KR20220035393A - 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법 - Google Patents

항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220035393A
KR20220035393A KR1020227002042A KR20227002042A KR20220035393A KR 20220035393 A KR20220035393 A KR 20220035393A KR 1020227002042 A KR1020227002042 A KR 1020227002042A KR 20227002042 A KR20227002042 A KR 20227002042A KR 20220035393 A KR20220035393 A KR 20220035393A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
protein
vegf
cells
aflibercept
Prior art date
Application number
KR1020227002042A
Other languages
English (en)
Inventor
매튜 프랭클린
Original Assignee
리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=76210828&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20220035393(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. filed Critical 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority to KR1020237036668A priority Critical patent/KR20230152810A/ko
Publication of KR20220035393A publication Critical patent/KR20220035393A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0031—Serum-free culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21004—Trypsin (3.4.21.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/80—Fraction collectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

본 개시내용은 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물 및 이러한 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-VEGF 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 서열 목록을 포함한다. 2020년 8월 13일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 070816-02351_SL.txt이며, 크기는 134,385 바이트이다.
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 8월 13일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/065,012호의 우선권 및 이익을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 항-VEGF 조성물 및 이를 생산하는 방법에 관한 것이다.
단백질-기반 생물약제학적 조성물은 연구, 안과 질환, 암, 자가면역 질환, 감염뿐만 아니라 기타 질환 및 장애의 치료를 위한 중요한 제품으로 부상하고 있다. 바이오의약품은 제약 산업에서 가장 빠르게 성장하고 있는 제품 부문 중 하나이다.
혈관 내피 세포에 대한 선택성을 갖는 세포-유래 이량체 마이토겐의 한 종류가 확인되었으며, 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial cell growth factor: VEGF)로 명명되었다.
지속적인 혈관신생은 건선, 류마티스성 관절염, 혈관종, 혈관섬유종, 당뇨병성 망막병증 및 혈관신생성 녹내장과 같은 소정의 질환을 유발하거나 또는 악화시킬 수 있다. VEGF 활성의 저해제는 이러한 질환 및 기타 VEGF-유도성 병리학적 혈관신생 및 혈관 투과성 병태, 예컨대, 종양 혈관화에 대한 치료제로서 유용할 것이다. 안지오포이에틴 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 패밀리의 구성원은 혈관 내피 세포에 대체로 특이적인 것으로 생각되는 유일한 성장 인자이다.
여러 눈 장애가 병리학적 혈관신생과 관련이 있다. 예를 들어, 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD)의 발병은 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization: CNV)이라는 과정과 관련이 있다. CNV로부터의 누출은 황반부종 및 황반 아래 체액의 저류를 유발하여 시력 상실을 초래한다. 당뇨병성 황반부종(Diabetic macular edema: DME)은 혈관형성 성분이 있는 또 다른 눈 장애이다. DME는 당뇨병 환자에서 중등도 시력 상실의 가장 흔한 원인이며, 망막의 혈관에 영향을 미치는 질환인 당뇨병성 망막병증의 흔한 합병증이다. 임상적으로 중요한 DME는 선명하고 직접적인 시력을 담당하는 망막의 빛에 민감한 부분인 황반의 중심으로 액체가 누출될 때 발생한다. 황반의 액체는 심각한 시력 상실 또는 실명을 유발할 수 있다.
VEGF 트랩 Eylea(애플리버셉트(aflibercept))와 같은 다양한 VEGF 저해제가 이러한 눈 장애를 치료하도록 승인되었다.
본 발명은 융합 단백질인 VEGF trap 단백질 애플리버셉트를 비롯한 항-VEGF 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 새로운 항-VEGF 단백질인 애플리버셉트 MiniTrap 또는 VEGF MiniTrap(달리 언급되지 않는 한 총칭하여 MiniTrap이라 함)에 관한 것이다. 관심 있는 단백질을 생산하기 위한 효율적이고 효과적인 수단을 제공하는 생산 양식을 포함하는, 이러한 항-VEGF 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 일 양태에서, 본 발명은 항-VEGF 단백질을 생산하기 위한 화학적으로 정의된 배지(chemically defined media: CDM)의 용도에 관한 것이다. 특정 양태에서, 관심 있는 CDM은 사용될 때 샘플이 황갈색 색상을 띠며 산화된 종을 포함할 수 있는 단백질 샘플을 생성하는 것들이다. 본 발명에서 추가로, 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질의 변이체가 수반되는 생산 방법이 함께 개시된다.
애플리버셉트의 생산
본 개시내용은 세포 배양 배지를 사용한 애플리버셉트의 생산을 설명한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 정의된 배지("CDM")이다. CDM은 동물-유래 성분이 없는 무단백질의 화학적으로-정의된 조성이며, 배지의 구성이 확실하기 때문에 자주 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 대두 가수분해물 배지이다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질을 생산하는 방법은 (a) 관심 있는 재조합 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 세포가 관심 있는 재조합 단백질을 발현하기에 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 항-VEGF 단백질이다. 특정 양태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트 및 재조합 MiniTrap(이의 예는 미국 특허 제7,279,159호에 개시되어 있음), 애플리버셉트 scFv 및 기타 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 애플리버셉트이다.
