KR20050035885A

KR20050035885A - 마이크로솜성 프로스타글란딘 ｅ 신타제 또는 조혈성 프로스타글란딘 ｄ 신타제의 활성을 감소시키는 능력에 대해 화합물 또는 제제를 검정하는 방법

Info

Publication number: KR20050035885A
Application number: KR1020057002538A
Authority: KR
Inventors: 취옌 리; 준지에 샤옹; 제프리 에스 사볼; 와이 헨리 마
Original assignee: 아벤티스 파마슈티칼스 인크.
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2003-08-15
Publication date: 2005-04-19
Also published as: AU2003258278A1; WO2004016223A3; CN1675543A; RU2005107329A; EP1543327A2; WO2004016223A2; JP2006511789A; IL166782A0; CA2495391A1

Abstract

본 발명에서는 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 또는 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제가 이들 각각의 프로스타글란딘 생성물을 만들 수 있는 활성을 감소시키는 화합물 또는 제제의 능력을 평가하는 신규하고 유용한 방법을 제공한다.

Description

마이크로솜성 프로스타글란딘 Ｅ 신타제 또는 조혈성 프로스타글란딘 Ｄ 신타제의 활성을 감소시키는 능력에 대해 화합물 또는 제제를 검정하는 방법 {Method for assaying compounds or agents for ability to decrease the activity of microsomal prostaglandin E synthase or hematopoietic prostaglandin D synthase}

본 발명은 시험대상 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제의 활성을 감소시키는 능력에 대해 검정하는 신규하고 유용한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시험대상 화합물 또는 제제가 마이크로솜 프로스타글란딘 E 신타제(hPGES) 또는 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제(hPGDS)의 활성을 감소시키는 능력에 대해 검정하는 방법에 관계한다.

프로스타글란딘은 통증, 발열 및 염증에 중요한 역할을 하는 에이코사노이드(eicosanoids) 부류 중 하나이다. 프로스타글란딘은 생체 내에서 아라키돈산으로부터 합성되는데, 아라키돈산의 탄소 쇄 일부를 형성하는 탄소 원자들의 5원 환을 가지고 있다. 프로스타글란딘은 호르몬은 아니지만, 국소적으로 즉 합성 부위에 인접하여 작용한다.

2개의 프로스타글란딘인 PGE₂ 및 PGD₂는 발열, 통증 및 염증에 특히 중요한 역할을 한다. 특히, 항원성 챌린지시, 비만세포는 기도 알레르기 장애의 주요 중개물질인 PGD₂ 수준을 증가시킨다. 특히 이 수준이 증가되어서 다른 것보다도 기관지수축, 기관지 과다활성, 비강 차단, 호산구 및 TH₂ 세포 침윤을 유발한다. PGE₂는 통증 중개물질이며, 통각과민, 발열, 혈관확장 및 부종을 유도하는 역할을 하는 것으로 보인다.

생체 내 합성시에, 포스포리파제 A2는 인지질을 아라키돈산(생체 내에서는 에스테르 형으로 확인됨)으로 전환시킨다. 차례로, 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타제가 아라키돈산을 프로스타글란딘 G₂ (PGG₂)로 전환시킨다. 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타제는 또한 PGG₂ 상의 퍼옥시드 기 환원을 촉매하여 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂)를 형성하는데, 이는 PGE₂ 및 PGD₂ 모두의 전구물질이다. PGE₂ 생산에서 프로스타글란딘 E 신타제 (PGES)는 보조인자 글루타티온(GSH) 존재하에 PGH₂를 PGE₂로 전환시킨다. 적어도 두 가지 PGE₂ 신타제, 즉 세포질 PGES (PGES) 및 마이크로솜성 PGES (mPGES)가 있다. 2개의 PEGS는 많은 조직에서 광범위하게 발현되는 것으로 그 분포가 겹쳐진다. 리포폴리사카라이드(LPS), IL-1 및 TNF-α와 같은 염증성 자극물질에 의해 mPGES가 유도되는 반면 cPGES는 구성적으로 발현된다. 더욱이, mPGES는 COX-2 활성과 결합되어 있는 것으로 보인다 [Murakami 등, J. Biol. Chem. 275: 32783 (2000)].

PGD₂는 프로스타글란딘 D 합성효소(PGDS)에 의해 PGH₂가 PGD₂로 전환된 결과로써 생산된 것이다. 두 가지 형태의 PGD₂ 신타제가 공지되어 있다. 첫째는 리포칼린형 PGDS (L-PGDS)인데 주로 중추 신경계에서 볼 수 있으며, 두번째는 조혈 PGDS (hPGDS)로써 말초 조직에서 주로 볼 수 있다. L-PGDS는 글루타티온 (GH)에 대해 독립적이며, 반면에 hPGDS는 GST 활성을 가지는 GSH-의존적이다. 또한, L-PGDS와 hPGDS 사이에 구조적 유사성은 거의 없다.

PGD₂ 및 PGE₂는 발열, 통증 및 염증에 주요 역할을 하기 때문에, 이들 생산을 감소 또는 심지어 저해시킬 수 있는 화합물에 대한 검사 방법을 찾는데 주력하였다. 특히, HPLC, ELISA 또는 RIA와 같은 기술을 사용하여 PGD₂ 및 PGE₂ 생산을 정량화시킴으로써 프로스타글란딘 신타제의 활성을 감소 또는 저해시킬 수 있는 화합물 또는 제제의 능력을 측정하였다. 그러나, 이러한 기술은 근본적인 한계가 있다. 예를 들면 여러 세척 단계, 정제 단계 및/또는 방사능 활성 물질을 이용하는 단계가 요구된다. 또한, 이러한 방법들은 상당한 시간이 소요되고, 하루에 데이터 처리량이 10(HPLC) 내지 수백개(ELISA & RIA)가 고작이다. 따라서, 고처리량의 스크리닝에는 사용할 수 없다.

형광 편광은 분자간의 상호작용을 연구하는데 이용되는 기술이다. 이 기술에 사용되는 원리는 평가할 분자의 크기에 따라 달라진다. 특히, 형광 분자에 평면 편광을 조사하는 경우에, 전자들은 분자의 바닥상태에서 여기(excited) 상태로 증진한다. 약 4-5 나노초후에, 이러한 여기된 전자들은 바닥상태로 붕괴되어 되돌아간다. 붕괴되는 동안에 분자가 형광 시그날을 방출한다. 형광 편광시에, 분자가 여기된 상태를 경유하여 정지상태로 유지되는 경우에 한하여 동일 평면에서 이러한 형광 방출이 감지될 수 있다. 분자가 여기 상태 동안에 이동 또는 회전한다면, 형광 전자를 여기시키는 편광면보다는 빛의 상이한 면에 형광 방출이 생길 것이다. 그 결과, 형광 방출은 감지되지 않을 것이다. 일반적으로 분자가 작을수록 분자의 이동성 및 회전성이 더 크다. 그러므로, 작은 분자는 더 큰 분자보다 실질적으로 더 작은 시그날을 생성하는데, 이는 여기 기간 동안에 상대적으로 정지단계에 머무를 것이다. 형광 편광은 분자의 이러한 성질을 이용하는 것이다. 특히, 리간드의 형광 편광 검정시에, 리간드, 트레이서(tracer), 즉 형광 라벨로 라벨링된 리간드 및 리간드가 결합한 수용체 등을 용액에 넣는다. 그 다음 리간드 및 트레이서는 수용체에 결합하기 위해 서로 경쟁하게 된다. 그 다음 용액에 평면 편광을 조사한 후 시그날이 감지된다. 용액에 많은 리간드가 존재하지 않다면, 존재하는 수용체의 대부분이 트레이서에 결합할 것이다. 수용체가 (리간드에 비하여) 큰 분자이기 때문에, 형광 라벨로부터 시그날을 수득할 수 있고 높은 정도의 형광 편광도 수득할 수 있다. 대조적으로 존재하는 리간드의 양이 많은 경우에, 수용체 대부분이 리간드와 결합할 것이다. 그 결과, 트레이서 단독에 의해서만 생산된 형광 편광 시그날이 있다 하더라도 수용체에 결합된 트레이서에 의해 생성된 이전에 수득된 시그날보다 실질적으로 그 양이 적을 것이다. 리간드의 존재 여부 및 그 농도를 측정하기 위해 당업자가 이용하는 이러한 시그날간에는 차이가 있다. 형광 편광은 밀리편광 단위(millipolarization units) 또는 mP로 나타낸다.

