JP2022548818A - 抗vegfタンパク質組成物及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。当該ASCIIコピーは2020年8月13日に作成され、070816-02301_SL.txtと明記され、サイズは134,385バイトである。
本出願は、2020年8月13日に出願された米国仮特許出願番号第63/065,012号に対する優先権及びその恩典を主張するものであり、その内容は全体が本明細書に参照として組み入れられる。
本発明は概して、抗VEGF組成物及びその製造方法に関する。
タンパク質をベースとするバイオ医薬組成物は、眼科疾患、がん、自己免疫疾患、感染症、並びに他の疾患及び障害の治療薬である、研究目的の重要な製品として台頭してきた。バイオ医薬品は、製薬産業の急速に成長している製品区分の1つである。
本発明は、融合タンパク質である、VEGFトラップタンパク質であるアフリベルセプトを含む、抗VEGFタンパク質に関する。本発明はまた、新規の抗VEGFタンパク質、アフリベルセプトMiniTrap又はVEGF MiniTrap(特に明記しない限り、MiniTrapと総称される)に関する。本明細書では、関心対象のタンパク質を産生する効率的かつ効果的な手段を提供する製造様式を含む、これらの抗VEGFタンパク質を作製する方法を開示する。一態様においては、本発明は抗VEGFタンパク質を産生する合成培地(CDM)の使用を目的に行われる。特定の態様においては、関心対象のCDMは使用時、タンパク質試料を産生するCDMであり、この試料は黄褐色であり、酸化種を含み得る。更に本出願では、アフリベルセプト及びVEGF MiniTrapのタンパク質バリアントは、付随する製造方法と共に開示される。
本開示は、細胞培地を使用するアフリベルセプトの製造を説明する。一実施形態において、細胞培養培地は合成培地(「CDM」)である。CDMは、これがタンパク質を含まず動物由来成分を使用しない合成製剤であり、培地の組成物に関して確実性が存在することから、多くの場合使用される。別の実施形態において、細胞培養培地はダイズ加水分解培地である。
本開示は、アフリベルセプトの改変バージョンの製造を説明し、このFc部分は、取り除かれるか又は存在しておらず、アフリベルセプトMiniTrap又はVEGF MiniTrapと称される。このMiniTrapは、合成培地(CDM)又はダイズ加水分解培地を含む細胞培養培地にて産生され得る。
本開示は、VEGF MiniTrapを産生するための、IdeS(FabRICATOR)(配列番号1)又はIdeSバリアントである他のポリペプチド(配列番号2~16)の使用を説明する。IdeS(配列番号1)は、87位、130位、182位、及び/又は274位におけるアスパラギン残基を含む(以下の配列番号1では太字かつイタリック体にて「N*」と示される)。これらの位置のアスパラギンは、アスパラギン以外のアミノ酸に変異され、IdeSバリアントを形成することができる(変異した(1つ以上の)アミノ酸は、イタリック体かつ下線で強調された(1つ以上の)アミノ酸として示されている):
本開示はまた、アフィニティークロマトグラフィーを使用して抗VEGFタンパク質を産生する間、宿主細胞タンパク質並びに望ましくない他のタンパク質及び核酸を減少させる方法を提供する。
本発明の一実施形態は、光を使用して酸化タンパク質種を合成する1つ以上の方法に関する。本実施形態の一態様において、関心対象のタンパク質は抗VEGFタンパク質である。特定の態様において、抗VEGFタンパク質はアフリベルセプトである。別の態様において、抗VEGFタンパク質は組換えVEGF MiniTrapを含むVEGF MiniTrapである。本実施形態の更なる別の態様において、抗VEGFタンパク質は一本鎖可変断片(scFv)である。
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、TNYLTH*R(配列番号21)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(配列番号22)、VH*EKDK(配列番号23)、SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(配列番号64)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(配列番号65)、TQSGSEM*K(配列番号66)、SDQGLYTC*AASSGLM*TK(配列番号67)、IIW*DSR/RIIW*DSR/IIW*DSRK(配列番号28)、TELNVGIDFNW*EYPSSK(配列番号29)、GFIISNATY*K(配列番号69)、KF*PLDTLIPDGK(配列番号70)F*LSTLTIDGVTR(配列番号32)
からなる群から1つ以上を含み、この場合、H*はヒスチジンであり2-オキソ-ヒスチジンに酸化され、C*はシステインでありカルボキシメチル化され、M*は酸化メチオニンであり、W*は酸化トリプトファンであり、Y*は酸化チロシンであり、F*は酸化フェニルアラニンである。消化は、ここまでに言及されたプロテアーゼにより、例えばトリプシンにより実施され得る。オリゴペプチドは質量分析法を使用して分析され得る。
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、TNYLTH*R(配列番号21)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(配列番号22)、VH*EKDK(配列番号23)、SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(配列番号64)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(配列番号65)、TQSGSEM*K(配列番号66)、SDQGLYTC*AASSGLM*TK(配列番号67)、IIW*DSR/RIIW*DSR/IIW*DSRK(配列番号28)、TELNVGIDFNW*EYPSSK(配列番号29)、GFIISNATY*K(配列番号69)、KF*PLDTLIPDGK(配列番号70)F*LSTLTIDGVTR(配列番号32)
からなる群から選択される1つ以上の修飾オリゴペプチドを含み、この場合、H*はヒスチジンであり2-オキソ-ヒスチジンに酸化され、C*はシステインでありカルボキシメチル化され、M*は酸化メチオニンであり、W*は酸化トリプトファンであり、Y*は酸化チロシンであり、F*は酸化フェニルアラニンである。消化は、ここまでに言及されたプロテアーゼにより、例えばトリプシンにより実施され得る。オリゴペプチドは質量分析法を使用して分析され得る。
本開示は、CDM中に産生されるアフリベルセプト、MiniTrap又はその同等物の産生中、黄褐色の呈色を低減させる方法を提供する。
既存の血管系からの新しい血管の増殖である血管新生は、適切な胎児性血管発生及び出生後の血管発生にとって重要である、高度な組織化プロセスである。異常血管新生又は病理学的血管新生は、がん及び複数の網膜疾患の特徴である。この場合、血管内皮増殖因子(VEGF)といった血管新生促進因子の上方制御により、内皮増殖の増加、血管形態の変化、及び血管透過性の増加が引き起こされる。様々な眼疾患の患者の硝子体液及び網膜血管では、高レベルのVEGFが見出されている。VEGF活性を遮断することもまた、DME、湿性AMD、CNV、網膜静脈閉塞症n及び異常血管新生が病因の根底にある他の眼疾患を処置する最適な治療となる。
特に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。当業者に公知の本明細書に説明される方法及び材料と類似するか又は同等の方法及び材料は、本明細書に説明される特定の実施形態の実施に使用することができる。言及されたすべての刊行物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
(i)1つ以上のVEGFR1(Flt1)の免疫グロブリン様(Ig)ドメイン2(R1D2)、
(ii)1つ以上のVEGFR2(Flk1又はKDR)のIgドメイン3(Flk1D3)(R2D3)、
(iii)1つ以上のVEGFR2(Flt1又はKDR)のIgドメイン4(Flk1D4)(R2D4)、及び/又は
(iv)1つ以上のVEGFR3(Flt4)のIgドメイン3(FltD3又はR3D3)
を含むことができる。
・((R1D2)-(R2D3))a-リンカー-((R1D2)-(R2D3))b;
・((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-リンカー-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d;
・((R1D2)-(R2D3))e-(MC)g;
・((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f-(MC)g;
式中、
- R1D2は、VEGF受容体1(VEGFR1)Igドメイン2(D2)であり;
- R2D3は、VEGFR2 Igドメイン3であり;
- R2D4は、VEGFR2 Igドメイン4であり;
- MCは多量体化成分(例えばIgG1に由来する、例えばIgGヒンジドメイン又はそれらの断片)であり;
- リンカーは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16アミノ酸を含むペプチドであり、例えば(GGGS)gであり;
並びに、
独立して、
a=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
b=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
c=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
d=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
e=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
f=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;及び
g=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15。
(i)(R1D2)a-(R2D3)b-(MC)c;又は
(ii)(R1D2)a-(R2D3)b-(R2D4)c-(MC)d;
これらは、例えば各ポリペプチドのMC間で結合することにより、当該第2のポリペプチドとホモ二量体化することができる。
この場合、
(i)当該R1D2ドメイン同士が整列して、
(ii)当該R2D3ドメイン同士が整列して、及び/又は
(iii)当該R2D4ドメイン同士が整列して、
二量体VEGF結合ドメインを形成する。
を含む。述べられるように、こうしたポリペプチドは多量体化されることができ(例えば、二量体化(例えば、ホモ二量体化))、この場合、ポリペプチド間の結合は多量体化成分を介して媒介される。
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)3-(R1D2)1-(R2D3)1;
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)6-(R1D2)1-(R2D3)1;
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)9-(R1D2)1-(R2D3)1;又は
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)12-(R1D2)1-(R2D3)1
を含む。G4Sは、-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-である。
(この場合、xは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である)を含む。本明細書にて述べられるように、これらのポリペプチドは二次構造を含むことができ、この場合、同様のVEGER Igドメインは鎖内VEGF結合ドメインを形成するように結合する(例えば、図2)。本発明の一実施形態において、こうしたポリペプチドの2つ以上は多量体化し(例えば、二量体化(例えば、ホモ二量体化))し、この場合、各鎖のVEGFR Igドメインは、鎖内VEGF結合ドメインを形成するために別の鎖の同様のIgドメインと結合する。
(i)当該R1D2ドメイン同士が整列して、
(ii)当該R2D3ドメイン同士が整列して、及び/又は
(iii)当該R2D4ドメイン同士が整列して、
VEGF結合ドメインを形成する。図2は、そのようなドメイン配置を示す一本鎖VEGF MiniTrapを示す。VEGFR1、VEGFR2、及びリンカードメインが示される。示されるリンカーは(G4S)6である。本発明は、(G4S)3;(G4S)9;又は(G4S)12リンカーを有する一本鎖VEGF MiniTrapを含む。
(配列番号55)として記載されるアミノ酸配列を含む。
本明細書にて使用される場合、組換えタンパク質、特に抗VEGFタンパク質の産生中に観察される色は、様々な方法により測定され得る。非限定的な例としては、ヨウ素色数、ハーゼン色数、ガードナー色数、ロビボンド色数、セーボルト色数、鉱油色数、欧州薬局方色数、米国薬局方色数、CIE L*、a*、b*(又はCIELAB)、クレット色数、Hess-Ives色数、黄色度、ADMI色数、並びにASBC及びEBC醸造所色数の使用が挙げられる。こうしたスケールにおける詳細は、LangeによるアプリケーションレポートNo.3.9eに見出すことができ、その全体の教示は本明細書に組み入れられる。