본 실시형태의 일 양태에서, 애플리버셉트는 적합한 숙주 세포에서 발현된다. 이러한 숙주-세포의 비제한적인 예는 CHO, CHO K1, EESYR®, NICE®, NS0, Sp2/0, 배아 신장 세포 및 BHK를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 CDM은 둘베코 변형 이글(Dulbecco's Modified Eagle's: DME) 배지, 함스 영양 혼합물(Ham's Nutrient Mixture), Excell 배지 및 IS CHO-CD 배지를 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 CDM도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다. 특정 양태에서, 적합한 CDM은 CDM1B(리제네론(Regeneron)) 또는 Excell 강화 배지(Excell Advanced Medium: SAFC)이다.
일 실시형태에서, 애플리버셉트를 포함하는 CDM 배양물로부터의 정화된 수확 샘플은 포획 크로마토그래피 절차에 적용된다. 일 양태에서, 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 추가의 양태에서, 친화성 절차의 용리액은 소정의 색상을 나타내며, 예를 들어, 용리액은 황갈색 색상을 나타낼 수 있다. 아래에 더 자세히 설명되는 바와 같이, 색상은 (i) 정성적 육안 검사가 수행되는 유럽 색상 표준 "BY" 또는 (ii) BY 시스템보다 더 정량적인, 비색 검정, CIE L*, a*, b*(또는 CIELAB)를 사용하여 평가될 수 있다. 그러나, 두 경우 모두, 여러 샘플 간의 색상 평가는 의미 있는 평가를 보장하기 위해 단백질 농도로 정규화되어야 한다. 예를 들어, 하기 실시예 9를 참조하면, 단백질 용리액은 대략 BY5의 BY 값에 상응하는 약 2.52의 "b*" 값을 갖는다(단백질 용리액에서 5 g/ℓ의 단백질의 농도로 측정될 때). 단백질 용리액의 색상을 또 다른 샘플과 비교하려면, 동일한 단백질 농도에 대해 비교가 이루어져야 한다. CIELAB 색 공간의 b* 값은 샘플의 착색을 나타내는데 사용되며, 청색(-)에서 황색(+)까지를 커버한다. b* 값이 높을수록 다른 샘플에 비해 샘플의 황갈색 착색이 더 강함을 나타낸다.
일 실시형태에서, 애플리버셉트는 CDM을 사용하여 애플리버셉트를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포로부터 생산된다. 일 양태에서, 애플리버셉트의 다른 종 또는 변이체도 또한 생산된다. 이러한 변이체는 옥소-변이체로 집합적으로 지칭되는 하나 이상의 산화된 아미노산 잔기를 포함하는 애플리버셉트 아이소형을 포함한다. 애플리버셉트뿐만 아니라 이의 옥소-변이체를 포함하는 CDM을 사용하여 생산된 정화된 수확 샘플은 포획 크로마토그래피 절차를 거칠 수 있다. 일 양태에서, 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 황갈색 색상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있는 친화성 용리액으로부터 추출된 샘플이, 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 애플리버셉트의 하나 이상의 산화된 변이체가 검출될 수 있다. 변형된 애플리버셉트의 소정의 아미노산 잔기는 히스티딘 및/또는 트립토판 잔기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 산화되는 것으로 나타난다. 일 양태에서, 변이체는 하나 이상의 메티오닌 잔기뿐만 아니라 다른 잔기의 산화를 포함할 수 있다(하기 참조).
또 다른 양태에서, 변이체는 N-폼일카이누레닌을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 변이체는 모노-하이드록실 트립토판을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 단백질 변이체는 다이-하이드록실 트립토판을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 단백질 변이체는 트라이-하이드록실 트립토판을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 변이체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다: 예를 들어, 하나 이상의 아스파라긴의 탈아마이드화; 아이소-아스파테이트 및/또는 Asn으로 전환되는 하나 이상의 아스파르트산; 하나 이상의 메티오닌의 산화; 하나 이상의 트립토판의 N-폼일카이누레닌으로의 산화; 하나 이상의 트립토판의 모노-하이드록실 트립토판으로의 산화; 하나 이상의 트립토판의 다이-하이드록실 트립토판으로의 산화; 하나 이상의 트립토판의 트라이-하이드록실 트립토판으로의 산화; 하나 이상의 아르기닌의 Arg 3-데옥시글루코소화(3-deoxyglucosonation); C-말단 글리신의 제거; 및 하나 이상의 비-글리코실화 글리코사이트의 존재.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 애플리버셉트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일 양태에서, 애플리버셉트 및 이의 변이체를 포함하는 정화된 수확 샘플은 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 같은 포획 단계를 거친다. 친화성 단계 이후, 친화성 용리액은 이온 교환 크로마토그래피를 거칠 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 또한, 혼합-모드 또는 다중 모드 크로마토그래피뿐만 아니라 아래에 추가로 논의되는 다른 크로마토그래피 절차도 본 발명의 실시형태의 범위 내에 있는 것으로 상정된다. 특정 양태에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography: AEX)이다. AEX를 사용하기에 적합한 조건은 약 8.3 내지 약 8.6의 pH의 트리스 하이드로클로라이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 약 8.3 내지 약 8.6의 pH에서 트리스 하이드로클로라이드를 사용한 평형화 후, AEX 칼럼에 샘플이 로딩된다. 칼럼의 로딩 후, 칼럼은, 예를 들어, 평형 완충액을 사용하여 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 특정 양태에서, 사용된 조건은 상당량의 옥소-변이체가 없는 애플리버셉트를 포함하는 분획이 통과 분획(flowthrough fraction)에서 수집될 수 있는 반면 상당 부분의 옥소-변이체가 AEX 칼럼의 고체상에 유지되어 칼럼을 스트리핑할 때 얻어질 수 있도록 애플리버셉트 및 이의 산화된 변이체의 차등 크로마토그래피 거동을 촉진할 수 있다 - 하기 실시예 2, 도 11을 참조한다. 도 11 및 실시예 2를 참조하면, 옥소-변이체의 변화는 상이한 생산 단계 사이에서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 이러한 변화는 "트립토판 산화 수준(%)" 부문, 특히 "W138(+16)" 열의 데이터에 의해 설명될 수 있다. 여기에서 옥소-변이체(특히, 옥소-트립토판)가 로딩 샘플에서 약 0.131%에서 AEX 크로마토그래피(AEX 분리 2) 후 통과액(flowthrough) 샘플에서 약 0.070%로 변했음을 관찰할 수 있으며, 이는 AEX를 사용하여 애플리버셉트의 옥소-변이체가 감소하였음을 나타낸다.