따라서, ELISA, HPLC 및 RIA와 같은 검정 방법보다는 훨씬 간단하고 효과적으로 형광 편광을 실행할 수 있어야 한다. 또한, 매우 짧은 기간동안에 다수의 화합물 또는 제제의 고처리량의 스크리닝에 바로 제공할 수 있다.

따라서 필요한 것은 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제 활성을 감소 또는 저해하는 능력이 있는지를 평가하는 형광 편광 방법이고, 특히 mPGES가 PGE₂를 생산하는 능력을 화합물 또는 제제가 감소 또는 저해시키는 지를 평가하고, hPGDS가 PGD₂를 생산하는 능력을 화합물 또는 제제가 감소 또는 저해시키는지를 평가하는 형광 편광 방법이다.

또한 필요한 것은 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제, 특히 mPGES 또는 hPGDS의 활성을 감소 또는 저해시키는 능력에 대해 평가할 수 있는 고처리량 시스템이다. 조혈성 프로스타글란딘 D₂ 신타제(hPGDS) 활성 또는 유도성 마이크로솜성 프로스타글란딘 E₂ 신타제(mPGES) 활성을 감소 또는 심지어 저해시키는 화합물은, 일부만 예를 들자면, 관절염, 천식 및 비염과 같은 염증 및 알레르기 징후를 치료하는 데에 적용할 수 있을 것이다. 더욱이, 이와 같은 화합물 또는 제제는 통증 및/또는 발열 치료에도 이용될 수도 있다.

본원 언급된 문헌을 본 발명의 "선행기술"로써 이용할 수 있는 문헌을 인정하는 것으로 간주해서는 안된다.

발명의 요약

본 발명에 따르면, mPGES 또는 hPGDS가 이의 각 프로스타글란딘 생성물을 생산하는 능력을 감소 또는 심지어 저해시킬 수 있는 능력에 대해 화합물 또는 제제를 평가할 수 있고, 동시에 방사능 동위원소를 이용하지 않으면서 다단계의 세척 단계를 요하지 않고 세포를 이용하는 방법 또는 별도의 방법으로, 시험관 내 또는 생체 외로 실행할 수 있는 신규하고 유용한 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법은 고처리량 방식으로 바로 실행할 수 있는 방법이다.

넓게는 본 발명은 화합물 또는 제제가 기질과 반응하여 프로스타글란딘 생성물을 형성하는 프로스타글란딘 신타제의 활성을 저해시키는지를 측정하는 방법까지도 포함되며, 이때, 프로스타글란딘 신타제는 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 (mPGES) 및 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제(hPGDS)로 이루어진 그룹에서 선택된다. 본 발명의 이와 같은 방법은 프로스타글란딘 신타제를 이의 기질, 보조인자 및 화합물 또는 제제와 혼합하는 단계를 포함하여서 효소 반응을 일으킬 수 있다. 그 다음 혼합물을 반응안된 기질이 프로스타글란딘 생성물로 자발적으로 변환되는 것을 방지하는 제제가 포함된 정지 용액과 항온처리 시킨다. 이러한 혼합물을 그 다음 형광 라벨(즉, 트레이서)로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물 및 면역원으로서 프로스타글란딘 생성물을 가지는 항체를 포함하는 감지 시약과 함께 항온처리 시킨다. 차례로, 혼합물과 화합물 또는 제제가 없는 동일한 방식으로 처리된 대조군 혼합물을 형광 라벨이 형광을 발산하는 파장에서 평면 편광을 조사한다. 혼합물 및 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정 비교한다. 대조군 혼합물의 편광 측정치보다 더 큰 편광 수치를 가지는 혼합물은 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제의 활성을 감소시켰다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 이와 같은 화합물 또는 제제는, 몇가지 예를 들자면, 염증, 알레르기, 통증, 발열 또는 이의 복합 증상을 가지는 개체를 치료하는데 바로 적용될 수 있을 것이다.

더구나, 본 발명은 상기에서 기술된 방법까지 포함하는데, 여기서, 프로스타글란딘 신타제는 유도성 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제(mPGES)이고, 기질은 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂)이며, 보조인자는 글루타티온(GSH)이고, 프로스타글란딘 생성물은 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)이다. 본 발명의 방법에 사용되는 mPGES는 소, 양, 설치류, 말, 개, 사람, 고양이 등에서 얻을 수 있다. 특정 양태에서는, 사람의 mPGES을 이용하고, 도 9B 및 서열번호 2에서 제공하는 아미노산 서열을 가진다. 또한, 본 발명의 방법에서 이용된 mPGES는 정제된 형일 필요가 없다.

본 발명은 본원에서 기술된 바와 같이 프로스타글란딘 생성물을 형성하기 위해 프로스타글란딘 신타제가 이의 기질과 반응하는 활성을 화합물 또는 제제가 감소시키는지 여부를 측정하는 방법도 포함되는데, 이때 프로스타글란딘 신타제는 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제(hPGDS)이고, 기질은 PGH₂이며, 보조인자는 GSH이고, 프로스타글란딘 생성물은 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)이다. mPGES와 같이, 본 발명의 방법에 적용되는 hPGDS는 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 특정 양태에서, hPGDS는 사람 hPGDS이고, 도 10B 및 서열번호 4에서 제시하는 아미노산 서열을 가진다. 더욱이, 정제된 hPGDS를 사용할 필요는 없다.

상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 방법에서, 정지 용액에는 반응안된 기질의 프로스타글란딘 생성물로의 자발적 변환을 방지하는 제제가 포함된다. 특히, 상기에서 기술하는 바와 같이 2개의 프로스타글란딘 신타제의 기질, PGH₂에는 퍼옥시드기가 함유된다. 이들 메카니즘에 한정하여 설명하거나 임의 설명에 국한시키지는 않지만, mPGES 및 hPGDS 모두는 PGH₂의 퍼옥시드기의 산소 결합 파괴를 촉매하여, PGH₂가 PGE₂ 및 PGD₂로 각각 전환되게 한다. 그러나, PGH₂ 는 또한 PGE₂ 또는 PGD₂로의 자발적 전환을 실행한다. 이와 같은 자발적 전환은 화합물 또는 제제가 mPGES 또는 hPGDS를 감소시키는 활성의 검정 결과를 간섭하고 변형시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에서, 혼합물을 PGH₂ 의 PGD₂ 또는 PGE₂로의 자발적 전환을 방해하는 제제를 포함하는 정지 용액과 항온처리 시킨다. 이와 같은 제제의 특정 예는 약 20mM 농도의 FeCl₂ 이다. 그러나, 당업자는 이와 같은 동시 전환을 억제하고 본 발명의 방법에 포함될 수 있는 다른 제제에 대해 숙지하고 있을 것이다. 더욱이 항온처리 기간을 다양하게 할 수는 있으나, 임의 잔존하는 반응안된 PGH₂ 의 프로스타글란딘 생성물로의 전환을 방지할 수 있을 정도의 충분한 시간이어야 한다.

더구나, 본 발명은 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제, 특히, mPGES 또는 hPGDS가 이의 기질과 반응하여 프로스타글란딘 생성물을 형성하는 활성을 감소시키는지를 측정하는 방법까지 포함되는데, 이때 정지 용액과 항온처리 후에, 혼합물을 형광 라벨로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물과 면역원으로서 프로스타글란딘 생성물을 가지는 항체를 포함하는 감지 시약과 함께 항온처리 시킨다. 당업자들에게 공지된 다양한 형광 라벨을 본 발명에 적용할 수도 있다. 이와 같은 형광 라벨로는 플루오레신, 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 유리 란탄니드 시리즈 염, 킬레이트된 란탄니드 시리즈 염, CyDye (Amersham Biotech), BODIPY (분자 프로브) 및 ALEXA (분자 프로브)가 포함된다. 특정 양태에서, 형광 라벨은 텍사스 레드이다. 더욱이, 형광 라벨은 프로스타글란딘 생성물에 직접 결합시킬 수도 있거나, 또는 링커 분자에 결합시키고, 다시 이 링커를 통하여 프로스타글란딘 생성물에 결합시킬 수 있다. 본원에서 적용되는 특정 링커 분자를 일부 명시하자면, 아미노부티르산, 아미노카프로산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노카프릴산, Fmoc-아미노카프로산, 한 개 이상의 β-알라닌, 이소티오시아네이트기, 숙신이미딜 에스테르, 설포날 할로겐 화합물, 카보디이미드가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 특정 양태에서, 프로스타글란딘 생성물이 카보디이미드 링커에 결합되고, 이는 다시 형광 라벨, 예를 들어 텍사스 레드에 결합되어 있다.