を使用し、空間内の単純ユークリッド距離として計算され得る。CIE L*、a*、b*色座標は、例えば、Hunter Labs UltrascanPro(Hunter Associates Laboratory,Reston,Virginia)を使用して、又はBYK Gardner LCS IV(BYK-Gardner,Columbia,Maryland)上で生成され得る。Hunter Labs UltraScanProに関しては、波長の較正のため、Didymium Filter Testを実行することができる。この機器は、使用前に0.780インチのポートインサート及びDIWを備えたTTRANにて標準化され得る。これにより、ライトトラップ及び黒色板を使用し、測光スケールの最上部(L=100)及び最下部(L=0)を確立する。Pack et al.,Modernization of Physical Appearance and Solution Color Tests Using Quantitative Tristimulus Colorimetry:Advantages,Harmonization,and Validation Strategies,J.Pharmaceutical Sci.104:3299-3313(2015)を参照されたい。その全体の教示は本明細書に組み入れられる。BY標準の色はまた、CIE L*、a*、b*色空間(「CIELAB」又は「CIELab」色空間)の下で発現され得る。表2を参照されたい。
VEGFシグナル伝達経路を制御するタンパク質のVEGFファミリーの少なくとも5つのメンバーが存在する。すなわち、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、及び胎盤増殖因子(PlGF)である。抗VEGF組成物は、VEGFアンタゴニストを含むことができ、これは、タンパク質のVEGFファミリーの1つ以上のメンバーと特異的に相互作用し、例えば、分裂促進性活性、血管新生活性、及び/又は血管透過性活性といった1つ以上のその生物学的活性を阻害する。
(i)欧州の色標準BY2と同程度の黄褐色;
(ii)欧州の色標準BY3と同程度の黄褐色;
(iii)欧州の色標準BY4と同程度の黄褐色;
(iv)欧州の色標準BY5と同程度の黄褐色;
(v)欧州の色標準でBY2~BY3の間;
(vi)欧州の色標準でBY3~BY4の間;
(vii)欧州の色標準でBY4~BY5の間
で認識される標準色特性評価により特徴付けられ得る。この組成物は約5g/L又は約10g/Lの抗VEGFタンパク質を含み、この組成物は清澄化された回収物であるプロテインA溶出液からの試料として得られる。
(i)約22~23のb*値と同程度の黄褐色;
(ii)約16~17のb*値と同程度の黄褐色;
(iii)9~10のb*値と同程度の黄褐色;
(iv)4~5のb*値と同程度の黄褐色;
(v)2~3のb*値と同程度の黄褐色;
(vi)17~23の間のb*値;
(vii)10~17の間のb*値;
(viii)5~10の間のb*値;
(ix)3~5の間のb*値;又は
(x)1~3の間のb*値
で認識される標準色特性評価により特徴付けられ得る。この組成物は約5g/L又は約10g/Lの抗VEGFタンパク質を含み、この組成物は清澄化された回収物であるプロテインA溶出液からの試料として得られる。
約0.004~0.013%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、
約0.006~0.028%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、
約0.049~0.085%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、
約0.057~0.092%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、
約0.008~0.022%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TNYLTH*R(配列番号21)、及び/又は
約0.185~0.298%の二酸化トリプトファンを含む、IIWDSR(配列番号56)、
又は
約0.008%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、
約0.02%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、
約0.06%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、
約0.07%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、
約0.01%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TNYLTH*R(配列番号21)、及び/又は
約0.23%のジ-オキソトリプトファンを含む、IIWDSR(配列番号56)
のうち1つ以上を含むことができ、H*は2-オキソ-ヒスチジンへと酸化され得るヒスチジンであり、C*はカルボキシメチル化され得るシステインである。特定の実施形態において、抗VEGFタンパク質はアフリベルセプトである。別の実施形態において、抗VEGFタンパク質はVEGF MiniTrapである。
により表される残基を生じる。このような修飾は、遊離チオールがジスルフィド架橋を再形成するのを防止し、ジスルフィド結合のスクランブルを防ぐ。本発明は抗VEGFタンパク質及びそのバリアントを含む組成物(例えば、水性組成物)を含む。IAMで修飾され、プロテアーゼ(例えば、Lys-C及びトリプシン)で消化され、質量分析法により分析される場合に、これは以下のペプチド:
約0.004~0.013%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、
約0.006~0.028%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、
約0.049~0.085%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、
約0.057~0.092%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、
約0.008~0.022%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TNYLTH*R(配列番号21)、及び/又は
約0.185~0.298%の二酸化トリプトファンを含む、IIWDSR(配列番号56)、
又は
約0.008%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、
約0.02%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、
約0.06%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、
約0.07%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、
約0.01%の2-オキソ-ヒスチジンを含む、TNYLTH*R(配列番号21)、及び/又は
約0.23%のジ-オキソトリプトファンを含む、IIWDSR(配列番号56)
を含み、ここでH*は2-オキソ-ヒスチジンであり、C*はカルボキシメチル化システインである。本発明の一実施形態において、ペプチドはPNGase Fで脱グリコシル化される。
CDMを使用して生成された抗VEGFタンパク質組成物の異なる色特性又はそのバリアントの発見に加え、本発明者らはまた、光に曝露することで、実験室にてこうした組成物を人工的に生成することができることも発見した。
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、TNYLTH*R(配列番号21)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(配列番号22)、VH*EKDK(配列番号23)、SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(配列番号64)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(配列番号65)、TQSGSEM*K(配列番号66)、SDQGLYTC*AASSGLM*TK(配列番号67)、IIW*DSR/RIIW*DSR/IIW*DSRK(配列番号28)、TELNVGIDFNW*EYPSSK(配列番号29)、GFIISNATY*K(配列番号69)、KF*PLDTLIPDGK(配列番号70)F*LSTLTIDGVTR(配列番号32)
からなる群から選択され、ここで、H*はヒスチジンであり2-オキソ-ヒスチジンに酸化され、C*はシステインでありカルボキシメチル化され、M*は酸化メチオニンであり、W*は酸化トリプトファンであり、Y*は酸化チロシンであり、F*は酸化フェニルアラニンである。更なる態様において、抗VEGF組成物は、例えば約30時間といった一定期間にわたり、抗VEGF組成物を冷白色光に曝露することにより1種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約1.5~約10倍の増加を含むことができる。別の態様において、抗VEGF組成物は、約75時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより1種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約1.5~約10倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗VEGF組成物は、約100時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、前に説明される1種以上のオリゴペプチドにおいて約1.5~約20倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗VEGF組成物は、約150時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、前に説明される1種以上のオリゴペプチドにおいて約1.5~約20倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗VEGF組成物は、約300時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、1種以上のオリゴペプチドにおいて約1.5~約50倍の増加を含むことができる(以下実施例4を参照されたい)。
本発明の組成物は抗VEGFタンパク質を含み、CDM中に生成された抗VEGFタンパク質は様々な糖質多様性を有する。抗VEGFタンパク質の異なるグリコシル化プロファイルは、本発明の範囲内である。
バイオ医薬品の場合、頑強で柔軟性のある上流プロセスの実装が望ましい。効率的な上流プロセスは、関心対象のタンパク質の望ましい産生及びスケールアップにつながり得る。本発明者らは、抗VEGFタンパク質を含む本発明の組成物は、CDMの培地成分の変更など、上流でのタンパク質産生中の条件を調整することで生成され得る。上流プロセスの各工程は、製造されるタンパク質の品質、純度及び量に影響を与え得る。
(i)欧州の色標準BY2と同程度の黄褐色;
(ii)欧州の色標準BY3と同程度の黄褐色;
(iii)欧州の色標準BY4と同程度の黄褐色;
(iv)欧州の色標準BY5と同程度の黄褐色;
(v)欧州の色標準でBY2~BY3の間;
(vi)欧州の色標準でBY3~BY4の間;
(vii)欧州の色標準でBY4~BY5の間
のように特徴付けられ、この組成物は約5g/L又は約10g/Lの抗VEGFタンパク質を含み、この組成物の試料は清澄化された回収物であるプロテインA溶出液からの試料として得ることができる。以下の実施例9、表9-3で確認されるように、5g/Lのアフリベルセプトを含むプロテインA溶出液は、黄褐色を呈し、これは1.77のb*値を有すると測定される。AEX後の下流で生成されたとき、こうした試料は、0.50のb*値を有した。これは、試料の黄褐色を低下させるAEXの有用性を実証している(表9-3)。
(i)約22~23のb*値と同程度の黄褐色;
(ii)約16~17のb*値と同程度の黄褐色;
(iii)9~10のb*値と同程度の黄褐色;
(iv)4~5のb*値と同程度の黄褐色;
(v)2~3のb*値と同程度の黄褐色;
(vi)17~23のb*値;
(vii)10~17のb*値;
(viii)5~10のb*値;
(ix)3~5のb*値;又は
(x)1~3のb*値
での認められた標準色特性評価により特徴付けられ、この場合、この組成物は約5g/L又は約10g/Lの抗VEGFタンパク質を含み、この組成物は清澄化された回収物であるプロテインA溶出液からの試料として得られる。実施例9、表9-3を参照されたい。
いくつかの実施形態において、改変CDMは、CDM中のアミノ酸の累積濃度を減少又は増加させることにより得ることができる。こうしたアミノ酸の非限定的な例としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン(又はこれらの塩)が挙げられる。改変CDMにおけるこれらのアミノ酸の累積量における増加又は減少は、出発CDMと比較すると、約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%であることができ、上記のうち1つ以上の範囲内である。代替的には、改変CDM中の1種以上のアミノ酸の累積量の増加又は減少は、未改変CDMと比較すると、約5~約20%、約10~約30%、約30%~約40%、約30%~約50%、約40%~約60%、約60%~約70%、約70%~約80%、約80%~約90%、又は約90%~約100%であることができ、上記のうち1つ以上の範囲内である(図25~27及び実施例5を参照されたい)。
いくつかの実施形態において、改変CDMは、CDM中の金属の累積濃度を減少又は増加させることにより得ることができる。金属の非限定的な例としては、鉄、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、ニッケル、カルシウム、カリウム及びナトリウムが挙げられる。改変CDMにおける1種以上の金属の量における増加又は減少は、未改変CDMと比較すると、約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%であることができ、上記のうち1つ以上の範囲内である。代替的には、改変CDM中の1種以上の金属の累積量の増加又は減少は、未改変CDMと比較すると、約5~約20%、約10~約30%、約30%~約40%、約30%~約50%、約40%~約60%、約60%~約70%、約70%~約80%、約80%~約90%、又は約90%~約100%であることができ、上記のうち1つ以上の範囲内である(図25~27及び実施例5を参照されたい)。
