JP5514453B2 - 発光タンパク質を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、カルシウム結合型発光タンパク質で標識した抗リン酸化抗体を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法、及びリン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおいて使用するためのカルシウム結合型発光タンパク質標識抗リン酸化抗体に関する。

カルシウム結合型発光タンパク質は、カルシウムイオンと特異的に結合し、その結合により瞬間的に発光するタンパク質である。そのようなものとしては、現在、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン、及びベルボイン等が知られている。これらの発光タンパク質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、また、その発光強度が強いため、これらの発光タンパク質の発光に関しては、市販の検出装置を用いて検出した場合の検出限界がタンパク質１ピコグラム以下という、高い検出感度が実現できる（非特許文献１）。そのため、カルシウム結合型発光タンパク質は、上記のような特徴を活かし、細胞内カルシウム、及び液体検体（例えば、血液）中の微量カルシウムイオンの検出並びに定量に利用されている。

イムノアッセイにおける検出法では、通常、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどを用いた化学発光反応が用いられるが、それらを用いる検出法では化学発光の際のバックグラウンドが問題となり、また、検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がある。一方で、カルシウム結合型発光タンパク質の発光はカルシウムイオンとの特異的な結合により生じるため、通常用いられるアルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた化学発光反応において問題となるバックグラウンドは全くない。それに加えて、カルシウム結合型発光タンパク質では、カルシウムの添加という簡便な処理により、カルシウムイオンの結合に際して瞬時に発光が起こり、その発光は数秒以内に終了する。このため、短時間にシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）の高い検出を行うことができるという利点を有する。また、その発光はカルシウムとの結合に依存することから、検出の時点でのみ発光を生じさせることが可能であり、したがって検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がない。さらに、カルシウム結合型発光タンパク質の発光反応は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、当該反応に必要な構成要素はすべてが生体由来であるため、有害な化学物質等（例えば、放射線同位体、発癌性化合物）を含まず、よって安全性が高い。この理由から、当該発光タンパク質は、診断薬等における標識として応用されている。

ヒトをはじめとする生物では、その外的環境の変化により、細胞レベルで様々な応答反応が引き起こされる。これらの応答としては、細胞運動、細胞死、生理活性物質の産生などが挙げられ、場合により、産生された生理活性物質の刺激によって他の細胞がさらなる応答反応を示す。このような応答反応には、タンパク質リン酸化を介した細胞内情報伝達が深く関わっている。遺伝子転写、タンパク質翻訳、分子輸送、タンパク質間相互作用、その他の様々な現象がタンパク質リン酸化を介した情報伝達によって制御されていることは広く知られている（非特許文献２）。また、ある種のリン酸化酵素が疾患時に活性化されること、及び遺伝子変異等によりリン酸化酵素が制御不能となることが疾患の原因となり得ることも示唆されてきている（非特許文献３）。

Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｊｕｌｙ １９７５，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．７，ｐ．２５３０−２５３４ 山本ら（編）、実験医学増刊「シグナル伝達研究２００５−’０６」、羊土社、２００５年 Ｋｉｙｏｉ，Ｈ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｅｐ １９９８，１２（９），ｐ．１３３３−１３３７

このように、タンパク質リン酸化反応は細胞の活動にとって重要な働きを担っている。上記のとおり、ある種のリン酸化酵素は疾患に関連する場合もあるため、特定のリン酸化酵素を特異的に阻害する阻害物質をスクリーニングすることにより、様々な疾患に対する治療薬・予防薬を開発することが可能になる。したがって、そのような阻害物質のスクリーニングを正確、迅速且つ低コストで行う方法が必要とされている。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、リン酸化反応を効果的に検出する手段を開発し、そのような手段を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法を完成させた。