또한, 본 발명은 유도성 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제(mPGES)와 이의 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂) 기질과 반응하여 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂) 가 형성되는 반응을 화합물 또는 제제가 저해 또는 감소시키는지를 측정하는 방법까지 포함되는데, 그 방법은 다음을 포함한다:

(a) mPGES와 PGH₂, 글루타티온(GSH) 및 화합물 또는 제제를 최소 30초간 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과 FeCl₂를 포함하는 정지 용액과 함께 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물과 텍사스 레드로 라벨링된 PGE₂ 및 면역원으로서 PGE₂를 가지는 항체를 포함하는 감지 시약과 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 580±20 nm 파장의 평면 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계.

검사될 화합물 또는 제제를 함유하는 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 편광 측정치보다 큰 경우에, 화합물 또는 제제가 mPEGS 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 특정 양태에서, mPGES는 도 9B 및 서열번호 2에 나타난 아미노산 서열을 가지는 사람의 mPGES이고, 카보디이미드 링커는 PGE₂ 및 텍사스 레드에 결합되어 있다. 텍사스 레드가 여기되는 파장은 580 nm이다. 그러나, 이 파장은 580 ±20 nm 범위가 될 수 있다. 유사하게, 텍사스 레드의 형광 방출 파장은 일반적으로 620 nm이다. 그러나, 이 파장도 620 ±20 nm 범위가 될 수 있다. 여기 파장 및 방출 파장에서 이와 같은 변이는 본 발명의 범위에 포함된다. 더욱이, 이미 설명된 바와 같이, 정제된 형의 mPGES를 사용할 필요는 없다.

또한, 본 발명은 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제(mPGDS)와 이의 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂) 기질과 반응하여 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)가 형성되는 반응을 화합물 또는 제제가 저해시키는지를 측정하는 방법까지 포함되는데, 그 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) hPGDS와 PGH₂, GSH 및 화합물 또는 제제를 최소 30초간 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과 FeCl₂를 포함하는 정지 용액과 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물과 텍사스 레드로 라벨링된 PGD₂ 및 면역원으로서 PGD₂ 를 가지는 항체를 포함하는 감지 시약과 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 580 ±20 nm 파장의 선형 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계.

검사될 화합물 또는 제제를 함유하는 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 편광 측정치보다 큰 경우에, 화합물 또는 제제가 hPGDS 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 특정 양태에서, hPGDS는 도 10B 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 가지는 사람의 hPGDS이고, 텍사스 레드 및 PGD₂ 는 카보디이미드 링커를 경유하여 화학적으로 연결되어 있다.

더구나, 본 발명에는 mPGES 또는 hPGDS와 같은 프로스타글란딘 신타제가 프로스타글란딘 생성물을 생성하는 활성을 화합물 또는 제제가 감소시키는지를 측정하는 방법도 포함되는데, 이때 이와 같은 방법은 고처리량 방식으로 실행된다.

따라서, mPGES 또는 hPGDS와 같은 프로스타글란딘 신타제의 활성을 화합물 또는 제제가 감소 또는 심지어 저해까지도 시킬 수 있는 능력을 평가하는 방법을 제공한다. 결론적으로, 본 발명의 방법은 당분야에 당업자가 통증, 염증, 발열 또는 이의 복합 질환을 가진 개체를 치료하는데 화합물 또는 제제가 적용될 수 있는지를 확인하는데 이용된다.

본 발명의 또 다른 측면은 mPGES 또는 hPGDS의 활성을 화합물 또는 제제가 감소 또는 저해하는 능력에 대해 평가하는 방법을 제공하는 것인데, 이와 같은 방법은 방사능활성 동위원소를 이용하는 단계 또는 세척 단계를 요하지 않는다.

본 발명은 또한 또다른 측면은 mPGES 또는 hPGDS와 같은 프로스타글란딘 신타제의 활성을 감소 또는 저해시키는 화합물 또는 제제의 능력을 평가하는데 있어서 생체 외, 시험관 내, 세포 근거한 또는 별도의 방식으로 실행할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 고처리량 방식으로 실행할 수 있는, 프로스타글란딘 신타제 활성을 감소 또는 저해시키는 화합물 또는 제제의 능력을 평가하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면은 다음의 도면 및 상세한 설명을 참고하면 더 잘 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 기질 PGH₂ 에서 PGE₂ 로의 효소적 전환과 PGH₂ 에서 프로스타글란딘 생성물 PGD₂ 또는 PGE₂로의 자발적 전환 사이의 경쟁관계를 도시한 것으로, 이때 이용되는 효소는 mPGES이고, 자발적 전환은 FeCl₂를 이용하여 방지한다.

도 2는 본 발명의 방법을 도시한 것으로, 프로스타글란딘 신타제는 mPGES이고, 프로스타글란딘 생성물은 PGE₂이다.

도 3은 기질 PGH₂ 에서 PGD₂ 로의 효소적 전환과 PGH₂ 에서 프로스타글란딘 생성물 PGD₂ 또는 PGE₂로의 자발적 전환 사이의 경쟁관계를 도시한 것으로, 이때 이용되는 효소는 hPGDS이고, 자발적 전환은 FeCl₂를 이용하여 방지한다.

도 4는 본 발명의 방법을 도시한 것으로, 프로스타글란딘 신타제는 hPGDS이고, 프로스타글란딘 생성물은 PGD₂이다.

도 5는 본 발명의 방법이 프로스타글란딘 신타제 활성을 화합물 또는 제제가 저해 또는 감소시키는지를 측정할 수 있는지를 증명하는데 이용되는 공지의 mPGES 억제제인 MK-886의 화학 구조를 나타낸다.

도 6은 프로스타글란딘 신타제 mPGES 와 공지의 억제제 MK-886을 이용하는 본 발명의 방법에서 농도 반응 곡선을 나타낸 것이다. IC50 = 27.5 uM. 이러한 결과로부터 본 발명의 방법을 이용하면 당업자는 프로스타글란딘 신타제, 이 경우 mPGES의 활성을 화합물 또는 제제가 감소시키는지를 측정할 수 있다.

도 7에서는 HQL 79의 화학적 구조를 나타낸다.

도 8에서는 HQL79 에 의해 유발된 hPGDS 활성 감소가 본 발명의 방법으로 감지될 수 있다는 것을 보여주는 막대그래프를 나타낸다.

도 9A 및 9B에서는 하기 실시예 1에서 이용되는 사람의 mPGES 에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열(각각, 서열번호 1 및 2)을 나타낸다.

도 10A 및 10B는 사람 H-PGDS의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열(각각, 서열번호 3 및 4)을 나타낸다.

본 발명은 프로스타글란딘 신타제, 예를 들aus mPGES 또는 hPGDS가 프로스타글란딘, 예를 들어 PGD₂ 또는 PGE₂를 생산하는 활성을 감소시키는 화합물 또는 제제를 확인하는데 형광 편광이 이용될 수 있다는 놀랍고도 예기치 않은 발견에 근거한다. 그러므로, 광범위하게 본 발명은 mPGES 및 hPGDS에서 선택된 프로스타글란딘 신타제가 이의 기질과 반응하여 프로스타글란딘 생성물을 형성할 수 있는 활성을 화합물 또는 제제가 감소시키는지를 측정하는 방법까지 포함되는데, 이 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다;

(a) 프로스타글란딘 신타제를 이의 기질, 보조인자 및 화합물 또는 제제와 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과 기질의 프로스타글란딘 생성물로의 자발적 전환을 방지시키는 물질을 포함하는 정지 용액과 함께 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물과 형광 라벨로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물 및 면역원으로서 프로스타글란딘 생성물을 가지는 항체를 포함한 감지 시약과 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 형광 라벨이 형광을 발하는 파장의 선형 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계로, 이때 (d) 단계 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 평광 측정치보다 큰 경우에 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제의 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 이용된 여러 용어 및 문구는 하기와 같이 정의한다. 따라서;

