JP4340544B2 - プロテインキナーゼをアッセイするための方法および試薬 - Google Patents
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Description
試薬とペプチド
Ro318220、K252c及びRottlerinはカルビオケム−ノバビオケム社(ラホーヤ、CA、アメリカ)より購入した。Y2は化学合成により得た。また、UCN01はダンディー大学生命科学校のCarl Smythe博士のご厚意により頂いた。ヒストンH1はライフテクノロジーズ(パースリー、スコットランド、イギリス)より購入した。ペプチドはすべてGraham Bloomberg博士(ブリストル大学生化学学科、イギリス)及び本学のF.B.Caudwell氏の合成による。
AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK、S.Hawley博士及びD.G.Hardie博士提供)、cGMP依存型プロテインキナーゼ(PKG、ヴュルツブルグ大学(ドイツ)のSusanLohmann博士及びUlrichWalter博士のご厚意による提供)、及び環状AMP依存型プロテインキナーゼの触媒サブユニット(PKA、C.Smythe博士提供)は、それぞれラット肝臓、ウシ肺及びウシ心臓より単離したものである。これらを除きその他のプロテインキナーゼは、すべてGST融合またはHisタグタンパクのどちらかとして発現させた(本学科のMsC.Clark氏、MsF.Douglas氏、A.Paterson博士、またはMsG.Wiggiri氏による)。発現させたタンパク質は、ラットRho依存型プロテインキナーゼ(ROCK−II)及びキナーゼ1a(MAPKAP−K1a、RSKともいう)を活性化するラット有糸分裂因子活性型プロテインキナーゼ(MAPK)を除き、すべてヒト配列と同等である。GST融合タンパクはGSH−アガロース(アマシャムファルマシアバイオテック、アマシャム、イギリス)で、またHisタグタンパクはNi−NTAアガロース(Qiagen)を用いて、ほぼ取扱説明書に従って精製した。本研究で用いられたすべてのプロテインキナーゼは、カルモジュリン依存プロテインキナーゼII(CaMKII)のα−アイソフォーム、MAPKAP−K3及びPKGを除き、アップステートバイオテクノロジー社(レイクパラシッド、NY、アメリカ)より購入可能である。
以下の酵素はGST融合タンパクとして大腸菌により発現させた。細胞外シグナル調節型プロテインキナーゼ−2(ERK2)およびストレス活性化プロテインキナーゼ−2a(SAPK2a、p38とも呼ばれる)。MAPKAP−K2、MAPKAP−K3、CaMKII(カルビオケム−ノバビオケム社)およびチェックポイントキナーゼ2(CHK2)。CHK2は全長生成物の精製を補助するために、C末端側の端部に補足的にHisタグを含む。ERK2はRaf活性化MAPKキナーゼ1(MKK1)により活性化した、またSAPK2a/p38は、MKK6の構成性の活性突然変異体を用いて活性化した。MKK1とMKK6もGST融合タンパク質として大腸菌により発現させた。
以下の酵素はSf21細胞により発現させた。チェックポイントキナーゼ1(CHK1)およびp38調節/活性化キナーゼ(PRAK)プロテインキナーゼBα(PKBα)、MAPKAP−K1a、及び血清およびグリココルチコイド誘導キナーゼ1(SGK1[S422D])、N末端59残基を欠く)、有系分裂促進物質、およびストレス活性化プロテインキナーゼ(MSK1)、p70のリボソームのS6キナーゼ1(S6K1[T412E])、C末端104残基を欠く)、c−Raf、プロテインキナーゼC(PKC(PKCα、カルビオケム−ノバケム社)、ラットROCKII[1−543])。
MAPKAP−K2およびMAPKAP−K3はMgATP及び細胞外シグナル調節型プロテインキナーゼ−2(ERK2)により、ERK2はMAPKキナーゼ−1(MKK1)により、MKK1はRafにより、SAPK2a/p38はMKK6により、PRAKはSAPK2a/p38により、PKBα、SGK1及びS6K1はPDK1により活性化した。
