína, una glicoproteína o un lípido, que es un producto en una célula tumoral como un resultado de la expresión de un gen que ya no se expresa 10 en un proceso de generación o crecimiento de un organismo individual. El diagnóstico serológico es una evaluación en una fase de la enfermedad, o grado de malignidad de un tumor por detección del marcador tumoral. Sin embargo, la mayoría de los marcadores tumorales actualmente disponibles no tienen elevada especificidad en el cáncer. Además, dado que el nivel de expresión del marcador tumoral es muy bajo en un cáncer de fase temprana, la precisión del diagnóstico es relativamente baja. Debido a las razones 15 anteriores, en los actuales institutos médicos, la fiabilidad en el diagnóstico del cáncer, usando el marcador tumoral, no es muy alta.

El diagnóstico tisular y el citodiagnóstico son métodos de diagnóstico, en los que después de la tinción del tejido o de las muestras celulares obtenidas por biopsia, los patólogos y los citólogos realizan una evaluación sobre las muestras teñidas basándose en los estados o patrones teñidos de las muestras 20 mediante observación microscópica, basándose en sus propios conocimientos médicos o clínicos. Los métodos de tinción son diferentes entre los institutos médicos. Además, la evaluación final depende de los conocimientos médicos o clínicos de los patólogos o citólogos. Por consiguiente, es difícil realizar un diagnóstico definitivo en una fase delicada tal como una fase moderadamente diferenciada o fase 1. En un caso menos favorable, la selección sobre el tratamiento de medicación puede ser errónea, 25 conduciendo por lo tanto a una progresión grave de un cáncer.

Considerando lo anterior, se ha establecido la clasificación TNM, como un criterio para normalizar los métodos de diagnóstico, y se ha difundido globalmente. La clasificación TNM para un cáncer es un criterio adoptado por la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC), y muestra niveles progresivos de tumores malignos. “T” representa el tamaño de un tumor primario, “N” representa el nivel 30 de una metástasis en los nódulos linfáticos y “M” representa una metástasis a distancia. “T” se clasifica desde el nivel “1” que indica que el tumor se localiza dentro del tejido, al nivel “4” que indica que aparece tumorigénesis en un lugar distinto al tejido afectado. “N” se clasifica desde el nivel “0” que indica que no se observa metástasis de los nódulos linfáticos locales, al nivel “3” que indica que histopatológicamente se observa metástasis de los nódulos linfáticos. “M” se clasifica desde el nivel “0” que indica que no se 35 observa metástasis a distancia, al nivel “1” en el que se observa metástasis a distancia. En cualquiera de los parámetros “T”, “N”, y “M”, a mayor valor numérico peor pronóstico, lo que significa que el grado de malignidad del cáncer es elevado.

La clasificación TMN (sic, TNM) se usa generalmente porque es útil para la determinación de un método de tratamiento o evaluación de pronóstico. Sin embargo, incluso si en los pacientes, el 40 diagnóstico se realiza en una fase temprana de un cáncer, de acuerdo con la clasificación TNM, en el caso de un cáncer de mama, la recaída por una metástasis a distancia se observa en aproximadamente del 10 al 20% de los pacientes 5 años después del diagnóstico, conduciendo a la muerte, lo cual es un asunto clínicamente importante. Aunque la evaluación basada en la clasificación TNM es útil para el personal médico, para llegar a comprender las afecciones clínicas de los pacientes en el momento del 45 diagnóstico, la evaluación no conduce exitosamente a una predicción exacta sobre un pronóstico.

Además del método diagnóstico anterior, se propone un método de diagnóstico del grado de malignidad de un cáncer midiendo el contenido de ADN de células cancerosas, usando una separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y basándose en el resultado de la medición, debido a que un tejido canceroso contiene una gran cantidad de poliploides tales como triploides y tetraploides. Sin 50 embargo, para medir la muestra de biopsia mediante las FACS es necesario dispersar una muestra obtenida por biopsia, en células individuales. Generalmente no es fácil dispersar una muestra de biopsia en células individuales y para hacer esto se requiere un alto nivel de destreza. Debido a las razones anteriores, se dice que no es fácil aplicar el método de diagnóstico del cáncer usando las FACS, en los

institutos médicos actuales.

En las circunstancias anteriores, existe una necesidad de establecer un método diagnóstico capaz de proporcionar un diagnóstico definitivo sin necesidad de realizar una preparación laboriosa de las muestras, concretamente, la dispersión en células individuales y con menor variación en el diagnóstico, dando como resultado evaluaciones individuales o métodos de evaluación diferentes en los institutos 5 médicos en entornos clínicos.

En los últimos años, se espera un diagnóstico molecular usando un aparato, como un método diagnóstico del cáncer normalizado con menor variación en la diagnosis por los diagnostas.

Uno de los diagnósticos moleculares es un método de evaluación del grado de malignidad del cáncer usando una microplaca de ADN, basándose en un resultado de comparación sobre la expresión 10 de un transcrito génico entre una muestra de biopsia y una muestra convencional. Sin embargo, la expresión del transcrito génico no tiene una elevada correlación con las proteínas producidas en un organismo vivo. Por consiguiente, se cree que la eficacia del método diagnóstico es menos fiable en los entornos clínicos.

El desarrollo y estudio han evolucionado respecto al diagnóstico molecular basado en una 15 proteína que se expresa en un organismo vivo. Por ejemplo, el documento D1 propone un método diagnóstico, en el que, de acuerdo con las necesidades, los niveles de expresión de CDK1 y CDK4 en una muestra y la mutación de p53, se usan como indicadores. El documento D2 propone un método diagnóstico de un cáncer y de estados precancerosos, usando la sobreexpresión de CDK4, CDK6 o del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (inhibidor CDK). 20

Se sabe que la expresión de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) es elevada en una célula en la que la proliferación se induce mediante un factor de crecimiento. Sin embargo, generalmente, en una célula existe una determinada cantidad de CDK, y la CDK muestra su actividad en una fase específica de un ciclo celular, dependiendo del tipo de CDK, por unión a moléculas de ciclina bajo la activación de fosforilación o una acción similar y formando un complejo de CDK y ciclina. Además, se 25 sabe que el inhibidor de CDK se une a CDK y/o a un complejo de ciclina y CDK, inhibiendo por lo tanto la actividad de CDK. Como se ha mencionado anteriormente, dado que el ciclo celular real se controla de manera complicada, la evaluación simplemente basada en el nivel de expresión de CDK, ciclina o inhibidor de CDK no proporciona un indicador suficiente para un estado controlado del ciclo celular.

El documento D3 describe un método de diagnóstico usando actividades de CDK como un 30 indicador para evaluar el grado de malignidad de un cáncer, considerando la unión a ciclina o la influencia de un inhibidor y un método para medir las actividades de CDK sin usar una sustancia radioactiva. Sin embargo, los datos sobre las actividades de CDK a medir por el método descrito no proporcionan suficiente precisión de diagnóstico como un sustituto de la diagnosis del cáncer actualmente realizada en los entornos clínicos. 35

Con frecuencia es necesario conocer la sensibilidad de las células tumorales in vitro frente a un agente anticanceroso, como un indicador sobre la eficacia de una quimioterapia usando el agente anticanceroso. Los ejemplos de los ensayos in vitro conocidos que miden la sensibilidad de las células tumorales frente a agentes, tales como un agente anticanceroso, son el método de ensayo MTT y el método DISC. El método de ensayo MTT es un método, que utiliza un fenómeno en el que el MTT (3-(4,5-40 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) puede degradarse por una reductasa (succinato deshidrogenasa) en las mitocondrias cuando el MTT está atrapado en una célula viva, pero el MTT no puede degradarse cuando está atrapado en una célula muerta. El método de ensayo MTT comprende cultivar una célula cancerosa durante 3 horas por adición del MTT y de un agente a medir, realizar la medición de la absorbancia lumínica, es decir, la actividad succinato deshidrogenasa y determinar 45 cuantitativamente el número de células vivas. Se ha publicado que el 80% de los resultados de evaluación de predicción por el método de evaluación in vitro, de acuerdo con la recaída o no recaída, por una quimioterapia real usando un agente anticanceroso y que el 68% de la predicción positiva, es decir, sensible al agente anticanceroso por el método de evaluación in vitro mostró no recaída por la quimioterapia real usando el agente anticanceroso (véase el documento D4). 50

El método DISC es un método que comprende poner en contacto una célula cancerosa con un agente anticanceroso durante 4 días, teñir las células muertas con un fast green, identificar las células vivas por tinción de las células vivas con hematoxilina-eosina para evaluar si la célula cancerosa está muerta o viva. Se ha indicado que existe una probabilidad, es decir una proporción coincidente entre los resultados in vitro y los resultados reales, del 82,7% y una probabilidad sobre la proporción de predicción 55

positiva es del 62,5% (véase el documento D4).

En cualquiera de los métodos anteriores, la proporción de predicción positiva es menor del 70%, lo cual es un indicador insuficiente para determinar si debe comenzar una quimioterapia usando un agente anticanceroso.

D1: publicación de patente JP Nº 2002-504683 5

D2: publicación de patente JP Nº 2002-519681

D3: publicación de patente JP Nº 2002-335997

D4: Weisenthal, L.M. y Nygren P (2002) Current status of cell culture drug resistance testing (CCDRT), http://weisenthal.org/oncol_t.htm

Kim et al., 1999 describieron un método para comparar tejidos carcinogénicos en comparación 10 con tejido normal adyacente evaluando la actividad específica de CDK1 (cdc2) y CDK2, y describieron que CDK1 tenía valor de pronóstico.