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화합물 또는 제제"는 이후 발견될 또는 현재 공지된 임의 조성물을 지칭한다. 본원에서 적용되는 화합물 또는 제제의 예는 유기 화합물(예를 들면 인공적 또는 자연 발생적), 펩티드(인공적 또는 자연 발생적), 탄수화물, 핵산 분자 등이 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효소"는 특정 화학 반응을 촉매하는 단백질 또는 RNA와 같은 생체분자를 지칭한다. 촉매된 반응의 평형에는 영향을 주지 않는다. 다만, 효소는 활성 에너지를 낮추어서 반응 속도를 강화시킨다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로스타글란딘 신타제"는 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂)의 프로스타글란딘 생성물로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 본 발명에서 적용되는 프로스타글란딘 신타제의 특정 예로는 유도성 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제(mPGES)가 포함되고, 이는 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)로 보조인자의 존재하에 전환시킨다. 또다른 예로, 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제(hPGDS)인데, 이는 프로스타글란딘 H₂를 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)로 보조인자 GSH의 존재하에 전환시킨다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기질"은 생성물을 생산하기 위해 효소가 작용하는 화합물을 지칭한다. 본원에서 적용되는 기질의 예로는 PGH₂이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보조인자"는 효소 활성에 요구되는 유기분자, 무기 분자, 펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 특정 양태에서, 프로스타글란딘 신타제는 mPGES 또는 hPGDS이고, 보조인자는 글루타티온(GSH)이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로스타글란딘 생성물"은 프로스타글란딘 신타제의 기질에 대한 프로스타글란딘 신타제의 작용에 기인하여 생성된 생성물을 지칭한다. 따라서, mPGES의 경우 프로스타글란딘 생성물은 PGE₂이고, hPGDS의 경우 프로스타글란딘 생성물은 PGD₂이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형광 라벨"은 특정 파장의 빛으로 조사하였을 경우에 형광을 발하는 기질을 지칭하는데, 이 라벨은 관심있는 화합물에 직접 결합되어 있을 수도 있고, 또는 링커를 통하여 관심있는 화합물에 차례로 결합된다. 본 발명의 방법에 적용되는 형광 라벨의 예에는 플루오레신, 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 유리 란탄니드 시리즈 염, 킬레이트된 란탄니드 시리즈 염, BODIPY, ALEXA, CyDye 등이 포함되나, 틀림없이 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에서 이용된 특정 형광 라벨은 텍사스 레드이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커" 및 용어 "링커 분자"는 서로 호환적으로 이용될 수 있고, 형광 라벨 및 프로스타글란딘 생성물이 결합되는 화학적 잔기를 지칭한다. 본 발명에서 적용되는 특정 링커의 예에는 일부만 명기하면, 아미노부티르산, 아미노카프로산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노카프릴산, Fmoc-아미노카프로산, 한 개 이상의 β-알라닌, 이소티오시아네이트기, 숙신이미딜 에스테르, 설포날 할로겐 화합물, 카보디이미드가 포함된다. 본 발명에 적용되는 링커의 특정 예는 카보디이미드기이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대조군 혼합물"은 검사될 제제 또는 화합물이 함유된 혼합물로써 동일한 양의 동일한 시약, 화합물, 세포 등을 함유하고, 검사될 화합물 또는 제제를 함유하는 혼합물로서 동일한 방식으로 처리되지만, 예외적으로 대조군 혼합물에는 검사할 대상 화합물 또는 제제가 함유되어 있지는 않는 혼합물을 지칭한다.

항체

상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 방법은 면역원으로서 PGD₂ 또는 PGE₂와 같은 프로스타글란딘 생성물을 가지는 항체를 이용한다. 이와 같은 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 심지어 키메라 항체가 될 수 있다. 당분야에 공지된 다양한 과정을 이용하여 PGE₂ 또는 PGD₂에 대한 폴리클로날 항체를 생산할 수 있다. 항체 생산을 위해서 토끼, 마우스, 랫트, 양, 염소 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물에 프로스타글란딘 생성물을 주사하여 면역화시킬 수 있다. 특정 양태에서, PGE₂ 또는 PGD₂ 는 면역원성 캐리어, 예를 들면, 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀 림페트 헤모시아닌 (KLH)에 결합될 수 있다. 다양한 보조제를 이용하면 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시킬 수 있는데, 예로는 프로인트 (완전 및 불완전) 보조제, 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다가 음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀, BCG (bacille Calmette - Guerin) 또는 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

프로스타글란딘 생성물에 대한 모노클로날 항체를 제조하기 위해서, 항온처리물에서 연속 세포주에 의한 항체 분자를 생산할 수 있는 임의 기술을 이용할 수도 있다. 여기에, Kohler 및 Milstein [Nature 256:495-497 (1975)]이 처음 개발한 하이브리도마 기술 뿐만 아니라 트리오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[Kozbor 등, Immunology Today 4:72 1983); Cote 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 80:2026-2030 (1983)] 및 EBV-하이브리도마 기술 [Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]을 이용하여 사람 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 기술이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 더구나, PCT/US90/02545에서 기술된 기술을 이용하여 무균 동물에서 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 프로스타글란딘 생성물에 특이적인 마우스 항체 분자의 유전자를 적절한 생물학적 활성을 가지는 사람의 항체 분자의 유전자와 함께 스플라이싱하여 "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술이 이용될 수도 있다. [Morrison 등, J. Bacteriol . 159:870 (1984); Neuberger 등, Nature 312:604-608 (1984); Takeda 등, Nature 314:452-454 (1985)].

조건

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법은 생체 외, 시험관 내 또는 분리형으로 실행될 수 있는데, 모든 시약, 효소 및 기질 등을 미리 분리하고, TRIS, TRIS HCl, HEPE 또는 인산 완충액과 같은 완충용액 또는 세포를 이용한 방식으로 유지시켰다. 더욱이, 본 발명의 방법에서 정제된 프로스타글란딘 신타제를 이용할 필요는 없다.

세포를 이용한 검사에서, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 검사될 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 생성물의 세포 분비를 방해 또는 감소시키는지를 측정하는 반면, 시험관 내 방법에서 본 발명의 방법을 실행하기에 앞서 세포를 용해시켜서 세포내 매질에서 화합물 또는 제제를 평가할 수 있도록 한다.

프로스타글란딘 신타제의 활성을 감소 또는 저해시키는 후보 화합물 또는 제제에 대한 라이브러리 연구

통상적으로, 유용한 성질을 가진 신규한 화학 물질군은 어느 정도 목적하는 성질 또는 활성을 가지는 화학적 화합물(소위 "유도 화합물")을 확인하고, 유도 화합물의 변이체를 만들고, 이들 변이체 화합물의 성질 및 활성을 평가함으로써 생성된다. 그러나, 현재 경향은 약물을 발견하는 측면에서는 소요 시간를 단축시킨다. 상당수의 화합물을 신속하고 효과적으로 시험하는 능력 덕분에, 고처리량 스크리닝(HTS) 방법이 통상의 유도 화합물 동정 방법의 대안이 되고 있다.

특정 양태에서, 고처리량 스크리닝 방법은 상당수의 잠재 치료 화합물(후보 화합물)을 함유하는 콜렉션을 제공한다. 이와 같은 "중요한 화학 콜렉션"은 본원 발명 방법으로 스크린하여 목적하는 특징적인 활성을 드러내는 콜렉션내 다수 화합물(특정 화학물 종 또는 서브클래스)을 확인한다. 따라서 확인된 화합물은 통상적인 "유도 화합물"로서 사용할 수 있거나 또는 이들 자체로 잠재 또는 실질 치료제로 이용할 수도 있다.

복합 화학 라이브러리

복합적 화학 라이브러리는 신규한 화학 유도 화합물 세대를 보조하는 바람직한 수단이다. 복합 화학 라이브러리는 시약과 같은 다수의 화학적 "빌딩 블록"을 결합시켜 화학적 또는 생물학적으로 합성시켜 생성되는 다양한 화학 화합물의 콜렉션이다. 예를 들면, 폴리펩티드 라이브러리와 같은 선형 복합 화학 라이브러리는 주어진 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물에서 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 아미노산 세트라고 불리는 화학적 빌딩 블록을 결합시켜 형성된다. 수많은 화학적 화합물은 화학적 빌딩 블록의 복합 혼합을 통하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 100개 상호교환될 수 있는 화학적 빌딩 블록을 전체적으로 복합 혼합하면 이론적으로 1억개 테트라머 화합물 또는 100억개 펜다머 화합물을 합성할 수 있다는 것을 확인하였다 (Gallop 등 Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery 2. Combinatorial Organic Synthesis, Library Screening Strategies and Future Directions J. Med. Chem. (1994) 37(9): 1233-1251).