いくつかの実施形態において、改変CDMは1種以上の抗酸化剤を含む。抗酸化剤の非限定的な例としては、タウリン、ヒポタウリン、グリシン、チオクト酸、グルタチオン、塩化コリン、ヒドロコルチゾン、ビタミンC、ビタミンE、及びこれらの組合せであり得る(図28A~E及び実施例5を参照されたい)。
本開示はまた、CDM中のある特定の成分の累積濃度を変更することにより、抗VEGFタンパク質のグリコシル化を調整する方法も含む。CDMに加えられる成分の累積量に基づき、フコシル化の合計%、ガラクトシル化の合計%、シアリル化の合計%及びマンノース-5を変更することができる。
本発明の抗VEGFタンパク質を含む組成物は、下流タンパク質産生中の条件を調整することにより産生され得る。本発明者らは、下流手順を最適化させることで、抗VEGFタンパク質の特定のバリアントが最小化し、かつこれが変色することを発見した。下流プロセスの最適化により、オキソバリアントが減少し、かつ色特性が最適化された組成物を生成することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、CDM中の宿主細胞で抗VEGFタンパク質を発現させることを含むプロセスに関与し得、この場合、抗VEGFタンパク質は宿主細胞から培地へと分泌され、清澄化された回収物が得られる。この回収物は、以下:(a)回収物から得られた生物学的試料を、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)に負荷する工程、(b)好適な洗浄バッファでAEXカラムを洗浄する工程、(c)(1つ以上の)フロースルー画分を収集する工程、任意で(d)好適なストリップバッファでカラムを洗浄する工程、及び(e)ストリップされた画分を収集する工程に供される。
(a)2-オキソ-ヒスチジンに酸化されているヒスチジン残基の割合であって、それらの色特性は以下:
(i)欧州の色標準BY2と同程度の黄褐色;
(ii)欧州の色標準BY3と同程度の黄褐色;
(iii)欧州の色標準BY4と同程度の黄褐色;
(iv)欧州の色標準BY5と同程度の黄褐色;
(v)欧州の色標準でBY2~BY3の間;
(vi)欧州の色標準でBY3~BY4の間;
(vii)欧州の色標準でBY4~BY5の間
であり、この組成物は約5g/L又は約10g/Lの抗VEGFタンパク質を含み、この組成物はフロースルー画分からの試料として得られる。
(b)2-オキソ-ヒスチジンに酸化されているヒスチジン残基の割合。更には、これらの色は、BY2、BY3、BY4、BY5、BY6、BY7の色に近く、又はBY2よりも暗くなく/強くもなく、BY3よりも暗くなく、BY4よりも暗くなく、BY5よりも暗くなく、BY6よりも暗くなく、BY7よりも暗くなく、又はBY2~BY3の間であり、BY2~BY4の間であり、BY3~BY4の間であり、又はBY3~BY5の間である、黄褐色を有することで特徴付けられる。
(c)2-オキソ-ヒスチジンに酸化されているヒスチジン残基の割合であり、それらの色は以下:
(i)約22~23のb*値と同程度の黄褐色;
(ii)約16~17のb*値と同程度の黄褐色;
(iii)9~10のb*値と同程度の黄褐色;
(iv)4~5のb*値と同程度の黄褐色;
(v)2~3のb*値と同程度の黄褐色;
(vi)17~23のb*値;
(vii)10~17のb*値;
(viii)5~10のb*値;
(ix)3~5のb*値;又は
(x)1~3のb*値
のようなCIEのL*、a*、b*色空間における色により特徴付けられ、この場合、この組成物は、約5g/L又は約10g/Lの抗VEGFタンパク質を含み、この組成物は、フロースルー画分からの試料として得られる。
(d)組成物中、約1%以下、約0.1%以下、又は約0.1~1%、約0.2~1%、約0.3~1%、約0.4~1%、約0.5~1%、約0.6~1%、約0.7~1%、約0.8~1%、又は約0.9~1%のヒスチジン残基は2-オキソ-ヒスチジンに酸化される。割合の計算はセクションIIに説明される。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、宿主細胞で抗VEGFタンパク質を発現させることを含むプロセスを使用して生成され得、この場合、抗VEGFタンパク質は宿主細胞から培地へと分泌され、清澄化された回収物が得られる。この回収物は、以下を含む工程に供される:(a)清澄化された回収物から得られた生物学的試料を、アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷する工程であって、アフィニティークロマトグラフィーが抗VEGFタンパク質に選択的又は特異的に結合可能なタンパク質を含む、工程、(b)好適な溶出バッファでアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、及び(c)(1つ以上の)溶出画分を収集する工程。例えば、表7-1及び表7-7~7-10に例示されるように、抗VEGFタンパク質に選択的又は特異的に結合可能であるタンパク質としてVEGF165を使用し、かつ上記方法に従い、溶出画分を収集することで、MT5(抗VEGFタンパク質)、アフリベルセプト及び抗VEGF scFv断片の首尾よい生成につながった。表7-1はまた、MT5に選択的又は特異的に結合可能である異なるタンパク質として、(i)mAb1(配列番号73は重鎖であり、配列番号74は軽鎖である、マウスの抗-VEGFR1 mAbヒトIgG1)、(ii)mAb2(配列番号75は重鎖であり、配列番号76は軽鎖である、マウスの抗VEGFR1 mAbヒトIgG1)、(iii)mAb3(配列番号77は重鎖であり、配列番号78は軽鎖である、マウスの抗-VEGFR1 mAbマウスIgG1)、及び(iv)mAb4(配列番号79は重鎖であり、配列番号80は軽鎖である、マウスの抗-VEGFR1 mAbマウスIgG1)、を使用するMT5の首尾よい生成を開示する。
アフリベルセプトといったFc融合タンパク質の切断に使用されるIdeSプロテアーゼは、塩基性pH条件の下で酵素活性を急速に損失し、これはVEGF MiniTrapの製造中、その使用を制限する可能性がある。したがってバリアントは、例えばNaOHといった強塩基の存在下で、塩基性pHで更に安定であるように開発されてきた。そのような塩基性条件は、0.05NのNaOHで1時間、又は0.1NのNaOHで0.5時間であり得る。
アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードのクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されず、単独で又は組み合わせられる、様々な異なる生成技術は本発明の範囲内にあることが想定される。これらのクロマトグラフィー工程は、それらの電荷、疎水性度、又はサイズ、又はこれらの組合せに基づき、分離の特定の形式に応じて、生物学的試料であるタンパク質の混合物を分離する。異なる複数のクロマトグラフィー樹脂は、上記に示唆された技術のそれぞれについて利用可能であり、これにより関与する特定のタンパク質に対する生成スキームを正確に作ることができる。各分離方法により、タンパク質が異なる速度でカラムを通過することで、それらがカラムを更に通過するたびに増加する物理分離又は分離媒体への選択的な付着が実現する。次いでタンパク質は、(i)適切な溶出バッファを使用して差次的に溶出され、及び/又は(ii)使用されるカラムから、任意選択で適切な平衡化バッファでカラムを洗浄することにより得られるフロースルー画分から収集される。場合によっては、不純物が優先的にカラムに付着し、関心対象のタンパク質がそれほど吸着しない、すなわち関心対象のタンパク質が特定のカラムの固相に吸着せず、したがってカラムを通過する場合、関心対象のタンパク質は、不純物(HCP、タンパク質バリアントなどの)から分離される。場合によっては、不純物がカラムに吸着できず、したがってカラムを通過する場合、この不純物は、関心対象のタンパク質から分離される。
特定の実施形態において、本明細書に開示される生成方法の初期工程は、生物学的試料からの関心対象のタンパク質の清澄及び一次回収に関与している。一次回収は、宿主細胞及び付随する細胞細片から関心対象のタンパク質を分離する1回以上の遠心分離工程を含む。試料の遠心分離は、例えば限定するものではないが、7,000xgからおよそ12,750xgで実施され得る。大規模な生成という観点では、こうした遠心分離は、例えば得られる上清中、150NTUの混濁度レベルを実現するように設定された流速で生産ラインにて実施される。こうした上清は次いで、更なる処理のために収集され、又は試料の更なる清澄のために1つ以上のデプスフィルタに通してライン中にろ過され得る。
特定の例示的な実施形態において、関心対象のタンパク質の生成のため、生物学的試料をアフィニティークロマトグラフィーに供することが有利な場合がある。クロマトグラフィー材料は、関心対象のタンパク質と選択的又は特異的に結合可能又は相互作用可能である。そのようなクロマトグラフィー材料の非限定的な例としては、プロテインA、プロテインGが挙げられる。また、例えば関心対象のタンパク質に結合可能又は相互作用可能であるタンパク質又はその部分を含むクロマトグラフィー材料もまた挙げられる。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、MiniTrap、又はこれらに関連するタンパク質などの抗VEGFタンパク質である。
ある特定の実施形態において、関心対象のタンパク質は、生物学的試料を少なくとも1つの陰イオン交換分離工程に供することにより生成される。あるシナリオにおいて、陰イオン交換工程は、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインAアフィニティー)手順後に生じ得る。それ以外のシナリオにおいて、陰イオン交換工程はアフィニティークロマトグラフィー工程前に生じ得る。更に他のプロトコルにおいて、陰イオン交換はアフィニティークロマトグラフィー工程前と工程後の両方で生じ得る。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト又はMiniTrapのいずれかである。
(i)His86、His110、His145、His209、His95、His19、及び/若しくはHis203から選択されるヒスチジン残基からの酸化ヒスチジン、(ii)Trp58及び/又はTrp138のトリプトファン残基から選択される酸化トリプトファン残基、(iii)Tyr64の酸化チロシン残基、(iv)Phe44及び/又はPhe166から選択される酸化フェニルアラニン残基、並びに/又は(v)Met10、Met20、Met163、及び/又はMet192から選択される酸化メチオニン残基
のうち、1つ以上が挙げられ得る。
本発明の組成物は、関心対象のタンパク質を含む生物学的試料を少なくとも1回の陽イオン交換(CEX)工程に供することにより生成され得る。特定の例示的な実施形態において、CEX工程はAEX工程に追加され、AEX工程前又は工程後のいずれかで実施される。一態様において、関心対象のタンパク質は、アフリベルセプト、MiniTrap、又はこれらに関連する分子のいずれかである。
混合モード(「MM」)クロマトグラフィーはまた、本発明の組成物を調製するために使用されてもよい。本明細書にて「マルチモーダルクロマトグラフィー」とも称されるMMクロマトグラフィーは、試料からの分析物又は関心対象のタンパク質と少なくとも2つの異なる相互作用をもたらすことが可能である配位子を含む支持体を利用する、クロマトグラフィー方針である。これらの部位のうち一方が、配位子と関心対象のタンパク質との間に誘引性の電荷-電荷相互作用をもたらし、もう一方は電子受容体-供与体相互作用及び/又は疎水性相互作用及び/又は親水性相互作用をもたらす。電子供与体-受容体相互作用としては、水素結合、π-π、陽イオン-π、電荷移動、双極子-双極子、誘起双極子などの相互作用が挙げられる。
本発明の組成物はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用して調製されてもよい。
サイズ排除クロマトグラフィー又はゲルろ過は、分子サイズの関数として成分の分離に依存する。分離は、流体中に存在する時間と比較して、物質が多孔質固定相中で費やす時間量に依存する。分子が細孔内に存在する確率は、分子及び細孔のサイズに依存する。加えて、物質が細孔内へと浸透する能力は、小さな巨大分子についてはより高い巨大分子の拡散移動度により決定される。非常に大きい巨大分子は、固定相の細孔に全く浸透しないことがある。また、非常に小さな巨大分子では、浸透する確率は1に近い。大きな分子サイズの成分は、より迅速に固定相を過ぎ去って移動するが、小さい分子サイズの成分は、固定相の細孔を通る経路がより長くなるため、固定相内により長く保持される。
ウイルスろ過は生成プロセス中のウイルス減少を目的とした工程である。この工程は、通常クロマトグラフィーのポリッシュ後に実施される。ウイルス減少は、Asahi Kasei Pharma製のPlanova 20N(商標)、Planova 50N、又はBioEx、EMD Millipore製のViresolve(商標)フィルタ、Sartorius製のViroSart CPV、Pall Corporation製のUltipor DV20又はUltipor DV50(商標)を含むがこれらに限定されない好適なフィルタの使用により達成され得る。所望のろ過性能を得るための好適なフィルタを選択することは、当業者には明らかであろう。
本発明の特定の実施形態は、関心対象のタンパク質を更に濃縮及び製剤化するために限外ろ過及び透析ろ過を利用する。限外ろ過は、Microfiltration and Ultrafiltration:Principles and Applications,L.Zeman and A.Zydney(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1996);及び:Ultrafiltration Handbook,Munir Cheryan(Technomic Publishing,1986;ISBN No.87762-456-9)中に詳細が説明されており、それらの全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる。ろ過プロセスの1つには、「Pharmaceutical Process Filtration Catalogue」と題されるMilliporeカタログの177~202頁(Bedford,Mass.,1995/96)(その全体の教示が本明細書に参照として組み入れられる)に説明されるようなタンジェンシャルフローろ過である。限外ろ過は、0.1μmより小さい細孔径を有するフィルタを使用したろ過を意味すると一般には考えられる。こうした小さい細孔径を有するフィルタを使用することにより、タンパク質を膜表面の上に保持させつつ、フィルタの膜細孔を通して試料バッファを浸透させることで試料の体積を減少させることができる。