Ueno et al., resumen publicado en enero del 2004, describieron un método para predecir la sensibilidad a paclitaxel evaluando la actividad específica de CDK1.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 15

Considerando lo anterior, un objeto de la invención es proporcionar un método que permita evaluar la probabilidad de metástasis, la probabilidad de recaída y calcular el pronóstico, de una célula de mamífero, y un método de diagnóstico molecular de un cáncer usando el método de evaluación.

Otro objeto de invención es proporcionar un método de evaluación con una mayor precisión, en comparación con un ensayo de sensibilidad de quimioterapia convencional, usando un agente 20 farmacéutico que permita utilizar un resultado de evaluación sobre la sensibilidad de las células de mamífero, frente a un agente irritante tal como un agente anticanceroso, como un indicador para determinar si se va a empezar una quimioterapia tal como un tratamiento usando un agente anticanceroso.

Como resultado de una amplia investigación y estudio, en relación con una interacción entre la 25 actividad específica de la quinasa dependiente de ciclina y la evaluación patológica en tejidos, los inventores observaron que existía una elevada correlación entre la proporción de CDK entre las actividades específicas de CDK1 y CKD2 y la potencia de proliferación celular y la probabilidad de recaída y sensibilidad de las células de mamíferos frente a un agente irritante.

Un perfil concerniente con una quinasa dependiente de ciclina de la célula (en lo sucesivo en 30 este documento, denominado “perfil CDK” de la célula) incluye una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de CDK1 contenido en la célula y una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de CDK2 contenido en la célula.

La etapa de evaluación se realizó por comparación de una proporción de A1 frente a A2 con un valor de umbral correspondiente a la proporción, en la que A1 es una proporción del valor de actividad 35 frente al nivel de expresión de CDK1 contenido en la célula y A2 es una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de CDK2 contenido en la célula.

En la probabilidad de metástasis la metástasis puede incluir la metástasis de nódulos linfáticos y la metástasis a distancia.

Un método de diagnóstico del cáncer de la invención comprende el método de evaluación de una 40 célula de mamífero mencionado anteriormente.

En otro aspecto de la invención, un método para evaluar la sensibilidad de una célula de mamífero frente a un agente irritante comprende evaluar la sensibilidad de una célula de mamífero basándose en la proporción entre A1 y A2, en la que A1 es la proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de CDK1 contenido en la célula y en la que A2 es una proporción del valor de actividad 45 frente al nivel de expresión de CDK2 contenido en la célula.

En una realización preferible, el método de la invención para evaluar una sensibilidad comprende adicionalmente comparar A1 y/o A2 con un valor de umbral correspondiente a A1 y A2 respectivamente.

El agente irritante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un factor de crecimiento, un agente anticanceroso y un mutágeno.

Un “perfil concerniente a CDK” o “perfil CKD” , en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones de la solicitud, significa información que contiene una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión tal como una actividad específica de CDK1 y CDK2, concretamente una proporción de A1 5 frente A2, es decir, A1/A2 o A2/A1, en la que A1 es una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de una primera CDK y A2 es una proporción de la actividad frente al nivel de expresión de una segunda CDK.

La “actividad específica de CDK” o “actividad específica CDK”, como se usa en este documento, significa una actividad quinasa de cantidad predeterminada, que se calcula mediante la siguiente 10 ecuación

Actividad específica CDK = (valor de actividad de CDK) / (nivel de expresión de CDK)

En la ecuación anterior, el valor de actividad de CDK corresponde a una unidad basándose en una cantidad de sustrato fosforilado y es un valor como valor de actividad relativo calculado con valores de actividad de una célula convencional y una célula contenida en la muestra. El nivel de expresión de 15 CDK es una cantidad (una unidad del número de moléculas) de CDK contenida en la célula.

La “probabilidad de metástasis”, en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones de la solicitud, es un grado de probabilidad con el que una célula cancerosa puede desplazarse desde un tumor primario a un tejido distante, dando como resultado el desarrollo de metástasis. Se sabe que las células cancerosas con un elevado grado de probabilidad, es decir células con una elevada probabilidad de 20 metástasis, tienen características biológicas que se muestran por medio de la capacidad de infiltración o la capacidad de migración.

“Probabilidad de recaída” es una frecuencia de recaída en pacientes con cáncer que se clasifica de acuerdo con una clasificación determinada, por ejemplo, una clasificación basándose en fases. Por ejemplo, la fase III corresponde a una proporción de recaída del 50%, lo que indica una mayor 25 probabilidad de recaída que en la fase II que corresponde a una proporción de recaída del 20%.

“Estimación de pronóstico” es una frecuencia de muerte de pacientes con cáncer 5 ó 10 años después del diagnóstico, que se clasifica de acuerdo con una determinada clasificación, por ejemplo, una clasificación basada en fases. Por ejemplo, la fase III corresponde a una proporción de muerte del 50%, lo que indica más muertes que en la fase II que corresponde a una proporción de muerte del 20% e indica 30 que el pronóstico es malo.

EFECTO DE LA INVENCIÓN

El método para evaluar las propiedades de las células de mamíferos permite eliminar errores o variaciones de medición resultantes de los métodos de preparación de muestras para la medición debido a que, como indicador, se usa una actividad específica. Además, un perfil de actividad específica de CDK, 35 que se usa como un indicador de evaluación, utilizando actividades específicas de dos tipos de CDK, particularmente, una proporción de las actividades específicas de los dos tipos de CDK, tiene una elevada correlación con una propiedad de las células cancerosas tales como la aneuploidía o una proporción de células bajo un ciclo celular normal. El uso de los perfiles de CDK permite proporcionar un diagnóstico molecular con una elevada fiabilidad. Además, el método usa el indicador basándose en el ciclo celular. 40 Esto permite realizar una evaluación no solamente sobre las características y propiedades biológicas de las células sino también sobre las características clínicas tales como malignidad, así como sensibilidad o resistencia frente a agentes farmacéuticos tales como agentes anticancerosos o agentes irritantes externos. En particular, el método es ventajoso ya que proporciona un indicador para determinar si va a comenzar una quimioterapia usando un agente anticanceroso, porque el método de la invención 45 proporciona una elevada probabilidad sobre la predicción positiva o sensitiva frente al agente canceroso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un diagrama para explicar un ciclo celular.

Las FIGS. 2(a) a 2(h) son diagramas que muestran resultados de medición del contenido de ADN en diversas líneas celulares. 50

La FIG. 3 es un gráfico para explicar los resultados sobre los datos del contenido de ADN.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra las proporciones de células en la fase S con respecto a diversas líneas celulares.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra los resultados de medición sobre la actividad específica de CDK1 y la actividad específica de CDK2 en células con respecto a diversas líneas celulares.

La Fig. 6 es un diagrama que muestra un perfil de actividad específica de CDK de muestras de 5 tejidos de pacientes con cáncer de mama, que se evalúan que tienen un riesgo bajo.

La Fig. 7 es un diagrama que muestra un perfil de actividad específica de CDK de muestras de tejidos de pacientes con cáncer de mama, que se evalúan que tienen riesgo alto.

La FIG. 8 es un gráfico que muestra los resultados de medición sobre la actividad específica de CDK1 y la actividad específica de CDK2 en pacientes, de A a I, con cáncer de mama, en el que a 10 los pacientes, de A a I, se les administró docetaxel, como un agente anticanceroso, y después de la administración se examinó un cambio en el tamaño del tumor.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la actividad específica de CDK1 y la actividad específica de CDK2 en pacientes, de J a P, con cáncer de mama, en el que a los pacientes de J a P se les administró paclitaxel, como un agente anticanceroso, y después de la 15 administración se examinó un cambio en el tamaño del tumor.

MEJOR MODO PARA REALIZAR LA INVENCIÓN

Un método para evaluar una propiedad de una célula de mamífero comprende evaluar una propiedad de una célula de mamífero basándose en el perfil CDK que incluye una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de una primera CDK contenida en la célula y una proporción del 20 valor de actividad frente al nivel de expresión de una segunda CDK en la célula. La aplicación del método a un tejido que contiene una célula tumoral hace posible proporcionar propiedades de una célula tumoral y un diagnóstico de apoyo del grado de malignidad del cáncer.

El método de la presente invención se aplica a un mamífero tal como, pero sin limitación, un ser humano, particularmente un ser humano que necesita una evaluación de la afección clínica, más 25 particularmente un paciente que necesita una evaluación de la fase cancerosa.

Las células que evalúa la invención pueden incluir células que constituyen un tejido obtenido del cuerpo de un mamífero vivo. El tejido incluye tejido conjuntivo, tal como tejido conectivo fibroso, tejido cartilaginoso, tejido óseo, sangre y linfa; tejido epitelial; tejido muscular y tejido nervioso. Particularmente, la célula preferible es una célula que necesita obtener información clínica, tal como, una célula cancerosa 30 derivada de tejido con fallos en la regulación del crecimiento y que produce la interrupción del equilibrio en un individuo. Los ejemplos preferibles de la célula cancerosa incluyen una célula derivada de un tumor generado en órganos tales como mama, pulmón, hígado, estómago, colon, páncreas, piel, útero, testículos, glándula tiroidea, glándula paratiroidea, sistema linfático y médula ósea.

Estas células cancerosas pueden ser células obtenidas directamente del tejido diana del cuerpo 35 vivo; células obtenidas de la excreción del individuo, tal como orina y esputo o células subcultivadas. En el caso de obtener información con respecto al cáncer, se usan preferiblemente células obtenidas del tejido tumoral.

