JP2007210908A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞毒性の低い抗ウイルス剤を安価に提供すること。
【解決手段】グルコースとグルクロン酸とラムノースからなり、１０％以上の水酸基が硫酸エステル化されている硫酸化多糖、特に硫酸化ジェランを、有効成分として含有する薬剤を作製し、抗ウイルス剤とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、原料多糖が有する水酸基が部分的に硫酸エステル化された硫酸化多糖類または該硫酸化多糖類を部分構造として有する化合物を含む新規な抗ウイルス剤に関する。

従来から硫酸化多糖による抗ウイルス作用については、ヘパリンを初めとして数多くの硫酸化多糖が研究されてきた（例えば非特許文献１、特許文献１参照）。しかしながらこれらを薬剤として用いる場合、硫酸化多糖の有する各種活性が逆に副作用となり問題となっている(例えば非特許文献１参照)。
特開昭６４−５２７２３号公報 Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol.15,No.81,pp29-46(2003)

このため安全でかつ安価な抗ウイルス剤の開発が望まれていた。このような事情に鑑み、本発明は、細胞毒性の低い抗ウイルス剤を安価に提供することを課題としてなされた。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、ジェランの水酸基を１０％以上硫酸化した硫酸化ジェランが、HIV感染に対する細胞障害抑制作用を有すること、細胞毒性が極めて低いこと、巨細胞形成抑制作用を有することを見出した。こうして、安価な多糖を既存の方法で硫酸化することで得られる硫酸化多糖に細胞毒性の低い抗ウイルス作用があることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明は下記の構成を有する。
［１］グルコースとグルクロン酸とラムノースからなり、糖を構成する水酸基の一部又は全部が硫酸エステル化されている硫酸化多糖を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
［２］前記硫酸化多糖が、グルコース２分子とグルクロン酸１分子とラムノース１分子からなる構成単位の繰り返しによって構成されていることを特徴とする前記［１］項記載の抗ウイルス剤。
［３］前記構成単位が、下記式（１）で示される単位であることを特徴とする前記［１］項記載の抗ウイルス剤。

（式中、Rはそれぞれ独立に選ばれるOHまたはOSO₃Hである。）
［４］前記硫酸化多糖が硫酸化ジェランであることを特徴とする前記［３］項記載の抗ウイルス剤。
［５］ヒトレトロウイルスに効果があることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。
［６］前記ヒトレトロウイルスがＨＩＶであることを特徴とする前記［５］記載の抗ウイルス剤。
［７］前記硫酸化多糖の平均分子量が５〜５００ｋＤａであることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。
［８］前記水酸基の１０％以上が硫酸化されていることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。

本発明により、細胞毒性の低い抗ウイルス剤を安価に提供することができるようになった。

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書においては、硫酸エステル化を硫酸化と、水酸基が部分的に硫酸エステル化された多糖を硫酸化多糖と称することがある。

本願発明にかかる抗ウイルス剤は、グルコースとグルクロン酸とラムノースからなり、糖を構成する水酸基の一部又は全部が硫酸エステル化されている硫酸化多糖を有効成分として含有する抗ウイルス剤である。特に、原料多糖において、グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２：１：１である構成単位の繰り返しによって構成されていることが好ましいが、この存在比であれば、構成単位内における、上記単糖の結合順序、単糖間の結合様式（例えばα結合、β結合）、単糖間の結合位置は特に限定されるものではない。なお、本発明において、硫酸化率とは、原料多糖が有する水酸基のうち、硫酸エステル化された割合を百分率で表した値をいう。本発明に用いられる硫酸化多糖の硫酸化率は、１０％以上であり、１０〜８０％が好ましく、２０〜５０％がより好ましい。硫酸化多糖の平均分子量は５〜５００ｋＤａが好ましく、５〜３０ｋＤａがより好ましい。

本発明の抗ウイルス剤を構成する硫酸化多糖の原料の多糖は、化学合成されたものであっても、天然由来の微生物の発酵産物や海藻抽出物などであってもよく、特に起源は限定されるものではない。また、それらは塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸またはその他の酸および水酸化ナトリウムなどのアルカリ化合物などによる加水分解により、あらかじめ低分子量化してから硫酸化反応に用いることができる。

