WO2004076686A1 - 細胞の検査方法 - Google Patents

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Toshiyuki Sakai
Hideki Ishihara
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method for profiling tissues and cells by simultaneously measuring cell cycle-related proteins in multiple items, and more particularly, to a method for molecular diagnosis of cancer tissues or cancer cells.
  • Cancer cells are distinguished by unlimited proliferation. If a means is found to selectively inhibit the growth of cancer cells without compromising the ability of normal cells to proliferate, arrest tumor growth regardless of the degree of differentiation, invasion or metastasis of the tumor becomes possible.
  • Anticancer drugs targeting proliferating cells have been widely developed as cancer therapeutics. However, it is important that such anticancer drugs have cytotoxicity because they also inhibit the growth of normal cells.
  • rCDKj cyclin-dependent kinase
  • the holoenzyme which is a cyclin / CDK complex, is inhibited by a protein called cyclin-dependent kinase inhibitor (hereinafter referred to as rcDKU) containing the protein p21 WAF1 / CIP1 (p2l).
  • the cyclin / CDK2 complex and the cyclin D / CDK4 or cyclin D / CDK6 complex regulate cell progression through a cell cycle checkpoint between the G1 phase and the DNA synthesis phase, S phase.
  • the cyclin B1 / CDK1 complex also controls the cell cycle checkpoint just before mitosis.
  • the p53 molecule (tumor suppressor molecule) is known as a protein that plays a central role in controlling the G1 phase of the cell cycle. It has been reported that the mutation of the p53 gene occurs at a high incidence in various cancer tissues. Normal p53 molecules function as transcription factors and regulate cell proliferation, DNA repair, differentiation, and apoptosis. In non-cancerous cells with damaged DNA, the p53 molecule promotes the expression of the CDKI molecule p21cipl / kipl, suppresses the intrinsic CDK2 kinase activity, and regulates the cell cycle at the G1 / S boundary. Stop at point R. On the other hand, mutated p53 molecules are unable to regulate the cell cycle, leading to uncontrolled cell growth and genomic instability, which can lead to cells becoming malignant.
  • An object of the present invention is to provide a more accurate method of diagnosing tissues and cells for performing a definitive diagnosis, a drug resistance test, and a prognosis of cancer.
  • the present inventors have focused on the relationship between the presence of various cell cycle regulators and the state of cancer cells, and as a result of intensive studies, measured the expression and activity of cell cycle-related proteins and determined the cell cycle profile.
  • the present inventors have found that more accurate diagnosis of cancer can be determined by analysis, and thus completed the present invention. That is, the present invention
  • a method for examining tissue and / or cells comprising measuring at least two or more cell cycle-related proteins and performing cell cycle profiling.
  • cell cycle-related proteins are at least two or more selected from CDK1, CDK2, CDK4 and CDK6.
  • the cell cycle-related protein measurement includes the cyclin expression measurement
  • a cancer testing method by performing the tissue and Z or cell testing method described in 1 above,
  • FIG. 1 shows CDK kinase activity in cancer tissues (A colon cancer, B gastric cancer, C esophageal cancer) and normal mucosa. (Example 2)
  • FIG. 2A and FIG. 2B show CDK kinase activity profiling. (Example 3)
  • the cell cycle-related protein refers to a factor capable of regulating the cell cycle, and specifically, a factor capable of promoting or arresting the cell cycle in a cycle from division of a cell to division of the cell again.
  • factors include, for example, cyclin, cyclin-dependent kinase (CDK), and cyclin-dependent kinase inhibitor Yuichi (CDKI).
  • cell cycle profiling refers to simultaneous measurement of at least two, preferably at least three, cell cycle-related proteins, and preferably one cell cycle-related protein. This refers to obtaining information (profile) on the state and properties of the tissues and cells to be measured by analyzing the other relative measurements based on the quality measurements.
  • Measurement items include, for example, CDK activities such as CDK1 activity, CDK2 activity, CDK4 activity and CDK6 activity, CDK1 protein expression, CDK2 protein expression, CDK4 protein expression and CDK6 protein expression, etc., cyclin B protein expression, cyclin D protein expression and cyclin E Examples include cyclin expression such as protein expression, pl6 protein expression, CDKI expression such as p21 protein expression and p27 protein expression, p53 protein expression, and Rb protein expression.
  • CDK activities such as CDK1 activity, CDK2 activity, CDK4 activity and CDK6 activity
  • CDK1 protein expression CDK2 protein expression
  • CDK4 protein expression and CDK6 protein expression etc.
  • cyclin B protein expression cyclin D protein expression and cyclin E
  • cyclin expression such as protein expression, pl6 protein expression, CDKI expression such as p21 protein expression and p27 protein expression, p53 protein expression, and Rb protein expression.
  • a reference value for obtaining a relative value for example, a CDK1 activity value and a CDK1 protein expression value can be considered, but a measured value other than the above items may be used.
  • any known or later-developed measurement method can be adopted.
  • CDK enzyme activity can be measured using a conventional radioisotope (RI) or without using RI (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-3355997). No. published patent publication).
  • RI radioisotope
  • any measurement method known or developed in the future can be adopted.
  • it can be measured by a simple quantitative analysis system based on protein expression analysis based on dot plot technology.
  • Table 1 shows the clinicopathological characteristics of patients with gastrointestinal cancer measured in the examples described below.
  • the median age of the study population was 65 years (range 23-86 years).
  • One of 22 colorectal cancers, 5 of 8 gastric cancers, and 3 of 7 esophageal cancers had clinical stage IV.