以下の結果に記載する、3種の一般的なペプチド基質に含まれる共通した7残基であるリン酸化したモチーフ(LpSFAEPG)を認識する抗体を、ペプチドLpSFAEGC(ここでpSはリン酸セリンを表す)に対して産生させた。C末端のシステイン残基は、キーホールリンペットヘモシアニンと結合できるように追加したものである。ペプチド−タンパク複合をディアグノスティックスコットランド(カールーク、イギリス)社のヒツジに注射し、抗血清をプロテインG−セファロース(アマシャムファルマシアバイオテック)により精製した(本学のJ.Leitch博士による)。抗体は、イムノブロットに対しては2μg/mlの濃度で、また改良ELISA法におけるリン酸化ペプチドの検出には10−20μg/mlの濃度で使用した。ウサギ抗ヤギ抗体のペルオキシダーゼ複合体は、ピアス(タッテンホール、チェシア、イギリス)より購入し、1/10,000に希釈して使用した。
すべてのプロテインキナーゼアッセイは、時間に対してリニアであった。標準的なペプチド基質を用いたアッセイについては前述している(非特許文献4)。本実施例で紹介される一般的な3のペプチドを使ったアッセイは、すべて以下の同じ緩衝液を用いて行われた。非標識のまたはビオチン標識した基質ペプチドを、0.1mM(γ32P)ATPの存在下で、50μlの反応液中で30度10分間アッセイした。放射性のアッセイは、反応液の40μlをリン酸セルロース紙にスポットし、続いて75mMリン酸溶液に浸漬することで停止させた。リン酸セルロース紙はすべてリン酸で3回、アセトンで1回洗浄し、乾燥させて放射活性を測定した。非放射性のアッセイは、終濃度が20mMとなるようにEDTAを加えて停止させ、Tween20を0.1%含む等量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した後、反応により捕獲されたペプチドを洗浄済みのストレプトアビチンでコートした96穴プレート(EquilonA/S、Vedbaek、デンマーク)で60分間ビオチン化した。そのプレートを0.1%Tween、PBSで6回洗浄(各5分)し、その後一般的なリン酸特異的抗体(上記参照)に対して産生された抗体(10〜20μg/ml)を60分間反応させた(上記参照)。プレートを0.1%Tween、PBSで6回洗浄(各5分)し、ペルオキシダーゼ複合抗ヤギ抗体(ピアス)をプレートに反応させてリン酸特異的な抗体の結合を検出した。プレートはさらに上記と同様に6回洗浄し、結合を増感化学ルミネッセンス(アマシャムファルマシアバイオテック)を用いて富士フイルムLAS−1000 CCDカメラで可視化した。シグナルはLAS−1000IRソフトウェア(富士フイルム)により量的評価した。
一般的なペプチド基質の作製
上述のように、多くのプロテインキナーゼは特定のアミノ酸モチーフ状のセリン残基をリン酸化する。我々は、多くのプロテインキナーゼをアッセイでき、単リン酸特異的な抗体を産生するのに使用できそうな、共通のC末端エピトープを持つ多数のペプチドを試験した。その結果、表1に示すような、PKBによりリン酸化されるグリコーゲン合成酵素キナーゼ3を取り囲む配列に関連する共通した7残基を含む3の包括的ポリペプチドの作製に至った。標準的な放射性のフィルター結合アッセイによると、これらの3のポリペプチドの1以上が数種の異なるキナーゼサブファミリーに分類される16のプロテインキナーゼにより十分にリン酸化された。実際、多くの場合、これらの3のペプチドが十分にリン酸化されていることが明らかとなったほか、通常のアッセイに常用される基質よりも十分にリン酸化される場合もあった。
本研究の主な目的は、簡潔に言えば、非放射性であり多数のプロテインキナーゼに応用できるアッセイ法による、プロテインキナーゼの「高い処理能力のスクリーニング」である。このために、我々は3の包括的基質に共通なリン酸化エピトープ(LpSFAEPG)を認識できるリン酸特異的な抗体を作製した(方法を参照)。この抗体は<10ngの複合リン酸ペプチド抗原を認識する(図1)。リン酸化した状態の3の包括的基質ペプチドを認識する抗体の能力は、競合実験により確証した。この実験では、リン酸化ペプチド抗体は7残基のリン酸−ペプチド抗原による前反応だけでなく、各リン酸化された一般的なペプチド基質による前反応によっても無力化された。対照的に、リン酸化されていない状態の同様なペプチドは、抗体を無力化することができなかった(図1)。
続いて、3の包括的ペプチドを上記のリン酸特異的な抗体と共に用いて、表1に示す一連のプロテインキナーゼに対するELISA法を基礎とした非放射性の簡便なアッセイ法を構築した(方法参照)。アッセイは標準的な放射性のフィルター結合アッセイと平行して行い、またペプチドの10%未満がリン酸化されるような直線的な反応速度となる状態で行った(図2)。その結果、非放射性のアッセイは標準的な放射性のアッセイと同様な精度を持ち、用いたプロテインキナーゼに対する公知な阻害物質の存在下では両者で同等な程度に阻害が認められた(非特許文献5)。
