CN109929038A

CN109929038A - Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法

Info

Publication number: CN109929038A
Application number: CN201711346802.8A
Authority: CN
Inventors: 赵燕燕; 陶文杰; 刘丽丽; 王鑫; 王广珺
Original assignee: Shandong Bioanty Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Boan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN109929038B

Abstract

本发明涉及一种VEGF捕获剂重组蛋白的纯化方法，其包括以下步骤：(1)亲和层析；(2)阴离子交换层析；和(3)阳离子交换层析。本发明纯化工艺具有简便、能够有效降低生产成本，这对大规模生产制造是非常有益的。

Description

VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，尤其是一种人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法。

背景技术

蛋白质通常称为“生物制品”，在今天的医药领域中起重要作用。为了保证生物药剂对人类的安全性，必须特异性地去除可能引起严重危害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质等杂质。另外，药监局对人用蛋白质的质量要求标准很高。人用生物制品其最大的挑战之一是在商品化规模上开发具有成本效益和有效的蛋白质纯化方法。

通常，使用经过基因工程改造能产生感兴趣的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系，通过插入一种含有该蛋白质基因的重组质粒，经过细胞培养来产生蛋白质。获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液后，通常尝试联合应用不同层析技术来将其与细胞产生的其它蛋白质分离。这些技术根据蛋白质的电荷、疏水程度、或大小来分离蛋白质混合物。这些技术中的每一种都可采用数种不同的层析树脂，这使得可对涉及的具体蛋白质制定专用的纯化方案。

血管内皮生长因子(VEGF)是多种肿瘤与血管性眼底疾病的重要治疗靶点，通过与特异性受体——血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合刺激新生血管的形成。

以VEGF为靶点的药物阿柏西普(Aflibercept)，称为VEGF捕获剂融合蛋白，是由人血管内皮细胞生长因子(VEGFR)受体的结合区与人免疫球蛋白G1的可结晶片段(Fc)融合而成。其结构较为复杂，二硫键和糖基化位点较多，其中含有较多的碱性电荷异构体，给下游纯化工作带来很大困难。

中国专利申请(公开号CN104853763A)对该融合蛋白进行了描述，并提供了其单体的氨基酸序列。若要将该蛋白纯化为药用级别，需要四个色谱分析步骤：蛋白质A亲和色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法和疏水作用色谱法。而这些繁杂的纯化过程无疑会增加药物的生产成本。该专利申请全文以引用的方式并入本文作为参考。

现有技术(CN105175548A)提供了一种纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，采用五步法进行纯化的方案：ProteinA亲和色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、疏水作用色谱法和脱盐色谱法。该专利申请全文以引用的方式并入本文作为参考。

令人惊奇的是，本申请的发明人发现，在亲和层析步骤中进行低pH值条件下病毒灭活，并将阳离子交换层析步骤中的洗脱方式由等度洗脱改为线性洗脱后，可以减少纯化工艺所需要进行的步骤，同时还可以保持纯化产物的纯化效果不变。

发明内容

本发明提供改良的VEGF捕获剂纯化方法，尤其是一种仅包括亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析三个步骤的纯化方法。

本发明所述VEGF捕获剂纯化方法，包括以下步骤：

(1)亲和层析

用NaH₂PO₄平衡缓冲液将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用NaH₂PO₄平衡缓冲液进行冲洗，用甘氨酸缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；再调节pH值至3.40-3.50进行病毒灭活。

(2)阴离子交换层析

用Tris平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤(1)中病毒灭活后的蛋白液调节至pH碱性进行上样，使VEGF捕获剂融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用pH值弱碱性的Tris缓冲液进行冲洗，再用pH值弱酸性的Bis-Tris洗脱液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(3)阳离子交换层析

用pH值为8.40-8.50、含有浓度为50mM/L Tris和浓度为50Mm/L NaCl的Tris-MES平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡，将步骤(2)中收集的洗脱蛋白液调节至pH5.8-6.2进行上样，使VEGF捕获剂融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗；再用包含MES和NaCl的A液和B液，以23-100％B液的线性洗脱方式对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

根据本发明的优选实施方案，在所述步骤(1)Protein A亲和层析中，用1L磷酸盐平衡缓冲液(20mM NaH₂PO₄，110MmNaCl，pH6.8-7.2)对亲和层析柱MabSuRe LX进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样；使融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用pH2.8-3.0，100mM/L甘氨酸缓冲液对融合蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

根据本发明优选实施方案，在所述步骤(2)阴离子交换层析中，用Tris平衡缓冲液(pH8.3-8.5，50mM Tris，50mM NaCl)对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤(1)处理的病毒灭活后的蛋白液的pH调节至pH8.3-8.5后进行上样，使融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用Tris缓冲液(pH8.30-8.50，50mM Tris)进行冲洗；再用Bis-Tris缓冲液(pH5.8-6.1，50mM Tris)对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；

根据本发明的优选实施方案，在所述步骤(3)阳离子交换层析中，用pH5.8-6.0的Tris-MES的平衡缓冲液(50mM Tris，50mM MES，50mM NaCl)对阳离子交换层析柱进行平衡，将步骤(2)收集的蛋白液的pH调节至pH5.9-6.1后进行上样，使VEGF捕获剂重组蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用线性洗脱方式对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