  • CDK1 CDK2 CDK4 CDK6 normal life, normal normal normal normal
  • CD 1 CDK2 CDK4 CDK6 normal normal ulcer normal normal colorectal 0 60 1.5 + 0.78 0.23 ⁇ 024 0.21 0. ⁇ 0.35 + 0.23 0 4 Sat ⁇ 5 0.19 ⁇ 0.23 0.24 + 0.25
  • Tables 2 and 3 show cancer colorectal cancer patients
  • Tables 4 and 5 show gastric cancer patients
  • Tables 6 and 7 show cancer activity and normal mucosal tissue of four CDKs and nine types of CDK in esophageal cancer patients. The expression results of cell cycle-related proteins are shown.
  • Table 8 shows the results of each CDK analysis on cancer tissues and normal mucosal tissues.
  • (+) is attached to the measured value exceeding the average + 2 SD (standard deviation), and (1) is attached to the measured value less than the average value minus 12 SD.
  • the measurement was performed by the method of the Example described later.
  • CDK1 The expression of CDK was higher for CDK1 in the three types of cancer tissues of the large intestine, stomach and esophagus than in normal mucosa.
  • the cut-off value of CDK1 expression per total protein was determined as the mean + 2SD in the corresponding normal tissue, which was 1.99 ng / pg in the large intestine, 1.60 ng / pg in the stomach, and 0.91 ng / pg in the esophagus.
  • the cut-off value of CDK1 expression per total protein was determined as the mean + 2SD in the corresponding normal tissue, which was 1.99 ng / pg in the large intestine, 1.60 ng / pg in the stomach, and 0.91 ng / pg in the esophagus.
  • CDK1 expression was found in 27% (6/22) of colon cancer tissue, 75% (6/8) of gastric cancer tissue, and 57% (4/7) of esophageal cancer tissue. was determined to be positive. All of these differences were statistically significant (large intestine; P 0.05, stomach; P ⁇ 0.05, esophagus; P 0.05, Wilcoxon signed-rank test).
  • CDK2 showed a statistically significant difference between cancer tissues and normal tissues (large intestine; P ⁇ 0.01, stomach; P ⁇ 0.01, esophagus; P ⁇ 0.01, Wilcoxon signed-ranks test ).
  • CDK4 activity and CDK6 activity were lower in cancer tissues than in normal mucosa (large intestine: CDK4P 0.05, large intestine; CDK6 P 0.05,
  • the technical scope of the present invention is a tissue test method, a reagent used in a cell test method, a test system, a cancer test method by the present test method, a cancer therapeutic drug selected by analyzing a profile, and a therapeutic method. It extends to
  • Each tissue (2 mm3) surgically collected was ground together with a lysis buffer containing Nonidet ⁇ _40 ( ⁇ ⁇ 40) (manufactured by Rikibiochem), and solubilized using a homogenizer. Insoluble substances were removed by Filichi. The obtained cell lysate was used as a tissue sample for measurement.
  • Samples containing 100 pg of total protein were combined with 2 pg of antibodies (anti-CDK1, 2, 4, and 6 antibodies, manufactured by Sanyu-Cruise) and 20 ⁇ l of protein A beads (bi- In addition to Oraddo Co.) by 1 hour at 4 a C, it was allowed to settle CDK molecules. After washing three times with a buffer solution (0.1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0), add 50 ⁇ l of the substrate mixture containing protein, shake at 37 ° C for 10 minutes, and incubate. did.
  • a buffer solution (0.1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • the substrate mixture consisted of 10 pg of histone HI (product of Upstate Biotechnology) corresponding to CDK1 and CDK2, 10 pg of C-terminal domain of recombinant Rb protein corresponding to CDK4 and 5 (aa 769-921), and 5 mM of adenosine. 5'-0- (3-Chio triphosphate) (ATP-Y S, sigma, USA), and buffer (20mM Tris-HCl, ⁇ 7.4, 0.1% Triton ⁇ - 100) is.
  • the monothiophosphoric acid induced in the substrate was combined with a coupling buffer (lOOmM Tris-HCl, pH8.5, IrriM EDTA) with the substrate further labeled with 10 mM o-acetylacetyl-biotin (Pierce, USA). After incubating at room temperature for 90 minutes at room temperature, the reaction was stopped with ⁇ -mercaptoethanol.
  • the substrate was added to the PVDF membrane using a slot blotter and aspirated.
  • the obtained membrane was blocked with 4% serum albumin (BSA) for 30 minutes, and allowed to react with avidin-FITC (manufactured by Vector I) at 37 ° C for 1 hour.
  • BSA serum albumin
  • the image on the membrane was analyzed with a fluorescence image analyzer (manufactured by Biorad). The activity was calculated based on a standard curve corresponding to 0, 12.5, 25, 50, 100, and 150 pg of CDK contained in the K-562 chronic myeloid leukemia cell line.
  • 1 U means the same as the enzyme activity when the total protein of K-562 cells is 1 pg.
  • the surgically collected tissue (2 mm3) was ground together with a lysis buffer containing Nonidet P_40 (NP-40) and solubilized using a homogenizer. Insoluble substances were removed by a filter. Then, a total of 2.5 pg of the protein was added to a well (2 ⁇ 2 ⁇ 3 mm-. Tolerance: 50 ⁇ 1) of a slot plotter on which a hydrophobic membrane (PVDF, manufactured by Millipore) was set.
  • the target substance in the crude sample bound to the membrane was quantitatively detected by the following reaction: an anti-cell cycle-related protein antibody, a biotinylated secondary antibody, and fluorescently labeled streptavidin.
  • TBS 25 mM Tris-HCL pH 7.4, 150 mM NaCl
  • the fluorescence image on the film was analyzed with an image analyzer (manufactured by Bio-Rad) to measure the fluorescence intensity of the dots.
  • Cell cycle-related proteins were quantified by a standard curve using standard recombinant proteins.
  • CDKi 2.5-25ng / dot, CDK2; 1.0-10ng / dot, CDK4; i.0-10ng / dot, CDK6; 2.5-25mg / dot
  • the enzyme activities of CDK1, 2, 4, and 6 were measured.