より詳細には、本発明は、以下の特徴を有する：
〔１〕リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（ａ）阻害候補物質の存在下で、基質ペプチドのリン酸化が可能な条件において該基質ペプチドにリン酸化酵素を作用させるステップ、
（ｂ）カルシウム結合型発光タンパク質で標識した抗リン酸化抗体を、（ａ）でリン酸化酵素を作用させた基質ペプチドと接触させるステップ、
（ｃ）カルシウムを添加し、標識抗体−基質ペプチド複合体から生じる発光を検出するステップ、
（ｄ）該候補物質の非存在下で、（ａ）〜（ｃ）を行うステップ
を含み、ここで、該抗リン酸化抗体は、該リン酸化酵素によりリン酸化された基質ペプチドに特異的に結合可能なものであり、かつ、ステップ（ｃ）から得られた発光シグナルが、ステップ（ｄ）から得られた発光シグナルより低い場合に、該候補物質が該リン酸化酵素の活性を阻害するものであることが示される、上記方法。
〔２〕前記基質ペプチドが固体支持体に固相化されている、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記カルシウム結合タンパク質がイクオリンである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記イクオリンが組換えイクオリンである、上記〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記抗リン酸化抗体が、配列番号１に示される配列を有するリン酸化ペプチドを認識できるものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の方法。
〔６〕前記基質ペプチドが配列番号１に示される配列を含む、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の方法。
〔７〕前記リン酸化酵素がＡｕｒｏｒａ Ｂ、ＰＫＡ、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、ＤＹＲＫ１Ａ、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１、ＰＡＫ１、ＩＫＫα、ＪＩＬ−１、ＶＲＫ１、Ｓｎｆ１、ＰＢＫ／ＴＯＰＫ、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＲＣＫα、ＰＡＫ２、ＷＮＫ２、及びＷＮＫ３からなる群より選択され、かつ基質ペプチドが配列番号１に示される配列を含む、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおける使用のための、カルシウム結合型発光タンパク質で標識された抗リン酸化抗体。
〔９〕前記カルシウム結合型発光タンパク質による抗リン酸化抗体の標識が、マレイミド基とスルフヒドリル基との反応を用いて行われる、上記〔８〕に記載の抗体。
〔１０〕前記カルシウム結合タンパク質がイクオリンである、上記〔８〕又は〔９〕に記載の抗体。
〔１１〕上記〔８〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の標識抗体、及び対象となるリン酸化酵素の基質ペプチドを含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキット。
〔１２〕前記基質ペプチドが配列番号１に示される配列を含む、上記〔１１〕に記載のキット。

本発明により、疾患の治療薬・予防薬として応用可能なリン酸化酵素阻害物質を見出すことができる。

図１は、イクオリン標識抗リン酸化抗体の電気泳動分析を示す。 図２は、ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐの基質特異性結合を表すプロットである。 図３は、イクオリン標識抗リン酸化抗体を用いて検出したＡｕｒｏｒａ Ｂ活性を示す。 図４は、イクオリン標識抗リン酸化抗体を用いて検出したスタウロスポリンによるＡｕｒｏｒａ Ｂのリン酸化活性阻害を表すプロットである。

本発明において、「リン酸化酵素」とは、細胞内で標的タンパク質をリン酸化する活性を有することが知られているタンパク質である。本発明におけるリン酸化酵素は、セリン／スレオニン特異的なものでもよいし、チロシン特異的なものでもよい。リン酸化酵素としては、例えば、ＦＬＴキナーゼ、Ａｕｒｏｒａキナーゼ、カルモジュリンキナーゼ、ＰＫＣなどが挙げられる。

好適なリン酸化酵素は、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、ＰＫＡ、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、ＤＹＲＫ１Ａ、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１、ＰＡＫ１、ＩＫＫα、ＪＩＬ−１、ＶＲＫ１、Ｓｎｆ１、ＰＢＫ／ＴＯＰＫ、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＲＣＫα、ＰＡＫ２、ＷＮＫ２、及びＷＮＫ３であり、特に好適なリン酸化酵素は、Ａｕｒｏｒａ Ｂ、ＰＫＡ、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、ＤＹＲＫ１Ａ、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１、及びＰＡＫ１である。

Ａｕｒｏｒａ ＢをはじめとするＡｕｒｏｒａキナーゼは、細胞分裂において重要な役割を果たす酵素であり、種々の悪性腫瘍でアップレギュレートされていることが知られている（中山ら（編）、実験医学増刊「細胞周期の最前線」、羊土社、２００５年、ｐ．１０５−１０９）。Ａｕｒｏｒａ ＢはヒストンＨ３の配列中のセリンをリン酸化することが知られている。

リン酸化酵素の活性亢進は、癌、アルツハイマー病等の様々な疾患に関与することが明らかになっており、分子標的治療薬の候補になりうる。

本発明の方法で用いるリン酸化酵素は、生物組織から抽出・精製したものでもよいし、大腸菌又は哺乳動物細胞などの宿主細胞により組換え的に発現させた後、適宜精製したものでもよい。

本発明において「候補物質」とは、リン酸化酵素を阻害する活性を有することが予想されるいずれかの物質であり、例えば、動物・植物組織の抽出物若しくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、又はそれらから単離された標品；天然に生じる分子（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；天然に生じる物質の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチドミメティクスなど）；天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製した低分子有機化合物）；並びにそれらの混合物を挙げることができる。本発明において「リン酸化酵素阻害物質」とは、対象となるリン酸化酵素の活性を阻害することが可能な物質である。