La propiedad de una célula de mamífero para evaluarse incluye la probabilidad de metástasis, la probabilidad de recaída, y la estimación de pronóstico. 40

La “recaída” incluye un caso en el que el mismo tipo de tumor a uno eliminado por cirugía de extirpación de una parte del órgano aparece de nuevo en la parte restante del órgano después de la cirugía y un caso de recaída de metástasis en el que una célula cancerosa migra desde un tumor primario a un tejido distante u órgano distante y prolifera autónomamente en el tejido u órgano distante. El caso en el que se observa recaída a los 5 años generalmente se considera como un caso de “alta probabilidad de 45 recaída”. La fase III que corresponde a una proporción de recaída del 50% indica una mayor recaída que la fase II que corresponde a una proporción de recaída del 20%. Pronóstico significa predicción del transcurso de la enfermedad y muerte debida a la enfermedad. Cuanto mayor es la frecuencia de muerte en 5 ó 10 años, peor es la estimación del cálculo. Por ejemplo, la fase III corresponde a una proporción de muerte del 50%, lo que indica un peor pronóstico que la etapa II correspondiente a una proporción de 50 muerte del 20%.

La quinasa dependiente de ciclina (CDK) es un término genérico para diversas enzimas que se activan por la unión a ciclina. La CDK actúa en una fase específica de un ciclo celular dependiendo de su tipo. El inhibidor de CDK es un término genérico para factores que pueden inhibir la actividad de CDK por la unión a un complejo de ciclina y CDK.

El ciclo celular se divide en cuatro fases: fase G1, fase S, fase G2 y fase M, como se muestra en 5 la FIG. 1. Referente a la FIG. 1, una célula comienza su proliferación y después experimenta diversos sucesos tales como replicación de ADN, distribución cromosómica, división nuclear y citocinesis y regresa al punto de partida como dos células hijas. La fase S es un periodo de replicación de ADN. La fase M es un periodo de mitosis. La fase G1 es un periodo después de terminar la mitosis y antes de comenzar la síntesis de ADN y es un periodo de control preliminar antes de que las células entren en la fase M. 10 Cuando la célula pasa un punto de control (punto R en el caso de una célula de mamífero) en la fase G1, el ciclo celular comienza, y normalmente el ciclo celular se completa sin detenerse en ningún punto en el ciclo. La fase G2 es un periodo después de la finalización de la síntesis del ADN y antes de comenzar la mitosis. Los puntos de control primarios en el ciclo celular son, el momento inmediatamente anterior de que la célula entre en la fase S después de pasar la fase G1 y el momento en el que la célula se dirige 15 hacia la mitosis después de pasar la fase G2. Particularmente, el punto de control en la fase G1 es importante ya que el punto de control causa el inicio de la fase S. Después de que la célula pase un determinado punto en la fase G1, el ciclo celular progresa de la fase S a la fase G2, fase M y después a la fase G1 sin detener la proliferación, incluso después de que haya desaparecido la señal de proliferación. Una célula en un periodo de reposo, es decir periodo G0, que está fuera del ciclo celular, lleva el 20 contenido de ADN en la fase G1 y se suspende su proliferación. La célula en la fase G0 puede regresar a la fase S en el ciclo celular por inducción de proliferación, después de permanecer durante un tiempo relativamente más largo en comparación con el periodo de la fase G1.

Se describe la quinasa dependiente de ciclina (CDK), que incluye el grupo que consiste en CDK1, CDK2, CDK4, CDK6, una quinasa dependiente de ciclina A, una quinasa dependiente de ciclina B, 25 y una quinasa dependiente de ciclina D. La quinasa dependiente de ciclina A representa una CDK que presenta actividad por unión a ciclina A. Actualmente, los ejemplos conocidos de quinasa dependiente de ciclina A, incluyen CDK1 y CDK2. La quinasa dependiente de ciclina B, representa una CDK que presenta actividad por unión a la ciclina B. Actualmente, los ejemplos conocidos de quinasa dependiente de ciclina B incluyen la CDK1. La quinasa dependiente de ciclina D representa una CDK que presenta actividad por 30 unión a la ciclina D. Actualmente, los ejemplos conocidos de la quinasa dependiente de ciclina B incluyen la CDK4 y la CDK6.

Cada una de estas CDK se une a una ciclina específica como se muestra en la Tabla 1 y forma el complejo ciclina-CDK (en lo sucesivo en este documento, frecuentemente denominada “CDK activada”) y actúa en una fase específica del ciclo celular como se muestra en la Tabla 1. Por ejemplo, la CDK1 se 35 une a ciclina A o a ciclina B y se convierte en una forma activada, la CDK2 se une a ciclina A o a ciclina y se convierte en una forma activada, cada una de CDK4 y CDK6 se une a ciclina D1, D2 o D3 y se convierten en una forma activada. Por otro lado, dicha activación de CDK puede inhibirse por el inhibidor de CDK como se muestra en la Tabla 1. Por ejemplo, p21 inhibe la activación de CDK1 y CDK2, p27 inhibe la activación de CDK2, CDK4 y CDK6, y p16 inhibe la activación de CDK4 y CDK6. 40

[Tabla 1]

CDK4: Ciclina a unirse Inhibidor de CDK a unirse Fase relacionada de CDK activada

CDK4 CDK6: Ciclina D1 Ciclina D2 Ciclina D3 p27, p16 G1

CDK2: Ciclina E p27 G1  progresión a S

CDK2: Ciclina A p21, p27 Activación de la fase S

CDK1: Ciclina A Ciclina B p21 G2  progresión a M

Quinasa dependiente de ciclina A: Ciclina A p21, p27 CDK1 : G2  M CDK2 : periodo central de la fase S

Quinasa dependiente de ciclina B: Ciclina B p21 CDK1 : G2  M

Quinasa dependiente de ciclina D: Ciclina D p27, p16 CDK4, 6 : G1

Actividad específica de CDK = (valor de la actividad de CDK) / (nivel de expresión de CDK)

El valor de la actividad de CDK representa el nivel de actividad quinasa que se mide como una cantidad del sustrato fosforilado mediante la unión a una ciclina específica, con un método convencional, para medir la actividad enzimática. El valor medido se expresa por U. Los ejemplos de la sustancia 5 incluyen histona 1(H1) sobre la que se activa una CDK1 o una CDK2, proteína del retinoblastoma sobre la que se activa una CDK4 o una CDK6. Específicamente, se propone un proceso que comprende las etapas de: preparar una muestra, que contiene una CDK activada, de un lisado celular como una muestra; marcar un sustrato con 32P por reacción con ATP marcado con 32P (-[32P]-ATP) sobre la CDK activada; medir la cantidad de ácido fosfórico en el sustrato marcado; y determinar cuantitativamente la cantidad de 10 sustrato marcado, basándose en una curva patrón previamente creada usando una muestra convencional. Además, la Publicación de Patente Japonesa, pendiente de examen, Nº: 2002-335997 describe un proceso sin usar, como marcador, una sustancia radioactiva. El proceso descrito comprende las etapas de: preparar una muestra que contiene la CDK de interés activada de un lisado celular como una muestra; hacer reaccionar el sustrato en la muestra con adenosina 5’-O-(3-triotrifosfato) (ATP-S); 15 introducir monotiofosfato en un resto de serina o treonina en el sustrato; marcar el sustrato uniendo una sustancia fluorescente o una enzima marcada a un átomo de azufre en el monotiofosfato introducido; medir la cantidad del sustrato tiofosforilado marcado (o la cantidad de sustancia fluorescente en el caso en el que se use una sustancia fluorescente); y determinar cuantitativamente la cantidad de ácido fosfórico en la muestra basándose en la curva patrón previamente creada usando una muestra 20 convencional.

Las muestras para medir la actividad de CDK se preparan recogiendo la CDK de interés de los lisados celulares como muestras. La preparación puede realizarse usando un anticuerpo anti-CDK específico contra la CDK de interés. En el caso en el que se mida la actividad de una quinasa específica dependiente de ciclina, por ejemplo, una quinasa dependiente de ciclina A, una quinasa dependiente de 25 ciclina B o una quinasa dependiente de ciclina E, la preparación puede realizarse usando un anticuerpo anti-ciclina específico contra la ciclina dependiente por la quinasa de interés. Tanto en el caso de usar el anticuerpo anti-CDK como en el caso de usar el anticuerpo anti-ciclina, las muestras a medir contienen una CDK distinta a la CDK activada. Por ejemplo, la muestra puede contener un complejo de CDK en el que el inhibidor de CDK se une al complejo ciclina-CDK. Además, cuando se usa el anticuerpo anti-CDK, 30 la muestra puede contener no solamente la propia CDK, sino también diversos complejos de CDK, tales como el complejo CDK-ciclina, el complejo inhibidor de CDK-CDK, el complejo inhibidor de CDK-ciclina-CDK, o los complejos de CDK u otros compuestos. Considerando esto, la actividad de CDK se mide en términos de la unidad (U) del sustrato fosforilado bajo la condición de que coexistan diversas CDK, tales como, CDK activada, CDK no activada y diversas sustancias reactivas competitivas. 35

El nivel de expresión de CDK es una cantidad relativa de CDK diana (unidad correspondiente al número de moléculas) que está contenida en un lisado celular como una muestra y que puede por un proceso convencional conocido de medición de la cantidad de una proteína diana en una mezcla que contiene la proteína. Por ejemplo, puede usarse un ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) o un proceso de transferencia de Western. Además, puede usarse un proceso descrito en la Publicación de 40 Patente Japonesa, pendiente de examen, Nº: 2003-130871. Usando un anticuerpo específico contra la proteína diana, puede unirse una proteína diana, es decir una CDK. Por ejemplo, el uso de un anticuerpo anti-CDK1 permite la unión de las CDK1, tales como la propia CDK1, el complejo CDK1-ciclina, el complejo inhibidor de CDK1-CDK1, el complejo inhibidor de CDK1-ciclina-CDK1 y los complejos de CDK1 y otros compuestos, en células de la muestra. 45

Por consiguiente, la actividad específica calculada mediante la fórmula mencionada anteriormente, corresponde a una proporción de CDK1 que muestra actividades enzimáticas con respecto a las CDK en las células. La proporción puede considerarse como la actividad de CDK mostrada debido a

un estado de proliferación intrínseco a las células de mamífero a evaluar. Una muestra para medir (solución de muestra que contiene células), en particular una muestra preparada a partir de una muestra obtenida por biopsia, se ve muy afectada por un proceso de preparación de muestras y por la cantidad de componentes extracelulares, por ejemplo, matriz extracelular, contenidos en los tejidos obtenidos por biopsia. Sin embargo, la proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de CDK no se ve 5 afectada por el proceso de preparación de la muestra. Por consiguiente, el uso de la proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de CDK es ventajoso, porque la proporción puede correlacionarse, en gran medida, con el descubrimiento clínico en comparación con la propia actividad.