根据本发明更优选的实施方案，所述线性洗脱以23-100％B液的方式进行，其中A液：50mM MES，50mM NaCl，pH5.85-5.95；B液50mM MES，220mM NaCl，pH 5.85-5.95。

本发明所获得的目的纯化产物采用SEC-HPLC方法检测，实验数据显示(请参见表1和表2)，纯度可以达到99.6％以上。

综上所述，本发明首先采用亲和层析捕获重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白，同时除去少量杂质蛋白，并在低pH酸性的条件下进行病毒灭活，然后进一步利用阴离子交换层析、阳离子交换层析去除其中的碱性电荷异构体、聚集体、色素和微量残留，达到纯化的目的。三个步骤依次作用，相互补充，最终制得高质量的纯化产物。经检测，本发明所述纯化方法得到的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的SEC-HPLC分子筛纯度为99.6％以上。本发明纯化工艺具有简便、能够有效降低生产成本，这对大规模生产制造是非常有益的。

附图说明：

图1：阿柏西普(Aflibercept)的氨基酸序列(SEQ ID:NO.1)。

具体实施方式

本文将通过以下实施例进一步说明所要保护的技术方案，这些实施例不作为本发明保护范围的限制。

使用通过重组DNA技术基因工程化的CHO细胞，通过对哺乳动物细胞的培养产生VEGF捕获剂。CHO细胞用补料分批方法培养，培养液经过深层过滤，得到VEGF捕获剂融合蛋白发酵液，其中VEGF捕获剂融合蛋白由SEQ ID NO:1氨基酸序列编码。

本发明中所提及的层析介质均是本领域中广泛适用的，且能够从商业途径购买获得。

实施例1：

取适量VEGF捕获剂融合蛋白发酵液，依据如下步骤和条件进行纯化，具体包括以下步骤：

(1)Protein A亲和层析

用1L磷酸盐平衡缓冲液(pH7.0，20mM NaH₂PO₄，110mM NaCl)对亲和层析柱MabSuReLX进行平衡，将含有所述VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使VEGF捕获剂融合蛋白吸附于protein A亲和介质上。上样结束后用上述平衡缓冲液进行冲洗，再用pH2.90，浓度为100mM的甘氨酸(Glycine)缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。然后用1mol/L的磷酸将洗脱液酸性调节至pH3.45进行病毒灭活。

(2)阴离子交换层析

用1L Tris平衡缓冲液(pH8.40，50mM Tris，50mM NaCl)对阴离子交换层析柱QFF进行平衡，然后用氢氧化钠溶液将步骤(1)处理的病毒灭活后的蛋白液的pH调节至8.40后进行上样，使VEGF捕获剂吸附于阴离子交换层析介质上；上样结束后用Tris缓冲液(pH8.40，50mM Tris)进行冲洗；再用pH 5.9，浓度50mMol/L的双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液对融合蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(3)阳离子交换层析

用pH5.85的Tris-MES的平衡缓冲液(50mM Tris，50mM MES，50mM NaCl)对阳离子交换层析柱Capto S Impact进行平衡，然后用1mol/L的磷酸将步骤(2)收集的蛋白液的pH调节至5.9后进行上样，使VEGF捕获剂吸附于阳离子交换层析介质上；上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用23-100％B(A液：50mM MES，50mM NaCl，pH5.85；B液：50mM MES，220mMNaCl，pH 5.85)的线性洗脱方式对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度为99.675％。

实施例2：

与实施例1相似，再次取适量VEGF捕获剂融合蛋白发酵液，依据如下步骤和条件进行纯化，具体如下：

(1)Protein A亲和层析

用磷酸盐平衡缓冲液(pH7.2，20mM NaH₂PO₄，110mM NaCl)对亲和层析柱MabSuReLX进行平衡，将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使VEGF捕获剂吸附于protein A亲和介质上。上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用pH3.00的Glycine(100mM)洗脱液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。然后用磷酸将洗脱液酸性调节至pH3.45进行病毒灭活。

(2)阴离子交换层析

用Tris平衡缓冲液(pH8.50，50mM Tris，50mM NaCl)对阴离子交换层析柱QFF进行平衡，将步骤(1)处理的病毒灭活后的蛋白液的pH调节至8.50后进行上样，使VEGF捕获剂融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上；上样结束后用Tris缓冲液(pH 8.50，50mM Tris)进行冲洗；再用pH6.1的Bis-Tris缓冲液(50mM)对融合蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

(3)阳离子交换层析

用pH5.95的Tris-MES的平衡缓冲液(50mM Tris，50mM MES，50mM NaCl)对阳离子交换层析柱Capto S Impact进行平衡，将步骤(2)收集的蛋白液的pH调节至6.1后进行上样，使VEGF捕获剂融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上；上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗，再用23-100％B(A液：50mM MES，50mM NaCl，pH5.95；B液：50mM MES，220mM NaCl，pH5.95)的线性洗脱方式对蛋白进行洗脱，收集洗脱液。