原料多糖の具体例として、式（２）の構成単位を有する多糖をあげることができる。

原料多糖としてさらに具体的には、式（２）の構成単位からなる多糖、すなわち、シュードモナス エロデア（Pseudomonas elodea）が生産する多糖類を脱アシル化処理後精製したジェラン（gellan CAS 71010-52-1）があげられる。ジェランはグルコース、グルクロン酸、ラムノースが主成分である多糖類で、安価に大量に入手することが可能であるから、本発明に好ましく使用することができる。

多糖の硫酸化の方法は特に限定されず、通常知られている方法が利用できる。例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でクロロスルホン酸を作用させる方法（インターナショナル オブ ジャーナル オブ バイオロジカル マクロモレキュルズ（International Journal of Biological Macromolecules）２８，３８１（２００１））や、ＤＭＦ中でＤＭＦ／ＳＯ_３複合体を作用させる方法（人工臓器 ２６,１（１９９７））や、脱水ピリジン中で三酸化硫黄錯体を作用させる方法（Journal of the Chemical Society ８１（１９５９））である。また他にジオキサン−ＳＯ_３複合体、トリメチルアミン−ＳＯ_３複合体、ピリジン−ＳＯ_３複合体などの無水硫酸複合体を作用させる方法が使用可能である。原料の多糖の分子量、反応条件を変えることにより、任意の分子量と硫酸化度を有する硫酸化多糖を得ることができる。

本発明の抗ウイルス剤には上記の硫酸化多糖が好ましく用いられるが、これら硫酸化多糖を部分構造として有する化合物も同様に用いることができる。硫酸化多糖を導入する基質の例は、アミノ基を有する多糖、アミノ基を有するポリアミノ酸、およびアミノ基を導入した多糖類などである。アミノ基を有する多糖の具体例はキトサンである。アミノ基を有するポリアミノ酸の具体例はポリリジンである。アミノ基を導入した多糖類の具体例はアミノ化セルロースである。その他、本発明の硫酸化多糖の抗ウイルス活性を失する物で無ければどのような化合物と結合しても問題ない。

硫酸化多糖を上記基質に導入する方法は、本発明の抗ウイルス剤の抗ウイルス活性を失わなければ、特に限定されないが、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を触媒に用いて、硫酸化多糖のカルボキシル基と基質のアミノ基を結合する方法、硫酸化多糖の還元末端アルデヒド基と基質のアミノ基を弱アルカリ条件下で反応させ還元剤（テトラヒドロホウ酸ナトリウムやジメチルアミンボラン等）で処理して結合させる方法等を挙げることができる。

調製された抗ウイルス剤は、種々のウイルス疾患に用いることが可能であるが、特にＨＩＶ（Human Immunodeficiency virus）疾患などのヒトレトロウイルスなどの感染によるウイルス疾患に対し、感染前に投与することにより予防に用いることができ、感染後に投与することにより治療に用いることができる。なお、これら抗ウイルス剤の投与方法は病態に応じて適切に行われる必要があり、主な手法としては注射による皮下投与や静脈投与、錠剤化しての経口投与、坐薬としての腸管投与など、薬剤を適切な形態としてその形態に応じた投与方法を選択するのであればいかなる投与方法、薬剤形態としても何ら問題ない。

以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例、比較例において使用する用語の定義及び測定方法は以下の通りである。

（１）平均分子量（ｋＤａ）：合成した硫酸化ジェランを０．２ｍｏｌ／ｌ−ＮａＣｌ水溶液（イオン交換水にて調製）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、同じＮａＣｌ水溶液を溶出液としたＨＰＬＣによってゲルろ過した。ここで、カラムはShodex（登録商標） Ionpak KS-804（昭和電工社）及びKS-G（昭和電工社）を使用し、溶出物は示差屈折率検出器により検出した。予め、同じ条件で測定した分子量既知のプルラン（Shodex STANDARD P-82（昭和電工社））をゲル濾過して溶出時間と分子量の検量線を作成し、合成した硫酸化ジェランの溶出時間を検量線に当てはめることにより、硫酸化ジェランの平均分子量を決定した。