Un perfil de CDK que incluye actividad específica o el número inverso de la misma de dos o más tipos de CDK proporciona información respecto a qué CDK tiene la prioridad en su actividad, de esta 10 manera, esto puede proporcionar información adicional sobre la proporción y/o el número de células en cada fase e información sobre qué fase tiene la prioridad en la célula existente.

El tipo de CDK cuya actividad específica se mide puede seleccionarse apropiadamente dependiendo de los tipos de propiedades necesarios para la evaluación. Generalmente, dado que una célula cancerosa está fuera del crecimiento normalmente controlado y prolifera rápidamente, se considera 15 que la proporción de células que permanecen en el periodo de la fase S y de la fase G2 puede ser mayor y que dicho estado es canceración. El tumor que contiene células en estado anómalo puede progresar rápidamente y estimarse a alto grado en malignidad. Y se considera que la aneuploidía está producida atravesando una fase M anómala o continuando a la fase G1 y después a la fase S sin pasar por la fase M. Por lo tanto, la muestra con una proporción baja de células en la fase M, puede estimarse a un alto 20 grado de malignidad. Por consiguiente, cuando se selecciona CDK1 como una primera CDK y CDK2 como una segunda CDK, la actividad específica de CDK2 es un valor que refleja una proporción de células en fase S en la muestra que pertenece al grupo de muestras que presentan actividades específicas similares a CDK1 cuando se clasifican de acuerdo con un grado de actividad específica de CDK1. El tejido que contiene una gran cantidad de células que permanecen en la fase S puede estimarse 25 a un elevado grado de malignidad en la medicina clínica. En otras palabras, el tejido tumoral puede ser maligno con elevada probabilidad de metástasis y un mal pronóstico.

El grado de malignidad de una muestra celular puede evaluarse prediciendo la proporción de células en la fase específica del ciclo celular basándose en un perfil de actividad específica de CDK que incluye actividades específicas de dos o más tipos de CDK considerando el tipo y la función conocida de 30 las CDK. De manera alternativa, el grado de malignidad de una muestra celular puede evaluarse creando un perfil de actividad específica de dos o más tipos de CDK contenidas en una célula convencional, obtenida de tejido no canceroso correspondiente al tejido que proporciona la muestra celular y comparando el perfil de actividad específica de CDK de la muestra celular, con el perfil de actividad específica de CDK, de la célula convencional, previamente creado. 35

El perfil de actividad específica de CDK incluye la proporción de la actividad específica de dos tipos de CDK. En este caso, las propiedades de la célula se evalúan comparando la proporción de las actividades de dos tipos de CDK con un valor de umbral predeterminado que corresponde a la proporción.

Un valor de umbral a usar en el método de evaluación de propiedades de las células de la invención, se determina apropiadamente dependiendo de los tipos de células a medir, y de los elementos 40 de evaluación. El valor de umbral puede establecerse seleccionando un valor proporcional de actividades específicas que sirve como un límite para un elemento de evaluación empleado basándose en una base de datos de multitud de muestras de células e individuos con respecto al elemento de evaluación empleado y una base de datos de actividades específicas de CDK de las muestras de las células empleadas. Por ejemplo, un valor de umbral se determina de la siguiente manera: se obtiene una 45 proporción de la actividad específica de un tipo de CDK frente a la actividad específica del otro tipo de CDK que se sabe que tiene una correlación frente a un tipo de CDK con respecto a las células tumorales obtenidas de pacientes cuyo grado de malignidad cancerosa se ha evaluado por patólogos; los valores proporcionales obtenidos se clasifican de menor a mayor valor y después se define, como el valor de umbral, una media que puede clasificar a los pacientes en dos grupos iguales. 50

El método de evaluación no solamente se aplica a las propiedades celulares tales como potencia de proliferación o grado de malignidad, sino que también es aplicable a la sensibilidad celular frente a un agente irritante. Por ejemplo, recientemente se ha indicado que una diferencia en la eficacia de agentes farmacéuticos, tal como un agente anticanceroso, debido a la constitución genética de los pacientes, da como resultado una diferencia en la sensibilidad celular frente a un agente irritante. En otras palabras, las 55 propiedades intrínsecas a las células incluyen una propiedad como si las células fueran sensibles a un agente irritante. La proporción de actividades específicas de dos tipos de CDK también tiene una

correlación con respecto a la sensibilidad del agente irritante. Considerando esto, el método para evaluar la sensibilidad de células de mamífero incluye el método de evaluar la sensibilidad celular frente a un agente irritante, basándose en un perfil CDK que incluye una proporción del nivel de expresión frente al valor de actividad con respecto a una primera CDK y una proporción del nivel de expresión frente al valor de actividad con respecto a una segunda CDK. Son ejemplos del perfil de CDK un perfil de actividad 5 específica de CDK que incluye actividades específicas de CDK y un perfil de número inverso de actividad específica de CDK que incluye números inversos con respecto a las actividades específicas de CDK. El perfil de actividad específica de CDK se dirige a un método para evaluar la sensibilidad celular frente a un agente irritante comparando un valor de umbral predeterminado con una proporción de una actividad específica de una primera CDK frente a una actividad específica de una segunda CDK. 10

El agente irritante se selecciona del grupo que consiste en, factores de crecimiento, agentes anticancerosos y mutágenos. Los contenidos a evaluar y los contenidos sobre la sensibilidad difieren dependiendo de los tipos de agentes irritantes. Por ejemplo, la eficacia o no eficacia se evalúa con respecto a los agentes anticancerosos y la sensibilidad o no sensibilidad se evalúa con respecto a los mutágenos o factores de crecimiento. 15

El valor de umbral que sirve como un indicador de evaluación en el método de evaluación de sensibilidad de las células de la invención, se establece apropiadamente dependiendo del tipo de agente irritante. El valor de umbral se establece examinando una correlación entre los valores de actividad específica de CDK que sirven como indicadores de evaluación para las muestras celulares preparadas de antemano y la sensibilidad/no sensibilidad de las muestras celulares con respecto a un agente irritante y 20 seleccionando un valor en un límite entre la sensibilidad y no sensibilidad, como un valor de umbral. El valor de umbral puede establecerse clasificando pacientes, que realmente están expuestos a un agente irritante, en un grupo de sensibilidad y en un grupo sin sensibilidad, concerniente a una sensibilidad frente a un agente irritante, basándose en proporciones de actividades específicas de las dos CDK, que se miden independientemente del ensayo de sensibilidad del agente irritante. Como alternativa el valor de 25 umbral puede establecerse estimulando diversas células tumorales cultivadas con un agente irritante, midiendo un nivel de proliferación o un nivel de respuesta de las células frente al agente irritante, clasificando a los pacientes en un grupo de sensible y en un grupo sin sensibilidad basándose en proporciones de actividades específicas de los dos tipos de CDK, que se miden independientemente del ensayo de sensibilidad del agente irritante. 30

Existe un caso en el que la proporción de las actividades específicas de las dos CDK está muy distanciada del valor de umbral porque una o las dos actividades específicas de CDK a usar en la evaluación son excesivamente pequeñas o excesivamente grandes, dependiendo del tipo de célula a medir o del tipo de agente irritante a usar. Además, hay un caso en el que el propio valor de actividad específica de CDK, como un elemento medido, es excesivamente pequeño si la célula medida se evalúa 35 que es no sensible frente a un irritante. En dicho caso, no sólo es preferible realizar una evaluación simplemente basada en la proporción de los valores de actividad específica, sino también evaluar la sensibilidad frente al agente irritante, considerando los mayores o menores valores de actividad específica de CDK a usar en la evaluación. Específicamente, se establece un valor de umbral como un indicador de evaluación con respecto al propio valor de actividad específica y se realiza una evaluación, considerando 40 un resultado comparativo con respecto al valor de actividad específica realmente medido con el valor de umbral de actividad específica

En el caso en el que para evaluar la sensibilidad frente al agente irritante, se compara el valor de actividad específica de CDK y el valor de umbral correspondiente y la proporción de las actividades específicas de CDK y el valor de umbral correspondiente, respectivamente, el orden de comparación no 45 está específicamente limitado. Es preferible determinar el orden de comparación, de acuerdo con las necesidades, dependiendo de los tipos de agentes irritantes o de los tipos de células. Por ejemplo, el valor de actividad específica puede compararse con el valor de umbral correspondiente para determinar ciertas células que se evalúan como que pertenecen a un grupo de sensibilidad o a un grupo sin sensibilidad y por lo tanto, la proporción de las actividades específicas puede compararse con el valor de 50 umbral correspondiente con respecto al resto de las células que no se han evaluado. Como alternativa, en el caso en el que uno o los dos valores de actividad específica sean excesivamente pequeños o excesivamente grandes en las células a medir, primero, debe comparase la proporción de actividades específicas de CDK con el valor de umbral correspondiente para clasificar las células en un grupo de sensibilidad y en un grupo sin sensibilidad. Posteriormente, el propio valor de actividad específica puede 55 compararse con el valor de umbral correspondiente con respecto a las células en las que uno o los dos valores de actividad específica son excesivamente grandes o excesivamente pequeños para evaluar de nuevo la sensibilidad. Después, basándose en la re-evaluación, se podrá corregir un resultado de

evaluación basándose en el resultado comparativo de la proporción de los valores de actividad específica con el correspondiente valor de umbral.