  • the activity was measured using the method described in Example 1 for each of the tissues of 22 cases of colorectal cancer (A), 8 cases of gastric cancer (B), 7 cases of esophageal cancer (C), and normal mucosa.
  • CDK2, 4, 6 For the G1 phase CDKs (CDK2, 4, 6), the activity values of CDK2, 4, 6 were normalized based on the activity value of CDK1, a G2 / M kinase, and the profile was examined. As a result, as shown by the solid line in Fig. 2A, the CDK profile in the G1 phase was 0.024-0.43 for CDK2 / CDK1, 1.2 to 39 for CDK4 / CDK1, and 1.2 to 39 for CDK6 / CDK1 was located in a fold width of 1.9 to 26, and was common. This indicates that the relative values of CDK activity are similar between normal colon tissues.
  • CDK1 activity value which is a G2 / M kinase
  • the method of the present invention for performing cell cycle profiling including activity measurements would be invaluable for tailor-made medical care. This is because, for breast cancer, it has been reported that the expression of cyclin E isomers that confer excessive activity on CDK2 is highly correlated with patient survival. [Industrial applicability]
  • cell cycle profiling including activity measurement is performed by the method of the present invention. More accurate examination of cancer tissues and cancer cells can be performed, and definitive diagnosis of cancer and drug resistance can be achieved. Sex tests and prognosis can be performed.

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Abstract

本発明は、癌の確定診断、薬剤耐性試験及び予後診断を行うためのより正確な組織もしくは細胞診断方法を提供することを課題とする。　細胞周期関連タンパク質を少なくとも２種以上測定し、それぞれの相対値を求める、つまり細胞周期プロファイリングを行うことを特徴とする組織及び細胞検査方法により、より正確な癌組織もしくは癌細胞の検査が可能となる。さらに、該プロファイリングにより、将来的にはテーラーメイドの癌治療薬の提供並びに癌治療方法の採用が可能となる。

Description

明 細 細胞の検査方法 [技術分野]
本発明は、 細胞周期関連夕ンパク質を多項目同時測定することによる 組織及び細胞のプロフアイリング方法に関し、 具体的には癌組織もしく は癌細胞の分子診断方法に関する。 [背景技術]
癌細胞は、 無制限に増殖することを顕著な特徴とする。 正常細胞の増 殖能を損なうことなく癌細胞の増殖を選択的に阻害する手段が発見され れば、 腫瘍の分化度、 侵達度又は転移の程度とは関係なく腫瘍の生育を 停止することが可能となる。 癌治療薬として、 増殖細胞を標的とする抗 癌剤の開発が広く行われているが、 このような抗癌剤は正常細胞の増殖 も阻害するために細胞毒性を有することが重要な問題である。
このような問題を解決するために、 癌細胞の分裂と正常細胞の分裂が どの様に異なるのかを理解することは、 興味深いことである。
細胞周期による細胞の増殖は、 細胞周期を通じてその濃度が変動する サイクリンと呼ばれるタンパク質と、 結合して活性型となるサイクリン 依存性キナーゼ （以下 r CDKj という。 ) との組合せによって形成され るホロ酵素により決定される。 また、 サイクリン / CDK複合体である該 ホロ酵素は、 夕ンパク質 p21 WAF1/CIP1 (p2l) を含むサイクリン依存 性キナーゼインヒピター （以下、 r cDKU という。 ) と呼ばれるタン パク質によって阻害される。
サイクリン E遺伝子、 D遺伝子及び B 1遺伝子のタンパク質並びに各 サイクリン依存性キナーゼである CDK については、 従来から種々の研 究がなされている。 サイクリン/ CDK2 複合体及びサイクリン D/CDK4 又はサイクリン D/CDK6複合体は、 G1期と DNA合成期である S期の 間の細胞周期チェックボイントを通じて細胞の進行を制御する。 また、 サイクリン B1/CDK1複合体は、 有糸分裂直前の細胞周期チェックボイ ン卜を制御する。
上記サイクリン /CDK 複合体に着目した癌の診断方法及び治療方法に 関する発明が既にすでに開示されており （特表 2 0 0 2 - 5 0 4 6 8 3 号公表特許公報、 特表 2 0 0 2— 5 1 9 6 8 1号公表特許公報） 、 細胞 周期調節因子を、 放射性同位元素 （以下 「RI」 という。 ） を使用せずに 測定する方法も開示されている （特開 2 0 0 2 — 3 3 5 9 9 7号公開特 許公報） 。