당업자는 복합 화학 라이브러리를 제조법을 잘 알고 있다. 이와 같은 복합 화학 라이브러리에는 펩티드 라이브러리(참고, 예를 들어, 미국 특허 5,010,175, Furka (1991) Int . J. Pept . Prot . Res., 37: 487-493, Houghton 등 (1991) Nature, 354: 84-88)등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 펩티드 합성은 본 발명으로 이용하기 위해 계획하고 고려할 수 있는 유일한 방식은 아니다. 화학적으로 다양한 라이브러리를 생성하기 위해 다른 화학물을 또한 이용할 수도 있다. 이와 같은 화학물에는 펩토이드(PCT 공고번호 WO 91/19735, Dec. 26, 1991), 암호화된 펩티드(PCT 공고번호 WO 93/20242, 14 Oct. 14, 1993), 무작위 생체올리고머(PCT 공고 WO 92/00091, Jan. 9, 1992), 벤조디아제핀(U.S. Pat. No. 5,288,514), 하이단토인, 벤조디아제핀, 디펩티드와 같은 다이버조머(Hobbs 등., (1993) Proc . Nat. Acad. Sci . USA 90: 69096913); 비닐성 폴리펩티드(Hagihara 등 (1992) J. Amer . Chem. Soc . 114: 6568), 베타 D 글루코스 골격을 가진 비펩티드성 펩디드유사체(Hirschmann 등, (1992) J. Amer . Chem . Soc . 114: 92179218), 소화합물 라이브러리의 유사 유기 합성(Chen 등 (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661), 올리고카르바메이트(Cho, 등, (1993) Science 261:1303) 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell 등, (1994) J. Org . Chem . 59: 658) 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. [Gordon 등, (1994) J. Med . Chem . 37:1385] 일반적으로, 핵산 라이브러리, 펩티드 핵산 라이브러리(미국 특허 5,539,083 예시 참고), 항체 라이브러리(Vaughn 등, (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314) 및 PCT/US96/10287 참고), 탄수화물 라이브러리(Liang 등 (1996) Science, 274: 1520-1522, 및 미국 특허5,593,853 참고), 및 작은 유기 분자 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀, Baum (1993) C&EN, 1월18일, 페이지 33, 이소프레노이드 미국 특허 5,569,588, 티아졸리디논 및 메타티아자논 미국 특허 5,549,974, 피롤리딘 미국 특허 5,525,735 및 5,519,134, 모르폴리노 화합물 미국 특허 5,506,337, 벤조디아제핀 5,288,514, 및 이와 유사물) 참조.

복합 라이브러리를 제조하는 장치는 시판된다(예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA).

용액 상 화학물에 대해 다수의 익히 공지된 로봇 시스템이 또한 개발되어 왔다. 이러한 시스템에는 Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japan) 에서 개발한 자동 합성 장치 및 화학자들이 수행하는 수작업 합성 조작과 닮은 로봇 팔을 이용하는 많은 로봇 시스템(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, HewlettPackard, Palo Alto, Calif.)이 포함된다. 상기 장치들은 본 발명에 사용하는데 적합하다. 이들 장치를 그대로 사용하거나 변형을 하여서 본원에서 논의되는 것과 같이 조작할 수 있는 것은 유관분야의 당업자가 명백히 이해할 수 있다. 또한, 상당수의 복합 라이브러리 자체도 시판된다 (ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, 등).

화학 라이브러리의 고처리량 검사 방법

당연히, 형광 편광을 이용하는 본 발명의 방법을 바로 고처리량 스크리닝에 이용할 수 있다. 고처리량 스크리닝 시스템은 시판된다(예를 들면, Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, 등). 이러한 시스템들은 전형적으로 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 시간을 정한 항온처리, 검사에 적합한 검출기(들)에서 마이크로 플레이트의 최종 판독을 포함하는 전체 공정이 자동화되어있다. 이러한 변경가능한 시스템은 고처리량, 신속하게 작업뿐만 아니라 고도의 유연성 및 맞춤성을 제공한다. 이와 같은 시스템 제조업자는 다양한 고처리량을 위한 상세한 프로토콜도 제공한다. 따라서, 예들어 Zymark Corp는 유전자 전사, 리간드 결합 등의 변화를 감지하는 스크리닝 시스템을 설명하는 기술 책자를 제공한다.

본 발명의 예시에서 제공되는 다음의 비제한적 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 좀더 완전히 설명하기 위해 제공되는 것이다. 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.

실시예 I

유도성 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 ( mPGES )의 형광 편광 검정

프로스타글란딘 E ₂ (PGE₂)는 염증 및 통증에 연관되는 주요 중개물질이다. 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제(mPGES)는 글루타티온 존재하에서 PGH₂의 PGE₂로의 전환을 촉매한다. 많은 염증 상태에서 mPGES 발현을 유도한다. 따라서, mPGES 활성을 저해 또는 감소시키는 화합물은 일부 질환 또는 장애를 명시하여, 염증, 통증, 발열, 또는 이의 복합 증세에 효과적인 가망 치료물질이 될 것이다.

유도성 마이크로솜성 PGE₂ 신타제에 의해 PGH₂에서 PGE₂로 전환을 측정하는 검정법이 개발되어왔다. 이 검정은 형광 편광 원리에 근거하여 고안된다. 효소를 PGH₂, 글루타티온 및 평가대상이 되는 화합물 또는 제제와 함께 항온처리한다. 짧은 항온처리시간(최소 30초) 후에, FeCl₂ 및 시트르산을 함유하는 정지 용액을 첨가하여 임의 잔류 PGH₂를 퀀치시켜 PGD₂ 또는 PGE₂로 자발적 전환되지 않도록 하여, PGH₂에서 PGE₂로 효소에 의한 전환의 정량화에 간섭이 일어난다(도 1). 형광 라벨(Texas Red)된 트레이서(PGE₂) 및 항-PGE₂ 항체를 함유하는 감지 용액을 그 다음 첨가하여 PGE₂ 생산에 역비가 되는 특정 시그날이 발생되도록 한다(도 2). 효소 반응으로부터 생성되는 PGE₂ 는 항체에 특이적으로 경쟁하여 형광 라벨링된 트레이서를 방출할 것이다. PGE₂ 신타제 활성 저해 결과는 FP 값이 증가된 것으로 나타날 것이다.

재료

글루타티온(GSH):

Sigma사 제품 이용 (Catalog # G-6529).

PGH ₂

Cayman Chemicals, Inc.의 제품이용 (Catalog #17020).

PGE ₂ 모노클로날 항체

Assay Designs, Inc.의 제품 이용 (Catalog # 915-057)

PGE ₂ :

Cayman Chemicals, Inc.의 제품 이용 (Catalog #14010)

사람 mPGES 효소의 발현

세균 발현 시스템 및 문헌[Jakobsson, P., 등 (Identification of human prostaglandin E synthase :a microsomal glutathione -dependent, Inducible Enzyme, Constituting a Potential Novel Drug Target. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:7220-7225 (1999년6월)]에서 제시하는 과정을 이용하여 사람 mPGES 효소를 발현시켰다. 따라서, 본 실시예에서 이용된 mPGES는 정제된 형태는 아니고, mPGES를 발현시키기 위해 이용된 세균으로부터 수득된 막 분취물로 오염되었다. 본 실시예에서 이용된 사람의 mPGES를 암호화하는 DNA 서열은 도 9A 및 서열번호 1에 제시한다. 본 실시예에서 이용된 사람의 mPGES 아미노산 서열은 도 9B 및 서열번호 2에 제시한다.

형광 라벨링된 프로스타글란딘 생성물 PGE ₂

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에는 다양한 형광 라벨이 적용된다. 특정 양태에서, 형광 라벨 텍사스 레드를 링커를 통하여 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)에 연결시킨다. 이 양태에서, 텍사스 레드에 의해 라벨링된 PGE₂는 Combinix (San Mateo, CA)로 합성하였다. 이와 같은 잔기를 생산하는 메카니즘은 하기에 기술한다:

합성시에, 텍사스 레드 카다바린(분자성 프로브)을 무수 염화 메틸렌중에 프로스타글란딘 E₂ (Cayman Chemicals) 용액에 첨가하였다. 디사이클로헥실카보디이미드(Sigma-Aldrich)를 첨가하고, 용액을 24시간동안 암흑 상태에서 질소 하에 교반시켰다. 역상 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 변형제로는 0.05% TFA와 함께 물/아세토니트릴 구배를 사용하여 정제하였다. 이 합성에 이용된 링커는 변화될 수 있다.