一次回収は、生成バイオリアクタの回収物からの細胞及び細胞細片(HCPを含む)を取り除くためにpH低下、遠心分離、及びろ過を順次利用することで進められる。本発明は、一次回収から、関心対象のタンパク質を含む生物学的試料を、(特に順序は問わないが)AEX、CEX、SEC、HIC及び/又はMMを含む、1種以上の生成工程に供することに関する。本発明の特定の態様は、更なる処理工程を含む。追加的な処理手順の例としては、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンSepharose(商標)でのクロマトグラフィー、更なる陰イオン交換クロマトグラフィー、及び/又は更なる陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィー(例えば、捕捉試薬としてプロテインA又はプロテインG、抗体、特異的基質、リガンド又は抗原を使用する)が挙げられる。特定の態様では、カラム温度(及び他のパラメータ)は、分離効率及び/又は任意の特定の生成工程の収率を向上させるために独立して変更され得る。
本発明はまた、抗VEGF組成物を含む製剤(上にて説明される)を開示する。抗VEGFタンパク質に好適な製剤としては、米国特許第7,608,261号、米国特許第7,807,164号、米国特許第8,092,803号、米国特許第8,481,046号、米国特許第8,802,107号、米国特許第9,340,594号、米国特許第9,914,763号、米国特許第9,580,489号、米国特許第10,400,025号、米国特許第8,110,546号、米国特許第8,404,638号、米国特許第8,710,004号、米国特許第8,921,316号、米国特許第9,416,167号、米国特許第9,511,140号、米国特許第9,636,400号及び米国特許第10,406,226号(その全体が本明細書に参照としてすべて組み入れられる)に説明される製剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、対象において、本明細書に開示される治療有効量の組成物を投与することを含む(上記セクションIII)、がん(例えば、その増殖及び/又は転移は、例えばVEGF介在血管新生など、VEGFが少なくとも部分的に介在する)又は血管新生性眼障害を処置又は予防する方法を提供する。
・加齢黄斑変性症(例えば、湿性又は乾性)、
・黄斑浮腫、
・網膜静脈閉塞症後の黄斑浮腫、
・網膜静脈閉塞症(RVO)、
・網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、
・網膜静脈分枝閉塞症(BRVO)、
・糖尿病性黄斑浮腫(DME)、
・脈絡膜新生血管(CNV)、
・虹彩新生血管、
・血管新生緑内障、
・緑内障の術後線維症、
・増殖性硝子体網膜症(PVR)、
・視神経円板血管新生、
・角膜血管新生、
・網膜血管新生、
・硝子体血管新生、
・パンヌス、
・翼状片、
・血管性網膜症、
・糖尿病性黄斑浮腫に罹っている対象における糖尿病性網膜症;及び
・糖尿病性網膜症(例えば、非増殖性糖尿病性網膜症(例えば、約47若しくは53の糖尿病性網膜症重症度スケール(DRESS)レベル)によって特徴付けられる)又は増殖性糖尿病性網膜症(例えば、DMEに罹患していない対象))。
本明細書に説明される技術を使用して生成されたクロマトグラフィー試料中のタンパク質バリアントのレベルは、以下の実施例に説明されるように分析され得る。ある特定の実施形態において、cIEF法は、フッ化炭素コーティングされたキャピラリーカートリッジ(100μm×5cm)を備えるiCE3分析器(ProteinSimple)を使用して利用される。両性電解質溶液は、0.35%のメチルセルロース(MC)、4%のPharmalyte3-10担体両性電解質、4%のPharmalyte5-8担体両性電解質、10mMのL-アルギニンHCl、24%のホルムアミドの混合物からなり、精製水中、5.12及び9.77のpIマーカからなる。アノード液は、0.10%のメチルセルロース中80mMのリン酸であり、カソード液は、0.10%のメチルセルロース中100mMの水酸化ナトリウムであった。試料を、精製水を用いて10mg/mLに希釈した。試料を両性電解質溶液と混合し、次いで1分間1500Vの電位を導入し、次いで7分間3000Vの電位を導入して電気泳動にかけた。電気泳動にかけたバリアントの画像は、キャピラリーを通して280nmの紫外線を通過させ、電荷結合デバイスのデジタルカメラレンズに入れることによって得た。次いで、この画像を分析し、様々な電荷バリアントの分布を決定した。当業者は、所望の結果を達成しつつ、正確なパラメータを変更させることができる。
MT1:CDM1を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるVEGF MiniTrap。
MT2:CDM2を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるVEGF MiniTrap。
MT3:CDM3を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるVEGF MiniTrap。
MT4:ダイズ加水分解物を使用して産生されたアフリベルセプトの切断により得られるVEGF MiniTrap。
MT5:組換えVEGF MiniTrap(二量体)。
MT6:組換えVEGF MiniTrap(scFv)。
MT1、MT5及びMT6の特性評価は、以下の実施例8にて説明される。
b*値を測定する分光光度アッセイ方法(CIELAB)は、色評価を実施するのに好適であることが分かった。
1.1 細胞供給源及び回収
本研究ではアフリベルセプト産生細胞株を利用した。合成培地(CDM)を使用してアフリベルセプト産生細胞株を培養し、回収した。
MT1を生成するため、固定化したIdeS酵素(Genovis(Cambridge,MA)から得たFabRICATOR(登録商標))を有するカラムを使用した。細胞培養回収物から得たアフリベルセプト(1.0mLの切断バッファ中、20mg)をカラムに加え、18℃で30分間インキュベートした。30分後、切断バッファ(1.0mL)でカラムを洗浄した。消化混合物と洗浄溶液を合わせた。分析用プロテインAアフィニティーカラム(Applied Biosystems(商標)、POROS(商標)20μMプロテインAカートリッジ、2.1×30mm、0.1mL(カタログ番号2-1001-00)に混合物を負荷し、ここから溶出させた。POROS(商標)20μMプロテインAカートリッジ、2.1×30mm、0.1mL(カタログ番号2-1001-00)向けのApplied Biosystems(商標)のプロトコルに従い、処理を行った。カラム高さは20±1.0cmであり、保持時間は15分間であった。また、平衡化/洗浄は40mMのトリス、54mMの酢酸塩(pH7.0±0.1)を使用して実施された。
(A)色形成を減少するためにAEXを利用した
CDM1を使用して発現されたアフリベルセプトの産生中の呈色を取り除くため、AEXクロマトグラフィーを実施した。
表2-2に説明されるようなAEXプロトコルを用い、表2-1に詳述されるように、この調査のために5回のAEX分離を実施した。AKTA Avantベンチトップ型液体クロマトグラフィーコントローラに、15.7mLのQ Sepharose Fast Flowカラム(床高さ19.5cm、内径1.0cm)及び14.1mLのPOROS 50 HQカラム(床高さ18.0cm、内径1.0cm)を統合した。
産生へのAEX分離の利用は、色の著しい低減を呈した(表2-3)。例えば、表2-3で確認されるように、AEX分離1におけるフロースルー(FT)及び洗浄液(pH8.30~8.50、1.90~2.10mS/cm)中で観察される色は、3.06のb*値を有するAEXの負荷(「AEX負荷」)の色と比較して、1.05のb*値を有した。b*値における増加は、試料の黄褐色の強度を反映する。
AEXの使用は黄褐色を低減させることが分かった。表2-3を参照されたい。表2-3を参照すると、AEX負荷は3.06のb*値を有するが、AEXクロマトグラフィーに供すると(AEX分離1~5)、b*値が減少し、これは黄褐色の減少を示している。この場合もまた、b*値が減少するにつれて呈色が低減し、b*値が増加するにつれて、所与の試料における黄褐色の増加を反映している。
試料調製。翻訳後修飾(PTM)を同定及び定量化するため、上記実験(表2-3)のAEX負荷及びフロースルーから得られた還元及びアルキル化アフリベルセプト試料のトリプシンマッピング(Tryptic mapping)を実施した。各試料のアリコート(負荷及びフロースルー)を、8.0Mの尿素、0.1Mのトリス-HCl(pH7.5)を使用して変性し、DTTで還元し、次いでヨードアセトアミドでアルキル化した。変性、還元及びアルキル化された試料を、最初に組換えLys-C(rLys-C)を用い、37℃で30分間、1:100(w/w)の酵素対基質比にて消化し、最終尿素濃度が1.8Mとなるように0.1Mのトリス-HCl(pH7.5)で希釈して、続いてトリプシンを用い、37℃で2時間、1:20(w/w)の酵素対物質比にて消化し、次いでPNGaseFを用いて、37℃で1時間、1:5(w/w)の酵素基質比で脱グリコシル化した。ギ酸(FA)を用いてpHを2.0未満とすることにより、消化を停止した。
CDM1を使用して発現された全長アフリベルセプトの切断実施時に得られるMT1の産生中に生じる呈色を取り除くため、AEXクロマトグラフィーを実施した。
表2-4にて説明されるように、本調査のために4回のAEX分離を実施した。MT1(「MT1ろ過プール」)のろ過試料から、AEX負荷を得た。この実験のため、AKTA Avantベンチトップ型液体クロマトグラフィーコントローラに、15.7mLのCapto Qカラム(床高さ20.0cm、内径1.0cm)、14.1mLのPOROS 50 HQカラム(床高さ18.0cm、内径1.0cm)、及び16.5mLのQ Sepharose FFカラム(床高さ21.0cm、内径1.0cm)を統合した。
4回のAEX分離はすべて、AEX分離1~4のフロースルー及び洗浄液の呈色に関して確認されるように、色の低減をもたらした(表2-7)。最初の3回のAEX分離を結合及び溶出モードにて評価したが(表2-6)、生成物の大部分は負荷ブロック及び洗浄液ブロックに存在していたことが観察された(62%~94%)。
アフリベルセプトについて確認されるように(上のセクション2.3を参照されたい)、AEXの使用により、MiniTrap産生に関して黄褐色が低減すること(表2-7)が分かった。表2-7を参照すると、AEX負荷は4.17のb*値を有するが、AEXクロマトグラフィーに供すると(AEX分離1~4)、b*値が減少し、これは黄褐色における減少を示している。この場合もまた、b*値が減少するにつれて呈色も低減する。(5g/Lの濃度での)AEX負荷の初期b*値は、約0.5~約25の範囲であり、より具体的には約1.0~約20.0、及び更により具体的には約1.5~約15.0の範囲であり得る。AEXの使用後、(5g/Lの濃度での)フロースルーのb*値は、0.5~約10.0の範囲であり、より具体的には約0.5~約7.0、及び更により具体的には約0.5~約5.0の範囲であり得る。
3.1 ペプチドマッピング
試料調製。翻訳後修飾を同定及び定量化するため、還元及びアルキル化MiniTrap(MT1)及びMT4(ダイズ加水分解細胞培養を使用して産生された異なる全長アフリベルセプトを使用し、MT1と類似するMiniTrap)試料のトリプシンマッピングを実施した。各試料のアリコートは、0.1Mのトリス-HCl(pH7.5)中8.0Mの尿素を使用して変性させ、DTTで還元し、次いでヨードアセトアミドでアルキル化した。変性させ、還元し、かつアルキル化した原薬を、最初に組換えLys-C(rLys-C)を用い、37℃で30分間、1:100(w/w)の酵素対基質比にて消化し、最終尿素濃度が1.8Mとなるように0.1Mのトリス-HCl(pH7.5)で希釈して、続いてトリプシンを用い、37℃で2時間、1:20(w/w)の酵素対物質比にて消化し、次いでPNGaseFを用いて、37℃で1時間、1:5(w/w)の酵素基質比で脱グリコシル化した。ギ酸(FA)を用いてpHを2.0未満とすることにより、消化を停止した。
MT1及びMT4に関するトリプシンペプチドマップを比較した際に、MT1におけるPTMを観察した(図12Aは20.0~75分に溶出されたペプチドの吸光度を示している)。様々なUVピークを有するペプチドが強調されている。クロマトグラムの拡大図を図12Bに示し、これは16~30分に溶出したペプチドの吸光度を示している。MT1とMT4との間のUV吸光度で著しく対照的であるペプチドは、TNYLTH*R、IIW(+4)DSR及びIIIW(+132)DSRであった(*又は下線は残基の酸化を表す)。更に、クロマトグラムの拡大図を図12Cに示し、これは30~75分に溶出したペプチドの吸光度を示している。MT1とMT4との間のUV吸光度で著しく対照的であるペプチドは、DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、EIGLLTCEATVNGH*LYK(配列番号18)及びQTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)であった(*は残基の酸化を表す)。ペプチドマッピングにより、VEGF MiniTrap間で存在量において有意に異なるペプチドの同一性が明らかとなった。ペプチドマッピング分析から同定されたペプチドの相対的な存在量を表3-1に示す。MT1(CDM中で産生)中の2-オキソ-ヒスチジンの量は、MT4(ダイズ加水分解物中で産生)より高かった。これは、アフリベルセプトを発現するために使用された培地が、酸化ヒスチジン又は酸化トリプトファンを有するペプチドの相対的な存在量に有意な影響を有し得ることを示唆している。例えば、ペプチドQTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)に関しては、MT1(CDM中で産生)中のペプチドの相対的な存在量のパーセントは、MT4(ダイズ加水分解物中で産生;MT1と比較すると約15分の1)中のペプチドの相対的な存在量のパーセントと比較して0.015パーセントであった。
