JPH0431735B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は体液中から血液凝固第因子を吸着分
離するための血液凝固第因子精製用吸着体およ
び該吸着体を用いた血液凝固第因子の精製法に
関する。 〔従来の技術および発明が解決しようとする問題
点〕 血液凝固第因子は抗血友病Ａ因子とも呼ば
れ、従来より血友病Ａ患者の出血の治療には欠乏
している血液凝固第因子を投与する方法が有効
で一般的に行われている。 しかしながら、血液凝固第因子は血漿中に微
量しか存在せずまた不安定であるためヒト血漿か
らの血液凝固第因子の回収精製は容易ではな
い。 現在のところ血友病Ａ患者への血液凝固第因
子の補充にはクリオプレシピテート、および第
因子濃縮製剤が用いられている。 クリオプレシピテートは血漿の粗分画を用いる
ため第因子の回収率が高いという利点はある一
方、その投与によつてアレルギー反応が出やすい
こと、大量のフイブリノーゲンを含んでいるため
血漿中のフイブリノーゲンの濃度が増加するこ
と、また第因子の濃度が低いため大量の製剤を
注入しなければならないことなどの欠点がある。 第因子濃縮製剤にはこれらの欠点がないため
血友病Ａ患者への補充用としてすぐれてはいる
が、通常第因子濃縮製剤は米国特許第3631018
などに示されているようにコーン分画、あるい
はクリオプレシピテートなどの第因子粗製画分
から、ポリエチレングリコール沈殿分画法、グリ
シン沈殿分画法などを組合わせた複雑な方法によ
り製造されるため濃縮時の第因子の回収率が約
20％と非常に低いという問題点がある。 また、吸着により第因子の精製を行う試みも
なされてはいるが、吸着選択性がわるいこと、吸
着した第因子の回収率が低いことなどの埋由
で、実用に耐える吸着体はなかつた。 本発明者らは、かかる実情に鑑み、鋭意研究を
重ねた結果、複雑な操作を用いることなく効率
的、選択的かつ高収率で血液凝固第因子を吸着
しうる吸着体およびそれを用いた血液凝固第因
子の精製法を見出した。 〔問題点を解決するための手段〕 すなわち本発明は、排除限界分子量が80万〜１
億の水不溶性多孔質ゲルであつて、少なくともそ
の表面の一部に硫酸エステル基を有することを特
徴とする血液凝固第因子精製用吸着体および血
液凝固第因子を含む溶液を前記吸着体で処理し
て血液凝固第因子を吸着したのち、血液凝固第
因子を溶出して回収することを特徴とする血液
凝固第因子の精製法に関する。 〔実施例〕 本明細書でいう体液とは血液、血漿およびこれ
らからえられた分画成分、あるいはその他の生体
由来の液性成分で血液凝固第因子を含有するも
のであればいかなるものであつてもよい。 本発明に用いる水不溶性多孔質ゲルは、血液凝
固第因子を吸着するために適当な大きさの径の
連続した細孔を有するものが好ましい。すなわ
ち、第因子は分子量が少なくとも100万以上の
巨大分子であり、これを吸着するためには第因
子が容易にゲル内に侵入できるような大きさの径
の細孔を有することが必要である。 細孔径の測定方法には種々あり、水銀圧入法が
最もよく用いられているが、親水性ゲルのばあい
には適用がむずかしい。したがつて、親水性ゲル
の細孔径の目安として排除限界分子量がよく用い
られる。排除限界分子量とは、たとえば「実験高
速液体クロマトグラフイ」（波多野博行および花
井俊彦著、(株)化学同人発行）などの成書に述べら
れているごとく、ゲル浸透クロマトグラフイにお
いて細孔内に侵入できない（排除される）分子の
うち最も小さい分子量を有する分子の分子量をい
う。排除限界分子量は対象とする化合物により異
なることが知られており、一般に球状蛋白質、デ
キストラン、ポリエチレングリコールなどについ
てよく調べられており、本発明においては第因
子に最も類似している球状蛋白質（ビールスを含
む）を用いてえられた値を用いるのが適当であ
る。 排除限界分子量の異なる種々の水不溶性多孔質
ゲルを用いて検討した結果、予想に反し排除限界