本発明において、「カルシウム結合型発光タンパク質」とは、カルシウムの結合により発光を生じるタンパク質を指す。その発光のメカニズムには、当該タンパク質へのカルシウムの結合が該タンパク質のコンホメーションを変化させ、それにより発光団が形成されることが含まれる。発光団は当該タンパク質のアミノ酸側基同士の結合により形成されるものでもよいし、当該タンパク質に結合したアミノ酸側基以外の化学基により形成されるものでもよい。本発明において利用しうるカルシウム結合型発光タンパク質としては、限定するものではないが、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン、及びベルボインが挙げられる。好適なカルシウム結合型発光タンパク質はイクオリンであり、さらに好適なカルシウム結合型発光タンパク質は組換えイクオリンである。組換えイクオリンは、例えばチッソ株式会社（東京、日本）から入手することができる。

本発明において標識としてカルシウム結合型発光タンパク質を用いる利点としては、カルシウムの添加という簡便な処理により発光が生じること、発光・検出の際に、検体中の分子全体としての発光がカルシウムの結合から短時間に、例えば数秒以内にピークに達することなどが挙げられる。発光は、好適にはカルシウムの結合から１秒以内にピークに達する。カルシウムの結合から短時間で発光がピークに達することは、分子間での発光のタイミングのばらつきが少ないこと、すなわち、ほぼすべての分子が同時に発光することを表す。これにより、検出感度が上昇する。

カルシウム結合型発光タンパク質を標識として用いることの他の利点は、（１）検出を発光により行うため、蛍光色素を用いる場合に問題となる検出の際の励起光の漏れがないこと、（２）その発光がカルシウムとの結合に依存するため、アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる化学発光の場合に問題となるバックグラウンドがないこと、（３）その発光がカルシウムとの結合に依存し、検出の時点でのみ発光させることができるため、検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がないこと、（４）放射性同位体や発癌性色素などの危険物質を用いないことなどである。

本発明において「抗リン酸化抗体」とは、リン酸化された特定のペプチド又はタンパク質に特異的に結合するが、リン酸化されていない同一のペプチドには実質的に結合しない抗体を意味する。そのような抗体では、標的ペプチド配列がリン酸化されている場合の結合強度が、該ペプチドがリン酸化されていない場合と比較して１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１，０００倍以上又は１０，０００倍以上である。抗リン酸化抗体は、様々な標的配列に対するものが市販されている。例えば、抗リン酸化ＣＲＥＢ（セリン）ウサギ抗体、抗リン酸化Ｊａｋ２（チロシン）ウサギ抗体などがある。また、本発明における抗リン酸化抗体として、以下に示すペプチドＫ９Ｐを抗原として生起されたモノクローナル抗体を用いることができる。

本発明における抗リン酸化抗体は、ポリクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ）、モノクローナル抗体、又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）のいずれであってもよい。抗リン酸化抗体は、市販されているものを購入してもよいし、新たに作製してもよい。各抗体タイプの抗体の作製方法は当業者に公知である。特に、モノクローナル抗体の作製方法は当業者に公知であり、適切な免疫原でのマウスの免疫化、免疫されたマウス由来の脾臓細胞と、同系のマウス骨髄腫細胞とのハイブリドーマの作製、抗体産生ハイブリドーマのクローニング、及びクローニングされたハイブリドーマからの抗体の精製を含む。

本発明におけるカルシウム結合型発光タンパク質を用いた抗リン酸化抗体の標識は、それらの間の安定な結合が実現できるかぎりいかなる手段により行ってもよい。そのような手段としては、例えば、グルタールアルデヒド一段階法、グルタールアルデヒド二段階法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、スクシンイミド法などがある。好適な手段は、マレイミド基とスルフヒドリル基との結合である。マレイミド基とスルフヒドリル基との結合を用いて抗体を標識する場合、好適なカルシウム結合型発光タンパク質は、システイン導入型イクオリンである。この場合、イクオリンに導入されたシステインの側鎖であるスルフヒドリル基を、抗体にコンジュゲートされたマレイミド基と結合させる。

タンパク質のリン酸化状態を検出する方法としては、放射性同位体である^３２Ｐを用いる方法がよく知られているが、放射性同位体を用いる方法を実施するには、特別な施設が必要であり、また試薬を厳重に管理しなければならない。本発明の方法では、抗リン酸化抗体を用いてタンパク質のリン酸化状態を検出することにより、そのような問題を回避することができる。

本発明の方法において、「基質ペプチドのリン酸化が可能な条件」とは、対象となるリン酸化酵素による基質ペプチドのリン酸化が可能な条件である。例えば、グリセロリン酸、オルトバナジン酸等のリン酸化アッセイで通常用いられる試薬を含有する緩衝液に、対象となるリン酸化酵素及びＡＴＰを添加し、この緩衝液を基質ペプチドに作用させて室温〜３７℃でインキュベートする。