抗VEGFタンパク質を含む試料中に存在する酸性種及び他のバリアントを同定するため、一連の実験を実施した。
icIEFにより、画分F1~7及びMC(CEX後のMT1-ロット2由来)中のバリアントの分布を更に評価した(図19)。
この実施例では、タンパク質試料を様々な量の冷白色(CW)蛍光灯又は紫外線A(UVA)光に曝露することにより、例えばMT1といったVEGF MiniTrap(MT)の光誘起を実施した。光に曝露した試料の色及び酸化アミノ酸含有量を判定した。上で説明したように、曝露後にLCMS分析を実施した。MTを冷白色光又はUVA光に曝露することで、例えばヒスチジンといった酸化アミノ酸残基の増加が生じた(表4-1、表4-2及び表4-3)。
ICHは、ICH統一三極ガイドライン:新原薬及び新製剤の光安定性試験ガイドラインQ1Bを指す。これは、少なくとも120万ルクス*時間で冷白色蛍光灯、及び少なくとも200W*時間/m2の近紫外線エネルギーを用いて実施される光安定性研究を明記している。
試料の色は、CIELAB色空間(L*、a*、b*変数)を使用し、EPのBY色標準と比較して示される。ここでL*=白~黒(L*は明度)、a*=マゼンダ~アクア、b*=黄色~青色であり、b値が高くなるほど黄色が強くなる。
5.1 合成培地のインキュベーション調査
アフリベルセプトを含む新鮮な合成培地(CDM)へと加えられた様々な成分の、呈色に関する効果を調査した。
・システイン:16.6mM
・鉄:0.23mM
・銅:0.0071mM
・亜鉛:0.54mM
アフリベルセプト産生細胞株の種培養から、バイオリアクタ(例えば、2L)に播種した。35.5℃の温度、7.1±0.25のpH、22ccmのエアスパージ設定点で、播種した培養物を増殖させた。必要に応じて、グルコース、消泡剤及び基礎培地をバイオリアクタに補充した。アフリベルセプトが発現される時の、システイン濃度及び金属濃度の低下による、色に対する効果をCDM1で評価した。
0日目の培地=CDM1、1.48mMのシステインを含む
・栄養フィード:
-2日目=合成フィード(CDF)+1.3~2.1mMのシステイン
-4日目=CDF+1.6~1.7mMのシステイン
-6日目=CDF+1.6~1.7mMのシステイン
-8日目=CDF+1.6~1.7mMのシステイン
・システインを、培養物1Lあたり約6~7ミリモルの累積濃度、培養物1Lあたり8~9ミリモルの累積濃度、又は培養物1Lあたり10~11ミリモルの累積濃度で加えた。
・1倍レベルでのCDM1中の金属(CDM1レベルの0.5倍、1倍、又は1.5倍)は以下に列挙する(濃度は種菌追加前のものである):
- Fe=培養物1リットルあたり68~83マイクロモル
- Zn=培養物1リットルあたり6~7マイクロモル
- Cu=培養物1リットルあたり0.1~0.2マイクロモル
- Ni=培養物1リットルあたり0.5~1マイクロモル
アフリベルセプトを含む使用済みCDMへと加えられる抗酸化剤であるタウリン、ヒポタウリン、チオクト酸、グルタチオン、グリシン及びビタミンCの、色に対する効果を評価した。1本以上の、10mLのワーキングボリューム(CDM1)を有する50mLの空気抜きキャップ付き振盪管を7日間インキュベートし、0日目及び7日目に試料を採取した。
・アフリベルセプト試料(5mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、及び100mMの塩化ナトリウムを含むpH6.2の緩衝水溶液中の、アフリベルセプト組換えタンパク質)は、6g/Lの濃度で振盪管へと加えた。
・抗酸化剤は以下の濃度にて使用済みCDM1に加えた:
- タウリン=培養物中10mM
- ヒポタウリン=培養物中10mM
- グリシン=培養物中10mM
- チオクト酸=培養物中0.0024mM
- 還元型グルタチオン=培養物中2mM
- ヒドロコルチゾン=培養物中0.0014mM
- ビタミンC(アスコルビン酸)=培養物中0.028mM
・アフリベルセプト試料(5mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、及び100mMの塩化ナトリウムを含むpH6.2の緩衝水溶液中の、アフリベルセプト組換えタンパク質)は、6g/Lの濃度で振盪管へと加えた。
・2つのDOE実験を実施した:
・(i)抗酸化剤は以下の濃度にて使用済みCDM1に加えた:
- タウリン=培養物中10mM
- ヒポタウリン=培養物中10mM
- グリシン=培養物中10mM
- チオクト酸=培養物中0.0024mM
- ビタミンC(アスコルビン酸)=培養物中0.028mM
・(ii)抗酸化剤は以下の累積濃度に達成するように加えた:
- ATA=2.5μM~5μM
- デフェロキサミンメシル酸塩(DFO)=5μM~10μM
- カタラーゼ=101.5mg/L
- S-カルボキシメチル-L-システイン=10mM
細胞培養物における色形成を減少させるそれらの能力に関して、タウリン、ヒポタウリン、グリシン、チオクト酸及びビタミンCを個別及び組合せで評価した(表5-3)。
アフリベルセプト産生細胞株の種培養から、バイオリアクタ(例えば、2L)に播種した。35.5℃の温度、7.1±0.25のpH、22ccmのエアスパージ設定点で、播種した培養物を増殖させた。必要に応じて、グルコース、消泡剤及び基礎培地をバイオリアクタに補充した。CDM1を使用してアフリベルセプトタンパク質の産生を実施した(独自仕様)。CDM1(独自仕様)、CDM2(商業的に入手)、及びCDM3(商業的に入手)を使用して、アフリベルセプト融合タンパク質を発現する宿主細胞株の産生を実施した。追加の培地成分を含まないCDM1、CDM2及びCDM3を使用し、一連の実験を実施した。ガラクトシル化プロファイルを変更するため、マンガン(塩化マンガン四水和物、Sigma、3.2mg/L)、ガラクトース(Sigma、8g/L)、及びウリジン(Sigma、6g/L)をフィードに加えたCDM1~3を使用し、もう一つの一連の実験を実施した。最後に、ガラクトシル化プロファイルを変更するためにマンガン(塩化マンガン四水和物、Sigma、3.2mg/L)、ガラクトース(Sigma、8g/L)、及びウリジン(Sigma、6g/L)をフィードに加え、組成物のシアリル化プロファイルを変更するためにデキサメタゾン(Sigma、12mg/L)をフィードに加えたCDM1~3を使用し、一連の実験を実施した。遠心分離、次いで0.45μmのろ過により、それぞれのCDMを使用した清澄化された回収物を調製した。
これらの実施例を通して、特段明記しない限り、低pH及び段階溶出グラジエントで作動し280nmで検出するAgilent(Santa Clara,CA)1200シリーズ HPLC又はその同等物を用いて、アフリベルセプト力価を毎日測定した。参照標準の検量線に対し、濃度を割り当てた。
これらの実施例を通して、特段明記しない限り、Nova BioProfile Flex自動細胞計測器(Nova Biomedical,Waltham,MA)によるトリパンブルー排除法により、生存細胞密度(VCD)及び細胞生存率値を測定した。Nova BioProfile Flex(Nova Biomedical,Waltham,MA)を用いて、グルコース、乳酸塩、オフラインpH、溶存酸素(DO)、pCO2測定、及び浸透圧を測定した。
GlycoWorks Rapid Deglycosylation及びGlycoWorks RapiFluor-MSラベルキット(Waters部品番号186008939及び186008091のそれぞれ)を使用し、Waters GlycoWorksプロトコルに従い、N-グリカン分析のために、CDM1~3回収物からのおよそ15μgのプロテインA処理試料を調製した。50.5℃で5分間、PNGase-Fで試料を処理し、続いて25℃で5分間冷却することでアフリベルセプトタンパク質からN-グリカンを取り除いた。室温で5分間反応させることで、RapiFluor-MS蛍光色素により、放出されたグリカンを標識した。アセトニトリルを反応混合物に加えることでタンパク質を沈殿させ、2,204×gで10分間の遠心分離によりウェルの底にペレット化した。標識グリカンを含む上清を収集し、ポストカラム蛍光検出を伴う親水性相互作用液体クロマトグラフィー(Waters BEHアミドカラム)を使用してUPLCで分析した。カラムに結合させた後、標識グリカンを分離し、アセトニトリル及び50mMの水性ギ酸アンモニウム(pH4.4)から構成される二成分移動相グラジエントを使用して溶出させた。265nmの励起波長及び425nmの発光波長を用い、蛍光検出器を使用して標識グリカンを検出した。得られたクロマトグラムにおけるN-グリカンピークの相対的領域割合を使用し、(1)コアフコース残基を含有するN-グリカン(総フコシル化、表6-1)、(2)少なくとも1つのシアル酸残基を含有するN-グリカン(総シアリル化、表6-2)、(3)マンノース-5として同定されるN-グリカン(マンノース-5、表6-3)、(4)少なくとも1つのガラクトース残基を含有するN-グリカン(総ガラクトシル化、表6-4)、及び(5)公知の同一性のN-グリカン(同定された全ピーク、表6-5)の合計割合として、N-グリカン分布を報告した。
追加成分有り又は無しでのCDM1~3に関しての、生存細胞数(VCC)、生存率、及び回収物力価の結果を図29~31に示す。
7.1 VEGF MiniTrapの発現
組換えVEGF MiniTrapのコーディング領域(例えば、MT5、配列番号46)をシグナル配列に機能的に結合し、哺乳動物発現ベクターにクローニングして、チャイニーズハムスター卵巣(CHO-K1)細胞へと形質移入し、12日間にわたり400μg/mLのハイグロマイシンを用いて選択した後、安定的に形質移入されたプールを単離した。タンパク質不含合成培地にて増殖した、安定したCHO細胞プールを使用し、調査のためにタンパク質を産生した。組換えポリペプチドを細胞から増殖培地へと分泌させた。
・ヒト Flt1(アクセッション番号 NP_001153392.1)
・ヒト Flk1(アクセッション番号 NP_002244.1)
・ヒト Fc(IGHG1、アクセッション番号 P01857-1)
VEGF MiniTrap(MT5)に結合可能である5つの異なるタンパク質を評価した。使用されるタンパク質は、VEGF165(配列番号72)、mAb1(配列番号73が重鎖であり、配列番号74が軽鎖である、マウス抗VEGFR1 mAb ヒトIgG1)、mAb2(配列番号75が重鎖であり、配列番号76が軽鎖である、マウス抗VEGFR1 mAb ヒトIgG1)、mAb3(配列番号77が重鎖であり、配列番号78が軽鎖である、マウス抗VEGFR1 mAbマウス IgG1)、及びmAb4(配列番号79が重鎖であり、配列番号80が軽鎖である、マウス抗VEGFR1 mAb マウスIgG1)、を含む。
試料調製。MiniTrapのための2つの異なる生成プロセスを実施した。1つの場合において、それぞれのアフィニティーカラムを使用し、MiniTrap試料を有する材料を生成した。この場合、親材料(MiniTrap)を1倍のDPBSバッファで20mg/mLに希釈し、これをカラムに加え、室温で30分間含めた。アフィニティーカラムを使用し、MiniTrapを約7000ppmのHCPで単離した。
セクション7.3に述べられる方法に従い、カラム1及びカラム2を使用して複数回の運転を実行した(カラム1については表7-2及びカラム2については表7-3)。
3つのカラム(カラム1、カラム2、及びカラム3)からの溶出画分のSDS-PAGE分析を行った。非還元型及び還元型SDS-PAGE試料バッファ中で試料を調製し、1倍のMES(カタログ番号NP0322、Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用し、4~12%勾配のNuPage bis-トリスゲルで運転を実行した。
CHO HCP ELISAキット、3G(F550)(Cygus Technologies)を使用し、宿主細胞タンパク質の濃度の標準曲線を得た(図32及び表7-4)。図32に示される標準曲線及び表7-4に列挙した曲線式を使用し、負荷溶液及び溶出画分中のHCPの量を計算した。
3つのカラム(カラム1~3)からの溶出画分のSECプロファイルを、負荷溶液中のMiniTrapのSECプロファイルと比較した。図36及び表7-5にて確認されるように、アフィニティー生成前後のMT5のSECプロファイルは非常に類似していた。
Biacore T200機器を使用して、動態調査を実施した。
7.3に示されるように、カラム1(hVEGF165)及びカラム2(mAb1)を使用して、工程7.1により得られるような回収物のクロマトグラフィー生成を実施した。カラムを、複数のクロマトグラフィーサイクルに使用した。カラムの収率は、追加の運転により有意に変化することはなかった。これは、カラムが結合能力を保持していたことを示唆している(表7-7)。
カラム1(VEGF165)及びカラム2(mAb1)を使用して、セクション7.1にて得られるような回収物質のクロマトグラフィー生成を実施した。最適化調査のため、10mgの代わりに14mg又は45mgのVEGF165又は抗VEGF R1 mAbを2つのHiTrap NHS活性化HPアフィニティーカラム(1mL、GE Healthcare)に負荷し、カラムを閉鎖して室温で30分間カップリングさせた。上の7.2及び7.3に述べられるように、カラム調製及びMiniTrapを含む回収物の生成を実行した。洗浄画分及び溶出画分中のMT5の量を表7-8に示す。10mgと比較した、14mg又は45mgのアフィニティーカラム(VEGF165又は抗VEGF R1 mAb(mAb1))結合量は、両方のカラムからのMiniTrapの収率の増加を示す。したがって、タンパク質対カラム比を最適化することにより、又はpH、インキュベーション時間、インキュベーション温度等を変更することによって結合効率を増加させることにより、概説した方法を使用したカラム収率を向上させることができる。
上のセクション7.3にて述べたように、カラム1を使用してMT5発現からの細胞培養物試料を生成した。得られた溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)カラム(HiTrap Capto S、1mL)に供した。カラムの操作条件を表7-9に示す。
他の抗VEGFタンパク質を生成する能力を調査するため、カラム1を評価した。この調査のため、アフリベルセプト及びVEGF結合能力を有するscFv断片を使用した。セクション7.3に述べられるように、生成プロセスを実施した。表7-10は、カラム1が、他の抗VEGFタンパク質の結合及び溶出に成功したことを実証している。