El valor de actividad específica es diferente dependiendo del método de medición de actividad de CDK, del método de medición del nivel de expresión de CDK, de los tipos de anticuerpos a usar en la medición o similar. Por consiguiente, es necesario realizar el método de medición de actividad específica 5 en la creación de una base de datos para establecer el mismo valor de umbral para el método de medición de actividad específica con respecto a una célula a ensayar, por lo que en el método de evaluación de la invención, se emplea el método de evaluación basándose en un resultado comparativo con el valor de umbral.

EJEMPLOS 10

En primer lugar, se describen los métodos usados en los siguientes ejemplos, es decir un método para preparar muestras para la medición y métodos para medir la actividad específica de CDK y el nivel de expresión de CDK.

[Preparación del lisado celular]

Como muestras de organismos a evaluar, se usaron tejidos, con un volumen cada uno de 2 mm3, 15 extirpados por biopsia o de células cultivadas de líneas celulares cancerosas como se muestra en la Tabla 2.

[Tabla 2]

Células cultivadas: Tipo de tumor

KATO-III: Cáncer gástrico

K562: Leucemia

Colo204: Cáncer de colon

HeLa: Cáncer de cuello uterino

MCF-7: Cáncer de mama

SW-480: Cáncer de colon

SKBr: Cáncer de mama

T47D: Cáncer de mama

Se realizó la lisis de los tejidos y de las células cultivadas con tampón de lisis (0,1% p/v nonidet-20 40P (NP40) (Calbiochem), tris-HCl 50 mM (pH: 7,4), EDTA 5 mM, floruro de sodio 50 mM, ortovanadato de sodio 1 mM y 100 l/ml de Cóctel Inhibidor de Proteinasa (Sigma, St. Louis, Mo)) inyectando 10 veces con una jeringuilla (contenido admisible: 5 ml) que tenía una aguja de 23 G un en un baño helado para obtener soluciones celulares respectivamente. La concentración de la solución celular de las células cultivadas era de 1x107 células/5 ml. Después de centrifugar a 15000 rpm durante 5 min a 4ºC, para 25 retirar los materiales insolubles, se usaron los sobrenadantes (lisados celulares) para realizar las siguientes mediciones.

[Medición de la actividad de CDK]

Cada uno de los lisados celulares, preparados por el método mencionado anteriormente, se añadieron a un tampón de lisis en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, de manera que 100 g de proteína, en 30 cantidad total, se disolvieron en 500 l de tampón de lisis, y la solución resultante se sometió a la medición de la actividad de CDK.

A la solución para realizar la medición, se añadieron perlas de sefarosa (Bio-Rad, Calif., U.S.A.) recubiertas con 20 l de Proteína A y 2 g de anticuerpos específicos para una CDK cuya actividad iba a medirse, es decir, anticuerpos policlonales anti-CDK1 o anticuerpos policlonales anti-CDK2 (Santa Cruz 35 Biotechnology, Santa Cruz, Calif.). Después de la adición, la solución obtenida reaccionó a 4ºC durante 1

hora. Posteriormente, las perlas se lavaron tres veces con un tampón (NP-40 al 0,1% y tris-HCl 50 mM ajustado a un pH 7,0), seguido de re-suspensión en 15 l de tampón quinasa. Por lo tanto, se obtuvo una muestra que contenía las perlas a las que se unió la CDK de interés.

En la muestra, todas las CDK (en lo sucesivo en este documento, si no es necesario realizar una distinción, denominadas simplemente “CDK”) incluyendo la propia CDK, la CDK activada a la que se une 5 ciclina, complejos de CDK activada e inhibidor de CDK y complejos de CDK e inhibidor de CDK se unieron a los anticuerpos, fijando por tanto las CDK a las perlas. La actividad de las CDK en la muestra se midió por el siguiente método de medición.

Se preparó una solución de sustrato que contenía adenosina 5’-O-(8-tiotrifosfato) (ATP-S (Sigma)) 5 mM, una solución de tampón (tris-HCl 20 mM (pH: 7,4), Triton-X-100 al 0,1%) y 10 g de 10 histona H1 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, N.Y.) como un sustrato para CDK1 y CDK2. La solución de sustrato se añadió a la muestra que contenía las CDK hasta un volumen total de 50 l. La solución de la muestra resultante se agitó durante 10 minutos a 37ºC para la incubación. Como se muestra mediante la siguiente fórmula, la CDK activada fosforiló el resto de serina o de treonina en el sustrato y se produjo un sustrato monotiofosforilado. 15

[fórmula 1]

Después de la reacción, la solución de la muestra se centrifugó a 1000 rpm durante 10 segundos para precipitar las perlas y se obtuvieron 30 l de un sobrenadante que contenía monotiofosfatos. Se mezclaron 18 l de sobrenadante con 15 l de una solución de tampón que contenía tris-HCl 150 mM (pH: 20 9,2) y EDTA 5 mM y se añadió una solución de yodoacetil fluoresceína 10 mM (tris-HCl 100 mM (pH: 7,5) y EDTA 1 mM). La mezcla obtenida se incubó en un lugar oscuro durante 30 minutos a temperatura ambiente para marcar los iones sulfuro en los tiofosfatos en el sustrato monotiofosforilado con fluorescencia. La reacción de yodoacetil biotina con los tiofosfatos se detuvo añadiendo 6-mercaptoetanol.

En una membrana de PVDF, se realizó la transferencia de 0,4 g del sustrato tiofosforilado 25 marcado con fluorescencia, usando una transferencia por ranuras para la adsorción. La membrana transferida se bloqueó con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% durante 30 minutos, seguido de una reacción con avidina-FITC (Vector, Burlingame, Calif.) a 37ºC durante 1 hora. Después de esto, la membrana se lavó con TBS 50 mM (tris-HCl 25 mM (pH: 7,4) y NaCl 150 mM) tres veces durante 10 minutos. Después de realizar el lavado, se analizó la imagen de la membrana mediante un analizador de 30 imágenes fluorescentes (Bio-Rad, Calif. U.S.A.). La actividad de las CDK se calculó basándose en una curva patrón.

La curva patrón se creó midiendo la actividad de la CDK de interés activada en células de leucemia mieloide crónica, K-562 con el uso de soluciones con una diversidad de concentraciones de la CDK solamente activada. 35

Por consiguiente, 1U de la actividad de CDK a medir es un valor que representa la cantidad que tiene actividad enzimática sustancialmente equivalente a la actividad enzimática con respecto a 1 ng de proteína total de la célula K-562. La actividad enzimática corresponde a la cantidad de la enzima necesaria para hacer reaccionar una cantidad predeterminada de un sustrato.

[Medición del nivel de expresión de CDK] 40

Se colocó una membrana de PVDF activada (Millipore, Billerica, Mass), obtenida sumergiendo la membrana en TBS (tris-HCl 25 mM (pH: 7,4) y NaCl 150 mM), en una placa con pocillos para transferencia por ranura. Y en cada pocillo (223 mm, contenido admisible: 100 l) de la placa con

pocillos se sembraron 50 l de lisado celular preparado basándose en el método mencionado anteriormente. La cantidad total de proteínas contenida en el lisado celular en cada pocillo estaba en el intervalo entre 5 y 15 g.

Después de sembrar, cada lisado celular se adsorbió sobre la membrana aplicando una presión negativa de aproximadamente 200 mmHg desde el fondo de los pocillos, es decir, la parte posterior de la 5 membrana, durante aproximadamente 15 segundos.

Después, en cada pocillo, se sembró una solución que contenía anticuerpos de conejo anti-CDK1 o anticuerpos de conejo anti-CDK2, que son anticuerpos primarios que pueden unirse específicamente a la CDK de interés y la placa con pocillos se colocó inmóvil a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Después de esto, la muestra en el pocillo se adsorbió sobre la membrana 10 desde el fondo del pocillo con una presión negativa de 500 mmHg durante aproximadamente 50 segundos. Después, la membrana se lavó con TBS (tris-HCl 25 mM (pH: 7,4) y NaCl 150 mM).

Posteriormente, en cada pocillo se sembró una solución que contenía anticuerpos anti-conejo biotinilados (anticuerpo secundario) y la placa con pocillos se colocó inmóvil a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Después, la muestra en el pocillo se adsorbió sobre la membrana 15 desde el fondo de los pocillos con una presión negativa de 500 mmHg durante aproximadamente 15 segundos. Después de esto, la membrana se lavó con TBS (tris-HCl 25 mM (pH: 7,4) y NaCl 150 mM).