この実施例では、多種のプロテインキナーゼに対する高い処理能力のスクリーニングに好適な非放射性の簡便なアッセイ法について述べた。3種のペプチドは今回実験したプロテインキナーゼに深く関連するあらゆるアイソフォームの基質として、またおそらくすべてではなくもほぼすべての同じキナーゼサブファミリーに属するプロテインキナーゼの基質として用いることができると考えられる。また、同じC末端エピトープを持つペプチドもまた、リン酸化部位のN末端側にある特定のモチーフを認識する他のプロテインキナーゼのアッセイに用いることができると考えられる。例えば、CK1(カゼインキナーゼ1と呼ばれる)は、あるリン酸セリン残基から3残基C末端側のセリン残基をリン酸化する(非特許文献10)。即ち、Xaa−pSer−Xaa−Leu−Ser−Phe−Ala−Glu−Pro−Gly型のペプチドをリン酸化することができる。従って我々の方策は、少なくとも50、おそらく100以上のプロテインキナーゼに応用することができると考えられる。今回開発したアッセイ法は、リン酸化部位のC末端側のモチーフもしくは残基に厳格な要求があるプロテインキナーゼには利用することができない。例えば、MAPキナーゼ及びサイクリン依存型プロテインキナーゼはリン酸化部位に隣接するC末端側にプロリン残基が必ず必要であり(非特許文献5)、これは本実施例のプロテインキナーゼにとっては否定的な決定基となる。同様に、CK2はリン酸化部位のC末端側に数個の連続した酸性基が必要であり、またDNA依存プロテインキナーゼはC末端グルタミン酸が必要である(非特許文献5)。しかしながら、ここに示す結果によれば、共通のN末端エピトープを持つ2番目のペプチド基質はリン酸化において特定のC末端モチーフを要求する多数のプロテインキナーゼのアッセイに有用である。
モノクローナル抗体の作製ペプチドを、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)であるキャリアタンパクと結合させることができる。キャリアタンパク(たとえばKLH)は、約10mg/mlとなるようにPBSに溶解させる。m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)のジメチルホルムアミド溶液を調製する。0.1体積のMBSを、部分的に高濃度とならないよう撹拌しながらキャリアタンパク溶液に滴下する。1mlの10mg/mlペプチド溶液を添加する。活性化したキャリアと結合しなかったペプチドをPBSを用いてP10カラムで分離する。
化合物のスクリーニング法
相同FRET分析法を用いて、対象とする化合物をビオチン化ペプチド基質、酵素及びユーロピウム標識抗体にストレプトアビジンAPCを含む緩衝液中で反応させた。ペプチドのリン酸化によりユーロピウム標識抗体が基質に結合し、ユーロピウムがAPCと近接する。その結果、ユーロピウムからAPCへの電子転移が可能となり、励起波長610nm、放射波長660nmにて測定することができる。
Claims (22)
- 2以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドを有する部品からなるキットであって、
前記基質ポリペプチドはそれぞれ特異性決定部位(各キナーゼ基質ポリペプチドにより異なる)と、リン酸化可能な部位を有し、各ポリペプチドの前記リン酸化可能部位はアミノ酸配列LSFAEPGを有し、リン酸化の状態に依存して、抗体である、同一の特異的な結合相手と結合でき、前記特異的な結合相手は、単独のホスホチロシン残基、ホスホセリン残基またはホスホトレオニン残基に特異的な抗体ではない、キット。 - 請求項1に記載のキットにおいて、前記ポリペプチドのリン酸化可能部位は同一のアミノ酸配列を有するキット。
- 2以上のポリペプチドを有する部品からなるキットであって、前記ポリペプチドは請求項1または2に定義される2以上のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドであり、前記ポリペプチドのリン酸化可能部位の少なくとも1はリン酸化されているキット。
- 請求項1から3の何れかに記載のキットであって、前記各ポリペプチドはその長さがそれぞれ40、30、20、19、18、17、16、15または14個未満のアミノ酸であるキット。
