JPH0324480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ジギタリス中毒の治療に使用される
ことのできるジギタリス抗体の製造法に関する。

従来の技術 従来より、重篤なジギタリス中毒の治療は困難
であつた。殊に挙げられるが、症侯群、とくに悪
性心拍障害の処置、およびグリコシドの強制的除
去である。これらの方法は、中央病棟での多日数
の治療を必要とする。それでもなお死亡率が高
く：約20％の患者が制御不能な心拍障害で死亡す
る。実際に、極めて重篤な中毒は、調剤が不注意
によるかまたはスイサイド試験（Suizidversuch）
により過度に投与されるか、または腎不全により
有効成分が多数日にわたり排泄されずかつこれに
より被毒量が畜積された場合に生じる。

発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の課題は、グリコシドの毒性作
用を体内で中和しかつこれを迅速かつ有効に体内
から除去する有効物質を見出すことである。

発明を解決するための手段 この課題は、拮抗剤として、ジゴキシンだけで
なくジギトキシンおよび他の１連の心臓グリコシ
ドにも抜群に適当である、特許請求の範囲に詳述
せるジギタリス抗体により解決される。

すでに60年代のはじめに、ジゴキシン抗体が放
射線免疫効力検定でジゴキシンの定量に使用され
た（西ドイツ国特許公開公報第2331922号）。

その後にカート等（J.Curt etal）が、ヒトに
おける治療に使用するための羊−抗ジゴキシン−
Fab断片（Schaf−Anti−Digoxin−Fab−
Fragmente）の単離法を発表した（Proc.Nat.
Acad.Sci.USA，第68巻、2401頁、1971年）。治
療用途には、スミス等（Smith etal）による
New Engl.J.Med.（1982年）1357〜1362頁、およ
び（1976年）1125〜1129頁参照。この場合、羊
（Schafe）が、アルブミンに結合せるジゴキシン
で免疫され、その血清が取得されかつガンマグロ
ブリンフラクシヨンが硫酸アンモニウムで自体公
知の方法により沈殿される。グロブリンがパパイ
ンで均質な溶液中で分解され、かつ特異的なグリ
コシド結合Fab断片がウアバイン−セルロ−スマ
トリクスで吸着されかつ引続きウアバインで再び
溶離される。ウアバイン−Fab錯体が、蛋白質を
グアニジンヒドロクロリドで変性することにより
解離され、かつウアバインおよびグアニジンが透
析により分離される。生理学的緩衝液に対し透析
することにより、グアニジン処理により変性され
たFab−蛋白質が再び復元される。この方法は、
ジゴキシン抗体を経済的に製造するには多数の欠
点を有する： １ 有利に、ウアバインに結合されることによ
り、ウアバインとの強い交差反応を有する抗体
が単離され、かつジゴキシンに特異的であり、
従つてウアバインと反応せざる抗体が廃却され
る。

２ ウアバイン−Fab錯体の解離に際し、蛋白質
成分が変性され、その場合必然的に蛋白質の不
可逆的変化をも生じる。さらに透析は、１方で
グアニジンヒドロクロリドを完全に除去しかつ
他方でできるだけ広範囲な復元を惹起するた
め、極めて大きい容積、長い時間および慎重な
制御を必要とする。

３ この方法の場合、免疫吸着剤として、リボヌ
クレアーゼを経てセルロースに結合されたウア
バインが使用される。有機天然物質としてのセ
ルロースは、実際に不断に細菌で汚染され、そ
の結果とりわけ量産に際しかつ吸着剤の反復使
用に際し無菌かつ発熱性物質不含の作業が不可
能である。

従つて他の課題は、ジゴキシンおよびジギトキ
シンに特異的な、無菌かつ発熱物質不含の抗体の
有効な製造法を見出すことである。

この課題は、前述の方法で得られたガンマグロ
ブリンフラクシヨンを、ジゴトキシンが共有結合
された無機質キヤリヤより成る、ジゴキシン抗体
に特異的な吸着剤に吸着させ、ジギトキシンと結
合しない成分を適当な緩衝液で洗浄除去すること
により解決される。第２工程でジゴキシン特異性
IgGで装荷された吸着剤をパパインで処理し、こ
の抗体のFab−成分をFc−成分から分離させる。
パパイン及び分離されたFc−成分を溶離させ、
引続き、ジゴキシン特異性Fab−断片を強力な溶
離剤でカラムから溶出させて取得することができ
る。

こうして得られたFab断片は、有害な不純物の
最後の痕跡をも除去するため、ゲル透過クロマト
グラフイー、イオン交換クロマトグラフイーまた
は分別沈殿並びに限外濾過によりさらに精製され
ることができる。