本発明の方法において、基質ペプチドは適切なペプチド合成機を用いた化学合成により取得してもよいし、大腸菌などの宿主細胞により組換え的に発現させた後に適宜精製することによって取得してもよい。

本明細書中で用いられる「ペプチド」との用語には、化学合成により取得されたもの、又は天然に存在するタンパク質及び組換え的に発現させたタンパク質並びにそれらの分解物が含まれる。

基質ペプチドの配列は、対象となるリン酸化酵素に依存して決定される。特定のリン酸化酵素の標的配列は当業者に公知である。本発明で用いる好ましい基質ペプチドの配列は、ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＣ（配列番号１）を含む。この配列は、ヒストンＨ３の部分配列として知られ、配列番号１に示される配列の１０番目のセリンは広範なリン酸化酵素によりリン酸化される。リン酸化酵素Ａｕｒｏｒａ Ｂ、ＰＫＡ、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、ＤＹＲＫ１Ａ、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１及びＰＡＫ１が当該配列の１０番目のセリンをリン酸化することは、以下の実施例において示されている。ＩＫＫα（Ｙａｎｇ ＳＲ ｅｔ．ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００８ Ｊｕｎ；３８（６）：６８９−９８）、ＪＩＬ−１（Ｉｖａｌｄｉ ＭＳ ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００７ Ｎｏｖ １；２１（２１）：２８１８−３１）、ＶＲＫ１（Ｋａｎｇ ＴＨ ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７ Ｄｅｃ；２７（２４）：８５３３−４６）、Ｓｎｆ１（Ｌｏ ＷＳ ｅｔ．ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００５ Ｍａｒ ９；２４（５）：９９７−１００８．）、及びＰＢＫ／ＴＯＰＫ（Ｐａｒｋ ＪＨ ｅｔ．ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ｓｅｐ １５；６６（１８）：９１８６−９５）が当該配列中の１０番目のセリンをリン酸化することが、カッコ内に記載した文献中に示されている。また、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＲＣＫα、ＰＡＫ２、ＷＮＫ２、及びＷＮＫ３は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＬＡＮＣＥ（登録商標）Ｕｌｔｒａキナーゼアッセイの説明書中で、当該配列の１０番目のセリンを基質としてリン酸化することが記載されている。

本発明の方法により、Ａｕｒｏｒａキナーゼなどの疾患関連リン酸化酵素の阻害物質を、迅速かつ簡便にスクリーニングすることが可能になる。特に、本発明の方法は、カルシウム結合型発光タンパク質を標識として用いることにより、カルシウムの添加という簡便な処理により、カルシウムイオンの結合に際して瞬時に発光が起こり、その発光は数秒以内に終了する。このため、短時間にシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）の高い検出を行うことができるという利点を有する。また、その発光はカルシウムとの結合に依存することから、検出の時点でのみ発光を生じさせることが可能であり、したがって検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がない。そのため、簡便な操作で、短時間で感度のよい検出が可能となるので、リン酸化酵素阻害物質のハイスループットスクリーニングに適している。

本発明の方法では、基質タンパク質は好ましくは固体支持体に固相化されている。好ましい固体支持体は、限定するものではないが、プラスチック製の測定用プレートである。

本発明の方法では、発光の検出は、使用するカルシウム結合型発光タンパク質の発光波長を検出しうる検出器を用いて行う。カルシウム結合型発光タンパク質の発光波長は当業者には公知であり、例えばイクオリンの場合、４７０ｎｍ付近である。そのような検出器としては、市販のプレートリーダーが挙げられる。例えば、パーキンエルマー社のＡＲＶＯシリーズを用いることができる。

本発明には、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおける使用のための、カルシウム結合型発光タンパク質で標識された抗リン酸化抗体が包含される。

また、本発明には、少なくとも上記標識抗体、及び対象となるリン酸化酵素の基質ペプチドを含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキットが包含される。該キットには、さらに、固定化担体、バッファー、陽性対照試料及び陰性対照試料、本発明のスクリーニング方法を利用した該キットの使用方法を記載した指示書等を含めることができる。

実施例１：免疫原の調製
Ａｕｒｏｒａ Ｂによりリン酸化されるヒストンＨ３の部分配列を含むリン酸化ペプチドＫ９Ｐ（配列番号１：ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＣで表されるペプチドＫ９Ｃの１０番目のアミノ酸であるセリンがリン酸化されたもの）は、通常のペプチド合成機を用い、予めリン酸化したセリンを使用して合成することにより取得した。