이온 교환의 사용은 색상을 완화시키거나 또는 최소화하는데 사용될 수 있다. 본 실시형태의 일 양태에서, 정화된 수확 샘플은, 예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 포획 크로마토그래피를 거친다. 친화성 칼럼은 용리되고, 특정 BY를 갖고/갖거나 b* 값이 할당된 제1 색상을 갖는다. 그런 다음, 이 단백질 용리액은 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)와 같은 이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 이온 교환 칼럼이 세척되고, 통과액이 수집되며, 이는 특정 BY를 갖고/갖거나 b* 값이 할당된 제2 색상을 갖는다. 특정 양태에서, 제1 색상의 색상 값("BY" 또는 "b*")은 제2 색상과 다르다. 추가의 양태에서, 단백질 용리액의 제1 색상은 각각 BY 및/또는 b* 값에 의해 반영되는 AEX 통과액의 제2 색상과 비교하여 더 황갈색 색상을 갖는다. 전형적으로, 단백질 용리액의 제1 색상과 비교할 때 AEX 이후 제2 색상의 황갈색 색상이 감소한다. 예를 들어, 음이온 교환을 사용하면 AEX 후 약 3.06(제1 색상)에서 약 0.96(제2 색상)의 b* 값으로 단백질 용리액 샘플에서 관찰되는 황갈색 색상이 감소된다 - 하기 실시예 2, 표 2 내지 표 3을 참조한다.
실시형태의 일 양태에서, AEX 칼럼에 대한 평형 및 세척 완충액 둘 다의 pH는 약 8.30 내지 약 8.60일 수 있다. 또 다른 양태에서, AEX 칼럼에 대한 평형 및 세척 완충액의 전도도는 약 1.50 내지 약 3.00 mS/㎝일 수 있다.
실시형태의 일 양태에서, 평형 및 세척 완충액은 약 50mM 트리스 하이드로클로라이드일 수 있다. 일 양태에서, 스트립(strip) 완충액은 2M 소듐 클로라이드 또는 1N 소듐 하이드록사이드 또는 둘 다를 포함한다(표 2-2 참조).
본 발명의 실시형태는 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography: HIC), 친화성 크로마토그래피, 다중 모드 크로마토그래피, 바이러스 불활성화(예를 들어, 낮은 pH 사용), 바이러스 여과 및/또는 한외여과/정용여과뿐만 아니라 다른 잘 알려진 크로마토그래피 단계와 같은 하나 이상의 단계를 특정한 순서 없이 추가하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 다음과 같이 하나 이상의 아스파라긴에서 글리코실화된다: G0-GlcNAc 글리코실화; G1-GlcNAc 글리코실화; G1S-GlcNAc 글리코실화; G0 글리코실화; G1 글리코실화; G1S 글리코실화; G2 글리코실화; G2S 글리코실화; G2S2 글리코실화; G0F 글리코실화; G2F2S 글리코실화; G2F2S2 글리코실화; G1F 글리코실화; G1FS 글리코실화; G2F 글리코실화; G2FS 글리코실화; G2FS2 글리코실화; G3FS 글리코실화; G3FS3 글리코실화; G0-2GlcNAc 글리코실화; Man4 글리코실화; Man4_A1G1 글리코실화; Man4_A1G1S1 글리코실화; Man5 글리코실화; Man5_A1G1 글리코실화; Man5_A1G1S1 글리코실화; Man6 글리코실화; Man6_G0+포스페이트 글리코실화; Man6+포스페이트 글리코실화; 및/또는 Man7 글리코실화. 일 양태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트, 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap일 수 있다.
일 양태에서, 항-VEGF 단백질의 조성물의 글리코실화 프로파일은 다음과 같다: 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸(실시예 6 참조). 일 양태에서, 항-VEGF 단백질은 123번 아스파라긴 잔기의 약 32.4% 및/또는 196번 아스파라긴 잔기의 약 27.1%에 Man5 글리코실화가 있다.
일 실시형태에서, 방법은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여 원료의약품(약물 물질)을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 실시형태의 일 양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 다음으로부터 선택될 수 있다: 물, 완충제, 당, 염, 계면활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트제, 유화제 및 방부제. 당업자에게 잘 알려진 다른 부형제는 이 실시형태의 범위 내에 있다.