有利に、無機質のキヤリヤマトリクスとして、
適当な気孔寸法を有する多孔質ガラスが使用され
るが、但しまた十分に大きい表面積（約１〜20
m²／ｇ、有利に５〜15m²／ｇ）および相応する特
性を有する他の無機質キヤリヤ、例えばシリカゲ
ル、酸化アルミニウムゲル等が使用可能である。
ガラスは、ジギトキシンを結合させるキヤリヤ表
面を形成するため、例えば、トリアルコキシシリ
ルピロピルアミンまたは、遊離のアミノ基または
他のジゴキシンと反応性の基を生じる他の化合物
のようなスペーサで処理される。こうして得られ
たキヤリヤは、過沃素酸塩で自体公知の方法でい
わゆる“ジギトキシンジアルデヒド”に酸化され
たジギトキシンと反応され（酸化については、サ
ルド等（Sardo et al）によるChem.Pharm.Bul.
第18巻、94〜99頁（1970年））、かつ得られた“シ
ツフの塩基”が還元される。

こうして得られた吸着剤は、カート等により発
表されたもの（前記参照）と比べ以下の顕著な利
点を有する： １ この吸着剤は、無機質キヤリヤを使用するこ
とにより、細菌繁殖に対し実際に不活性かつ機
械的に極めて安定であり、従つてこれらは繰返
し使用されることができる。

２ ジゴキシンが、パパインにより分解不能なブ
リツジを介してガラスへ共有結合されることに
より、抗体の分割が直接に吸着剤で行なわれ
る。これにより、異種蛋白質だけでなく、パパ
イン分解に際し生じるFc成分並びにパパイン
自体をも慎重にカラムから洗除しかつこれによ
り吸着されたFabブロツクと分離することが可
能である。他方でこの分割により、残存する
Fab断片に対する吸着剤の結合力が、これら
Fab断片が適当な脱着剤で変性されることなく
再びカラムから溶出されうる程度に低減され
る。

３ ジギトキシンを含有する吸着剤を使用するこ
とにより、ジギトキシン、ジゴキシンおよびそ
れらの誘導体に特定のそれら抗体がとくに強固
に結合され、従つて最終的に、前記グリコシド
に対する拮抗体として殊に有効であるFabブロ
ツクが得られる。

ジゴキシン抗体の、IgG含有血清からのジギト
キシン含有吸着剤への吸着は、このような分離に
常用の中性〜弱酸性（PH６〜7.5）の水性緩衝−
および塩溶液中で行なわれる。有利に、中性の燐
酸塩緩衝剤が0.01〜0.5Mの濃度で、塩としての
塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムが0.01〜
0.5M、とくに0.025〜0.05Mの濃度で使用される。
この溶液は、さらに付加的に常用の湿潤剤0.01〜
0.1重量％を含有することができる。またパパイ
ン分解後に、これら溶液を使用し、Fc成分並び
にパパインがカラムから洗除されることができ
る。

高濃度の強酸性緩衝液は、抗体ないしはFab断
片の分離を行なうが、但し同時に部分的変性をも
行なう。従つて有利に、Fab断片の分離が希鉱
酸、とくに１〜10mM濃度の塩酸で実施される。
２〜5mMの濃度が有利である、それというのも
この濃度が、Fabブロツクの迅速な分離と最低の
変性率とを結び付け、かつ透析により容易にFab
ブロツクと分離されうるからである。

実施例 以下に、本発明を実施例につき詳説するが、本
発明はこれら実施例により制限されない。

例： １ 羊−抗ジゴキシン血清（Schaf−Anti−
Digoxin−Serum）の製造 免疫原 ジゴキシン−グルタリル−ｏ−ヒドロキシサク
シンイミドを、水溶液中で蛋白質、有利に牛アル
ブミンまたはエデスチン（麻の実からの蛋白質の
１種）と反応させる。過剰量のジゴキシン誘導体
を分離した後、生じたジギトキソーズの蛋白質１
分子当り多数のジゴキシン分子を、グルタリル連
鎖を介し蛋白質へ結合させる。

免疫化 ジゴキシン免疫原約0.5mgを、完全なフロイン
トの補薬（Freund′s Adjuvans）中に溶解し、最
低体重45Kgの健全な羊の皮内に投与する。２週
間、その後に４週間の間隔で、免疫原を同じく調
剤し、免疫応答を増大させるため筋肉内および皮
下に注射する。２〜４ケ月後に、動物の血清中の
力価がジゴキシン特異性IgG1mg／mlに達する。