このＫ９Ｐペプチドを、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）によってＫＬＨ（キーホールリンペット・ヘモシアニン）に結合させ、これを免疫原として用いた。すなわち、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で、２ｍｇのマレイミド活性型ＫＬＨと２ｍｇのＫ９Ｐペプチドとを、室温で２時間放置することにより反応させた。反応後、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に対して十分に透析し、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、１０μＬずつ分注して、−２０℃で凍結して保存した。

実施例２：マウスの免疫
実施例１で調製したペプチド結合ＫＬＨ溶液４００μＬと、フロイント完全アジュバント４００μＬとをよく混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を、抗原として３匹のマウス（メス、ＢＡＬＢ／ｃ）に１匹あたり２５μｇずつ腹腔内投与した。さらに、同量の抗原を２週間ごとに４回投与し、最後の投与の３日後に脾臓を摘出し、実施例３に記載の細胞融合に用いた。

実施例３：細胞融合、目的とするモノクローナル抗体（Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体）を産生する融合細胞の選択、及び抗体の取得
摘出したマウス脾臓の細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）とを約５：１の比率で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を融合促進剤として用いて、細胞融合を行った。融合後の細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するＧＩＴ培地に懸濁して、細胞濃度を１×１０^６細胞／ｍＬとした。得られた細胞懸濁液を、９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製、以下同じ。）に１ウェルあたり１００μＬずつ分注した。

融合細胞をＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）中で培養した。ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地（ＨＡＴ培地）で培地交換を行い、融合細胞をＨＡＴ培地中で増殖させることにより、ハイブリドーマについてのスクリーニングを行った。得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを、ＨＴ培地で馴化し、さらにＧＩＴ培地で馴化した。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体を、Ｋ９Ｐペプチドを固相化したマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性と認められたウェルについて、限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、Ｋ９Ｐペプチドに対する反応性を有する抗体を産生している細胞クローンを得た。得られた細胞クローンが産生するモノクローナル抗体（Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体）を、該細胞をＣＤハイブリドーマ培地で培養した培養上清から、ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。

実施例４：イクオリン標識抗リン酸化抗体の調製
イクオリン標識抗リン酸化抗体の調製は、化学修飾法に基づき、抗体にマレイミド基を導入するステップ、ついで該抗体をスルフヒドリル基を有するイクオリン（システイン導入型イクオリン）と反応させるステップの２段階によって行った。

（１）スルフヒドリル基と反応するマレイミド基導入抗体の調製
マレイミド基導入抗体は、抗リン酸化モノクローナル抗体にマレイミド基を有する架橋試薬を導入することにより行った。

上記で調製した、リン酸化ペプチドＫ９Ｐ（配列番号１で表されるＫ９Ｃの１０番目のアミノ酸であるセリンがリン酸化されたもの）と特異的に結合するモノクローナル抗リン酸化ペプチド抗体（Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体）５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）を、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、以下「緩衝液Ａ」と記載）２００μＬに溶解した。この溶液に、緩衝液Ａにて１ｍＭに調製したスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を３０μＬ加え（スルホ−ＳＭＣＣ ３０ｎｍｏｌ、抗体：スルホ−ＳＭＣＣ＝１：１０）、４℃にて２時間反応させた。反応後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）２μＬ（１００ｎｍｏｌ）を加え、２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。アミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心して（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）、未反応のスルホ−ＳＭＣＣを除去し、マレイミド基を導入したＨ３Ｓ１０Ｐ抗体を得た（以下「マレイミド化Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体」と表記）。なお、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出したマレイミド化Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体の回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。

（２）システイン導入型イクオリンとマレイミド化Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体との反応によるイクオリン標識抗リン酸化抗体の調製
０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて溶解したシステイン導入型イクオリン（チッソ株式会社製）１０μＬ（７．５ｎｍｏｌ）を、マレイミド化Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体９０μＬ（１．５ｎｍｏｌ）に加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、１０ｍＭシステイン水溶液を２μＬ（２０ｎｍｏｌ）加えて、反応を停止した。これによりイクオリン標識抗リン酸化抗体（以下、場合により「ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐ」と記載する）を得た。

得られたＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐに発光活性の低下はほとんど起こらず、いずれも９６％の発光活性を保持していた。得られたＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐを、１２％分離ゲルを用いて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。

結果を図１に示す。システイン導入型イクオリン（２１ｋＤａ）とＨ３Ｓ１０Ｐ抗体由来のＨ鎖（５５ｋＤａ）が結合してできたと思われる７５ｋＤａに主なバンドが観察され、ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐがイクオリン：Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体＝１：１で結合形成されていることが示された。

実施例５：基質ペプチド調製及び抗体反応検出
（１）基質ペプチド調製
上記実施例１と同様に調製した、非リン酸化ペプチドＫ９Ｃ（配列番号１）、及びＫ９Ｃの１０番目のアミノ酸であるセリンがリン酸化されたリン酸化ペプチドＫ９Ｐを用いた。両合成ペプチドは２０アミノ酸残基からなり、Ｃ末端にマレイミドと反応するシステイン残基を持つ。