分子量が第因子の分子量より小さい80万程度の
ものである程度の吸着能を示し、また細孔径の大
きいものほど吸着能力が大きいわけではなく、細
孔径がある大きさをこえるとむしろ能力が低下し
たり第因子以外の蛋白が吸着されることが示さ
れ、したがつて最適な細孔径の範囲が存在するこ
とが明らかになつた。すなわち80万未満の排除限
界分子量を有する水不溶性多孔質ゲルを用いたば
あいは第因子の吸着量は小さく実用に耐えない
が、排除限界分子量は第因子の分子量に近い80
万ないし200万の水不溶性多孔質ゲルを用いても
ある程度実用に供しうる吸着体がえられた。水不
溶性多孔質ゲルの、排除限界分子量が大きくなる
につれて第因子の吸着量は増加するがやがて頭
打ちとなり、排除限界分子量が１億より大きくな
ると表面積が少なすぎるため吸着量は目立つて低
下する。 したがつて本発明に用いる水不溶性多孔質ゲル
の好ましい排除限界分子量は80万〜１億であり、
さらに好ましくは200万〜5000万である。 また、水不溶性多孔質ゲルの多孔構造について
は表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、吸着表
面積を大きくするため空孔容積は20％以上である
ことが好ましい。水不溶性多孔質ゲルの形状は、
粒状、繊維状、膜状、ホローフアイバー状など任
意の形状を選ぶことができる。粒子状の水不溶性
多孔質ゲルを用いるばあい、その粒子径は、小さ
すぎると実用的な流速がえられず、また大きすぎ
ると吸着能力および溶出性が劣るため１〜5000μ
ｍであるのが望ましい。 本発明に使用する水不溶性多孔質ゲルは有機
性、無機性いずれであつてもよいが、目的とする
第因子以外の血液成分の吸着、いわゆる非特異
的吸着が少ないものが望ましい。 本発明に使用する水不溶性多孔質ゲルの代表と
しては、アガロース、デキストラン、ポリアクリ
ルアミドなどの軟質ゲル、多孔質ガラス、多孔質
シリカゲルなどの無機多孔体、ポリメチルメタク
リレート、ポリビニルアルコール、スチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体などの合成高分子、セル
ロースなどの天然高分子を原料とする多孔質ポリ
マー硬質ゲルなどがあげられるが、これらに限定
されるわけではない。 アガロースなどの軟質ゲルは合成ポリマーや無
機質からなるゲルに比べて非特異的吸着が少ない
という利点を有するが、血漿製剤の精製には軟質
ゲルよりも硬質ゲル（ポリマー硬質ゲル）のほう
が速い流速で吸着および脱離操作が行えるため一
層好ましい。 多孔質セルロースゲルは軟質硬質両ゲルの特徴
を併せ持ち、また硫酸エステル基の導入も容易に
行えるのでとくに好ましい。 水不溶性多孔質ゲルに硫酸エステル基を導入す
る方法は種々あるが、硫酸エステル基含有化合物
を水不溶性多孔質ゲルに固定する方法、水不溶性
多孔質ゲルが水酸基を含有するばあいにクロルス
ルホン酸、濃硫酸などの試薬を用いて水酸基含有
水不溶性多孔質ゲルの水酸基を硫酸エステル化す
ることにより直接硫酸エステル基を導入する方法
などが代表的な方法である。 硫酸エステル基含有化合物を水不溶性多孔質ゲ
ルに固定する方法としては共有結合を介する方法
が安定性が高く、好ましい。 本発明に用いる硫酸エステル基含有化合物とし
ては、アルコール、糖類、多価アルコール、炭水
化物などの水酸基含有化合物の硫酸エステルがあ
げられ、これらの化合物のうち硫酸エステル基の
ほかに水不溶性多孔質ゲルへの固定に利用できる
官能基を有する化合物が好ましい。なかでも多価
アルコールの部分硫酸エステル化物、とりわけ糖
類の硫酸エステル化物が硫酸エステル基および固
定に必要な官能基の両方を含んでいるうえに、生
体適合性、活性ともに高く好ましい。さらに硫酸
エステル化多糖類は容易に水不溶性多孔質ゲルに
固定できることからとくに好ましい。 硫酸エステル基含有化合物としては、エタノー
ルアミン、エチレングリコール、グリセリン、ア
ニソール、ペンタエリスリトール、ソルビトー