材料。実施例1にて説明されるように、アフリベルセプトからVEGF MiniTrap(MT1)を生成した。実施例7にて説明されるように、VEGF MiniTrap5(MT5)を生成した。組換えVEGF MiniTrapのコーディング領域(MT5)をシグナル配列に機能的に結合し、哺乳動物の発現ベクターにクローニングして、チャイニーズハムスター卵巣(CHO-K1)細胞へと形質移入し、12日間にわたり400μg/mLのハイグロマイシンを用いて選択した後、安定的に形質移入されたプールを単離するといった方法によりVEGF MiniTrap(MT6)を生成した。分析用のタンパク質を生成するため、CDM中で増殖させた安定したCHO細胞プールを使用した。
MT1、MT2及びMT3の清澄化された回収物からの試料を、1%(w/v)のRG界面活性剤(RapiGest SF、Waters,Milford,MA)及び50mMのHEPES(pH7.9)の28.8μLの溶液に入れ、0.52mg/mLの濃度に希釈又は再構成した。これらの溶液を約95℃で2分間にわたり加熱し、50℃まで冷却させて、1.2μLのPNGase F溶液(GlycoWorks Rapid PNGase F、Waters,Milford,MA)と混合した。50℃で5分間、試料をインキュベートすることにより脱グリコシル化を完了させた。
蛍光と質量分析検出とを組み合わせたHILIC分離により、MT1を分析した。MT2及びMT3をHILICのみを使用して分析した。フォトダイオードアレイ及び蛍光(FLR)検出器を搭載し、Waters Synapt G2-S質量分析計(MS条件)をインターフェース接続したWaters 2D Acquity UPLCを使用してクロマトグラフィーを実施した。Waters UPLCグリカンBEHアミドカラム(150×2.1mm、1.7μm)を用いて、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)モードの分離を使用した。カラム温度を60℃に設定し、オートサンプラー温度を5℃に設定した。注入量は50μLであった。フォトダイオードアレイスキャン範囲は190~700nmであった。FLRを、RapiFluor標識グリカンについては励起265nm、発光425nm、糖ペプチド中に存在するチロシンについては励起274nm、及び発光303nmに設定した。初期流速は0.4mL/分であり、移動相Aは100mMのギ酸アンモニウム(pH4.4)からなり、移動相Bはアセトニトリルであった。
Waters Synapt G2-S質量分析計を使用し、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)実験を実施した。スキャン範囲は、正イオンモード分析及び負イオンモード分析について、質量対電荷比100~2400であった。スキャン時間は1秒であり、glu-フィブリノペプチドBを校正物(「ロックマス」)として一定に注入(2μL/分)した。120℃のソース温度、500℃の脱溶媒和温度でキャピラリー電圧を2.5kVに設定した。窒素ネブライザガスフローを700L/時間に設定した。
すべてのオンラインSEC-MS分析のため、ACQUITY UPLC I クラスシステム(Waters、Milford,MA)を、Q Exactive HFハイブリッド四重極Orbitrap質量分析計(Thermo Scientific、Bremen,Germany)に連結した。ACQUITY UPLC Protein BEH SECカラム(200Å、1.7μm、4.6×300mm)を30℃に設定し、タンパク質分離のためにこれを使用した。移動相はpH6.8である100mMの酢酸アンモニウムであった。各分離は0.3mL/分の流速で30分間行い、注入量を40μgに設定した。オンラインSEC-ナノ-ESI-MSデータ取得のため、以下のMSパラメータを使用した。各取得は、試料注入直後に開始して25分であった。3kVのスプレー電圧、200℃のキャピラリー温度、及び70S-レンズのRFレベルであるポジティブモードにて、脱グリコシル化された試料をイオン化した。インソースCIDを75eVに設定した。2000~8000のm/zの質量範囲を有する15Kの分解能にて、フルMSスキャンを得た。フルMSスキャンのため、100msの最大注入時間、3e6の自動ゲインコントロール目標値、10マイクロスキャンを使用した。
ペプチドマッピングのための試料調製。5mmol/Lの最終濃度まで500mmol/Lのジチオトレイトール(DTT)を加え、続いて4℃で60分間インキュベートすることにより還元を達成した。10mmol/Lの最終濃度まで500mmol/Lのヨードアセトアミド(IAM)を加え、4℃で60分間、暗所でインキュベートすることによりアルキル化を実施した。Zeba(商標)Spin 7K MWCOサイズ排除脱塩カラム(P/N89882)(Thermo Scientific、Waltham,MA)を製造業者の指示に従って使用し、変性バッファを消化バッファ(0.1mol/Lのトリス中、1mol/Lの尿素、pH7.8)と交換した。(バッファ交換後、紫外可視分光法により測定されるVEGF MiniTrapタンパク質濃度に基づき)1:18(酵素:試料)の質量比で組換えブタトリプシン(Sigmaから購入、カタログ番号03708985001)を加えた。VEGF MiniTrapタンパク質の濃度を0.5μg/μLに調整し、室温で4時間のインキュベーション中に消化を進行させた。消化が完了したときに、LC-MSグレードの水中0.1%ギ酸を1:1の体積比で加えた。分析まで、-80℃で消化物を保管した。
VEGF MiniTrap構築物の構造。VEGF MiniTrap MT1、MT5及びMT6の構造を図40、図41、図43及び図44に示す。
下線をつけたセリン残基はグリコシル化されている)上に位置づけられるセリン残基で見られる。O-グリカンの組成を表8-13に示す。
(A)最適化されていないCDM(対照バイオリアクタ)
実施例5に説明されるMiniTrapの製造を利用した。
・8~9mMの累積濃度にてシステインを加えた。
・出発培地中の金属は、1倍濃度にて以下に列挙される(濃度は種菌の追加前のものである):
- Fe=培養物1リットルあたり68~83マイクロモル
- Zn=培養物1リットルあたり6~7マイクロモル
- Cu=培養物1リットルあたり0.1~0.2マイクロモル
- Ni=培養物1リットルあたり0.5~1マイクロモル
以下のプロトコルを使用し、システイン濃度の低下、金属濃度の低下、及び抗酸化剤の増加の、呈色に対する効果を評価した:
- 5~6mMの累積濃度にてシステインを加えた
・以下の累積濃度に到達するようにCDM1に抗酸化剤を加えた(濃度は種菌追加の前のものである):
- タウリン=培養物中10mM
- グリシン=培養物中10mM
- チオクト酸=培養物中0.0024mM
- ビタミンC(アスコルビン酸)=培養物中0.028mM
・出発培地中の金属を1倍レベルで以下に列挙する。
- Fe=培養物1リットルあたり68~83マイクロモル
- Zn=培養物1リットルあたり6~7マイクロモル
- Cu=培養物1リットルあたり0.1~0.2マイクロモル
- Ni=培養物1リットルあたり0.5~1マイクロモル
- 含まれるすべての金属の低減は、培地に関して、上に記載されたものの0.25倍濃度を使用
例示的に列挙された以下の例は、限定を意図するものではなく、当業者により理解される本願明細書に基づき、CDM及びタンパク質バリアントや黄褐色を増減させるための改変条件を用いてアフリベルセプト及びVEGF MiniTrapを含む抗VEGF組成物を産生するための追加のバリエーションが、本願明細書に沿って実施され得ることが理解されるであろう。
1.合成培地(CDM)中で培養された細胞の清澄化された回収物からアフリベルセプトを精製する方法であって、
(a)前記アフリベルセプトと結合可能なポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、前記清澄化された回収物からのアフリベルセプトを結合させる工程であって、前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、リガンド、ScFv、又はこれらの断片である、結合させる工程と、
(b)工程(a)の前記アフリベルセプトを溶出して、前記アフリベルセプトを、そのFcドメインを除去するために酵素的切断に供し、それによってMiniTrap溶出液を形成する工程と、
任意選択で、
(c)前記溶出したMiniTrapを第2クロマトグラフィー捕捉工程に供する工程と、
(d)工程(c)の第2クロマトグラフィーを洗浄する工程であって、前記MiniTrapがフロースルー画分中に回収される、洗浄する工程と
を含む、方法。
2.前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
3.平衡化バッファを使用して(a)の前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
4.前記平衡化バッファが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はトリス塩酸である、請求項3に記載の方法。
5.前記平衡化バッファが約8.3~約8.6のpHを有する、請求項4に記載の方法。
6.1つ以上のフロースルー画分を得るために、平衡化バッファを用いてカラム(d)を洗浄する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
7.前記平衡化バッファがダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水であり、約7.0~約8.6のpHを有する、請求項6に記載の方法。
8.1つ以上の溶出画分を得るために、(a)のカラムを溶出液で1回以上洗浄する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
9.前記溶出バッファが、約2.5のpHを有する100mMのグリシンバッファを含む、請求項8に記載の方法。
10.前記溶出バッファのpHが、約2.0~約3.5である、請求項8に記載の方法。
11.中和バッファの追加により、前記溶出画分を中和する工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
12.前記中和バッファがトリス塩酸である、請求項11に記載の方法。
13.(c)における宿主細胞タンパク質の量が、前記清澄化された回収物中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約90%、約95%、約98%、又は約99%だけ著しく減少する、請求項1に記載の方法。
14.(d)の前記第2捕捉クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)を含む、請求項1に記載の方法。
15.前記AEXカラム用の前記平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度が、約1.50~約3.0mS/cmであり得る、請求項14に記載の方法。
16.(d)の前記1つ以上のフロースルー画分からのMiniTrapが、20%未満のMiniTrapの総酸性種を含み、酸性種が、MiniTrapの強陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)クロマトグラムにおけるメインピークよりも早く溶出するピークに対応しており、クロマトグラムが、20mMの2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)(pH5.7)の第1移動相、及び40mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム(pH9.0)(移動相B)の第2移動相を使用して生成され、クロマトグラムが280nmでの検出を使用して生成される、請求項14に記載の方法。
17.MiniTrapを産生する方法であって、
(a)アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程と、
(b)前記アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記宿主細胞を培養する工程と、
(c)アフリベルセプトと前記宿主細胞により産生された少なくとも1つの不純物とを含む調製物を回収する工程と、
(d)好適な条件の下で、前記調製物をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含む、供する工程と、
(e)前記アフリベルセプトを、そのFcドメインを除去するために酵素的切断に供し、それによってMiniTrapを形成する工程と
を含む、方法。
18.前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、リガンド、ScFv、又はこれらの断片である、請求項17に記載の方法。
19.前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
20.平衡化バッファを使用して前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、請求項17に記載の方法。
21.1つ以上のフロースルー画分を得るために、前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化バッファを用いて洗浄する工程を更に含む、請求項17に記載の方法。
22.1つ以上の溶出画分を得るために、前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを溶出バッファで1回以上洗浄する工程を更に含む、請求項17に記載の方法。
23.前記溶出バッファのpHが、約2.0~約4.0である、請求項22に記載の方法。
24.前記溶出バッファが、約2.5のpHを有する100mMのグリシンバッファを含む、請求項22に記載の方法。
25.中和バッファの追加により、前記1つ以上の溶出画分を中和する工程を更に含む、請求項22に記載の方法。
26.抗VEGFタンパク質を精製する方法であって、前記抗VEGFタンパク質を含む試料を、好適な条件の下でアフィニティークロマトグラフィーに供する工程を含み、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記抗VEGFタンパク質と結合又は相互作用可能であるポリペプチドを含む、方法。