（２）硫酸化率（％）：原料多糖が有する水酸基のうち硫酸エステル化された割合を百分率で表示した。合成した硫酸化多糖の全Ｓ量をＩＣＰ発光分析装置による元素分析により測定し、イオンクロマトグラフィーにより硫酸化多糖本体から遊離した遊離Ｓ量を測定した。全Ｓ量から遊離Ｓ量を差し引いた結合Ｓ量から硫酸化率を算出した。なお、イオンクロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
分離カラム：ICS-A23（横河製）
カラム温度：４０℃
溶離液：３mmol/l 炭酸ナトリウム水溶液 流量 １ml/min
除去液：１５mmol/l 硫酸水溶液 流量 １ml/min

（３）Ｍｏｌｔ４細胞を用いた細胞障害抑制試験及び細胞毒性試験：抗ＨＩＶ物質の細胞毒性と抗ＨＩＶ活性を測定する２種類のプレートを用意する。両プレートとも９６穴平底培養プレートを使用し、左端８穴（ウエル）に１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で所定の濃度に希釈した試料溶液２００μｌを加えた。残りの穴には培地を１００μｌずつ入れ、左端の穴から１００μｌずつ隣の穴に溶液を移すことにより２倍段階希釈を１１穴まで行い、１２穴目は薬剤濃度を０として細胞増殖及びＨＩＶ感染のコントロールとした。検査薬剤１種類につき細胞毒性と抗ＨＩＶ活性測定プレートのそれぞれ２列を使用した。検査薬剤を希釈したプレートに１プレート当たり２×１０^６の対数増殖期にあるＭｏｌｔ４細胞を遠心分離により集め、細胞毒性測定用のプレートには培地１０ｍｌで懸濁し１００μｌずつすべての穴に加えた。一方、抗ＨＩＶ測定用のプレートには遠心分離により集めた２×１０^６のＭｏｌｔ４細胞に１００ＴＣＩＤ_５０となるようにＨＩＶ（ＨＴＬＶ-IIIＢ）のストック溶液を加え、３７℃１時間感染させた後、遠心して沈殿した細胞を培地１０ｍｌで再懸濁し、抗ＨＩＶ活性測定プレートのすべての穴に１００μｌずつ加えた。
培養５日目に、顕微鏡によりＨＩＶによる細胞障害効果（ＣＰＥ）と細胞毒性を観察した。細胞障害や細胞毒性があれば、細胞変性がおきるため、細胞は丸くなってちぢみ、顕微鏡下では、細胞が黒ずんだ色に見えた。

（４）巨細胞形成抑制試験：有効性の確認されたサンプルについてはＭｏｌｔ４細胞による巨細胞形成抑制試験を行った。平底２４穴プレートに所定の濃度に希釈した試料溶液５００μｌを加える。培地に懸濁した持続感染Ｍｏｌｔ４／ＨＩＶ細胞浮遊液１×１０^６個／ｍｌを２５０μｌ／穴加え、さらに非感染Ｍｏｌｔ４細胞浮遊液１×１０^６個／ｍｌを２５０μｌ／穴加え、攪拌し、ＣＯ_２存在下、３７℃で混合培養する。混合培養後数時間で巨細胞形成は認められ、２０時間後には顕著となる。検鏡により試料の巨細胞形成抑制効果を判定する。

＜実施例１＞
ジェラン（和光純薬製）２ｇをあらかじめ０．５ｍｏｌ／ｌ−トリフルオロ酢酸水溶液２００ｍｌに添加し８０℃下で３０分間反応させ加水分解した。得られた低分子量化ジェランを窒素ガスシール下でＤＭＦ５ｇに添加し１０時間、室温で攪拌し膨潤させた。その後、温度を４０℃に上げてＤＭＦ／ＳＯ_３錯体（ＳＯ_３ １８質量％）を１４ｇ添加し６時間反応させた。反応終了後氷冷し０．３ｇの水を添加して未反応のＤＭＦ／ＳＯ_３錯体を分解、反応停止した。続いて２倍容量のエタノールを添加し反応物を沈殿させ濾過により回収した。回収した沈殿を２０ｍｌのイオン交換水に溶解し１ｍｏｌ／ｌ−ＮａＯＨにて中和し、再び２倍容量のエタノールにて沈殿させ回収した。その後、回収した沈殿を純水に添加し２倍容量のエタノールで沈殿させる手法で精製・洗浄を計３回行い、５０℃の減圧乾燥により１日乾燥し、硫酸化ジェランの粉末１．７ｇ（収率６１質量％）を得た。硫酸化ジェランの平均分子量を前述の手法で測定したところ５．６ｋＤａであった。又、水酸基の硫酸化率は２４．４％であった。