A continuación, se sembraron 40 l de un reactivo de estreptavidina marcada con FITC en cada uno de los pocillos, y la placa con pocillos se colocó inmóvil a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos para marcar el anticuerpo secundario con el FITC. Después del marcado, la 20 muestra en los pocillos se adsorbió sobre la membrana con una presión negativa de 500 mmHg durante aproximadamente 15 segundos. Después de esto, la membrana se lavó con TBS (tris-HCl 25 mM (pH: 7,4) y NaCl 150 mM).

Después de retirar la membrana de PVDF de la placa con pocillos, la membrana se lavó con agua destilada, se sumergió en metanol al 20% durante 5 minutos y después se secó aproximadamente 25 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, se analizó la intensidad de fluorescencia de la proteína adsorbida en la membrana y se midió mediante un analizador de imagen (Bio-Rad). La proteína marcada con FIFC (CDK1 o CDK2) se cuantificó basándose en la curva patrón previamente creada convirtiendo la cantidad correspondiente del número de las CDK en el peso (ng) de la proteína convencional. La cantidad de las CDK medidas por el proceso anterior es la cantidad total de las CDK en 30 las células, tales como la propia CDK y complejos de CDK (complejo de CDK-ciclina, complejo inhibidor de CDK-ciclina-CDK, complejo inhibidor de CDK-CDK, complejos de CDK y otros compuestos).

La curva patrón se creó sembrando 50 l de cada una de las soluciones que contenían una proteína de CDK recombinante purificada en cinco concentraciones diferentes en TBS que contenía NP-40 al 0,005% y 50 g/ml de BSA en los pocillos que se habían procesado de manera similar como se ha 35 mencionado anteriormente, marcando la proteína con FITC de acuerdo con la manera similar mencionada anteriormente, midiendo la intensidad de fluorescencia de la proteína marcada y expresando una relación entre la intensidad de fluorescencia de la proteína marcada y la cantidad de la proteína CDK.

[Cálculos sobre la Actividad Específica de CDK]

La actividad específica (mU/ng) de la CDK se calculó basándose en la actividad de CDK medida 40 y el nivel de expresión de CDK medido de acuerdo con la siguiente ecuación.

[Ejemplo 1: Propiedades de Diversas Líneas Celulares Cancerosas]

Para conocer las propiedades patológicas de diversas células cancerosas, se examinaron los contenidos de ADN y las actividades específicas de CDK con respecto a las células de las líneas 45 celulares cultivadas mostradas en la Tabla 2

(1) Contenido de ADN

Después de realizar la dispersión de las células de interés por tratamiento con tripsina/EDTA y de lavar dos veces con PBS, se recogieron las células (2105 a 1106) por un proceso de centrifugado de 100g a 4ºC durante 5 minutos. Las células recogidas se agitaron con una mezcladora de agitación 50 vorticial, al mismo tiempo que se añadía gradualmente 1 ml de etanol al 70% previamente enfriado a -

20ºC para fijar las células, seguido por reacción a 4ºC o -20ºC durante 2 horas o más. Después de lavar con PBS dos veces, se añadieron 20 K unidades/ml de RNasa (Sigma), 50 g/m de yoduro de propicio (PI) y 1 mg/ml de glucosa/PBS para dispersar suficientemente las células. Después, las células reaccionaron a temperatura ambiente durante 1 hora para teñir fluorescentemente el ADN con PI. Después de la tinción, los componentes sólidos se retiraron con una malla de nylon de 35 mm (FALCON). 5 Después, se realizó la medición de fluorescencia por FACScalibur (BD) a longitudes de onda de excitación de 488/536 nm y 617 nm y se realizó un análisis.

En las FIGS. 2(a) a 2(h) se muestran los resultados de la medición. Refiriéndose a las FIGS. 2(a) a 2(h), los ejes de ordenadas representan la intensidad de fluorescencia correspondiente al recuento, es decir, el número de células y el eje de abscisas representa el contenido de ADN. 10

Como se muestra en la FIG. 3, generalmente, la relación entre el contenido de ADN de las células animales y el número de células está asociado con el ciclo celular. Se examinó la proporción de células en fase S y la proporción de células en fase G1, usando ModFit (Verity Software House) basándose en los resultados de medición en las FIGS. 2(a) a 2(h). En la FIG. 4 se muestran los resultados del examen. 15

Los resultados en las FIGS. 2(a) a 2(h) y en la FIG. 4 muestran que la proporción de células en la fase S era mayor con respecto a las líneas celulares KATOIII, K562 y Colo205. Además, se observó ploidía (particularmente, aneuploidía) con respecto a las líneas celulares KATOIII, Colo205 y HeLa.

(2) Actividad específica de CDK

De acuerdo con el método de medición mencionado anteriormente, se midieron las actividades y 20 los niveles de expresión de CDK1 y CDK1, con respecto a lisados celulares preparados basándose en el método de preparación mencionado anteriormente, usando las células cultivadas mostradas en la Tabla 2 y se obtuvieron actividades específicas de CDK1 y CDK2. En la FIG. 5 se muestran los resultados de la medición.

Referente a la FIG. 5, las barras finas en negrita muestran actividades específicas de CDK2, las 25 barras huecas gruesas muestran actividades específicas de CDK1, el eje de ordenadas lateral izquierdo muestra una escala de actividades específicas de CDK1 y el eje de ordenadas lateral derecho muestra una escala de actividades específicas de CDK2.

Las células examinadas se clasificaron, en líneas generales, en un grupo (células KATOIII, K-562, Colo205 y HeLa y MCF-7) en el que la actividad específica de CDK1 era relativamente baja y en un 30 grupo (SW480, SKBr3 y T47D) en el que la actividad específica de CDK1 era relativamente alta, basándose en la magnitud de los valores de actividad específica de CDK1. Está claro que la magnitud de la actividad específica de CDK2 tiene una correlación con respecto a la proporción de células en la fase S, que se obtiene basándose en la medición del contenido de ADN. En otras palabras, aunque la proporción de células en la fase S no puede correlacionarse directamente con la magnitud de los valores de actividad 35 específica de CDK2, la magnitud del valor de actividad específica de CDK2 puede correlacionarse con la malignidad celular después de la clasificación de las células basándose en los valores de actividad específica de CDK1.

[Ejemplo 2: correlación entre la evaluación realizada por patólogos concerniente a muestras de biopsia y perfil de actividad específica de CDK] 40

Se examinó una relación entre la recaída por una metástasis a distancia 5 años después de cirugía y un perfil de actividad específica de CDK basándose en la actividad específica de CDK1 y en la actividad específica de CDK2 que se había medido por el método anterior con respecto a células obtenidas a partir de muestras de biopsia de tejidos cancerosos verdaderos.

(1) Evaluación realizada por patólogos 45

En las Tablas 3 y 4 se muestran los resultados de evaluación (clasificación TNM, estado de metástasis del nódulo linfático, tamaño del tejido canceroso, generación o no generación de metástasis 5 años después de cirugía, lugar de recaída) realizada por patólogos con respecto a muestras de biopsia (Nos 1 a 77) obtenidas de 77 pacientes con cáncer de mama verdadero. Los 77 pacientes tenían un cáncer de mama de fase temprana (fase I o IIA). 50

En la Tabla 3, “LN” indica un estado de metástasis de los nódulos linfáticos después de cirugía, en el que “a” significa que no se observó metástasis en los nódulos linfáticos regionales, “b” significa que

se observó metástasis en uno de los tres nódulos linfáticos regionales y “c” significa que se observó metástasis en cuatro o más nódulos linfáticos regionales. “T” indica el tamaño del tumor primario en el momento de la cirugía, en el que “a” significa el tamaño del tumor de 2 cm o menor, “b” significa el tamaño del tumor de 2 cm a 5 cm y “c” significa el tamaño del tumor de 5 cm o mayor.

(2) Establecimiento del valor de umbral 5

Se midió la actividad específica de CDK1 y la actividad específica de CDK2 con respecto a los lisados celulares preparados basándose en el método mencionado anteriormente, usando muestras de biopsia obtenidas de 126 pacientes con cáncer de mama. Los valores proporcionales obtenidos de actividad específica de CDK / actividad específica de CDK1 de los 126 pacientes con cáncer se clasificaron desde el valor más bajo al valor más alto y se estableció un valor capaz de clasificar a los 10 pacientes en dos grupos, consistiendo cada uno en 63 pacientes, como un valor de umbral para la proporción de actividad específica. El valor de umbral fue de 46. El grupo en el que la proporción de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1 fue menor que el valor de umbral = 46 se evaluó como que tenía un riesgo de recaída bajo y el grupo en el que la proporción de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1 fue igual o mayor que el valor de umbral = 46 se evaluó como 15 que tenía un riesgo de recaída alto.

(3) Evaluación del grado de malignidad por perfil de la actividad específica de CDK

Se midió la actividad específica de CDK1 y la actividad específica de CDK2 con respecto a los lisados celulares preparados basándose en el método anteriormente mencionado, usando muestras de biopsia de 77 pacientes con cáncer de mama. Los 77 pacientes con cáncer de mama se clasificaron en 20 un grupo de alto riesgo y en un grupo de bajo riesgo de acuerdo con el valor de umbral establecido en (2). En las Tablas 3 y 4 se muestra un resultado de evaluación por el perfil de actividad específica junto con el resultado de evaluación realizado por patólogos.