27.(a)平衡化バッファを使用して前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程と、
(b)平衡化バッファを用いて前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを1回以上洗浄する工程と、
(c)1つ以上の溶出画分を得るために、前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを溶出バッファで1回以上洗浄する工程と、
(d)中和バッファの追加により、前記1つ以上の溶出画分を中和する工程と
を更に含む、請求項26に記載の方法。
28.前記溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量が、前記試料中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約90%、約95%、約98%、又は約99%だけ著しく減少する、請求項27に記載の方法。
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、TNYLTH*R(配列番号21)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(配列番号22)、VH*EKDK(配列番号23)、SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(配列番号64)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(配列番号65)、TQSGSEM*K(配列番号66)、SDQGLYTC*AASSGLM*TK(配列番号67)、IIW*DSR(配列番号28)、RIIW*DSR(配列番号115)、IIW*DSRK(配列番号114)、TELNVGIDFNW*EYPSSK(配列番号29)、GFIISNATY*K(配列番号69)、KF*PLDTLIPDGK(配列番号70)F*LSTLTIDGVTR(配列番号32)
からなる群から1つ以上を含み、この場合、H*はヒスチジンであり2-オキソ-ヒスチジンに酸化され、C*はシステインでありカルボキシメチル化され、M*は酸化メチオニンであり、W*は酸化トリプトファンであり、Y*は酸化チロシンであり、F*は酸化フェニルアラニンである。消化は、ここまでに言及されたプロテアーゼにより、例えばトリプシンにより実施され得る。オリゴペプチドは質量分析法を使用して分析され得る。
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、TNYLTH*R(配列番号21)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(配列番号22)、VH*EKDK(配列番号23)、SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(配列番号64)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(配列番号65)、TQSGSEM*K(配列番号66)、SDQGLYTC*AASSGLM*TK(配列番号67)、IIW*DSR(配列番号28)、RIIW*DSR(配列番号115)、IIW*DSRK(配列番号114)、TELNVGIDFNW*EYPSSK(配列番号29)、GFIISNATY*K(配列番号69)、KF*PLDTLIPDGK(配列番号70)F*LSTLTIDGVTR(配列番号32)
からなる群から選択される1つ以上の修飾オリゴペプチドを含み、この場合、H*はヒスチジンであり2-オキソ-ヒスチジンに酸化され、C*はシステインでありカルボキシメチル化され、M*は酸化メチオニンであり、W*は酸化トリプトファンであり、Y*は酸化チロシンであり、F*は酸化フェニルアラニンである。消化は、ここまでに言及されたプロテアーゼにより、例えばトリプシンにより実施され得る。オリゴペプチドは質量分析法を使用して分析され得る。
アフリベルセプトを産生する方法であって、
(a)合成培地(CDM)中で培養された細胞の清澄化された回収物を産生する工程と、
(b)前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、前記清澄化された回収物からのアフリベルセプトを結合させる工程であって、前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、ScFv、又はこれらの断片である、結合させる工程と、
(c)アフィニティー溶出液を形成する、工程(b)の前記アフリベルセプトを溶出する工程と、
任意選択で、
(d)(c)の前記溶出したアフリベルセプトを第2クロマトグラフィー捕捉工程に供する工程と、
(e)フロースルー画分を収集する工程であって、前記フロースルー画分がアフリベルセプトを有する、収集する工程と
を含む、方法。
[本発明1002]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
平衡化バッファを使用して(b)の前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記平衡化バッファが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はトリス塩酸である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記平衡化バッファが約8.3~約8.6のpHを有する、本発明1004の方法。
[本発明1006]
1つ以上のフロースルー画分を得るために、平衡化バッファを用いてカラム(d)を洗浄する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記平衡化バッファがダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水であり、約7.0~約8.6のpHを有する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
1つ以上の溶出画分を得るために、(b)のカラムを溶出バッファに供する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記溶出バッファが、約2.5のpHを有する100mMのグリシンバッファを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記溶出バッファのpHが、約2.0~約3.5である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
中和バッファの追加により、前記溶出画分を中和する工程を更に含む、本発明1008の方法。
[本発明1012]
前記中和バッファがトリス塩酸である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
(c)における宿主細胞タンパク質の量が、前記清澄化された回収物中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約90%、約95%、約98%、又は約99%だけ著しく減少する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
(d)の前記第2捕捉クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記AEXカラム用の前記平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度が、約1.50~約3.0mS/cmであり得る、本発明1014の方法。
[本発明1016]
(e)の前記1つ以上のフロースルー画分からのアフリベルセプトが、20%未満のアフリベルセプトの総酸性種を含み、酸性種が、アフリベルセプトの陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)クロマトグラムにおけるメインピークよりも早く溶出するピークに対応しており、クロマトグラムが、20mMの2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)(pH5.7)の第1移動相、及び40mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム(pH9.0)(移動相B)の第2移動相を使用して生成され、クロマトグラムが280nmでの検出を使用して生成される、本発明1014の方法。
[本発明1017]
アフリベルセプトを産生する方法であって、
(a)アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程と、
(b)前記アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記宿主細胞を培養する工程と、
(c)アフリベルセプトと前記宿主細胞により産生された少なくとも1つの不純物とを含む調製物を回収する工程と、
(d)好適な条件の下で、前記調製物をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含む、供する工程と
を含む、方法。
[本発明1018]
前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、ScFv、又はこれらの断片である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号73から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号74から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号75から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1024]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号76から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1025]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号77から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1026]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号78から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1027]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号79から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1028]
前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1029]
前記溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量が、(c)における宿主細胞タンパク質の量と比較して約90%、約95%、約98%、又は約99%だけ著しく減少する、本発明1017の方法。
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と合わせて考えると、よりよく認識され、かつよりよく理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態及びそれらの多数の特定の詳細部分を示すが、例示として与えられており限定するものではない。本発明の範囲内で、多くの置換、修正、追加、又は再配置を行うことができる。
・((R1D2)-(R2D3))a-リンカー-((R1D2)-(R2D3))b;
・((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-リンカー-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d;
・((R1D2)-(R2D3))e-(MC)g;
・((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f-(MC)g;
式中、
- R1D2は、VEGF受容体1(VEGFR1)Igドメイン2(D2)であり;
- R2D3は、VEGFR2 Igドメイン3であり;
- R2D4は、VEGFR2 Igドメイン4であり;
- MCは多量体化成分(例えばIgG1に由来する、例えばIgGヒンジドメイン又はそれらの断片)であり;
- リンカーは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16アミノ酸を含むペプチドであり、例えば(GGGS)(配列番号104)であり;
並びに、
独立して、
a=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
b=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
c=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
d=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
e=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;
f=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15;及び
g=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15。
を含む。述べられるように、こうしたポリペプチドは多量体化されることができ(例えば、二量体化(例えば、ホモ二量体化))、この場合、ポリペプチド間の結合は多量体化成分を介して媒介される。
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)3-(R1D2)1-(R2D3)1 (「(G 4 S) 3 」:配列番号107として開示される);