방법

우선, 효소를 함유하는 막 분취물을 K₂HPO₄ 및 KH₂PO₄을 함유하는 반응 완충액중에 희석시켜 인산염 완충 효소 용액을 제조하였다. 검사할 화합물 또는 제제를 효소 용액에 넣었다. 임의로, 이 용액을 항온처리 시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 용액을 약 30분간 항온처리 시켰다. 아세톤중에 기질 PGH₂ 와 보조인자 GSH를 4℃에서 별도의 용기에 넣었다. PGH₂를 함유한 용기에 이어서 효소 용액을 첨가하여 반응을 개시하였다. 이 혼합물을 약 30초간 항온처리 시켰다. FeCl₂ (20 mM)을 함유하는 정지 용액을 혼합물에 혼합시켜 임의 잔존하는 PGH₂가 PGE₂로자발적으로 전환되는 것을 방지하였다. 그 다음 항-PGE₂ 항체 및 PGE₂-텍사스 레드 트레이서를 함유하는 감지 용액을 혼합물에 첨가하고, 전체 혼합물을 항온처리 하였다. 이러한 특정 실시예에서, 항온처리 시간은 약 120분으로 하였다. 그러나, 당업자는 이 실시예에서 기술된 임의 항온처리 기간을 다양하게 변화시켜 유용한 결과를 수득할 수도 있을 것이다. 이 혼합물과 동일하나 단, 검사대상인 화합물 또는 제제가 포함되지 않은 대조군 혼합물도 동일하게 처리하는데, 즉 동일한 시약을 함유하고, 동일한 시간동안 항온처리하는 등의 처리를 하였다. 이어서, 전체 혼합물 및 대조군 혼합물에 580 nm 파장의 평면 편광을 조사하고, 여기 파장 580 nm 및 방출 파장 620 nm로 설치된 형광 필터를 사용하여 혼합물의 형광 편광과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하였다. 측정 장치가 FP 모드로 있는 동안에 측정이 이루어졌다. 이러한 2개의 측정치를 이어서 비교하여 화합물 또는 제제를 함유하는 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 용액의 형광 측정치보다 큰지를 측정하였다. 대조군 혼합물의 측정치보다 상기 혼합물의 측정치가 큰 경우에 검사 대상 화합물 또는 제제는 mPFES 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

결과

상기에서 기술된 검사 대상은 mPGES의 공지 억제제로 유효하였다. 이 억제제, MK-886은 Biomol Research Laboratories, Inc.(Plymouth Meeting, PA, catalog #EI-266)에서 시판되는 것으로 상품 코드가 CAS# 118414-82-7이다. 이 물질의 구조는 도 5에 제시한다. 이 실험 결과는 도 6에 제시한다. 이들 결과로부터 mPGES 검사의 농도 반응 곡선을 나타내고, 대상 화합물 또는 제제가 mPGES의 활성을 감소 또는 심지어 저해시키는 능력을 평가하는데 본 발명의 방법이 적용된다는 것을 분명하게 나타낸다.

실시예 II

조혈성 프로스타글란딘 D 신타제 ( hPGDS )의 형광 편광 검정

기도 알레르기성 장애에서 항원성 챌리지는 PGD₂ 생성을 증가시킬 것이다. 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제 (hPGDS)때문에 PGH₂가 PGD₂로 전환하는 PGD₂는 D 형 프로스타글란딘 수용체(DP) 및 Th2 세포에 대한 케모킨 수용체 (CRTH2) 모두에 결합되어, 기관지수축, 혈관확장, 비강 점막 비대가 증가된다. 수득한 기관지 과다활성, 비강 폐색, 호산구 및 Th2 세포 침윤이 알레르기 반응을 유도한다. 결과적으로, hPGDS 의 활성을 감소 또는 저해시킬 수 있는 화합물 또는 제제를 치료제로서 즉시 적용할 수 있다.

hPGDS 활성을 측정하기 위한 형광 편광(FP) 검사법이 또한 개발되어 왔다(도 3, 4). 이 검사는 형광 편광 원리에 근거하여 고안된다. hPGDS를 PGH₂, 글루타티온 및 평가대상이 되는 화합물 또는 제제와 혼합하였다. 짧은 시간(약 30초)후에, FeCl₂ (20 mM)을 함유하는 정지 용액을 첨가하여 임의 잔존하는 PGH₂를 퀀치하고, PGD₂ 및 PGE₂ 혼합물로 자발적인 전환을 진행시켜서, PGH₂로부터 PGD₂로의 효소적 전환의 정량화에 간섭하였다(도 3). 형광 라벨링된(텍사스 레드) 트레이서(PGD₂) 및 항-PGD₂ 항체를 함유하는 감지 용액을 이어서 첨가하여 PGD₂ 생산에 역비례하는 특이적 시그날을 생성시켰다(도 4). 효소 반응으로 생성된 PGD₂ 는 항체와 특이적 경쟁하고 형광 라벨링된 트레이서를 방출하였다. 상기에서 논의한 이유로 인하여, PGD₂ 신타제 활성이 감소 또는 저해됨으로써 형광 편광(FP) 값이 증가한다.

재료

hPGDS 의 발현

Kanaoka 등 (Structure and Chromosomal Localization of Human and Mouse Genes for Hematopoietic Prostaglandin D Synthase . Eur. J. Biochem. 267:3315-3322 (2000))에서 제시하고 있는 공정에 속하는 세균 발현 시스템을 이용하여 사람의 조혈성 PGD₂ 신타제를 발현시켰다. 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 도 10A 및 서열번호 3에 제시한다. 암호화 뉴클레오티드 서열을 증폭시킨 후, pT7-7 벡터로 삽입시켜, 이 벡터를 이용하여 다시 E. coli FL21 (DE3) 균주의 세포를 형질전환시켰다. 티오-β-D-갈락토시드(최종 농도0.6 mM)를 이어서 형질전환된 세포로 첨가하여 사람의 hPGDS 효소가 생산되도록 유도하였다. 사람의 hPGDS는 GSH-세파로즈 4B 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 본 실시예에서 이용된 사람 hPGDS의 아미노산 서열은 도 10B 및 서열번호 4에 제시한다.

GSH

Sigma사 제품이용 (Catalog # G-6529)

PGH ₂

Cayman Chemical Inc.로부터 구입 (Ann Arbor, Michigan) 제품번호는 17020이다.

항-PGD ₂ 항체

모노클로날 항-PGD₂ 항체는 Institute Pasteur에서 구입하였고, 제품번호는 0465328이었다.

PGD ₂ :

Cayman Chemicals, Inc.에서 구입하였다 (Ann Arbor, Michigan) (Catalog #12010).

형광 라벨링된 프로스타글란딘 생성물 PGD ₂

상기 실시예 1에와 같이, 텍사스 레드를 형광 라벨로 이용하였다. 텍사스 레드로 라벨링된 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)는 Combinix (San Mateo, CA)에서 생산하였다. 다음에는 이와 같은 잔기를 생성하는 메카니즘을 설명한다.

합성시에, 무수 염화 메틸렌중에 프로스타글란딘 D₂ (Cayman Chemicals) 용액에 텍사스 레드 카다바린(분자성 프로브)을 첨가하였다. 디사이클로헥실카보디이미드(Sigma-Aldrich)를 첨가하고, 반응물을 24시간동안 암흑 상태에서 질소 하에 교반시켰다. 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 변형제로서 0.05% TFA와 함께 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 정제하였다. 당연히 이용된 링커는 변화될 수 있다.

방법

이 방법은 실시예 I에서 사용된 것과 동일하나, 단 이용되는 효소가 hPGDS이고, 프로스타글란딘 생성물은 PGD₂이다. 따라서, 상기에서 기술하는 바와 같이, 효소 및 GSH를 처음부터 K₂HPO₄ 및 KH₂PO₄를 함유하는 반응 완충액에서 함께 희석시켜 효소 용액을 제조하였다. 검사할 화합물 또는 제제를 인산 완충된 효소 용액에 이어서 넣었다. 임의로, 이 용액을 이어서 항온처리시킬 수 있다. 이 항온처리 시간은 몇 분내지 한 시간까지 다양하게 할 수 있다. 특정 실시예에서, 효소 용액은 약 30분간 항온처리 시켰다.