실시형태의 일 양태에서, 제형은 인간 대상체에 투여하기에 적합할 수 있다. 특히, 투여는 유리체내(intravitreal) 주사에 의해 영향을 받을 수 있다. 일 양태에서, 제형은 약 40 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 관심 있는 단백질을 가질 수 있다.
제형은 다음을 포함할 수 있는 혈관형성 눈 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서 사용될 수 있다: 연령-관련 황반 변성(예를 들어, 습성 또는 건성), 황반부종, 망막 정맥 폐색 후 황반부종, 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion: RVO), 중심성 망막 정맥 폐색(중심 retinal vein occlusion: CRVO), 분지 망막 정맥 폐색(branch retinal vein occlusion: BRVO), 당뇨병성 황반부종(DME), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization: CNV), 홍채 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 녹내장의 수술 후 섬유화, 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy: PVR), 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 파누스(pannus), 익상편(pterygium), 혈관 망막증, 당뇨병성 황반부종을 동반한 대상체의 당뇨병성 망막병증; 또는 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 비-증식성 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 약 47 또는 53의 당뇨병성 망막병증 중증도 척도(Diabetic Retinopathy Severity Scale: DRSS) 수준을 특징으로 함) 또는 증식성 당뇨병성 망막병증; 예를 들어, DME를 앓고 있지 않은 대상체에서).
VEGF MiniTrap의 생산
본 개시내용은 Fc 부분이 제거되거나 없으며 애플리버셉트 MiniTrap 또는 VEGF MiniTrap으로 지칭되는 변형된 버전의 애플리버셉트의 생산을 설명한다. 이 MiniTrap은 화학적으로 정의된 배지(CDM) 또는 대두 가수분해물 배지를 포함하는 세포 배양 배지에서 생산될 수 있다.
일 실시형태에서, MiniTrap은 CDM을 사용하여 생산된다. MiniTrap 생산의 일 양태에서, 전장 애플리버셉트는 적합한 숙주를 사용하여 적합한 조건하에 생산되며, 추가로 처리되어 Fc 부분이 효소적으로 제거됨으로써 MiniTrap이 생성된다. 대안적으로, MiniTrap을 암호화하는 유전자(예를 들어, Fc 부분이 없는 애플리버셉트를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)는 적합한 숙주 세포를 사용하여 적합한 조건하에 생산될 수 있다.
일 실시형태에서, MiniTrap을 제조하는 방법은 전장 애플리버셉트 융합 단백질을 생산한 후 Fc 영역을 절단하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 방법은 (a) 전장 애플리버셉트를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 세포가 전장 애플리버셉트를 발현하기에 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계; (c) 세포에 의해 생산된 전장 애플리버셉트의 제조물을 수확하는 단계; 및 (d) 융합 단백질의 Fc 부분을 제거하는데 특이적인 효소적 절단에 전장 애플리버셉트를 적용하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질, 즉, 전장 애플리버셉트 융합 단백질을 생산하는 단계를 포함한다(미국 특허 제7,279,159호 참조, 이의 전체 교시내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용됨). 또 다른 양태에서, Fc 부분이 빠진 애플리버셉트를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당업자에게 잘 알려진 적합한 조건하에 적합한 숙주 세포로부터 발현된다(미국 특허 제7,279,159호 참조).
본 실시형태의 일 양태에서, 애플리버셉트는 적합한 숙주 세포에서 발현된다. 이러한 숙주-세포의 비제한적인 예는 CHO, CHO K1, EESYR®, NICE®, NS0, Sp2/0, 배아 신장 세포 및 BHK를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 CDM은 둘베코 변형 이글(DME) 배지, 함스 영양 혼합물, EX-CELL 배지(SAFC) 및 IS CHO-CD 배지(어바인(Irvine))를 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 CDM도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다. 특정 양태에서, 적합한 CDM은 CDM1B(리제네론) 또는 Excell 배지(SAFC)이다.
일 양태에서, MiniTrap를 생산하는 동안, 변이체(옥소-변이체 포함)와 함께 관심 있는 단백질을 포함하는 샘플(즉, 애플리버셉트 융합 단백질 및/또는 MiniTrap)은 소정의 색상 특성 - 황갈색 색상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 단계로부터의 용리액 샘플은 BY 및/또는 b* 시스템(하기 실시예 2 및 실시예 9 참조)을 사용하여 측정되는 소정의 황갈색 색상을 나타낼 수 있다. "샘플"에 대한 예시적인 공급원은 단백질 A와 같은 친화성 크로마토그래피 용리액을 포함할 수 있고; 샘플은 이온 교환 크로마토그래피 절차의 통과 분획으로부터 얻을 수 있으며; 이는 또한 이온 교환 칼럼의 스트립으로부터 얻어질 수도 있다 - 샘플을 분석할 수 있는 당업자에게 잘 알려진 생산 공정 중에 다른 공급원이 있다. 위에서 언급하고 아래에서 추가로 설명하는 바와 같이, 색상은 (i) 정성적 육안 검사가 수행되는 유럽 색상 표준 "BY" 또는 (ii) BY 시스템보다 더 정량적인 비색 검정인 CIELAB를 사용하여 평가될 수 있다. 그러나, 두 경우 모두 샘플 간의 의미 있는 평가를 보장하기 위해, 여러 샘플 간의 색상 평가는, 예를 들어, 단백질 농도를 사용하여 정규화되어야 한다.