これらのＫ９Ｃペプチド及びＫ９Ｐペプチドは、化学結合によりマレイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＰＩＥＲＣＥ社）と結合させた。結合は以下のように行った。リン酸化ペプチドＫ９Ｐ １ｍｇ（４４４ｎｍｏｌ）を１．５ｍＬチューブに入れ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１００μＬ加えて溶解させた。このリン酸化ペプチドＫ９Ｐ溶液６５μＬに、マレイミド活性化ウシ血清アルブミン（以下マレイミド−ＢＳＡと表記、ＰＩＥＲＣＥ社製）９５μＬ（１６．１ｎｍｏｌ ＢＳＡ、２４１．７ｎｍｏｌ マレイミド基当量）を加え、室温にて２時間反応させ、リン酸化ペプチドＫ９Ｐ結合ＢＳＡ（以下Ｋ９Ｐ−ＢＳＡと表記）を得た。一方、非リン酸化ペプチドＫ９Ｃ １ｍｇを別の１．５ｍＬチューブに入れ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１００μＬ加えて溶解させた（４５４ｎｍｏｌ／１００μＬ）。その後、上記と同様にマレイミド−ＢＳＡと反応させ、非リン酸化ペプチドＫ９Ｃ結合ＢＳＡ（以下Ｋ９Ｃ−ＢＳＡと表記）を得た。

（２）ＢＳＡ結合ペプチド基質の固相化
Ｋ９Ｐ−ＢＳＡ及びＫ９Ｃ−ＢＳＡのストック溶液（それぞれ１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍＬ濃度に希釈した。これらの溶液を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル白色プレート（Ｎｕｎｃ，＃４３７７９６）に１ウェル当たり１００μＬで分注し、１分間振盪した後、３０℃にて１８時間インキュベートした。ペプチド溶液を除去し、次いでポストコーティング溶液（１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ_３を含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（以下ＴＢＳと表記））を２００μＬ分注し、１分間振盪した後、４℃にて１８時間以上静置保存した。なお、陰性対照としてポストコーティングのみを施したプレートも作製した。

（３）Ｋ９Ｐ−ＢＳＡ、Ｋ９Ｃ−ＢＳＡ及びＢＳＡとＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐとの結合
イクオリン標識された抗リン酸化ヒストンＨ３抗体（ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐ）について、Ｋ９Ｐ−ＢＳＡに対する反応性の確認を行った。

方法は以下のとおりとした。Ｋ９Ｐ−ＢＳＡ又はＫ９Ｃ−ＢＳＡ溶液を固相化したＭａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル白色プレートを用いた。プレートからポストコーティング溶液を除去し、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以降ＴＢＳＴ−Ｅと表記）にてよく洗浄した後、１０％ブロックエース（大日本製薬製）、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ（以降希釈液と記載）で１２５０〜５０００倍（２．１〜０．５３μｇ／ｍＬ）に希釈したＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐを１００μＬ／ウェルで分注した。続いて３０℃にて１時間静置した。

（４）イクオリンによる発光の測定
静置後、反応液を捨て、ＴＢＳＴ−Ｅにて洗浄した後、発光測定装置ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）にて、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２（和光純薬社製）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）（以降カルシウム溶液と表記）を１００μＬ／ウェル注入して発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定した。

最大発光強度値（Ｉｍａｘ）を算出し、表１及び図２に示した。データは３回の測定の平均を表す。非リン酸化ペプチドであるＫ９Ｃに対してはいずれの抗体濃度でもイクオリンの発光はほとんど検出されないが、リン酸化ペプチドであるＫ９Ｐに対しては、抗体の濃度に比例してイクオリンの発光強度が上昇していることが見て取れる。

以上の結果から、ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０ＰはＫ９Ｐ−ＢＳＡに特異的かつ濃度依存的に反応することが示された。

実施例６：Ａｕｒｏｒａ Ｂリン酸化酵素活性測定の検討
前述の方法で固相化したＫ９Ｃ−ＢＳＡに対する、リン酸化酵素Ａｕｒｏｒａ Ｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ社）の用量依存的リン酸化活性を、イクオリン標識抗リン酸化抗体ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐを用いて検討した（Ａｕｒｏｒａ Ｂ添加量：０〜１０００ｎｇ／ウェル）。酵素反応溶液としては、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ β−グリセロリン酸、０．１ｍＭ オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、２ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ウシ血清アルブミンを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた。