細胞周期のうち主に G1期の構造が破壊されると、 異常な細胞増殖が 誘導される。 細胞周期の G1期の制御において中心的役割を果たすタン パク質として p53分子 （腫瘍抑制分子） が知られている。 様々な癌組織 において、 該 p53遺伝子の突然変異が高い発生率で生じることは、 既に 報告されている。正常な p53分子は、転写因子として機能し、細胞増殖、 DNA修復、 分化、 及びアポト一シスを制御する。 また、 DNAが損傷し た非癌細胞において、 p53分子は CDKI分子である p21 cip l/kip lの発 現を促進し、 内在する CDK2キナーゼ活性を抑制し、 細胞周期を G1/S 境界である R点で止める。 一方、 突然変異した p53分子は、 細胞周期を 調節することができず、 制御不能な細胞の増殖及びゲノムの不安定性を 導き、 その結果細胞を悪性腫瘍に至らしめると考えられる。
一連の分子病理学的調査により、 G1期における CDK制御分子の臨床 的意義が明らかになつている。細胞周期調節タンパク質である CDK2に 対応するサイクリン E及び CDK4並びに CDK6に対応するサイクリン D1の過剰発現、及び CDKI分子、例えば CDK2に対応する p21、 CDK2, 4, 6に対応する p27、 及び CDK2に対応する p l6の不活性化は種々の組 織における腫瘍発生において重要な役割を果たしている。
しかし、 抗体毎の特異性に依存する免疫組織学的な技術がいまだ確立 されていないこと蔓から、 これらのサイクリン E；、 サイクリン D1 等の 癌組織における発現率は、 報告ごとに大きくばらついている。
[発明の開示]
本発明は、 癌の確定診断、 薬剤耐性試験及び予後診断を行うためのよ り正確な組織及び細胞の診断方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、 各種細胞周期調節因子の存在と癌細胞の状態に関連が あることに着目し、 鋭意研究を重ねた結果、 細胞周期関連タンパク質の 発現及び活性を測定し、 細胞周期プロファイルを分析することにより、 より正確な癌の診断が判断可能となることを見出し、本発明を完成した。 すなわち本発明は、
1 . 細胞周期関連タンパク質を少なくとも 2種以上測定し、 細胞周期プ ロフアイリングを行うことを特徴とする組織及び/又は細胞の検査方法、
2 . 細胞周期プロフアイリングが、 1つの細胞周期関連タンパク質の測 定値を基準とした他方の相対測定値を解析することにより、 組織及び/ 又は細胞の情報を得ることである前項 1に記載の検査方法、
3 . 細胞周期関連タンパク質がサイクリン依存性キナーゼである前項丄 に記載の検査方法、
4 . 細胞周期関連夕ンパク質が CDK1， CDK2, CDK4及び CDK6のいず れかから選択される少なくとも 2種以上である前項 2に記載の検査方法，
5 . 基準とする細胞周期関連タンパク質測定項目の 1種が CDK1活性値 である前項 2に記載の検査方法、
6 · 細胞周期関連夕ンパク質の測定が、 サイクリンの発現測定を含む前 項丄に記載の検査方法、
7 . 細胞周期関連タンパク質が、 サイクリン依存性キナーゼインヒビ夕 一である前項 1に記載の検査方法。
8 . 前項 1に記載の組織及び Z又は細胞の検査方法を行うことによる癌 検査方法、
9 . 前項 1に記載の検査方法のための検査システム、 よりなる。
[図面の簡単な説明]
第 1図は、癌組織（A大腸癌、 B胃癌、 C食道癌）及び正常粘膜の CDK キナーゼ活性を示す図である。 （実施例 2 )
第 2図 A及び第 2図 Bは CDKキナーゼ活性プロファイリングを示す 図である。 （実施例 3 )
[発明を実施するための最良の形態]
本発明において、 細胞周期関連タンパク質とは、 細胞周期を調節しう る因子をいい、 具体的には細胞が分裂してからさらにもう一度分裂する までの周期において、 細胞周期を促進又は停止しうる因子をいう。 この ような因子として、 例えばサイクリン、 サイクリン依存性キナーゼ ( CDK) のほか、 サイクリン依存性キナーゼインヒビ夕一 （CDKI) な どが挙げられる。
また、 本発明において、 細胞周期プロフアイリングとは、 細胞周期関 連タンパク質の発現又は活性を最低 2個以上、 好ましくは 3個以上同時 測定することをいい、 好ましくは 1つの細胞周期関連夕ンパク質の測定 値を基準とした他方の相対測定値を解析することにより、 測定対象とす る組織及び細胞の状態や性質に関する情報 （プロファイル） を得ること をいう。 測定項目は、 例えば CDK1活性、 CDK2活性、 CDK4活性及び CDK6活性などの CDK活性、 CDK1タンパク質発現、 CDK2タンパク 質発現、 CDK4夕ンパク質発現及び CDK6タンパク質発現などの CDK 発現、 cyclin Bタンパク質発現、 cyclin Dタンパク質発現及び cyclin E タンパク質発現などのサイクリン発現、 pl6 タンパク質発現、 p21 夕ン パク質発現及び p27タンパク質発現などの CDKI発現、 p53タンパク質 発現、 Rbタンパク質発現などである。
また、相対値を得る為の基準値としては、例えば CDK1活性値、 CDK1 夕ンパク質発現値が考えられるが、 上記項目以外の測定値を用いても良 い。
(細胞周期関連夕ンパク質の測定）
本発明の検査方法において行う細胞周期関連夕ンパク質の測定は、 公 知の又は今後開発されるあらゆる測定方法を採用することができる。 例 えば、 CDK 酵素活性は従来の放射性同位元素 （RI) を用いて測定する こともできるし、 RIを使用せずに測定することもできる （特開 2 0 0 2 - 3 3 5 9 9 7号公開特許公報） 。 臨床検査の現場において、 複数の患 者等からバイオプシーや外科切除等により採取した組織を簡便迅速に測 定するには、 RIを使用しない方法により測定することが好ましい。
また、 タンパク質発現量の測定も、 公知又は今後開発されるあらゆる 測定方法を採用することができる。 例えば、 ドッ トプロット技術に基づ いたタンパク質発現分析によるシンプルな定量分析システムにより測定 することができる。