ル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチ
ルメタクリレートなどのアルコール、多価アルコ
ールの硫酸エステル化物、グルコース、キシロー
ス、トレオース、ガラクトース、フコース、ガラ
クトサミン、ウロン酸、グルクロン酸、アスコル
ビン酸などの糖類、炭水化物の硫酸エステル化
物、ヘパリン、デキストラン酸、コンドロイチン
硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパラン硫酸、
ケラタン硫酸、キシラン硫酸、カロニン硫酸、セ
ルロース硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸、ペク
チン硫酸、イヌリン硫酸、アルギニン硫酸、グリ
コーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラギーナ
ン硫酸、硫酸化デンプン、ポリグリコース硫酸、
ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、
メペサルフエートなどの硫酸エステル化多糖類な
どがあげられるがこれらに限定されるわけではな
い。 硫酸エステル化多糖類のうち分子量が10万以下
の低分子量のものはフイブリノーゲンなどの吸着
がほとんどなくとくに好ましい。また硫酸エステ
ル化多糖類のうちイオウ含量が５〜20％のものは
吸着活性が高く好ましい。 導入される硫酸エステル基の量は、吸着体１ml
あたり0.1μ〜10mmolが望ましい。0.1μmol未満で
は吸着能力が充分でなく、また10mmolを越える
と非特異的吸着、とくにフイブリノーゲンの吸着
が多すぎ、実用に供することが困難である。さら
に好ましくは１〜500μmolがよい。 第因子を含む溶液から本発明による吸着体を
用いて第因子を分離するには、第因子を含む
溶液と吸着体とを接触させて第因子を吸着させ
たのち、未吸着成分を洗浄してから第因子を溶
出させればよい。 吸着した第因子を溶出する方法としては温度
を高める方法、PHを変化させる方法など種々の方
法があるがイオン強度の高い水溶液によつて溶出
する方法が後処理も簡便で好ましい。吸着体の種
類により第因子以外の成分が吸着するばあいに
は、イオン強度、PHなどを連続的に変化させるい
わゆるグラデイエント法により、あるいは段階的
に変化させるステツプワイズ法により第因子を
分離することもできる。 以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定さ
れるものではない。 実施例 １ 多孔質セルロースゲルであるCKゲルＡ−３（商
品名、チツソ(株)製、球状蛋白質の排除限界分子量
5000万、粒径45〜105μｍ）10mlを採り、エタノ
ール中で臨界点乾燥により乾燥させた。乾燥ゲル
をよく脱水したピリジン10ml中に懸濁させ氷冷し
た。これにクロルスルホン酸２mlを撹拌下滴下
し、滴下終了後さらに10分間撹拌をつづけた。反
応終了後ゲルを濾別し、ピリジン、水で洗浄し
て、表面に硫酸エステル基が導入されたセルロー
スゲルをえた。硫酸エステル基の導入量は吸着体
１mlあたり110μmolであつた。 実施例 ２ クロルスルホン酸の量を３mlに、滴下後の攪拌
時間を60分間にかえたほかは実施例１と同様にし
て表面に硫酸エステル基が導入されたセルロース
ゲルをえた。硫酸エステル基の導入量は吸着体１
mlあたり750μmolであつた。 実施例 ３ 多孔質セルロースゲルであるセルロフアイン
GCL−2000（商品名、チツソ(株)製、球状蛋白質の
排除限界分子量300万、粒径45〜105μｍ）10mlを
水洗後吸引濾過し、これにジメチルスルホキサイ
ド６ml、2N NaOH 2.6ml、エピクロルヒドリン
1.5mlを加え40℃で２時間撹拌した。反応後ゲル
を濾別、水洗してエポキシ基の導入されたセルロ
ースゲルをえた。 これに濃アンモニア水６mlを加え、40℃で２時