この硫酸化ジェランは３．８μｇ/ｍｌ以上で細胞障害抑制効果が認められた。また、少なくとも１０００μｇ/ｍｌにおいて、細胞毒性は認められなかった。さらに、２００μｇ/ｍｌ以上で巨細胞形成抑制効果が認められた。

＜実施例２＞
使用原料として低分子量化していない通常のジェランを２ｇ用い、硫酸化剤にクロロスルホン酸を３．６ｇ使用し、反応温度を５０℃で行った以外は実施例１に準じた方法で硫酸化したところ、分子量が２３ｋＤａ、水酸基の硫酸化率が３６．６％の硫酸化ジェランが得られた。

この硫酸化ジェランは１．９μｇ/ｍｌ以上で細胞障害抑制効果が認められた。また、少なくとも１０００μｇ/ｍｌにおいて、細胞毒性は認められなかった。さらに、２００μｇ/ｍｌ以上で巨細胞形成抑制効果が認められた。

＜実施例３＞
使用原料として実施例１に準じた手法で低分子量化したジェランを使用した他は実施例２と同じ条件でジェランを硫酸化したところ、分子量が１３ｋＤａ、水酸基の硫酸化率が３９．８％の硫酸化ジェランを得た。

この硫酸化ジェランは１．９μｇ/ｍｌ以上で細胞障害抑制効果が認められた。また、少なくとも１０００μｇ/ｍｌにおいて、細胞毒性は認められなかった。さらに、４０μｇ/ｍｌ以上で巨細胞形成抑制効果が認められた。

＜比較例１＞
使用原料として低分子量化していない通常のジェランを２ｇ用い、実施例１に準じた方法で硫酸化したところ、分子量が４．２ｋＤａ、水酸基の硫酸化率が９．０％の硫酸化ジェランを得た。

この硫酸化ジェランの細胞毒性は少なくとも１０００μｇ/ｍｌ以上であったが、細胞障害抑制効果は５００μｇ/ｍｌ以上と高く、また巨細胞形成抑制効果は認められなかった。

＜結論＞
表１に、実施例及び比較例の結果をまとめる。

このように、平均硫酸化率の高い（約２０％以上）硫酸化ジェランを用いた場合、低い濃度で細胞障害抑制効果が得られ、細胞毒性は検出できず、巨細胞形成抑制効果が得られた。それに対し、平均硫酸化率の低い（約１０％未満）硫酸化ジェランを用いた場合（比較例１）、細胞毒性は検出できなかったが、細胞障害抑制効果は、より高濃度でしか検出できず、巨細胞形成抑制効果は検出されなかった。このことから、１０％以上の平均硫酸化率を有する硫酸化ジェランは、安価に製造でき、高い抗ウイルス活性を有し、細胞毒性が低いことが示された。
なお、硫酸化ジェランの細胞障害抑制効果は、ウイルスが感染した細胞に対して効果があるため、抗ウイルス剤としては、予防（感染前に投与）にも治療（感染後に投与）にも有効に用いることができることがわかった。

Claims (8)

1. グルコースとグルクロン酸とラムノースからなり、糖を構成する水酸基の一部又は全部が硫酸エステル化されている硫酸化多糖を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
2. 前記硫酸化多糖が、グルコース２分子とグルクロン酸１分子とラムノース１分子からなる構成単位の繰り返しによって構成されていることを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス剤。
3. 前記構成単位が、下記式（１）で示される単位であることを特徴とする請求項２記載の抗ウイルス剤。
   

   

   （式中、Rはそれぞれ独立に選ばれるOHまたはOSO₃Hである。）
4. 前記硫酸化多糖が硫酸化ジェランであることを特徴とする請求項３記載の抗ウイルス剤。
5. ヒトレトロウイルスに効果があることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。
6. 前記ヒトレトロウイルスがＨＩＶであることを特徴とする請求項５記載の抗ウイルス剤。
7. 前記硫酸化多糖の平均分子量が５〜５００ｋＤａであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。
8. 前記水酸基の１０％以上が硫酸化されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の抗ウイルス剤。