(細胞周期プロファイリングのための試料の調製）
本発明の検査方法を行うために、 測定用試料を調製する必要がある。 具体的な細胞の可溶化方法、 CDKを含む試料の単離方法は、 特開 2 0 0 2 - 3 3 5 9 9 7号公開特許公報に記載されている方法を採用すること ができる。
(細胞周期プロフアイリング分析） 正常細胞において、 細胞の増殖は、 G1 期において調節因子により厳 格に制御されている。 一方、 制限ポイント （R) を通過した後の細胞周 期の進展は、 G1 期に比較して制御が緩やかである。 それゆえに G1 期 CDK ( CDK2, 4, 6)活性プロファィリングを、 G2/Mキナーゼ又は CDK1 活性値を基準として行うことは妥当である。
癌細胞における異常増殖の原因は、 細胞周期関連夕ンパク質の発現に よっては単純に分析することができない。 つまり、 これらの分子の不活 性化又は活性化の原因として、 タンパク質の発現量の増減に加え、 分子 の突然変異等が報告されている。 上記、 様々な原因を一義的なアツセィ システムで測定することは困難である。 そこで、 細胞周期関連蛋白質の 多くがその調節にかかわつている CDK活性を測定することは、 癌診断 に有用であると考えた。
表 1に、 後述する実施例で測定した胃腸癌を保有する患者の臨床病理 学的特徴を示した。 研究集団のメジアン年齢は 65歳 （23歳〜 86歳の範 囲） であった。 大腸癌 22例中の 1例、 胃癌 8例中の 5例、 食道癌 7例 中の 3例が臨床病期第 IV期であった。
1 患者の臨床病理学的特徴
w
忠者 性別年齢ステ シ' 部位 ism
リノハ m k 肝 u 大腸癌
C001 F 53 nib well/ mod As N2 PO HO MO V1 Ly1
C002 M 66 well/mod Rs NO PO HO MO V3 Ly1
C003 M 67 Ilia well/mod Rs-S N1 P0 HO MO V1 Ly1
C005 M 56 IHb mod-por Ac N2 P0 HO MO V1 Ly1
C006 M 48 Ilia welhmod Rb NO PO HO MO V1 Ly1
C007 F 80 Ilia ne Rb N1 PO HO MO V1 Ly2
C008 M 73 muc A NO PO HO MO VO Lyl j
C009 M 60 well/mod Rs NO PO HO MO V1 LyO
C010 M 83 Illb well/mod T N2 PO HO MO V2 Ly1
C011 M 77 Ilia well/mod Rs N1 PO HO MO V2 Ly1
C012 M 86 Ilia well/mod Rb N1 PO HO MO V2 Ly1
C013 F 7ΐ por>mod A NO PO HO MO VO Lyl
C014 F 81 well/mod Rs NO PO HO MO VO Lyl
C015 F 70 III well/mod Rab N1 PO HO MO V1 Ly2
0016 F 43 IV well S N1 PO HO M1 V1 Ly1
C017 M 47 u well/ mod RaRs NO PO HO MO V2 Ly1 y 1VI 59 well/mod 1 \ΰ Mn p 1 n HO IYI VI 1 v1
C019 F 34 Ilia well/mod Re N1 PO HO MO V1 Ly1
0020 73 well/ mod A NO PO HO MO VI Ly1
C021 M 48 Illb rnod-por Ds N2 PO HO MO V3 Ly3
C022 M 23 Illb por Ce N3 PO HO MO V1 Ly1
C023 F 79 well/ mod Rs NO PO HO MO V1 Ly1 - 慮者の臨床病理学的特徴 つ―
1ΐ別 军離 メ 7 ― ^
ノ 組線 3≥
リンハ。節 flfi 蔞 肝 Pi
円 ¾5
S001 Μ 70 IV tub2 Ue Ν2 PO H1 MO V1 し y1
S002 66 Illb por>tub2 Ue Ν2 PO HO MO V1 し yl
S005 59 lb tubl一 2 u NO PO HO MO V2 Ly2
S006 F 67 IV por2 し Ν2 PI HO MO V3 し y3
S008 Μ 75 IV tub2 >por1 し Ν2 PO H1 V し yd
S009 Μ 67 IV tub2 M Ν3 PO HI O Ly n
S 01 0 72 IV tub2 >por Ml Ν2 PO H i I I I V Lyo
SOI 1 F 40 II muc M Ν1 PO HO O VO し y2
E002 Μ 46 IVa po r>>mod Lt-Ae Ν2 O VI し yl
E003 Μ 77 IVb mod し t Ν3 tvn V2 Ly2
E005 44 III mod > we II MtLt Ν3 MO V1 Ly2
E006 Μ 60 III mod^por UtLt Ν1 MO VO Ly2
EOOS Μ 61 IVa mod t Ν2 WiO V2 Ly2
E009 Μ 65 II well Mt NT O V1 Ly1
ECH O Μ 59 III rnod>por Ae Ν3 MO V1 し yl
表 2 大腸癌患者の各 GDK活性 cdkl cdk2 cdk4 c 2k6 サンプル名 kinase kinase kinase kinase
(U/yg lysate) (U/pg lysateソ (U/pg lysate) (U/yg lysate)
C001 0.000 0.056 (+) 0.082 0.041 G002 0.049 0.072 (+)
C003 0.065 (+) 0.065 (+) 0.141 0.109 G005 0.024 0.097 (+)
C006 0.042 0.1 17 (+)
G007 0.020 0.057 (+)
G008 0.008 0.124 (+) 0.138 0.039 G009 0.001 0.038
C010 0.000 0.179 (+)
GO" 0.004 0.062 (+)