間反応させてアミノ化セルロースゲルをえた。 えられたゲル２ｇに、分子量約5000、イオウ含
量15％のデキストラン硫酸ナトリウム４ｇを
0.1Mリン酸バツフア（PH8.0）８mlに溶解した液
を加え室温で16時間振盪した。反応後
NaCNBH₃20mgを加え室温で30分間撹拌後、40
℃で４時間加熱したのちゲルを濾別水洗してデキ
ストラン硫酸の固定されたセルロースゲルをえ
た。導入されたデキストラン硫酸の量は吸着体１
mlあたり、3.4mgであつた。 実施例 ４ 分子量が約50万、イオウ含量4.5％のデキスト
ラン硫酸を用いたほかは実施例３と同様にしてデ
キストラン硫酸の固定されたセルロースゲルをえ
た。導入されたデキストラン硫酸の量は吸着体１
mlあたり5.4mgであつた。 比較例 セルロースゲルとしてセルロフアインGC700
（商品名、チツソ(株)製、球状蛋白質の排除限界分
子量40万、粒径45〜105μｍ）を用いたほかは実
施例１と同様にして表面に硫酸イオンが導入され
たセルロースゲルをえた。硫酸エステル基の導入
量は吸着体１mlあたり250μmolであつた。 実施例 ５ 実施例１〜４および比較例で合成した各ゲル１
mlを試験管にとり、これにクエン酸加ヒト血漿６
mlを加え撹拌しながら37℃で１時間インキユベー
トした。 吸着後の血漿中の第因子の活性、フイブリノ
ーゲンの濃度を第１表に示す。第因子活性は
APTT法で測定した。

〔発明の効果〕

本発明の吸着体および該吸着体を用いた第因
子の精製法は、複雑な操作を用いることなく効率
的、選択的かつ高収率で第因子を分離回収する
効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１でえられた本発明の吸着体
を充填したカラムにヒト血漿を流したのち、
0.15Mから2Mの食塩濃度でグラデイエント溶出
したばあいの各フラクシヨンにおける食塩濃度、
総蛋白の濃度、および第因子、フイブリノーゲ
ンの溶出のパターンを表わすグラフである。第２
図は、実施例３でえられた本発明の吸着体を充填
したカラムに血液凝固第因子濃縮製剤であるク
リオブリンを溶解した緩衝液を流したのち、
0.5Mと1.5Mの２段階の食塩濃度の緩衝液で溶出
したばあいの食塩濃度と蛋白濃度の変化および各
フラクシヨンにおける第因子活性を表わすグラ
フである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 排除限界分子量が80万〜１億の水不溶性多孔
   質ゲルであつて、少なくともその表面の一部に硫
   酸エステル基を有することを特徴とする血液凝固
   第因子精製用吸着体。 ２ 水不溶性多孔質ゲルが水酸基含有化合物より
   構成されてなる特許請求の範囲第１項記載の吸着
   体。 ３ 水酸基含有水不溶性多孔質ゲルの水酸基を硫
   酸エステル化することにより硫酸エステル基が導
   入された特許請求の範囲第２項記載の吸着体。 ４ 硫酸エステル基含有化合物が共有結合により
   水不溶性多孔質ゲルに固定されてなる特許請求の
   範囲第１項記載の吸着体。 ５ 硫酸エステル基含有化合物が硫酸エステル化
   多糖類である特許請求の範囲第４項記載の吸着
   体。 ６ 硫酸エステル基の含量が吸着体１mlあたり
   0.1μ〜10mmolである特許請求の範囲第１項記載の
   吸着体。 ７ 硫酸エステル基の含量は吸着体１mlあたり１
   〜500μmolである特許請求の範囲第１項記載の吸
   着体。 ８ 硫酸エステル化多糖類の分子量が10万以下で
   ある特許請求の範囲第５項記載の吸着体。 ９ 血液凝固第因子を含む溶液を、排除限界分
   子量が80万〜１億の水不溶性多孔質ゲルであつ
   て、少なくともその表面の一部に硫酸エステル基
   を有することを特徴とする血液凝固第因子の吸
   着体で処理して血液凝固第因子を吸着したの
   ち、血液凝固第因子を溶出して回収することを
   特徴とする血液凝固第因子の精製法。