ブロッキング処理されたペプチド固相化９６ウェルプレートを、ＴＢＳＴ−Ｅで３回、続いて純水で２回洗浄した。次に酵素反応を行った。各ウェルに酵素反応溶液１００μＬを分注し、最終濃度が０、１、３、１０、３０、１００、３００、又は１０００ｎｇ／ウェルになるように希釈したＡｕｒｏｒａ Ｂ ２５μＬを添加し、攪拌した。次に、酵素反応溶液を用いて調製された６０μＭ ＡＴＰ ２５μＬを加えた。攪拌後、３０℃、１時間のリン酸化反応を行った。反応溶液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅにて３回洗浄を行い、１２５０倍希釈（２．１μｇ／ｍＬ）のＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐ １５０μＬを各ウェルに加えた。続いて３０℃にて１時間反応させた。反応溶液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅにて３回洗浄後、カルシウム溶液を１００μＬ添加して発光検出を行った。

結果を表２及び図３に示す。データは３回の測定の平均を表す。Ａｕｒｏｒａ Ｂの濃度上昇に伴い、イクオリンの発光活性が上昇していることが見て取れる。この結果から、Ａｕｒｏｒａ Ｂ酵素の用量依存的発光値の上昇は、固相化された基質ペプチドに対するＡｕｒｏｒａ Ｂのリン酸化活性を反映するものであることが明らかである。

以上より、イクオリン標識抗リン酸化抗体（ＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐ）を用いた発光検出において定量的なリン酸化活性の測定系が確立された事が示された。

実施例７：Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼリン酸化活性阻害物質を用いた、本発明のスクリーニング方法の検討
前述で示したイクオリン標識抗体を用いるリン酸化酵素活性検出法に基づき、プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（カルビオケム社）による、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼリン酸化活性の阻害について検討した。

前述の方法に従い、ポストコーティング処理済みのＫ９Ｃ固相化プレートをＴＢＳＴ−Ｅで３回、純水で２回洗浄し、阻害剤であるスタウロスポリンの最終濃度が０、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、又は３０００ｎＭになるように希釈系列を作成し、各ウェルに酵素反応溶液５０μＬ、スタウロスポリン溶液５０μＬ、最終濃度１００ｎｇ／ウェルに調製されたＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼ溶液２５μＬを添加して攪拌した。最後に、６０μＭ ＡＴＰ ２５μＬを加えた。攪拌後、３０℃にて１時間、リン酸化反応を行った。反応後ＴＢＳＴ−Ｅで３回洗浄し、１２５０倍希釈（２．１μｇ／ｍＬ）のＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体を１５０μＬ加え、３０℃にて１時間反応させ、再びＴＢＳＴ−Ｅにて３回洗浄を行った。続いてカルシウム溶液１００μＬを添加し、発光検出を行った。

結果を表３及び図４に示す。データは３回の測定の平均を表す。イクオリン標識抗リン酸化抗体を用いて検出した場合、スタウロスポリンの濃度が上昇するにつれ、イクオリンの発光が低下していることが見て取れる。

以上の結果から、プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンにおける濃度依存的なイクオリン発光値の低下が認められ、Ａｕｒｏｒａ Ｂキナーゼのリン酸化酵素活性阻害の定量的検出が確認された。すなわちこの系がリン酸化酵素阻害物質スクリーニングとして有用であることが示された。

実施例８：様々なリン酸化酵素に関する本発明のスクリーニング方法の使用
上述のイクオリン標識抗リン酸化抗体を用いたリン酸化酵素活性の検出及びそれを利用したリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法が、Ａｕｒｏｒａ Ｂのみならず他のリン酸化酵素についても適用可能であることを実証するために、上記で用いたペプチドＫ９Ｃを基質とすることが予測される様々なリン酸化酵素に関して本発明の方法を使用した。

タンパク質リン酸化酵素として、ＰＫＡ（ＰＫＡα；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２７３０）及びＤＹＲＫ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１３９６．３；特願２００８−１９０２７７に記載（該出願は参照によりその全文が本明細書に組み入れられる））は自社精製のもの、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１及びＰＡＫ１はカルナバイオサイエンス社（兵庫）から市販されているものを用いた。また、これらのリン酸化酵素に対する阻害剤として、スタウロスポリン（カルビオケム社）又はハルミン（ＳＩＧＭＡ）を用いた。