본 실시형태의 일 양태에서, 전장 애플리버셉트 융합 단백질은, 예를 들어, 프로테이스 또는 이의 효소적으로 활성인 변이체를 이용하는 단백질 분해성 소화를 사용하여, VEGF MiniTrap을 생성하기 위해 효소 처리("절단 활성")를 거칠 수 있다. 이 실시형태의 일 양태에서, 프로테이스는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 면역글로불린-소화 효소(IdeS)일 수 있다. 또 다른 양태에서, 프로테이스는 트롬빈 트립신, 엔도프로티네이스 Arg-C, 엔도프로티네이스 Asp-N, 엔도프로티네이스 Glu-C, 외막 프로테이스 T(OmpT), IdeS, 키모트립신, 펩신, 서몰리신, 파파인, 프로네이스 또는 아스퍼질러스 사이토이(Aspergillus Saitoi)로부터의 프로테이스일 수 있다. 일 양태에서, 프로테이스는 시스테인 프로테이스일 수 있다. 실시형태의 특정 양태에서, 프로테이스는 IdeS일 수 있다. 또 다른 양태에서, 프로테이스는 IdeS의 변이체일 수 있다. IdeS의 변이체의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있으며, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일 양태에서, 프로테이스는 아가로스 또는 또 다른 적합한 매트릭스 상에 고정될 수 있다.
일 양태에서, 관심 있는 단백질(이의 변이체와 함께)은 CDM을 사용하여 생산된다. 특정 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트 또는 MiniTrap을 포함한다. 변이체는 집합적으로 옥소-변이체인 하나 이상의 산화된 아미노산 잔기를 포함한다. 산화된 잔기의 예는 하나 이상의 히스티딘 및/또는 트립토판 잔기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 산화된 메티오닌과 같은 다른 산화된 잔기도 또한 LC-MS를 사용하여 검출되었으며 아래에 기재되어 있다. AEX와 같은 후속 크로마토그래피는 주어진 샘플의 관심 있는 단백질로부터 이러한 옥소-변이체를 단리하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 본 명세서에 설명되어 있다.
일 양태에서, 변이체는 N-폼일카이누레닌을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 변이체는 모노-하이드록실 트립토판을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 단백질 변이체는 다이-하이드록실 트립토판을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 단백질 변이체는 트라이-하이드록실 트립토판을 형성하기 위해 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 옥소-변이체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다: 하나 이상의 아스파라긴 잔기의 탈아마이드화; 아이소-아스파테이트 및/또는 Asn으로 전환된 하나 이상의 아스파르트산; 하나 이상의 메티오닌의 산화 잔기; N-폼일카이누레닌을 형성하기 위한 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화; 모노-하이드록실 트립토판을 형성하기 위한 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화; 다이-하이드록실 트립토판을 형성하기 위한 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화; 트라이-하이드록실 트립토판을 형성하기 위한 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화; 하나 이상의 아르기닌 잔기의 Arg 3-데옥시글루코소화; C-말단 글리신의 제거; 및 하나 이상의 비-글리코실화 글리코사이트의 존재.
일 실시형태에서, MiniTrap 단백질을 제조하는 방법은 (a) 제1 크로마토그래피 플랫폼에서 전장 애플리버셉트 융합 단백질을 포획하는 단계 및 (b) 애플리버셉트를 절단하여 MiniTrap 단백질, 즉, Fc 도메인이 없는 애플리버셉트를 형성하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 제1 크로마토그래피 지지체는 친화성 크로마토그래피 매질, 이온-교환 크로마토그래피 매질 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질를 포함한다. 특정 양태에서, 제1 크로마토그래피 플랫폼은 단백질 A와 같은 친화성 크로마토그래피 플랫폼을 포함한다. 추가의 양태에서, 포획 단계 (a)의 단백질은 절단 단계 (b) 전에 제1 크로마토그래피 플랫폼으로부터 용리된다. 또 다른 양태에서, 제2 포획 단계는 절단 단계 (b)에 뒤따른다. 특정 양태에서, 이 제2 포획 단계는 단백질 A 친화성 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피에 의해 촉진될 수 있다. 이 제2 포획 단계(MiniTrap을 포함)의 통과액은 제1 색상, 예를 들어, 황갈색 색상을 가지며, 특정 BY 및/또는 b* 값을 가지는 것으로 측정된다 - 예를 들어, 아래 실시예 9를 참조한다. 추가적으로, 이 제2 포획 통과액의 LC-MS 분석은 MiniTrap의 하나 이상의 잔기가 산화된 옥소-변이체의 존재를 입증할 수 있다(아래 실시예 9 참조).