血清採取、分析、プール形成 サンプル検査で前記力価が得られた健全な動物
は、最低１ケ年にわたり毎週頚動脈からの採血に
使用することができる。採血の抜取り検査におい
て、力価を、放射線免疫試験または酵素免疫試験
で連続的に測定する。同じく抜取り検査におい
て、結合定数を、所定希釈率の抗血清サンプルに
より、放射性標識せるジゴキシンの結合率をスキ
ヤツチヤード・プロツト評価（Scatchard−Plot
Auswertung）することにより測定した。文献記
載値：５×10⁹〜５×10¹⁰（リツトル／モル）と一
致することが明白となつた。Fab単離で使用すべ
き抗血清の回分変動率をできるだけ低く維持する
ため、20〜50のロツトを、多数の羊の長期間に
わたる個々の採血から形成する。

２ 免疫吸着剤の製造 アミノ基含有ガラス 調整された多孔質ガラス（エレクトロ・ニユク
レオニクス社製（Electro Nucleonics，Inc.，
Fairfield，USA））940ｇを、微小粒子および不
純物を除去するため水性懸濁液中で超音波で処理
し、その後に65％硝酸で80〜90℃で３時間加熱す
る。酸を洗除した後、ガラスを150℃で乾燥する。
この精製ガラスを、無水ジメチルスルホキシド
2.7中で３−（トリエトキシシリル）−プロピル
アミン300mlとともに約20時間85℃で還流冷却器
下に緩慢に撹拌する。過剰量のシリルアミンをイ
ソプロパノールで洗除し、かつアミン化せるガラ
スをさらに乾燥する（60℃、低真空）。収量：ア
ミノプロピルガラス1.8（750ｇ）。

ジギトキシンの酸化 ジギトキシン６ｇを、エタノール／水の２：１
混合物450ml中で化学量論的に等量の過沃素酸ナ
トリウム（1.7ｇ）と室温で反応させる。不溶性
の沈殿を濾別しかつ廃却する。上澄みを回転蒸発
器で乾燥させる。残渣を水２×100mlで洗浄し、
その後に真空中で塩化カルシウム上で乾燥する。
収量：酸化ジギトキシン４〜５ｇ。

ジギトキシン−ガラス−吸着剤 酸化ジギトキシン4.5ｇを、エタノール−水の
２：１混合物2.25中に溶解し、アミノプロピル
−ガラス750ｇを混合し、かつ緩慢な撹拌下に20
時間室温で反応させる。このガラスを、濾別する
ことにより分離する。濾液中で、ジギトキシンを
UV（260nm）中の吸光度測定により定量し、か
つこれから固定されたジギトキシンを計算する。
（標準値：ジゴキシン３mg／ガラス容積ml）。硼水
素化ナトリウム４ｇを、再蒸溜水（bidest.
Wasser）１中に溶解し、エタノール２で希
釈しかつジギトキシン誘導ガラスへ添加する。多
数回の振り混ぜ下に、２時間にわたり室温で、PH
値を2N塩酸の添加により7.0〜7.4に調節する。こ
の場合、差当り不安定なシツフ塩基結合を介しガ
ラスに固定されたジギトキシンが、安定な固定へ
変換される。このジギトキシン−ガラス−免疫吸
着剤をエタノール／水／エタノールで完全に洗浄
し、その後に低真空で乾燥する。収量：免疫吸着
剤約1.8。

免疫吸着剤を直接に使用するための前処理 この吸着剤を、緩衝液Ａ（PH7.0の燐酸塩
0mM／NaCl 0.15M／アジ化ナトリウム0.1％）
に懸濁し、フリツトを有するガラスカラム中へ充
填し、かつNaCl 0.5M／トウイーン20
（Tween20）0.05％より成る溶液、その後に再蒸
溜水、その後に1Mプロピオン酸で洗浄する。最
後に、緩衝液Ａで平衡化する。Fab精製に際し使
用された免疫吸着剤を、1Mプロピオン酸で洗浄
することにより再生しかつ緩衝液Ａ中に４℃で貯
蔵する。この吸着剤は、特性が損なわれることな
く多数回使用可能である。使用直前に、新鮮な吸
着剤を前洗浄する。

３ 羊−抗ジゴキシン−Fab（Schaf−Anti−
Digoxin−Fab）の製造法 精製に使用する溶液を、オートクレーブ中でま
たは薄膜濾過により滅菌する。溶液の製造に使用
する水は蒸溜により発熱物質不含である。容器お
よび装置並びに他の補助的材料（例えばクロマト
グラフ材料）は、適合性に応じ、加熱または、
0.5M NaOHを使用する処理により発熱物質不含
とする。