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)6-(R1D2)1-(R2D3)1 (「(G 4 S) 6 」:配列番号108として開示される);
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)9-(R1D2)1-(R2D3)1 (「(G 4 S) 9 」:配列番号109として開示される);又は
・(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)12-(R1D2)1-(R2D3)1 (「(G 4 S) 12 」:配列番号110として開示される)
を含む。G4Sは、-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号111)である。
(この場合、xは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15である)を含む。本明細書にて述べられるように、これらのポリペプチドは二次構造を含むことができ、この場合、同様のVEGER Igドメインは鎖内VEGF結合ドメインを形成するように結合する(例えば、図2)。本発明の一実施形態において、こうしたポリペプチドの2つ以上は多量体化し(例えば、二量体化(例えば、ホモ二量体化))し、この場合、各鎖のVEGFR Igドメインは、鎖内VEGF結合ドメインを形成するために別の鎖の同様のIgドメインと結合する。
(i)当該R1D2ドメイン同士が整列して、
(ii)当該R2D3ドメイン同士が整列して、及び/又は
(iii)当該R2D4ドメイン同士が整列して、
VEGF結合ドメインを形成する。図2は、そのようなドメイン配置を示す一本鎖VEGF MiniTrapを示す。VEGFR1、VEGFR2、及びリンカードメインが示される。示されるリンカーは(G4S)6 (配列番号108)である。本発明は、(G4S)3 (配列番号107);(G4S)9 (配列番号109);又は(G4S)12 (配列番号110)リンカーを有する一本鎖VEGF MiniTrapを含む。
(配列番号55)として記載されるアミノ酸配列を含む。
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、EIGLLTC*EATVNGH*LYK(配列番号18)、QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、TNYLTH*R(配列番号21)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(配列番号22)、VH*EKDK(配列番号23)、SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(配列番号64)、SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(配列番号65)、TQSGSEM*K(配列番号66)、SDQGLYTC*AASSGLM*TK(配列番号67)、IIW*DSR(配列番号28)、RIIW*DSR(配列番号115)、IIW*DSRK(配列番号114)、TELNVGIDFNW*EYPSSK(配列番号29)、GFIISNATY*K(配列番号69)、KF*PLDTLIPDGK(配列番号70)F*LSTLTIDGVTR(配列番号32)
からなる群から選択され、ここで、H*はヒスチジンであり2-オキソ-ヒスチジンに酸化され、C*はシステインでありカルボキシメチル化され、M*は酸化メチオニンであり、W*は酸化トリプトファンであり、Y*は酸化チロシンであり、F*は酸化フェニルアラニンである。更なる態様において、抗VEGF組成物は、例えば約30時間といった一定期間にわたり、抗VEGF組成物を冷白色光に曝露することにより1種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約1.5~約10倍の増加を含むことができる。別の態様において、抗VEGF組成物は、約75時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより1種以上の修飾オリゴペプチドにおいて約1.5~約10倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗VEGF組成物は、約100時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、前に説明される1種以上のオリゴペプチドにおいて約1.5~約20倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗VEGF組成物は、約150時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、前に説明される1種以上のオリゴペプチドにおいて約1.5~約20倍の増加を含むことができる。更に別の態様において、抗VEGF組成物は、約300時間にわたり、試料を冷白色光に曝露することにより、1種以上のオリゴペプチドにおいて約1.5~約50倍の増加を含むことができる(以下実施例4を参照されたい)。
MT1及びMT4に関するトリプシンペプチドマップを比較した際に、MT1におけるPTMを観察した(図12Aは20.0~75分に溶出されたペプチドの吸光度を示している)。様々なUVピークを有するペプチドが強調されている。クロマトグラムの拡大図を図12Bに示し、これは16~30分に溶出したペプチドの吸光度を示している。MT1とMT4との間のUV吸光度で著しく対照的であるペプチドは、TNYLTH*R(配列番号21)、IIW(+4)DSR(配列番号28)及びIIIW(+132)DSR(配列番号124)であった(*又は下線は残基の酸化を表す)。更に、クロマトグラムの拡大図を図12Cに示し、これは30~75分に溶出したペプチドの吸光度を示している。MT1とMT4との間のUV吸光度で著しく対照的であるペプチドは、DKTH*TC*PPC*PAPELLG(配列番号17)、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(配列番号20)、EIGLLTCEATVNGH*LYK(配列番号18)及びQTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)であった(*は残基の酸化を表す)。ペプチドマッピングにより、VEGF MiniTrap間で存在量において有意に異なるペプチドの同一性が明らかとなった。ペプチドマッピング分析から同定されたペプチドの相対的な存在量を表3-1に示す。MT1(CDM中で産生)中の2-オキソ-ヒスチジンの量は、MT4(ダイズ加水分解物中で産生)より高かった。これは、アフリベルセプトを発現するために使用された培地が、酸化ヒスチジン又は酸化トリプトファンを有するペプチドの相対的な存在量に有意な影響を有し得ることを示唆している。例えば、ペプチドQTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(配列番号19)に関しては、MT1(CDM中で産生)中のペプチドの相対的な存在量のパーセントは、MT4(ダイズ加水分解物中で産生;MT1と比較すると約15分の1)中のペプチドの相対的な存在量のパーセントと比較して0.015パーセントであった。
Claims (29)
- アフリベルセプトを産生する方法であって、
(a)合成培地(CDM)中で培養された細胞の清澄化された回収物を産生する工程と、
(b)前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、前記清澄化された回収物からのアフリベルセプトを結合させる工程であって、前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、ScFv、又はこれらの断片である、結合させる工程と、
(c)アフィニティー溶出液を形成する、工程(b)の前記アフリベルセプトを溶出する工程と、
任意選択で、
(d)(c)の前記溶出したアフリベルセプトを第2クロマトグラフィー捕捉工程に供する工程と、
(e)フロースルー画分を収集する工程であって、前記フロースルー画分がアフリベルセプトを有する、収集する工程と
を含む、方法。 - 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 平衡化バッファを使用して(b)の前記アフィニティークロマトグラフィーカラムを平衡化する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記平衡化バッファが、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はトリス塩酸である、請求項3に記載の方法。
- 前記平衡化バッファが約8.3~約8.6のpHを有する、請求項4に記載の方法。
- 1つ以上のフロースルー画分を得るために、平衡化バッファを用いてカラム(d)を洗浄する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記平衡化バッファがダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水であり、約7.0~約8.6のpHを有する、請求項6に記載の方法。
- 1つ以上の溶出画分を得るために、(b)のカラムを溶出バッファに供する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出バッファが、約2.5のpHを有する100mMのグリシンバッファを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記溶出バッファのpHが、約2.0~約3.5である、請求項8に記載の方法。
- 中和バッファの追加により、前記溶出画分を中和する工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
- 前記中和バッファがトリス塩酸である、請求項11に記載の方法。
- (c)における宿主細胞タンパク質の量が、前記清澄化された回収物中の宿主細胞タンパク質の量と比較して約90%、約95%、約98%、又は約99%だけ著しく減少する、請求項1に記載の方法。
- (d)の前記第2捕捉クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィー(AEX)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記AEXカラム用の前記平衡化バッファ及び洗浄バッファの両方の伝導度が、約1.50~約3.0mS/cmであり得る、請求項14に記載の方法。
- (e)の前記1つ以上のフロースルー画分からのアフリベルセプトが、20%未満のアフリベルセプトの総酸性種を含み、酸性種が、アフリベルセプトの陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)クロマトグラムにおけるメインピークよりも早く溶出するピークに対応しており、クロマトグラムが、20mMの2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)(pH5.7)の第1移動相、及び40mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム(pH9.0)(移動相B)の第2移動相を使用して生成され、クロマトグラムが280nmでの検出を使用して生成される、請求項14に記載の方法。
- アフリベルセプトを産生する方法であって、
(a)アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された宿主細胞を提供する工程と、
(b)前記アフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記宿主細胞を培養する工程と、
(c)アフリベルセプトと前記宿主細胞により産生された少なくとも1つの不純物とを含む調製物を回収する工程と、
(d)好適な条件の下で、前記調製物をアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、前記アフィニティークロマトグラフィーが、前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能なポリペプチドを含む、供する工程と
を含む、方法。 - 前記アフリベルセプトと結合可能な前記ポリペプチドが、抗体、融合タンパク質、ScFv、又はこれらの断片である、請求項17に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、及び配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号72から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号73から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号74から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号75から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号76から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号77から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号78から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号79から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記アフリベルセプトと結合又は相互作用可能な前記ポリペプチドが、配列番号80から選択される単離されたアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記溶出画分中の宿主細胞タンパク質の量が、(c)における宿主細胞タンパク質の量と比較して約90%、約95%、約98%、又は約99%だけ著しく減少する、請求項17に記載の方法。
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