추가의 양태에서, 제2 포획 통과액은 AEX와 같은 이온 교환 크로마토그래피를 거칠 수 있다. 이 AEX 칼럼은 적합한 완충액을 사용하여 세척될 수 있으며, 본질적으로 MiniTrap을 포함하는 AEX 통과 분획이 수집될 수 있다. 이 AEX 통과 분획은 특정 BY 및/또는 b* 값을 갖는 황갈색 착색인 제2 색상을 가질 수 있다. 추가의 양태에서, 제1 색상(제2 포획 단계로부터의 통과액) 및 제2 색상(이온 교환 절차의 통과액)은 BY 및/또는 b* 시스템에 의해 측정되는 바와 같이 상이한 색상을 갖는다. 일 양태에서, 제2 색상은 AEX 다음에 BY 및/또는 b* 값을 사용하여 제1 색상과 비교될 때, 감소된 황갈색 색상을 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 단계 (b)의 절단 활성은 절단 활성, 예를 들어, 효소 활성이 칼럼 매트릭스에 부착되거나 또는 고정된 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행될 수 있다. 단계 (b)에서 사용되는 칼럼은 이미 언급되고 아래에 보다 충분히 설명되는 프로테이스 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 이온-교환 크로마토그래피 절차는 음이온-교환(AEX) 크로마토그래피 매질을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 이온-교환 크로마토그래피 매질은 양이온 교환(cation exchange: CEX) 크로마토그래피 매질을 포함한다. AEX을 이용하기에 적합한 조건은 pH가 약 8.3 내지 약 8.6인 트리스 하이드로클로라이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, pH가 약 8.3 내지 약 8.6인 트리스 하이드로클로라이드를 사용하여 평형화한 후, AEX 칼럼에 샘플이 로딩된다. 칼럼의 로딩 후, 칼럼은, 예를 들어, 평형 완충액을 사용하여 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 특정 양태에서, 사용되는 조건은 MiniTrap이 실질적으로 통과 분획에 있는 반면 옥소-변이체는 AEX 칼럼 상에 실질적으로 남아 있으며 칼럼을 스트리핑하여 수집될 수 있도록, AEX를 사용하는 MiniTrap 및 이의 옥소-변이체의 차등 크로마토그래피 거동을 촉진할 수 있다(아래 실시예 9 참조).
일 실시예에서, 상이한 생산 단계로부터의 샘플이 색상 및 옥소-변이체의 존재에 대해 분석되었다. 실시예 9를 참조하면, 친화성 통과액 풀(pool)(제2 단백질 A 친화성 단계로부터의 통과액)은 약 1.58의 제1 b* 값을 갖는다(표 9-3 참조). 이 제2 친화성 통과액은 AEX를 거쳤다. AEX 통과액은 약 0.50의 제2 b* 값을 가지며, 이는 AEX의 사용에 따라 황갈색 색상의 상당한 감소를 나타낸다. AEX 칼럼의 스트리핑은 스트립 샘플을 생성하였고, 약 6.10의 제3 b* 값이 관찰되었으며, 이는 로딩액 또는 통과액과 비교할 때 이 스트립 샘플이 더 황갈색 색상을 가짐을 나타낸다.
다시 실시예 9를 참조하면, 옥소-변이체 분석이 또한 수행되었다. 분석된 샘플은 친화성 통과액 풀(제2 단백질 A 친화성 용리액), AEX 통과액 및 AEX 스트립이었다. 표 9-5 및 표 9-6을 참조하면, 옥소-변이체의 변화는 상이한 생산 단계 사이에서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 이러한 변화는 "트립토판 산화 수준(%)" 부문, 특히, "W58(+16)" 열의 데이터에 의해 설명될 수 있다. 옥소-변이체(구체적으로, 옥소-트립토판)가 로딩 샘플에서 약 0.055%에서 AEX 크로마토그래피 후 통과액 샘플에서 약 0.038%로 갔음이 관찰될 수 있으며, 이는 AEX 후에 옥소-변이체의 감소가 있었음을 나타낸다. AEX 스트립이 분석되었고, 옥소-트립토판 종의 백분율은 약 0.089%인 것으로 밝혀졌다. 이 스트립 값을 로딩액(뿐만 아니라 통과액)과 비교하였을 때, 이 옥소-변이체의 상당 부분이 AEX 칼럼 상에 남아 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 실시형태는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 다중 모드 크로마토그래피, 바이러스 불활성화(예를 들어, 낮은 pH를 사용), 바이러스 여과 및/또는 한외여과/정용여과와 같은 하나 이상의 단계를 특정한 순서 없이 추가하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 수지를 포함하는 크로마토그래피 칼럼을 재생시키는 방법에 관한 것이다. 실시형태의 일 양태에서, 수지는 고정화된 가수분해제를 갖는다. 본 실시형태의 또 다른 양태에 있어서, 수지는 고정화된 프로테이스 효소를 포함한다. 본 실시형태의 또 다른 양태에 있어서, 수지는 FabRICATOR® 수지 또는 수지의 변종(돌연변이체)이다. 실시형태의 일 양태에서, 수지를 포함하는 칼럼을 재생시키는 방법은 수지의 반응 효율을 개선한다.
실시형태의 일 양태에서, 수지를 포함하는 칼럼을 재생시키는 방법은 칼럼 수지를 아세트산과 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 사용되는 아세트산의 농도는 약 0.1M 내지 약 2M이다. 일 양태에서, 아세트산의 농도는 약 0.5M이다. 일 양태에서, 수지는 적어도 약 10분 동안 인큐베이션된다. 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 30분 동안 인큐베이션된다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 50분 동안 인큐베이션된다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 100분 동안 인큐베이션된다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 200분 동안 인큐베이션된다. 이 실시형태의 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 300분 동안 인큐베이션된다.