G012 0.024 0.034 0.020 (-） (0.032) (-) C013 0.000 _ 0.059 (+) (0.094) (一） (0.035) (-) G014 0.037 0.068 (+)
C015 0.022 0.053 (+)
G016 0.009 0.051 (+) 0.085 0.021 G017 0.041 0.091 (+) 0.095 0.089 G018 0.017 0.033 0.1 10 0.040 C019 0.000 0.045 (+) 0.099 0.154 G020 0.007 0.040 (0.003) (-) 0.050 C021 0.012 0.007 0.020 (-) 0.034 G022 0.003 0.063 (+) 0.012 (-) 0.012 G023 0.001 0.000 0.093 0.042
Figure imgf000012_0001
1
Figure imgf000013_0001
襄 4 胃癌患者の各 CDK活性 cdkl cdk2 cdk4 cdk6 サンプル名 kinase kinase kinase kinase
(U/ig lysate) (U/ g lysate) (U/ μg lysate) (U/ lysate) soot 0.096 0.ΪΪ6 (+) (0-014) (0.038) (-)
S002 0.011 0.014
S005 0.074 0.129 (+)
S006 0.000 0J82 (+) 0.015 0.038 (-) S008 0.027 0.181 (+) (0.012) 0.108 S009 0.000 0.555 (+) 0.067 0.024 (-) S010 0.000 0.226 (+) 0.037 O.lOt SOU 0.000 0.030 0.040 0.04 ί„ (-)
表 5— 1 ；患者の各タンパク質発現
计 々 cd
Figure imgf000015_0001
c ciinU 1
(ng pg lysate) ηβ ≤ lysate) (ng g lysate) (ng/ §1 lysate) (ng yg lysate)
S001 1.727 0.504 0.813 0.584 0.105
S002 6.960 (+) 2.232 (+) 2.255 (+) 3.627 (+) 0.256 C+)
S005 1035 0.000 (-) 0.282 0.000 C-) 0.051
S006 2.524 C+) 0.377 0.645 0.514 0.083
S008 3.023 C+) 0.404 1.536 (+) 0.376 0.195 (+)
S009 2.155 C+) 0.330 0.405 0.451 0.044
S010 4.278 (+) 0.343 0.690 0.518 0.103
S011 0.713 0.000 C-) 0.208 0.000 C-) 0.057
表 5— 2 ；患者の各タンパク質発現 j
P53 p21 p16
C/C,jnE p27 サンプル名 f 、 ELISA ELISA WB ( n.g lysa te)
<pg lysate) (mU/ lysate) (CNTxmm)
S001 0.518 0.158 4.050 580 (+) 0.141 S002 3.692 (十〕 0.182 8.550 0.566 (+) S005 0.300 1.279 3.824 0.109 S006 0.840 3.431 (+) 8.270 ISA (+) 0.138 S008 0.298 2.236 C+) 7.065 92.3 (+) 0077 S009 0.600 0.980 3.050 72.7 (+) 0.107 S010 0.420 0.104 16.560 C+) 68.4 C+) 0.096 SO11 0.312 0.000 1.150 16.7 0086
道癌患者の CDK活性
cdkl cdk2 cdk4 cdkS
kinase サンプル名 kinase kinase kinase
(U/pg lysate; (U/yg lysate) (U/xg lysate) (U/ μ§ lysate)
E002 0.000 0.073 (+) 0.125 0.149 E003 0.000 0.034
E005 0.000 0.089 (+)
E006 0.000 0.047 (+)
E008 0.000 0.033
E009 0.012 (+) 0.037 (+) 0.154 0.133 E010 0.002 0.048 — (+) 0.015 0.201
表 7— 1 [癌患者の各タンパク質発現 i
cdkl cdk2 cdk4 ycIinD I サンプ,! (ng/ lysate) Cng/ g lysate) (ng/ g lysate) (ng/ g; lysate; (ng/ pg lysate
E002 2.524 w 0.377 W 0.645 0.514 (÷) 0.083
E003 1.742 (+) 0.255 0.392 議 3
E005 3.240 (+) 0.324 (+) 1.095 ◎.567 (÷) 0.168
E006 0.841 0.000 0.674 0.345 (蚤） 0.055
EO 0.484 0.000 0.000 (-） 0.000 (-）
E誦 0.875 0.000 0.169 0.000 0.033 (-）
E 10 1.092 (+) 0.277 0.306 0.344 (÷) 0.060
表 7 — 2 食道癌患者の各タンパク質発現 i
p53 p21 p18
cycnnt p27
'ンプ ELISA ELISA 丽
"Ω (ng/ lysate (ng/pg lysat
(pg g lysate) (mU/ g lysate) (CNTxmm)
E觀 0.840 ¾ m
(+) 0.138
E003 0.391 W 0.099 10.749 (+) 0.081
E005 0.310 (+) 0.141 8.032 (+) 0.073
E00@ 0.313 (+) 0.240 1 1.526 (+) 0.088
EOOS 0.000 (-） 0.104 4.842 0.000
EQOS 0.000 (-） 0.247 5.750 0.066
Ei謹 0.000 (-） 0.126 8.560 (+) 0.083
表 8 活性（ 総 ノパク質 ± s.d.