Creando un gráfico del perfil de actividad específica de CDK, representando el eje de abscisas los pacientes respectivos, y representando los ejes de ordenadas la actividad específica de CDK1 y la 25 actividad específica de CDK2, se creó un gráfico mostrando un resultado sobre el perfil de actividad específica de CDK estableciendo la escala de la actividad específica de CDK2 en aproximadamente 46 veces tan grande como la actividad específica de CDK. En la FIG 6 se muestran los resultados sobre un perfil de CDK concerniente a los pacientes Nos 1 a 42 que se evaluaron que pertenecían al grupo de bajo riesgo y en la FIG 7 se muestran los resultados sobre un perfil de CDK concerniente a los pacientes Nos 30 43 a 77 que se evaluaron que pertenecían al grupo de alto riesgo.

[Tabla 3]

Paciente Nº: TNM LN T recaída Lugar de recaída Evaluación del grado de malignidad

1: I a a No - Riesgo bajo

2: I a a No - Riesgo bajo

3: I a a No - Riesgo bajo

4: I a a No - Riesgo bajo

5: I a a No - Riesgo bajo

6: I a a No - Riesgo bajo

7: I a a No - Riesgo bajo

8: I a a No - Riesgo bajo

9: I a a No - Riesgo bajo

10: I a a No - Riesgo bajo

11: I a a No - Riesgo bajo

12: I a a No - Riesgo bajo

13: I a a No - Riesgo bajo

14: IIA a b No - Riesgo bajo

15: IIA a b No - Riesgo bajo

16: IIA a b No - Riesgo bajo

17: IIA a b No - Riesgo bajo

18: IIA a b No Riesgo bajo

19: IIA a b No - Riesgo Bajo

20: IIA a b No - Riesgo bajo

21: IIA a b No - Riesgo bajo

22: IIA a b No - Riesgo bajo

23: IIA a b No - Riesgo bajo

24: IIA a b No - Riesgo bajo

25: IIA a b No - Riesgo Bajo

26: IIA a b No - Riesgo bajo

27: IIA a b No - Riesgo bajo

28: IIA a b No - Riesgo bajo

29: IIA a b No - Riesgo bajo

30: IIA a b No - Riesgo bajo

31: IIA a b No - Riesgo bajo

32: IIA a b No - Riesgo bajo

33: IIA a b No - Riesgo bajo

34: IIA a b No - Riesgo bajo

35: IIA a b No - Riesgo bajo

36: IIA a b No - Riesgo bajo

37: IIA a b No - Riesgo bajo

38: IIA a b No - Riesgo bajo

39: IIA a b No - Riesgo bajo

40: IIA a b No - Riesgo bajo

[Tabla 4]

41: IIA b a No - Riesgo bajo

42: IIA b a No - Riesgo bajo

43: I a a No - Riesgo alto

44: I a a No - Riesgo alto

45: I a a No - Riesgo alto

46: IIA a b No - Riesgo alto

47: IIA a b No - Riesgo alto

48: IIA a b No - Riesgo alto

49: IIA a b No - Riesgo alto

50: IIA a b No - Riesgo alto

51: IIA a b No - Riesgo alto

52: IIA a b No - Riesgo alto

53: IIA a b No - Riesgo alto

54: IIA a b No - Riesgo alto

55: IIA b a No - Riesgo alto

56: IIA a b No - Riesgo alto

57: IIA b a No - Riesgo alto

58: IIA a b No - Riesgo alto

59: IIA b a No - Riesgo alto

60: IIA b a No - Riesgo alto

61: IIA b a No - Riesgo alto

62: IIA b a No - Riesgo alto

63: IIA b a No - Riesgo alto

64: IIA b a No - Riesgo alto

65: IIA b a No - Riesgo alto

66: I a a Sí Piel Riesgo alto

67: I a a Sí Pulmón Riesgo alto

68: IIA a b Sí Piel Riesgo alto

69: IIA a b Sí Nódulo linfático Riesgo alto

70: IIA a b Sí Hígado, hueso Riesgo alto

71: IIA a b Sí Pared torácica Riesgo alto

72: IIA a b Sí Pulmón Riesgo alto

73: IIA a b Sí Hueso Riesgo alto

74: IIA a b Sí Piel Riesgo alto

75: IIA a b Sí Hueso Riesgo alto

76: IIA a b Sí Nódulo linfático Riesgo alto

77: IIA a b Sí Pulmón Riesgo alto

Como se muestra en la Tabla 4 y en las FIGS. 6 y 7, de los 77 pacientes con cáncer de mama de fase temprana, que se habían evaluado con una malignidad relativamente elevada, 35 pacientes (Nos 43 a 77) se evaluaron con un riesgo alto en el perfil de actividad específica de CDK y entre los 35 pacientes se observó recaída en 12 pacientes (Nos 66 a 77) 5 años después de la cirugía. Por otro lado, no se observó 5 recaída en ninguno de los 42 pacientes evaluados con un riesgo bajo en el perfil de actividad específica de CDK. Es obvio que el resultado de la evaluación con una actividad específica de CDK1 baja y una actividad específica de CDK2 alta significa malignidad cancerosa alta y a la inversa, el resultado de la evaluación con una actividad específica de CDK2 baja y una actividad específica de CDK1 alta significa malignidad cancerosa baja, en el caso en el que se realizaron los perfiles de las muestras de tejido de los 10 pacientes con cáncer de mama, considerando la proporción de las actividades específicas de CDK (en este ejemplo, la proporción de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1), además del resultado comparativo entre el valor de actividad específica de CDK1 y el valor de actividad específica de CDK2. En otras palabras, se puede llegar a la conclusión de que las células cancerosas procedentes, por ejemplo, del paciente Nº 38 y Nº 67, cuya actividad específica de CDK1 es relativamente alta, tiene una 15 baja malignidad, a pesar de que la actividad específica de CDK2 es sustancialmente tan alta como la actividad específica de CDK1.

En otras palabras, basándose en un resultado comparativo de la actividad específica con el valor de umbral correspondiente predeterminado, puede conocerse una propiedad cancerosa y un grado de malignidad. 20

[Ejemplo 3: Sensibilidades frente a docetaxel como agente anticanceroso]

(1) Establecimiento de los valores de umbral y criterios de evaluación

Los lisados celulares para realizar la medición se prepararon basándose en el método mencionado anteriormente, usando muestras de tejido canceroso obtenidas de 1000 pacientes con cáncer de mama antes de la administración de taxano, aunque se habían tratado con quimioterapia 25 usando taxano como agente anticanceroso. Para calcular las actividades específicas de CDK1 y CDK2, con respecto a los lisados celulares, se midieron las actividades y los niveles de expresión de CDK1 y CDK2. Por otro lado, estos pacientes se clasificaron en un grupo en el que se observó reducción del tamaño tumoral y en un grupo en el que no se observó reducción del tamaño tumoral, como resultado de la quimioterapia usando taxano. Se estableció un umbral de la proporción de actividades específicas, es 30 decir, el umbral de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1, de manera que el umbral podría servir de límite entre el grupo con reducción del tamaño tumoral y el grupo sin reducción del tamaño tumoral. El valor de umbral de la proporción de la actividad específica fue de 16.

En el caso en el que el valor de actividad específica de CDK1 o el valor de actividad específica de CDK2 sea excesivamente grande o excesivamente pequeño, se estableció un valor de umbral de 35 manera que la clasificación en el grupo con reducción del tamaño tumoral y en el grupo sin reducción del tamaño tumoral podría realizarse basándose en la actividad específica de CDK1 o en la actividad específica de CDK2. El umbral de la actividad específica de CDK1 fue de 20 y el umbral de la actividad específica de CDK2 fue de 500 y 10000.

La evaluación se realizó de la siguiente manera: comparación de la actividad específica de CDK1 40 y actividad específica de CDK2 con los valores de umbral correspondientes respectivamente, y después, clasificación en un grupo con sensibilidad prevista y en un grupo sin sensibilidad prevista, en el que una muestra con actividad específica de CDK1 menor de 20, es decir, actividad específica de CDK1 < 20, y

actividad específica de CDK2 menor de 500, es decir, actividad específica de CDK1 < 500, se evaluó como sin sensibilidad prevista, mientras que una muestra con actividad específica de CDK2 de más de 10000, es decir actividad específica de CDK1 > 10000 (sic, correctamente actividad específica de CDK2 > 10000) se evaluó como con sensibilidad prevista. Después de esto, con respecto a las muestras que no se habían clasificado en el grupo con sensibilidad ni en el grupo sin sensibilidad, basándose en la 5 evaluación mencionada anteriormente, comparación del valor de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1 con un valor de umbral correspondiente = 16, y realizando la evaluación en la que la proporción de actividad específica de 16 o más se evaluó como con sensibilidad prevista y la proporción de actividad específica menor de 16 se evaluó como sin sensibilidad prevista.

En el Ejemplo 3, cuando la actividad específica de CDK1 era 0, es decir, valor de actividad 10 específica de CDK1 = 0, y la actividad específica de CDK2 se encontró en el intervalo entre 500 y 10000, es decir, 500 ≤ valor de actividad específica de CDK2 ≤ 10000, el valor de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1 se consideró como infinito por conveniencia de la evaluación. La muestra aplicada a dicho caso se evaluó como con sensibilidad prevista, porque la proporción de actividades específicas era mayor de 16. 15

(2) Perfil de actividad específica de CDK y predicción de sensibilidad

Las actividades y los niveles de expresión de CDK1 y CDK2 se midieron con respecto a los lisados celulares, preparados basándose en el método indicado anteriormente, usando muestras de tejido de cáncer de mama obtenida de pacientes, de A a I, con cáncer de mama que no se trataron con quimioterapia usando un agente anticanceroso. Después, se calcularon las actividades específicas de 20 CDK1 y CDK2.