선택적으로, 칼럼 수지는 구아니딘 하이드로클로라이드(Gu-HCl)와 추가로 인큐베이션된다. 일 양태에서, 아세트산이 없는 Gu-HCl이 칼럼 수지를 재생시키기 위해 사용된다. 이용되는 Gu-HCl의 농도는 약 1N 내지 약 10N이다. 또 다른 양태에서, Gu-HCl의 농도는 약 6N이다. 추가의 양태에서, 칼럼 수지는 재생제(regenerative agent)(아세트산, Gu-HCl)와 함께 적어도 약 10분 동안 인큐베이션될 수 있다. 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 30분 동안 인큐베이션된다. 또 다른 양태에서, 수지는 적어도 약 50분 동안 인큐베이션된다. 또 다른 양태에서, 상기 수지는 적어도 약 100분 동안 인큐베이션된다.
일 실시형태에서, 수지를 포함하는 칼럼은 에탄올에 보관된다. 일 양태에서, 칼럼은 에탄올에 보관되되, 에탄올 백분율은 약 5% v/v 내지 약 20% v/v이다. 특정 양태에서, 칼럼은 20% v/v 에탄올을 사용하여 보관된다.
일 실시형태에서, 방법은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여 VEGF MiniTrap을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 다음으로부터 선택될 수 있다: 물, 완충제, 당, 염, 계면활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트제, 유화제 및 방부제. 당업자에게 잘 알려진 다른 부형제는 이 실시형태의 범위 내에 있다.
본 발명의 제형은 인간 대상체에 투여하는데 적합하다. 본 실시형태의 일 양태에서, 투여는 유리체내 주사에 의해 수행될 수 있다. 일 양태에서, 제형은 약 40 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 관심 있는 단백질을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트 또는 애플리버셉트 MiniTrap이다.
제형은 다음을 포함할 수 있는 혈관형성 눈 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있다: 연령-관련 황반 변성(예를 들어, 습성 또는 건성), 황반부종, 망막 정맥 폐색 후 황반부종, 망막 정맥 폐색(RVO), 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO), 분지 망막 정맥 폐색(BRVO), 당뇨병성 황반부종(DME), 맥락막 혈관신생(CNV), 홍채 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 녹내장의 수술 후 섬유화, 증식성 유리체망막병증(PVR), 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 파누스, 익상편, 혈관 망막증, 당뇨병성 황반부종을 동반한 대상체의 당뇨병성 망막병증; 또는 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 비-증식성 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 약 47 또는 53의 당뇨병성 망막병증 중증도 척도(DRSS) 수준을 특징으로 함) 또는 증식성 당뇨병성 망막병증; 예를 들어, DME를 앓고 있지 않은 대상체에서).
IdeS의 변이체
본 개시내용은 VEGF MiniTrap를 생성하기 위한 IdeS(FabRICATOR)(서열번호 1) 또는 IdeS 변이체인 다른 폴리펩타이드(서열번호 2 내지 16)의 용도를 설명한다. IdeS(서열번호 1)는 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에 아스파라긴 잔기를 포함한다(아래의 서열번호 1에서 " N *"으로 굵게 표시되고 이탤릭체로 표시됨). 이들 위치에 있는 아스파라긴은 IdeS 변이체(및 돌연변이된 아미노산(들)은 이탤릭체로 밑줄 표시된 아미노산(들)으로 표시됨)를 형성하기 위해 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이될 수 있다:
서열번호 1
서열번호 2
서열번호 3
서열번호 4
서열번호 5
서열번호 6
서열번호 7
서열번호 8
서열번호 9
서열번호 10
서열번호 11
서열번호 12
서열번호 13
서열번호 14
서열번호 15
서열번호 16
일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 바와 같은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 아미노산 서열을 갖는다. 일 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 표적 단백질을 단편으로 절단할 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 IgG이다. 또 다른 양태에서, 표적 단백질은 융합 단백질이다. 또 다른 양태에서, 단편은 Fab 단편 및/또는 Fc 단편을 포함할 수 있다.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16.
본 개시내용은 또한 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 바와 같은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 일 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 표적 단백질을 단편으로 절단할 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 IgG이다. 또 다른 특정 양태에서, 표적 단백질은 융합 단백질이다. 또 다른 특정 양태에서, 단편은 Fab 단편 및/또는 Fc 단편을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 바와 같은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일 양태에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 이의 발현을 지시할 수 있는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일 양태에서, 벡터는 플라스미드일 수 있다. 일 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일 양태에서, 폴리펩타이드는 표적 단백질을 단편으로 절단할 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 IgG이다. 또 다른 양태에서, 표적 단백질은 융합 단백질이다. 또 다른 양태에서, 단편은 Fab 단편 및/또는 Fc 단편을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 단리된 아미노산은 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이된 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에 아스파라긴 잔기를 갖는 서열번호 1로 정의되는 모(parental) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 돌연변이는 모 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH-값에서 화학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 돌연변이는 모 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH-값에서 화학적 안정성을 50%까지 증가시킬 수 있다. 일 양태에서, 아미노산은 아스파르트산, 류신 및 아르기닌으로부터 선택될 수 있다. 특정 양태에서, 87번 위치의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 130번 위치의 아스파라긴 잔기는 아르기닌 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 182번 위치의 아스파라긴 잔기는 류신 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 274번 위치의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 87번 및 130번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 87번 및 182번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 87번 및 274번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 130번 및 182번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 130번 및 274번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 182번 및 274번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 87번, 130번 및 182번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 87번, 182번 및 274번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 130번, 182번 및 274번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 양태에서, 87번, 130번, 182번 및 274번 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다.