羊−抗ジゴキシン−血清（Schaf−Anti−
Digoxin−Serum）の前精製 抗血清30を、リポ蛋白質を除去するため、ア
エロジル（Aerosil）300ｇとともに１時間室温で
撹拌する。アエロジルを遠心分離により分離した
後、４℃に冷却した上澄み液から、固体硫酸アン
モニウムを濃度1.8Mになるまで添加することに
より、ガンマグロブリンを沈殿させる。沈殿を、
遠心分離することにより集め、塩化ナトリウム
0.15M／アジド0.1％より成る溶液に溶解し、か
つ緩衝液（燐酸塩15mM、PH7.1／Nacl 50mモ
ル／ヒビタン（Hibitane）0.002％）に対し４℃
で透析する。この透析物を、交換容積16.2を有
するジエチルアミンセルロースカラム（De 52−
セルロース、ホワツトマン社製（Whatman、
Maidstone、England））に装填しかつ透析緩衝
液と同じ組成の緩衝液で溶離する。この緩衝液と
ともにカラムから流出する蛋白質は、羊−抗ジゴ
キシン−血清からの、Fab製造に役立つIgGフラ
クシヨンである。蛋白質収量は約500〜700ｇであ
る。ジゴキシン特異抗体の含有率は、抗血清中の
初期力価の約80〜90％である。

特異的吸着 ジゴキシン特異性IgG15ｇを含有する溶液約10
中のIgGフラクシヨン約250ｇを、燐酸塩
50mM／NaCl 0.15M／ヒビタン0.002％／PH7.0
より成る濃緩衝液（緩衝液Ｂ）に装入する。この
溶液を、室温で約２時間以内に、ジゴキシン−ガ
ラス−免疫吸着剤2.4が充填されたカラムを経
てポンプ搬送する。特定IgG成分の90％が吸着剤
に結合する。この吸着剤を、NaCl 0.35Mおよび
トウイーン200.05％が添加された緩衝液Ｂで洗浄
し、その後に、引続くパパイン分解に適当である
緩衝液Ｃ（PH7.0の燐酸塩75mM／NaCl 0.15M／
エチレンジアミンテトラ酢酸2mM／システイン
10mM／ヒビタン0.01％）で平衡化する。

酸素による分断 ジゴキシン特定IgGが装荷された吸着剤を、遅
滞することなくカラムからガラス管中へ移し、か
つ緩衝液C2中に溶解されたパパイン240mgを混
合する。金属製翼形ミキサを使用し緩慢に撹拌し
た場合、４時間15分で37℃で恒温保持する。吸着
剤懸濁液の上澄みのサンプルを、培養中の種々の
時点でUV光度計（280nm）で測定することによ
り、Fc蛋白質の分離の機構（Kinetik）および従
つてFab形成を追跡することができる。培養の終
りに、吸着剤を再びカラム中へ充填しかつ緩衝液
Ｂで洗浄する。システインの存在におけるパパイ
ン分解からの遊離のSH基を中和するため、吸着
剤を、沃化アセタミド10mMを添加した緩衝液
（PH7.5の燐酸塩75mM／NaCl 0.15M／ヒビタン
0.01％）で洗浄する。その後に、NaCl 0.15M／
ヒビタン0.01％より成る溶液で過剰量の沃化アセ
タミドを洗除し、かつNaCl 30mM溶液で吸着剤
を溶離のために前処理する。

溶離（RT） 特定Fabを溶離するため、3mM塩酸水を吸着
カラムを経てポンプ搬送する。Fab蛋白質を、カ
ラムの流出口で、UV吸収（280nm）を測定する
ことにより検知しかつ捕集する。蛋白質約11ｇを
含有する溶液５〜７を、限外濾過により約200
〜250mlに濃縮し、その後に直ちに凍結乾燥させ
る。

ゲル透過クロマトグラフイー（４℃） 長さ１ｍのカラムに、セフアクリルS200
（Sephacryl Ｓ 200）（フアーマシア社製
（Pharmacia，Schweden））7.5を充填し、かつ
緩衝液（PH7.0の燐酸塩5mM／NaCl 0.5M／ヒビ
タン0.002％）で平衡化する。Fab凍結乾燥物５
ｇを、平衡化用緩衝液110mlに溶解しかつゲルカ
ラムを経てクロマトグラフ処理する。溶離物の
UV吸収を記録することにより、Fabピークを分
子量50000で検出しかつ捕集する。収量：ゲルク
ロマトグラフにより均質な蛋白質約3.75ｇ。IgG
残分、高分子Fab凝集体および微小断片を分離す
る。このFab溶液約700〜800mlを、限外濾過によ
り約150mlに濃縮し、その後に緩衝液（燐酸塩
15mM、PH7.5／NaCl 0.15M）に対し透析する。