- 請求項4に記載のキットであって、前記各ポリペプチドはその長さがそれぞれ13、12、11、10または9個のアミノ酸であるキット。
- 請求項1から5の何れかに記載のキットであって、前記プロテインキナーゼ基質ポリペプチドはセリン/トレオニンプロテインキナーゼに対する基質であるキット。
- 請求項1から6の何れかに記載のキットであって、さらに特異的な結合相手を有するキット。
- アミノ酸配列LSFAEPGにより構成されるエピトープに特異的な抗体。
- アミノ酸配列LpSFAEPGにより構成されるエピトープに特異的な抗体。
- 長さが40、30、20、19、18、17、15または14個未満のアミノ酸のプロテインキナーゼ基質ポリペプチドであって、
前記ポリペプチドはグリコーゲン合成酵素3の断片ではなく、前記ポリペプチドはアミノ酸配列LSFAEPGを有し、さらにプロテインキナーゼに対するコンセンサス配列と一致するアミノ酸配列(前記配列LSFAEPGと重複してもよい)を有する特異性決定部位を有し、前記コンセンサス配列と一致する配列は、前記プロテインキナーゼが前記ポリペプチドにおける前記配列LSFAEPGのセリン残基をリン酸化できるように前記配列LSFAEPGに関連して配置している、ポリペプチド。 - 請求項10に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さが13、12、11、10または9個のアミノ酸であるポリペプチド。
- 請求項10または11に記載のポリペプチドであって、前記コンセンサス配列に相当するアミノ酸配列は配列LSFAEPGのN末端まで続いているポリペプチド。
- 請求項10から12の何れかに記載のポリペプチドであって、前記コンセンサス配列が、Arg/Lys−Arg/Lys−Arg/Lys−Xaa−Ser、Arg/Lys−Xaa−Arg/Lys−Xaa−Xaa−Ser、Hyd−Xaa−Arg−Xaa−Xaa−ser、またはXaa−pSer−Xaa−Xaa−Serであるポリペプチド。
- 請求項10から13の何れかに記載のポリペプチドであって、前記配列LSFAEPGのセリンはホスホセリンに置換されているポリペプチド。
- 請求項10から14の何れかに記載のポリペプチドまたはリン酸化ポリペプチドを、プロテインキナーゼ活性のアッセイに用いる前記ポリペプチドの利用方法。
- 請求項8または9に記載の抗体を、プロテインキナーゼ活性のアッセイに用いる前記抗体の利用方法。
- プロテインキナーゼを含むかもしれない試料に対してプロテインキナーゼをスクリーニングする方法であって、
請求項11から15何れかに記載のポリペプチドを試料に反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうかを測定する工程を有する方法。 - プロテインキナーゼの活性を評価する方法であって、
請求項10から13の何れかに記載のポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうかを測定する工程を有する方法。 - 第1のプロテインキナーゼと第2のプロテインキナーゼの活性を評価する方法であって、
請求項1に記載のキットの第1のポリペプチドを前記第1のプロテインキナーゼに反応させる工程と、請求項1に記載のキットの第2のポリペプチドを前記第2のプロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうかを測定する工程を有する方法。 - プロテインキナーゼの活性を評価する方法であって、
請求項2に記載のキットの第1の(リン酸化されていない)ポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうかを測定する工程を有する方法。 - プロテインキナーゼの基質特異性をキャラクタライズする方法であって、
請求項1に記載のキットの第1のポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、請求項1に記載のキットの第2のポリペプチドを前記プロテインキナーゼに反応させる工程と、前記ポリペプチドがリン酸化されたかどうかを測定する工程を有する方法。 - 請求項17から21のいずれか一項に記載の方法であって、どの程度リン酸化されたかを測定する工程をさらに有する方法。
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