所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.665％。

对比实施例——现有技术

中国专利申请(CN105175548A)提供了一种纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，其采用五步法进行纯化的方案：Protein A亲和色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、疏水作用色谱法和脱盐色谱法。该专利申请的实施例1具体描述了重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，即如上所述的五步法。

此外，该专利申请中还公开了其实施例1所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.5％。

实验结果：

1.实施例1纯化产物的质量评估

根据实施例1所述，将待测样品LX131-0011-3进行亲和蛋白层析(Protein A)、阴离子交换层析(AEX)和阳离子交换层析(CEX)三个纯化步骤；每个步骤之后分别对洗脱液的等电点(pI)、单体百分比(Mono％)、聚体百分比(Agg％)、宿主DNA、宿主细胞蛋白(HCP)和ProA残留进行了检测，结果如下表1：

表1：

纯化步骤	pI	Mono％	Agg％	宿主DNA	HCP	ProA残留
							Protein A	6.9-9.0	98.900	1.100	>172.12	1744.24	2.7
AEX	6.9-8.1	98.860	1.140	0.23	39.53	<0.3
							CEX	6.9-8.1	99.675	0.325	<0.19	2.87	<0.3

2.实施例2所得产物的质量评估

待测样品LX131-0011-3进行亲和蛋白层析(Protein A)、阴离子交换层析(AEX)和阳离子交换层析(CEX)三个纯化步骤；每个步骤之后分别对洗脱液的等电点(pI)、单体百分比(Mono％)、聚体百分比(Agg％)、宿主DNA、宿主细胞蛋白(HCP)和ProA残留进行了检测，结果如下表2：

表2：

纯化步骤	pI	Mono％	Agg％	宿主DNA	HCP	ProA残留
							Protein A	6.8-9.1	98.860	1.135	>174.93	2075.73	3.1
AEX	6.9-8.4	98.600	1.400	<0.20	57.55	<0.3
							CEX	6.9-8.1	99.665	0.335	<0.18	2.64	<0.3

3.本发明所获得产物与对比实施例的比较研究

将依照本发明方法所获得的纯化融合蛋白和对比实施例所获得的纯化融合蛋白进行质量比较研究。结果如下：

表3：

由以上实验结果可知，SEC-HPLC液相分析实施例1、实施例2纯化后的VEGF捕获剂融合蛋白的纯度图谱，其纯度分别为99.675和99.665，均大于对比实施例(即现有技术CN105175548A中实施例1)中所获得融合蛋白原液的纯度。由此可知，本发明所提供的纯化方法，由三个步骤组成，特别是在亲和层析步骤中进行低pH值条件下病毒灭活，并将阳离子交换层析步骤中的洗脱方式由等度洗脱改为线性洗脱，能够显著减少纯化工艺所需要进行的步骤，并能够同时保持纯化产物的质量。

序列表

<110> 山东博安生物技术有限公司

<120> VEGF捕获剂融合蛋白的纯化方法

<130> CP1170596/CB

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

Claims

1.一种VEGF捕获剂重组蛋白的纯化方法，其包括以下步骤：

(1)亲和层析

用NaH₂PO₄平衡缓冲液将含有由SEQ ID NO:1编码的VEGF捕获剂融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使融合蛋白吸附于Protein A亲和层析介质上，上样结束后用NaH₂PO₄平衡缓冲液进行冲洗，用甘氨酸缓冲液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；再调节pH值至3.40-3.50进行病毒灭活；

(2)阴离子交换层析

用Tris平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡，将步骤(1)中病毒灭活后的蛋白液调节至pH碱性进行上样，使VEGF捕获剂融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后用pH值弱碱性的Tris缓冲液进行冲洗，再用pH值弱酸性的Bis-Tris洗脱液对蛋白进行洗脱，收集洗脱液；

(3)阳离子交换层析

2.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(1)中，所述NaH₂PO₄平衡缓冲液的pH值是6.80-7.20，其中NaH₂PO₄浓度为20mM/L，NaCl浓度为110mM/L。

3.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(1)中，所述甘氨酸缓冲液的pH值是2.8-3.0、浓度为100mM/L。

4.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)中，所述Tris缓冲液的pH是8.30-8.50，浓度为50mM/L。

5.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)中，所述蛋白液的pH调节至pH8.30-8.50。

6.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(2)中，所述Bis-Tris缓冲液的pH是5.8-6.1，浓度为50mM/L。

7.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(3)中，所述Tris-MES平衡缓冲液的pH是5.80-6.00，其中Tris浓度是50mM/L，MES浓度是50mM/L，NaCl浓度是50mM/L。

8.如权利要求1所述的纯化方法，其中，在所述步骤(3)中，所述蛋白液的pH调节至pH5.9-6.1后进行上样。

9.如权利要求1所述的纯化方法，其中，所述步骤(3)中，所述A液的pH值是5.85-5.95，其中MES浓度为50mM/L，NaCl浓度为50mM/L；所述B液的pH值是5.85-5.95，其中MES浓度为50mM/L，NaCl浓度为220mM/L。

10.如权利要求9所述的纯化方法，所述A液和所述B液的pH值都是5.85，或者都是5.95。