CDK1 CDK2 CDK4 CDK6 正常 life 、正常 正常 正常
曰
大 ft ！' ¥ 0.017土 0.02G 0.0 士 0.019 0.012+0.016 0.065+0.040 0.086土 0.043 0.069土 0.05 0.094+0.11 0.049+0.044 田 0.034+ 0.036 0.027+0.038 0.040+0.031 0.18 ±0.17 0.1010.086 0.027+0.026 0.10+0.050 0.052 ±0.043 食道 0.004+ 0.003 0.003+0.0040.011 +0.011 0耐 0 0.098 + 0.073 0.16 0.16+0.036 発現（ ng/ g総 ンパク質 士 s.d. )
CD 1 CDK2 CDK4 CDK6 正常 正常 ί里瘍 正常 正常 大腸 0應 60 1.5+0.78 0.23 ±024 0.21士 0.Π 0.35+0.23 0 4土 ΰ 5 0.19 ±0.23 0.24+0.25 田
冃 0.84 ±0.38 2.8+2.0 0龍 29 0.52土 0.71 0.38 ±0.17 0.85+0.70 0.28 ± 0.76 + 1.2 食道 0.63 ±0」 4 1.7 + 1.0 0.084+0.11 0.2 0.16 0.59士 0.39 0.55+0.33 0.001 0.30+0.25
表 2及び表 3に癌大腸癌患者、 表 4及び表 5に胃癌患者、 並びに表 6 及び表 7に食道癌患者由来の癌組織及び正常粘膜組織における 4種類の CDK のキナーゼ活性及び 9種類の細胞周期関連蛋白質の発現結果を示 した。 また、 表 8に癌組織及び正常粘膜組織での各 CDK分析結果を示 した。
ここで、 表 2乃至表 7において平均値 + 2 S D ( standard deviation： 標準偏差） を超える測定値には （+ ) 、 平均値一 2 S D未満の測定値に は （一） を付している。 なお、 測定は、 後述する実施例の方法により行 つた。
CDKの発現は、 CDK1に関し、 大腸、 胃及び食道の 3種の癌組織で、 正常粘膜に比較し高値を示した。総タンパク質あたりの CDK1発現量の カッ トオフ値を、 相当する正常組織における平均値 +2SD として決定し たところ、大腸では 1.99 ng/pg、胃では 1.60 ng/pg、食道では 0.91 ng/pg であった。
このカツ トオフ値を用いて解析したところ、大腸癌組織の 27 % (6/22)、 胃癌組織の 75 % (6/8)、 食道癌組織の 57 % (4/7)について、 CDK1の発現 が陽性と判断された。 これらの相違はすべて統計上有意であった（大腸； Pく 0.05， 胃 ； P< 0.05, 食道； Pく 0.05、 Wilcoxon signed-rank 試験）。
これとは対照的に、 CDK2, 4， 6の発現に関して、 癌組織と正常組織間 に統計的有意差は認められなかった。
CDK活性のうち、 CDK2については、 癌組織と正常組織間で統計上著 しい相違が認められた （大腸； P< 0.01、 胃 ； P<0.01、 食道； Pく 0.01、 Wilcoxon signed-ranks ϊί験) 。
各組織について、 夕ンパク質重量あたりの CDK2活性の力ッ 1、オフ値 を、正常組織で示される CDK2活性の平均値 +2SDとすると、大腸； 0.054 U/ g、 胃 ； 0.102 U/pg、 食道； 0.033 U/pgであった。 これにより、 大 腸癌組織の 72 % (16/22)、胃癌組織の 75 % (6/8)、及び食道癌組織の 100 % (7/7)が陽性と判断された。 例えば乳癌については、 過剰な活性を有する サイクリン Eの異性体 (isoform)の発現が、患者生存率と強力に相関する ことが報告されており、 このことは、 高い CDK2活性がゲノムの不安定 性及び癌の悪性化の主な原因であることを示唆する。
CDK4活性及び CDK6活性については、 正常粘膜と比較すると癌組織 の方が低値であった （大腸 ； CDK4 Pく 0.05、 大腸 ； CDK6 Pく 0.05、
Wiicoxon signed-ranks 百 験) 。
胃の組織では、 他の臓器に比較して、 CDK1及び CDK2の両方に高い 発現と活性が見られた。 これらの結果は、 他の器官よりも胃の粘膜組織 が活発に再生していることを、 又は、 日本人にしばしば観察される
Helicobacter Pyroli感染による肥厚増殖を示唆する。
本発明の技術的範囲は、組織検査方法、細胞検査方法に使用する試薬、 検査システム、 本検査方法による癌の検査方法並びにプロファイルを分 析することにより選択された癌の治療薬、 治療方法にまで及ぶものであ る。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、 本発明は、 これ らに限定されるものではない。
(実施例 1 ) 細胞検査方法
1 ) 測定用組織試料の調製
外科的に採取した各組織 （2mm3) を、 ノニデッ ト Ρ_40(ΝΡ·40) (力 ルビオケム社製） を含む溶解緩衝液とともにすりつぶし、 ホモジナイザ —を用いて可溶化した。 不溶性物質は、 フィル夕一により除去した。 得 られた細胞可溶化液を測定用組織試料とした。
2 ) CDK活性測定
総タンパク質量 100pgを含む試料を、 2pgの抗体 （抗 - CDK1, 2, 4及 び 6抗体、 サン夕-クルーズ製) 及び 20μ1のプロテイン Aビーズ (バイ オラッド社製）に加えて 4aCで 1時間反応させ、 CDK分子を沈降させた。 緩衝液 (0.1 % NP-40, 50mM Tris-HCl, pH7.0)で 3回洗浄したのち、 タ ンパク質を含む基質混合物を 50μ1加え、 37°Cで 10分間振盪してィンキ ュべ一卜した。
基質混合物は、 CDK1及び CDK2に対応する 10pgのヒストン HI (ァ ップステイ トバイオテクノロジー製） 、 CDK4及び 5 に対応する 10pg の遺伝子組換え Rbタンパク質の C末 ドメイン（a. a. 769-921)、 5mM のアデノシン 5'-0-(3-チォ 3リン酸） (ATP-YS、 シグマ社製、 USA), 及び 緩衝液 (20mM Tris-HCl, ρΗ7.4, 0.1% Triton Χ- 100) である。