上述の方法に従って、ポストコーティング処理済のＫ９Ｃ固相化プレートをＴＢＳＴ−Ｅで３回、純水で２回洗浄した。０μＭ又は３０μＭの阻害剤溶液（酵素反応溶液中）を調製した。また、リン酸化酵素溶液は、各リン酸化酵素の最終濃度がそれぞれ、ＰＫＡ：８００ｎｇ／ウェル、ＭＳＫ１：１００ｎｇ／ウェル、ＰＫＣε：３００ｎｇ／ウェル、ＣＲＩＫ：３００ｎｇ／ウェル、ＮＤＲ１：３００ｎｇ／ウェル、ＤＹＲＫ１Ａ：５００ｎｇ／ウェル、Ｒｓｋ２：１００ｎｇ／ウェル、ＰＩＭ１：６μｇ／ウェル、及びＰＡＫ１：３００ｎｇ／ウェルとなるように、酵素反応溶液を用いて調製した。プレートの各ウェルに、酵素反応溶液５０μＬ、阻害剤溶液５０μＬ、リン酸化酵素溶液２５μＬを添加して撹拌し、最後に、６０μＭ ＡＴＰを２５μＬ加えた。撹拌後、３０℃にて１時間反応させた。リン酸化反応後、ＴＢＳＴ−Ｅで３回洗浄し、１２５０倍希釈（２．１μｇ／ｍＬ）のＡＱ−Ｓ−Ｈ３Ｓ１０Ｐ抗体を１５０μＬ添加し、３０℃にて１時間反応させ、再びＴＢＳＴ−Ｅで３回洗浄した。続いて、カルシウム溶液１００μＬを添加し、発光を検出した。

タンパク質リン酸化酵素であるＰＫＡ、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、ＤＹＲＫ１Ａ、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１、又はＰＡＫ１を用いた結果を表４に示す。阻害剤の非存在下でリン酸化反応を行った場合、リン酸化酵素を加えなかった場合と比較して発光強度が上昇し、それぞれのリン酸化酵素に対する阻害作用を有することが知られているスタウロスポリン又はハルミンの存在下では発光強度が低下していることが見て取れる。

以上の結果から、本発明の方法はＡｕｒｏｒａ Ｂキナーゼに限らず、広範なリン酸化酵素に対する阻害物質のスクリーニング方法として有用であることが示された。

本発明は、リン酸化酵素の阻害物質の特定を可能にすることにより、リン酸化酵素が関与する疾患の予防薬・治療薬の開発に役立つ。

配列番号１：基質ペプチド

Claims (9)

1. リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
   （ａ）阻害候補物質の存在下で、基質ペプチドのリン酸化が可能な条件において該基質ペプチドにリン酸化酵素を作用させるステップ、
   （ｂ）システイン導入型イクオリンで標識した抗リン酸化抗体を、（ａ）でリン酸化酵素を作用させた基質ペプチドと接触させるステップ、
   （ｃ）カルシウムを添加し、標識抗体−基質ペプチド複合体から生じる発光を検出するステップ、
   （ｄ）該候補物質の非存在下で、（ａ）〜（ｃ）を行うステップ
   を含み、ここで、該抗リン酸化抗体は、該リン酸化酵素によりリン酸化された基質ペプチドに特異的に結合可能なマレイミド化抗体であり、かつ、ステップ（ｃ）から得られた発光シグナルが、ステップ（ｄ）から得られた発光シグナルより低い場合に、該候補物質が該リン酸化酵素の活性を阻害するものであることが示され、かつ前記イクオリンによる抗リン酸化抗体の標識が、該抗リン酸化抗体のマレイミド基と該イクオリンの導入システインのスルフヒドリル基との1:1（モル比）の結合反応を用いて行われる、上記方法。
2. 前記基質ペプチドが固体支持体に固相化されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記イクオリンが組換えイクオリンである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記抗リン酸化抗体が、配列番号１に示される配列を有するリン酸化ペプチドを認識できるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記基質ペプチドが配列番号１に示される配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記リン酸化酵素がＡｕｒｏｒａ Ｂ、ＰＫＡ、ＭＳＫ１、ＰＫＣε、ＣＲＩＫ、ＮＤＲ１、ＤＹＲＫ１Ａ、Ｒｓｋ２、ＰＩＭ１、ＰＡＫ１、ＩＫＫα、ＪＩＬ−１、ＶＲＫ１、Ｓｎｆ１、ＰＢＫ／ＴＯＰＫ、ＭＮＫ１、ＭＮＫ２、ＭＲＣＫα、ＰＡＫ２、ＷＮＫ２、及びＷＮＫ３からなる群より選択され、かつ基質ペプチドが配列番号１に示される配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおける使用のための、システイン導入型イクオリンで標識された抗リン酸化抗体であって、前記イクオリンによる抗リン酸化抗体の標識が、該抗リン酸化抗体を修飾したマレイミド基と該イクオリンの導入システインのスルフヒドリル基との1:1（モル比）の結合反応を用いて行われる、上記抗体。
8. 請求項７に記載の標識抗体、及び対象となるリン酸化酵素の基質ペプチドを含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキット。
9. 前記基質ペプチドが配列番号１に示される配列を含む、請求項８に記載のキット。

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