아세톤중에 기질 PGH₂를 4℃에서 별도의 용기에 두었다. PGH₂를 함유한 용기에 효소 용액을 이어서 첨가하여 반응을 개시하였다. 이 혼합물은 약 30초간 항온처리 시켰다. FeCl₂ 및 시트르산을 포함하는 정지 용액을 이어서 혼합물에 혼합시켜 임의 잔존하는 PGH₂ 가 PGE₂또는 PGD₂로 자발적으로 전환되는 것을 방지하였다. 그 다음 PGD₂ 를 면역원으로서 항체 및 텍사스 레드 라벨링된 PGD₂ (트레이서)를 포함하는 감지 용액을 혼합물에 첨가하고, 전체 혼합물을 항온처리 하였다. 이 실시예에서, 혼합물은 약 120분동안 항온처리 하였다. 그러나, 당업자는 이 실시예에서 기술된 이 항온처리 기간뿐만 아니라 모든 다른 항온처리 기간을 시약 농도에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다.

효소를 함유하는 혼합물과 동일하게 대조군 혼합물을 제조하는데, 대조군 혼합물은 효소를 함유한 혼합물에 동일한 방식으로, 즉 동일한 항온처리 기간 등으로 처리하였다. 그러나, 이 대조군 혼합물은 평가 대상인 화합물 또는 제제는 함유하지 않았다. 전체 혼합물 및 대조군 혼합물에 580 nm(텍사스 레드가 여기되는 파장) 파장의 평면 편광을 조사하고, 여기 파장 580 nm 및 방출 파장 620 nm로 제시된 형광 필터를 사용하여 혼합물의 형광 편광과 대조군 혼합물의 형광 평광을 측정하였다. 측정 장치가 FP 모드로 있는 동안에 형광 편광 측정이 이루어졌다. 당연히, 이용되는 파장은 상기 방법에서 사용하는 형광 라벨에 따라 달라질 것이다. 이러한 2개의 FP 측정치를 이어서 비교하여 화합물 또는 제제를 함유하는 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 용액의 형광 측정치보다 큰지를 측정하였한다. 대조군 혼합물의 형광 편광 측정치보다 상기 혼합물의 형광 평광 측정치가 큰 경우에 검사 대상 화합물 또는 제제는 hPGDS 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

결과

hPGDS의 공지된 억제제인 HQL79를 이용하여 상기에서 기술된 검사법이 유효하였다. HQL79는 WO95/01350에서 기술하고 있다. HQL 79의 구조는 도 7에서 제시한다. 이 실험 결과는 도 8에 제시한다. 이러한 결과들을 통하여 본 발명의 방법으로 HQL 79가 hPGDS 활성을 감소시킨다는 것을 분명하게 나타낸다.

결론

실시예 I 및 II에서 본 발명의 방법은 프로스타글란딘 신타제, 특히 hPGDS 또는 mPGES의 활성을 화합물 또는 제제가 감소 또는 저해시키는지를 측정하는데 있어서, 간단하면서도, 여러 세척 단계 또는 방사능 동위원소 사용을 요하지 않으며, 고처리량 방식으로 즉시 이용될 수 있다는 것을 증명한다.

본 발명은 본원에서 기술하는 특정 실시예에 의해 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 또한, 본원에서 기술되는 것에 추가하여 본 발명의 방법을 다양하게 변형시킨 것도 당업자에게는 상기 명세서 및 첨부한 도면을 근거하여 충분히 이해될 수 있을 정도로 명백하다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구범위의 영역내에 포함된다.

다양한 문헌이 본원에서 언급하고 있으며, 이 내용물은 전부 참고문헌으로 인용되어 있다.

<110> Aventis Pharmaceuticals Inc. <120> Method for assaying compounds or agents for ability to decrease the activity of microsomal prostaglandin E synthase or hematopoietic prostaglandin D synthase <130> USAV2002/0098 WOPCT <150> US 60/404,008 <151> 2002-08-16 <150> GB 0229244.9 <151> 2002-12-16 <160> 4 <170> KopatentIn Ver. 1.7 <210> 1 <211> 459 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcctgccc acagcctggt gatgagcagc ccggccctcc cggccttcct gctctgcagc 60 acgctgctgg tcatcaagat gtacgtggtg gccatcatca cgggccaagt gaggctgcgg 120 aagaaggcct ttgccaaccc cgaggatgcc ctgagacacg gaggccccca gtattgcagg 180 agcgaccccg acgtggaacg ctgcctcagg gcccaccgga acgacatgga gaccatctac 240 cccttccttt tcctgggctt cgtctactcc tttctgggtc ctaacccttt tgtcgcctgg 300 atgcacttcc tggtcttcct cgtgggccgt gtggcacaca ccgtggccta cctggggaag 360 ctgcgggcac ccatccgctc cgtgacctac accctggccc agctcccctg cgcctccatg 420 gctctgcaga tcctctggga agcggcccgc cacctgtga 459 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ala His Ser Leu Val Met Ser Ser Pro Ala Leu Pro Ala Phe 1 5 10 15 Leu Leu Cys Ser Thr Leu Leu Val Ile Lys Met Tyr Val Val Ala Ile 20 25 30 Ile Thr Gly Gln Val Arg Leu Arg Lys Lys Ala Phe Ala Asn Pro Glu 35 40 45 Asp Ala Leu Arg His Gly Gly Pro Gln Tyr Cys Arg Ser Asp Pro Asp 50 55 60 Val Glu Arg Cys Leu Arg Ala His Arg Asn Asp Met Glu Thr Ile Tyr 65 70 75 80 Pro Phe Leu Phe Leu Gly Phe Val Tyr Ser Phe Leu Gly Pro Asn Pro 85 90 95 Phe Val Ala Trp Met His Phe Leu Val Phe Leu Val Gly Arg Val Ala 100 105 110 His Thr Val Ala Tyr Leu Gly Lys Leu Arg Ala Pro Ile Arg Ser Val 115 120 125 Thr Tyr Thr Leu Ala Gln Leu Pro Cys Ala Ser Met Ala Leu Gln Ile 130 135 140 Leu Trp Glu Ala Ala Arg His Leu 145 150 <210> 3 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgccaaact acaaactcac ttattttaat atgaggggga gagcagaaat tattcgttac 60 atatttgctt atttggacat acagtatgaa gaccacagaa tagaacaagc tgactggcct 120 gaaatcaaat caactctccc atttggaaaa atccccattt tggaagttga tggacttact 180 cttcaccaga gcctagcaat agcaagatat ttgaccaaaa acacagattt ggctggaaac 240 acagaaatgg aacaatgtca tgttgatgct attgtggaca ctctggatga tttcatgtca 300 tgttttcctt gggcagagaa aaagcaagat gtgaaagagc agatgttcaa tgagctgctc 360 acgtataatg cgcctcatct tatgcaagac ttggacacat atttaggggg gagagaatgg 420 cttattggta actctgtaac ttgggcagac ttctactggg agatttgcag taccacactt 480 ttggtcttta agcctgacct gttagacaac catccaaggc tggtgacttt acggaagaaa 540 gtccaagcca ttcctgccgt cgctaactgg ataaaacgaa ggccccaaac caaactctag 600 <210> 4 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Asn Tyr Lys Leu Thr Tyr Phe Asn Met Arg Gly Arg Ala Glu 1 5 10 15 Ile Ile Arg Tyr Ile Phe Ala Tyr Leu Asp Ile Gln Tyr Glu Asp His 20 25 30 Arg Ile Glu Gln Ala Asp Trp Pro Glu Ile Lys Ser Thr Leu Pro Phe 35 40 45 Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Val Asp Gly Leu Thr Leu His Gln Ser 50 55 60 Leu Ala Ile Ala Arg Tyr Leu Thr Lys Asn Thr Asp Leu Ala Gly Asn 65 70 75 80 Thr Glu Met Glu Gln Cys His Val Asp Ala Ile Val Asp Thr Leu Asp 85 90 95 Asp Phe Met Ser Cys Phe Pro Trp Ala Glu Lys Lys Gln Asp Val Lys 100 105 110 Glu Gln Met Phe Asn Glu Leu Leu Thr Tyr Asn Ala Pro His Leu Met 115 120 125 Gln Asp Leu Asp Thr Tyr Leu Gly Gly Arg Glu Trp Leu Ile Gly Asn 130 135 140 Ser Val Thr Trp Ala Asp Phe Tyr Trp Glu Ile Cys Ser Thr Thr Leu 145 150 155 160 Leu Val Phe Lys Pro Asp Leu Leu Asp Asn His Pro Arg Leu Val Thr 165 170 175 Leu Arg Lys Lys Val Gln Ala Ile Pro Ala Val Ala Asn Trp Ile Lys 180 185 190 Arg Arg Pro Gln Thr Lys Leu 195