このクロマトグラフイーを、第２の分量のFab
凍結乾燥物につき同じカラムで繰返す。クロマト
グラフ処理したこれら２つの分量を、引続く工程
のために再び合する。第１の分量の中間貯蔵物
は、−20℃で深冷凍結されていた。

DEAEイオン交換体を通す工程（４℃） De 52セルロース（滅菌および発熱性物質分離
のため0.5N HClおよび0.5M NaOHで前処理し
た）を、カラム中へ充填しかつ10mM燐酸塩緩衝
液PH7.1で平衡化する。前記工程からのFab蛋白
質を限外濾過により蛋白質濃度約50mg／mlに調節
し、その後にこの蛋白質溶液をDe52カラムを通
過させる。Fab蛋白質が殆んど遅滞せずに通過
し、痕跡量の異種蛋白質（例えばアルブミン、
Fc等）が固定される。Fab蛋白質を、流出口で捕
集し、必要に応じ限外濾過により蛋白質約15〜20
mg／mlに濃縮し、電極でPH値を7.0〜7.1に補正
し、かつ0.2μ薄膜フイルタにより滅菌濾別する。
工程収率：95％。最終収量：羊−抗ジゴキシン
Fab5〜６ｇ。

この滅菌濾別せる最終生成物を、細菌不含にガ
ラス壜中に充填しかつ−20℃に深冷凍結し貯蔵す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト以外の哺乳動物を蛋白質に結合せるジゴ
   キシンで免疫化し、この動物の血清を取得し、免
   疫グロブリン含有蛋白質フラクシヨンを自体公知
   の方法で分離し、免疫学的に活性なグロブリン
   （IgG）を免疫学的に活性なカラムを用いて他の
   蛋白質と分離し、パパインでFc−成分を離脱さ
   せ、Fabフラクシヨンを精製する方法でジゴキシ
   ン特異性IgGのFab−断片の形のジギタリス抗体
   を製造する場合に、免疫グロブリン含有蛋白質フ
   ラクシヨンを、パパインで分解不能なスペーサー
   を介してジギトキシンアルデヒドが結合してい
   る、大表面積無機質マトリクスからなるカラムに
   吸着させ、免疫学的に不活性の蛋白質を洗浄除去
   し、カラムに吸着された抗体をパパインでFab−
   及びFc−成分に分断し、パパイン及びFc−成分
   を洗浄除去し、ジギタリス抗体（Fab−断片）を
   溶離させて取得することを特徴とする、ジギタリ
   ス抗体の製造法。 ２ 無機質のキヤリヤ材料として多孔質ガラスを
   使用することを特徴とする、特許請求の範囲第１
   項記載のジギタリス抗体の製造法。 ３ スペーサとしてトリエトキシシリルプロピル
   アミンを使用することを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項または第２項記載のジギタリス抗体の
   製造法。 ４ ジギトキシンを過沃素塩で酸化することによ
   り得られたジギトキシンアルデヒドを、マトリツ
   クスにシツフの塩基として結合させ、ホウ水素化
   ナトリウムを用いてこのシツフの塩基を還元する
   ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項から第
   ３項までのいずれか１項記載のジギタリス抗体の
   製法。 ５ 免疫用の有効成分として、アルブミンに結合
   せるジゴキシングルタリル−ｏ−ヒドロキシサク
   シンイミドを使用することを特徴とする、特許請
   求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記
   載のジギタリス抗体の製造法。 ６ 抗体含有グロブリンフラクシヨンを、動物血
   清から硫酸アンモニウム沈殿により取得すること
   を特徴とする、特許請求の範囲第１項から第５項
   までのいずれか１項記載のジギタリス抗体の製造
   法。 ７ 抗体の吸着および随伴蛋白質の溶離を、PH７
   に緩衝された燐酸塩−／塩化ナトリウム溶液を用
   いて行なうことを特徴とする、特許請求の範囲第
   １項から第６項までのいずれか１項記載のジギタ
   リス抗体の製造法。 ８ パパインにより分離されたFab断片を、塩酸
   水を用いてカラムから溶離させることを特徴とす
   る、特許請求の範囲第１項から第７項までのいず
   れか１項記載のジギタリス抗体の製造法。 ９ カラムから分離されたFab断片を、ゲルおよ
   び／またはイオン交換体のクロマトグラフイーに
   よりさらに精製することを特徴とする、特許請求
   の範囲第１項から第８項までのいずれか１項記載
   のジギタリス抗体の製造法。