ピーズの除去後、 基質中に誘導されたモノチォリン酸は、 10mMのョ —ドアセチル -ビォチン （Pierce 製、 USA) でさらにラベルされた基質 とともにカツプリング緩衝液 （lOOmM Tris-HCl, pH8.5, IrriM EDTA) 中で喑所において 90分間室温にてィンキュベートした後、 反応を β-メ ルカプトエタノールで停止した。
反応後の基質 0.4pgを、 スロッ トブロッタ一を用いて PVDF膜上に添 加し、 吸引した。 得られた膜を 4%のゥシ血清アルブミン （BSA) で 30 分間ブロックし、 アビジン- FITC (ベクタ一製） を 37°Cで 1時間反応さ せた。
膜を洗浄した後、 膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー （バイ ォラッド社製） により分析した。 活性は、 K-562慢性骨髄性白血病細胞 株に含まれる 0， 12.5, 25, 50, 100, 150pgの CDKに対応する標準曲線に 基づいて活性を算出した。
なお、 1Uは、 K-562細胞の総タンパク質 l pgのときの酵素活性と同 等のものをいう。
3 ) タンパク質発現測定
外科的に採取した組織 （2mm3) を、 ノニデッ 卜 P_40(NP-40)を含む 溶解緩衝液とともにすりつぶし、 ホモジナイザーを用いて可溶化した。 不溶性物質は、 フィルタ一により除去した。 そして、 合計 2.5pgのタン パク質を、 疎水性膜 (PVDF,ミリポア社製) をセッ トしたスロットプロ ッターのゥエル ( 2x2x3mm-. 許容量： 50μ1) に加えた。 膜に結合した 粗製試料中の標的物質は、 次の反応である抗細胞周期関連夕ンパク質抗 体、 ピオチン化した 2次抗体及び蛍光ラベルしたストレプトアビジンの 反応により定量的に検出した。
各反応の間に、 ゥエルは TBS(25mM Tris-HCL pH7.4、 150mM NaCl) により自動的に洗浄された。
膜上の蛍光イメージをイメージアナライザ一 (バイオラッド社製) に よって分析し、 ドットの蛍光強度を測定した。 細胞周期関連タンパク質 の定量は、 標準遺伝子組換えタンパク質を用いた標準曲線により行った
( CDKi; 2.5-25ng/dot, CDK2; 1.0-10ng/dot, CDK4; i.0-10ng/dot, CDK6; 2.5-25mg/dot) c (実施例 2 ) CDK活性について
胃腸癌組織及び正常粘膜について、 CDK1、 2、 4及び 6の各酵素活性 を測定した。活性の測定は、実施例 1に記載の方法を用いて、大腸癌 (A)22 症例、 胃癌 (B)8症例、 及び食道癌 (C)7症例及び正常粘膜の各組織につい て行った。
その結果を第 1図 A〜 Cに示した。 その結果、 癌組織と正常な粘膜に おいて、 各酵素活性の相違は、 大腸、 胃及び食道組織の CDK2活性の上 昇において、 統計的有意性が認められた （P<0.01) 。 一方、 大腸及び胃 癌組織の CDK4及び CDK6は、正常な粘膜よりも比較的低い活性を示し た。 統計的分析は、 Wilco3£on signed-ranks 試験により行った。 CDK2 酵素活性の増加は、 ほとんどの大腸、 胃、 食道癌組織において観察され た。 (実施例 3 ) CDK活性プロファイルについて
G1 期の CDK(CDK2、 4、 6)について、 G2/M キナーゼである CDK1 活性値を基準にして CDK2、 4, 6の活性値を標準化し、 プロファイルを 調べた。 その結果、 図 2 A実線で示すように、 正常大腸粘膜組織 8例中 7例について、 G1期の CDKプロファイルは、 CDK2/CDK1では 0.024 - 0.43, CDK4/CDK1では 1·2〜39、 CDK6/CDK1では 1·9〜26のフォ 一ルド幅に位置しており、 共通していた。 これは、 正常大腸組織の間に おいて CDK活性の相対値が類似していることを示すものである。
次に、 大腸癌組織 9例の症例から無作為に選ばれものについて、 同様 に G1期の CDK(CDK2、 4、 6)について、 G2/Mキナーゼである CDK1 活性値を基準にしたプロファイルを調べた。 その結果、 第 2図 Bに示す ように、 正常粘膜組織に見られた共通プロファイルと一致したプロファ ィルは観察されなかった。
本発明の方法により、 活性測定を含む細胞周期プロフアイリングを行 うと、 より正確な癌組織及び癌細胞の検査が可能であることが見出され た。 各細胞周期調節因子の発現、 活性、 及びプロフアイリング等の分析 は、 レトロスぺクティブ又はプロスペクティブ試験において、 予後因子 としての価値が見出される可能性が高いと予想される。
また、 活性測定を含む細胞周期プロフアイリングを行う本発明の方法 は、 テーラ一メイ ドの医療に適応しうる非常に貴重なものとなるであろ う。 なぜならば、 乳癌については、 CDK2に過剰な活性を与えるサイク リン Eの異性体の発現が、 患者生存率と高度に相関することが報告され ているからである。 [産業上の利用可能性]
本発明の方法により活性測定を含む細胞周期プロフアイリングを行う と、 より正確な癌組織及び癌細胞の検査ができ、 癌の確定診断、 薬剤耐 性試験及び予後診断が可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 細胞周期関連タンパク質を少なくとも 2種以上測定し、 細胞周期 プロフアイリングを行うことを特徴とする組織及び/又は細胞の検査方 法。
2 . 細胞周期プロフアイリングが、 1つの細胞周期関連夕ンパク質の 測定値を基準とした他方の相対測定値を解析することにより、 組織及び z又は細胞の情報を得ることである請求の範囲 1に記載の検査方法。
3 . 細胞周期関連タンパク質がサイクリン依存性キナ一ゼである請求 の範囲 1に記載の検査方法。
4 . 細胞周期関連タンパク質が CDK1, CDK2, CDK4及び CDK6のい ずれかから選択される少なくとも 2種以上である請求の範囲 2に記載の 検査方法。
5 . 基準とする細胞周期関連タンパク質測定項目の 1種が C D K 1活性 値である請求の範囲 2に記載の検査方法。
6 . 細胞周期関連タンパク質の測定が、 サイクリンの発現測定を含む 請求の範囲 1に記載の検査方法。
7 . 細胞周期関連タンパク質が、 サイクリン依存性キナ一ゼインヒビ ターである請求の範囲 1に記載の検査方法。
8 . 請求の範囲 1に記載の組織及び Z又は細胞の検査方法を行うこと による癌検査方法。
9 . 請求の範囲 1に記載の検査方法のための検査
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