Los pacientes se clasificaron en un grupo con sensibilidad prevista y en un grupo sin sensibilidad prevista comparando el valor de actividad específica de CDK1 y el valor de actividad específica de CDK2 y la proporción de actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1 con los correspondientes valores de umbral respectivos establecidos en (1) concernientes a nueve pacientes, de A a I, con cáncer 25 de mama. La FIG. 8 muestra un perfil de actividad específica de CDK1 mostrando una relación de pacientes, de A a I, que se expresa a lo largo del eje de abscisas, frente a la actividad específica de CDK1 y la actividad específica de CDK2 que se expresa a lo largo del eje de ordenadas. La escala a lo largo del eje de ordenadas concerniente a la actividad específica de CDK2 es 16 veces tan grande como la escala del eje de ordenadas concerniente a la actividad específica de CDK1. 30

Los pacientes de A a I se clasificaron en un grupo en el que se evaluó previsiblemente que tenían sensibilidad a docetaxel y en un grupo que se evaluó previsiblemente que no tenían sensibilidad a docetaxel de acuerdo con el valor de umbral indicado anteriormente. El resultado de la clasificación es el siguiente:

grupo sin sensibilidad prevista a docetaxel: pacientes A, B y C 35

grupo con sensibilidad prevista a docetaxel: pacientes D, E, F, G, H e I

(3) Efectos quimioterapéuticos de docetaxel como agente anticanceroso

Se administró docetaxel, como agente anticanceroso (Aventis), 4 veces con un intervalo de 3 a 4 semanas, con 60 mg/m2 (área superficial corporal) por dosificación, a pacientes de A a I, con cáncer de mama. Después de la administración, se evaluó la reducción del tamaño del tumor. 40

Un patólogo evaluó los tumores por palpación de acuerdo con los criterios descritos en el siguiente artículo: Arbuck SG, Eisenhauer EA, Wanders J, Kaplan RS, Rubinstein L, Verweij J, Van Glabbeke M, van Oosterom AT, Christian MC y Gwyther SG, “New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors”, J. Natl. Cancer Inst 2000; 92: 205-21. Cuando el tumor se evaluó con el resultado de “Respuesta completa” y “Respuesta parcial”, el tumor se clasificó en el grupo de reducción 45 del tamaño del tumor. Cuando el tumor se evaluó con el resultado de “Enfermedad Estable” y “Enfermedad Progresiva”, el tumor se clasificó en el grupo de no reducción del tamaño del tumor.

Los pacientes clasificados en el grupo de no reducción del tamaño del tumor fueron: A, B, C y D, y los pacientes clasificados en el grupo de reducción de tamaño del tumor fueron: E, F, G, H e I. De los 9 pacientes, 8 mostraron coincidencia entre el resultado de evaluación predictivo y el resultado de 50 evaluación por la quimioterapia real. En particular, un resultado predictivo de evaluación positivo coincidió perfectamente con un resultado de evaluación para el caso en el que se observó un efecto quimioterapéutico real.

[Ejemplo 4: Sensibilidades a paclitaxel como agente anticanceroso]

(1) Establecimiento del valor de umbral y criterios de evaluación

En el Ejemplo 4 también se adoptaron el valor de umbral y los criterios de evaluación establecidos en el Ejemplo 3.

(2) Perfil de actividad específica de CDK y predicción de sensibilidad 5

Se midieron las actividades y los niveles de expresión de CDK1 y CDK2 con respecto a los lisados celulares, preparados basándose en el método mencionado anteriormente, usando muestras de tejido de cáncer de mama obtenidas de pacientes, de J a P, con cáncer de mama, que no se habían tratado con quimioterapia usando un agente anticanceroso. Después, se calcularon las actividades específicas de CDK1 y CDK2. 10

Se clasificaron siete pacientes con cáncer de mama, es decir, pacientes de J a P, en un grupo con sensibilidad prevista y en un grupo sin sensibilidad prevista, comparando el valor de actividad específica de CDK1 y el valor de actividad específica de CDK2 y la proporción de la actividad específica de CDK2 / actividad específica de CDK1 con los valores de umbral correspondientes respectivos establecidos en (1). La FIG. 9 muestra un perfil de actividad específica de CDK1 que muestra una relación 15 de los pacientes, de J a P, que se expresa a lo largo del eje de abscisas frente a la actividad de CDK1 y la actividad de CDK2, que se expresa a lo largo de los ejes de ordenadas. La escala a lo largo del eje de ordenadas concerniente a la actividad específica de CDK2 es 16 veces tan grande como la escala del eje de ordenadas concerniente a la actividad específica de CDK1.

Los pacientes, de J a P, se clasificaron en un grupo en el que se evaluó previsiblemente que 20 tenían sensibilidad a paclitaxel y en un grupo que se evaluó previsiblemente que no tenían sensibilidad a paclitaxel, de acuerdo con el valor de umbral mencionado anteriormente. Los resultados de clasificación fueron los siguientes:

grupo sin sensibilidad prevista a paclitaxel: pacientes J y K

grupo con sensibilidad prevista a paclitaxel: pacientes L, M, N, O y P 25

(3) Efectos quimioterapéuticos de paclitaxel como agente anticanceroso

Se administró paclitaxel, como agente anticanceroso (Bristol Meyers Squibb), una vez a la semana durante 12 semanas consecutivas, con 80 mg/m2 (área superficial corporal) por dosificación a pacientes, de A a I, con cáncer de mama, (sic, correctamente, de J a P). Después de la administración, se evaluó la reducción del tamaño del tumor de acuerdo con el mismo criterio al usado en la administración 30 de docetaxel.

Los resultados de la evaluación fueron los siguientes:

pacientes evaluados en los que se observó que no había reducción del tamaño del tumor: J

pacientes evaluados en los que se observó que había reducción del tamaño del tamaño del tumor: K, L, M, N, O y P, 35

Siete de los 8 pacientes mostraron coincidencia (probabilidad: 87,5%) entre el resultado de evaluación predictivo y el resultado de evaluación de la quimioterapia real. El 100% de los pacientes evaluados positivos por el método de la invención mostraron reducción del tamaño de su tumor.

APROVECHAMIENTO EN LA INDUSTRIA 40

Los resultados de evaluación basados en el método de evaluación descrito, concernientes a propiedades celulares, particularmente, grado de malignidad del cáncer, tienen una alta correlación con los resultados de evaluación realizados por especialistas clínicos en los institutos médicos. Por consiguiente, el método descrito es útil para realizar un diagnóstico definitivo de enfermedades que son el resultado de estados de crecimiento celular incontrolado tales como el cáncer. Además, el método 45 descrito puede aplicarse al estudio concerniente a estados de crecimiento incontrolado de diversas células de mamífero además del estudio en enfermedades humanas.

Además, el método de evaluación de sensibilidad de células animales con respecto a un agente

irritante es útil como un método para examinar si diversos agentes farmacéuticos y medicamentos, tales como agentes anticancerosos, factores de crecimiento o mutágenos, pueden influir en el crecimiento celular. Particularmente, el método es útil para evaluar la eficacia de agentes farmacéuticos, tales como agentes anticancerosos, dependiendo del tipo de células cancerosas o la eficacia de agentes farmacéuticos, tales como agentes anticancerosos, como resultado de una diferencia en los individuos. La 5 eficacia de una quimioterapia usando un agente anticanceroso seleccionado puede predecirse antes de la administración real del agente anticanceroso a los pacientes. Por consiguiente, el método de evaluación de sensibilidad puede usarse como un indicador de selección para seleccionar una quimioterapia correcta.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar una probabilidad de metástasis, probabilidad de recaída o para estimar el pronóstico de una célula de mamífero que comprende:

evaluar la probabilidad de metástasis, la probabilidad de recaída o estimar el pronóstico de una célula de mamífero basándose en una información que contiene una proporción de A1 frente a A2, en la que A1 es una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de proteína 5 de quinasa 1 dependiente de ciclina (CDK1) contenido en la célula y A2 es una proporción del valor de actividad frente al nivel de expresión de proteína de quinasa 2 dependiente de ciclina (CDK2) contenido en la célula.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende comparar el perfil concerniente a la CDK de la célula con un perfil concerniente a la CDK de una célula convencional de 10 mamífero.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

evaluar la probabilidad de metástasis, la probabilidad de recaída o estimar el pronóstico de una célula de mamífero basándose en la comparación de la proporción de A1 frente a A2 con un umbral predeterminado. 15
4. El método de evaluación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la metástasis incluye metástasis de nódulo linfático y metástasis a distancia.
5. Un método para diagnosticar el cáncer de una célula obtenida de un organismo vivo que comprende diagnosticar una probabilidad de metástasis, una probabilidad de recaída o estimar el pronóstico con el uso de un método de evaluación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 1 a 4.
6. Un método para evaluar la sensibilidad de una célula de mamífero con respecto a un agente irritante que comprende:

evaluar la sensibilidad de una célula de mamífero basándose en la información que contiene una proporción de A1 frente a A2, en la que A1 es una proporción del valor de actividad frente al nivel 25 de expresión de la proteína de CDK1 contenido en la célula y A2 es una proporción del valor de actividad frente a nivel de expresión de la proteína de CDK2 contenido en la célula.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende:

evaluar una sensibilidad de una célula de mamífero basándose en la comparación de una proporción de A1 frente a A2 con un umbral predeterminado. 30
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, que adicionalmente comprende comparar A1 y/o A2 con un umbral que corresponde a A1 y A2, respectivamente.
9. El método de evaluación, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el agente irritante se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento, agente anticanceroso y mutágeno. 35