Claims

(a) 프로스타글란딘 신타제를 기질, 보조인자 및 시험대상 화합물 또는 제제와 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과, 상기 기질의 프로스타글란딘 생성물로의 자발적 전환을 방지시키는 제제를 포함하는 정지 용액을 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물을, 형광 라벨로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물 및 면역원으로서 프로스타글란딘 생성물을 가지는 항체를 포함하는 감지 시약과 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 형광 라벨이 여기될 수 있는 파장의 평면 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계를 포함하고,

이때 (c) 단계 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 편팡 측정치보다 큰 경우에 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제 활성을 감소시킨다는 것을 나타내는 것인, 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 (mPGES) 및 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제 (hPGDS)로 이루어진 그룹에서 선택된 프로스타글란딘 신타제가 기질과 반응하여 프로스타글란딘 생성물을 형성할 수 있는 활성을 화합물 또는 제제가 감소시킬 수 있는 지의 여부를 측정하는 방법 .
제1항에 있어서, 프로스타글란딘 신타제가 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 (mPGES)이고, 기질이 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂)이며, 보조인자가 글루타티온(GSH)이고, 프로스타글란딘 생성물이 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)인 방법.
제2항에 있어서, 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 사람 mPGES인 방법.
제1항에 있어서, 프로스타글란딘 신타제가 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제 (hPGDS)이고, 기질이 PGH₂이며, 보조인자가 글루타티온(GSH)이고, 프로스타글란딘 생성물이 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)인 방법.
제4항에 있어서, 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한 사람의 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제인 방법.
제1항에 있어서, 정지 용액의 제제가 FeCl₂인 방법.
제1항에 있어서, 형광 라벨이 플루오레신, 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 유리 란탄니드 시리즈 염, 킬레이트된 란탄니드 시리즈 염, BODIPY, ALEXA, CyDye을 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 형광 라벨이 텍사스 레드(TR)인 방법.
제2항에 있어서, 정지 용액의 제제가 FeCl₂인 방법.
제9항에 있어서, 항온처리 단계 (b)가 30초이상 지속하고, 항온처리 단계 (c)가 3 분이상 지속하는 방법.
제10항에 있어서, 형광 라벨이 플루오레신, 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 유리 란탄니드 시리즈 염, 킬레이트된 란탄니드 시리즈 염, BODIPY, ALEXA, 또는 CyDye을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 형광 라벨이 텍사스 레드(TR)이고, 평면 편광 여기 광의 파장이 580±20 nm인 방법.
제4항에 있어서, 정지 용액의 제제가 FeCl₂인 방법.
제13항에 있어서, 형광 라벨이 플루오레신, 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 유리 란탄니드 시리즈 염, 킬레이트된 란탄니드 시리즈 염, BODIPY, ALEXA , CyDye을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 형광 라벨이 텍사스 레드(TR)이고, 평면 편광 여기 광의 파장이 580 ±20 nm인 방법.
(a) 프로스타글란딘 신타제를 기질, 보조인자 및 시험대상 화합물 또는 제제와 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과, 반응안된 기질의 프로스타글란딘 생성물로의 자발적 전환을 방지시키는 제제를 포함하는 정지 용액을 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물을, 텍사스 레드로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물 및 면역원으로서 프로스타글란딘 생성물을 가지는 항체를 포함하는 감지 시약과 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 580 ±20nm 파장의 평면 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 620 ±20nm에서 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계를 포함하고,

이때 (c) 단계 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 편광 측정치보다 큰 경우에 화합물 또는 제제가 프로스타글란딘 신타제 활성을 감소시킨다는 것을 나타내는 것인, 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제 (hPGDS) 및 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 (mPGES)로 이루어진 그룹에서 선택된 프로스타글란딘 신타제가 이의 기질과 반응하여 프로스타글란딘 생성물을 형성할 수 있는 활성을 화합물 또는 제제가 감소시킬 수 있는지의 여부를 측정하는 방법.
제16항에 있어서, 프로스타글란딘 신타제가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 사람의 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제 (mPGES)이고, 기질이 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂)이며, 보조인자가 글루타티온이고, 프로스타글란딘 생성물이 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)인 방법.
제17항에 있어서, 정지 용액의 제제가 FeCl₂인 방법.
제18항에 있어서, 텍사스 레드로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물이 프로스타글란딘 생성물 및 텍사스 레드가 결합되는 링커 분자를 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 링커 분자가 아미노부티르산, 아미노카프로산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노카프릴산, Fmoc-아미노카프로산, 한 개 이상의 β-알라닌, 이소티오시아네이트기, 숙신이미딜 에스테르, 설포날 할로겐 화합물 및 카보디이미드로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
제20항에 있어서, 링커 분자가 카보디이미드인 방법.
제16항에 있어서, 프로스타글란딘 신타제가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한 사람의 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제 (hPGDS)이고, 기질이 PGH₂이며, 보조인자가 글루타티온이고, 프로스타글란딘 생성물이 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)인 방법.
제22항에 있어서, 정지 용액의 제제가 FeCl₂인 방법.
제23항에 있어서, 텍사스 레드로 라벨링된 프로스타글란딘 생성물이 프로스타글란딘 생성물 및 텍사스 레드가 결합되는 링커 분자를 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 링커 분자가 아미노부티르산, 아미노카프로산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노카프릴산, Fmoc-아미노카프로산, 한 개 이상의 β-알라닌, 이소티오시아네이트기, 숙신이미딜 에스테르, 설포날 할로겐 화합물 및 카보디이미드로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
제25항에 있어서, 링커 분자가 카보디이미드인 방법.
(a) mPGES와 PGH₂, 글루타티온 및 시험대상 화합물 또는 제제를 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과, FeCl₂를 포함하는 정지 용액을 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물과, 텍사스 레드로 라벨링된 PGE₂ 및 면역원으로서 PGE₂ 를 가지는 항체를 포함하는 감지 시약을 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 580±20 nm 파장의 평면 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계를 포함하고,

이때 (c) 단계 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 편광 측정치보다 큰 경우에 화합물 또는 제제가 mPGES 활성을 감소시킨다는 것을 나타내는 것인, 화합물 또는 제제가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 사람의 마이크로솜성 프로스타글란딘 E 신타제(mPGES)와 이의 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂) 기질과 반응하여 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)를 형성하는 활성을 감소시키는지의 여부를 측정하는 방법.
(a) hPGDS와 PGH₂, 글루타티온 및 화합물 또는 제제를 혼합시키는 단계;

(b) (a) 단계의 혼합물과, FeCl₂를 포함하는 정지 용액을 항온처리하는 단계;

(c) (b) 단계의 혼합물과, 텍사스 레드로 라벨링된 PGD₂ 및 면역원으로서 PGD₂ 를 가지는 항체를 포함하는 감지 시약을 함께 항온처리하는 단계;

(d) (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물에 580±20 nm 파장의 평면 편광을 조사하고, (c) 단계의 혼합물과 대조군 혼합물의 형광 편광을 측정하는 단계; 및

(e) (d) 단계의 측정치를 비교하는 단계를 포함하고,

이때 (c) 단계 혼합물의 형광 편광 측정치가 대조군 혼합물의 형광 편광 측정치보다 큰 경우에 화합물 또는 제제가 hPGDS 활성을 감소시킨다는 것을 나타내는 것인, 화합물 또는 제제가 서열번호 4 의 아미노산 서열을 포함하는 사람의 조혈성 프로스타글란딘 D 신타제(hPGDS)와 이의 프로스타글란딘 H₂ (PGH₂) 기질이 반응하여 프로스타글란딘 D₂ (PGD₂)를 형성하는 활성을 감소시키는지의 여부를 측정하는 방법.