관련 실시형태에서, 개시내용은 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이된 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에 아스파라긴 잔기를 갖는 서열번호 1로 정의되는 모 아미노산 서열을 포함하는 단리된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함한다 - 위를 참조한다. 돌연변이는 모 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH-값에서 화학적 안정성을 증가시킬 수 있다.
추가의 관련 실시형태에서, 개시내용은 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이된 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에 아스파라긴 잔기를 갖는 서열번호 1로 정의되는 모 아미노산 서열을 포함하는 단리된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다 - 위를 참조한다. 돌연변이는 모 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH-값에서 화학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 일 양태에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 이의 발현을 지시할 수 있는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일 양태에서, 벡터는 플라스미드일 수 있다.
친화성-기반 생산
본 개시내용은 또한 친화성 크로마토그래피를 사용하여 항-VEGF 단백질의 생산 동안 숙주 세포 단백질뿐만 아니라 다른 바람직하지 않은 단백질 및 핵산을 감소시키는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질을 생산하는 방법은 (a) 관심 있는 재조합 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 세포가 관심 있는 재조합 단백질을 발현하기에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 항-VEGF 단백질이다. 특정 양태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트, MiniTrap, 재조합 MiniTrap(미국 특허 제7,279,159호에 개시되어 있는 예), scFv 및 다른 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 실시형태의 일 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 적합한 숙주 세포에서 발현된다. 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예는 CHO, CHO K1, EESYR®, NICE®, NS0, Sp2/0, 배아 신장 세포 및 BHK를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 실시형태의 일 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 CDM에서 배양된다. 적합한 CDM은 둘베코 변형 이글(DME) 배지, 함스 영양 혼합물, Excell 배지, IS CHO-CD 배지 및 CDM1B를 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 CDM도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다.
생산 제조물은 관심 있는 재조합 단백질 외에 하나 이상의 숙주 세포 단백질을 포함하는 적어도 하나의 오염물질을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 오염물질은 세포-기질, 세포 배양 또는 하류 공정으로부터 유래될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 생물학적 샘플로부터 항-VEGF 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법이 항-VEGF 단백질의 배양 생산 공정 동안 형성되는 하나 이상의 숙주 세포 단백질 및 핵산(예를 들어, DNA)으로부터 항-VEGF 단백질을 적어도 부분적으로 분리하기 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, 방법은 항-VEGF 단백질 및 수반되는 오염물질을 포함하는 생물학적 샘플을 적합한 조건하에 친화성 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 친화성 크로마토그래피는 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합("포획")할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 물질의 비제한적인 예는 단백질 A, 단백질 G, 크로마토그래피 물질, 예를 들어, 항-VEGF 단백질에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 크로마토그래피 물질 및 Fc 결합 단백질을 포함하는 크로마토그래피 물질을 포함한다. 특정 양태에서, 항-VEGF 단백질에 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 단백질은 항체, 융합 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 물질의 비제한적인 예는 실시예 7에 기재되어 있다.
본 실시형태의 일 양태에서, 방법은 항-VEGF 단백질 및 하나 이상의 숙주 세포 단백질/오염물질을 포함하는 생물학적 샘플을 적합한 조건하에 친화성 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함할 수 있되, 친화성 크로마토그래피 고정상(stationary phase)은 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 특정 양태에서, 단백질은 항체, 융합 단백질, scFv 또는 항체 단편일 수 있다. 특정 양태에서, 단백질은 토끼와 같은 다른 종으로부터의 VEGF165, VEGF121, VEGF 형태일 수 있다. 예를 들어, 표 7-1 및 표 7-10에 예시되어 있는 바와 같이, 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 단백질로서 VEGF165를 사용하여 MT5(항-VEGF 단백질), 애플리버셉트 및 항-VEGF scFv 단편의 성공적인 생산을 유도한다. 또 다른 특정 양태에서, 단백질은 서열번호 73 내지 서열번호 80에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 하나 이상일 수 있다. 표 7-1도 또한 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 단백질(MT5)로서 서열번호 73 내지 서열번호 80에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 단백질을 사용한 MT5의 성공적인 생산을 개시한다.
본 실시형태의 일 양태에서, 방법은 항-VEGF 단백질 및 하나 이상의 숙주 세포 단백질/오염물질을 포함하는 생물학적 샘플을 적합한 조건하에 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함할 수 있되, 친화성 크로마토그래피 고정상은 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 단백질을 포함하고, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트, VEGF MiniTrap 또는 항-VEGF 항체로부터 선택될 수 있다. 특정 양태에서, VEGF MiniTrap은 VEGF 수용체 성분으로부터 수득될 수 있으며, 또한; 이는 숙주 세포에서 VEGF MiniTrap의 재조합발현에 의해 형성될 수 있다. 방법을 수행하면 샘플에서 하나 이상의 숙주 세포 단백질의 양을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 도 35a 및 도 35b는 MT5에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 상이한 단백질로서 (i) VEGF165(서열번호 72); (ii) mAb1(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 73이 중쇄이고 서열번호 74가 경쇄임); (iii) mAb2(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 75가 중쇄이고 서열번호 76이 경쇄임); (iv) mAb3(마우스 항-VEGFR1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 77이 중쇄이고 서열번호 78이 경쇄임) 및 (v) mAb4(마우스 항-VEGFR1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 79가 중쇄이고 서열번호 80이 경쇄임)를 포함하는 5개의 상이한 친화성 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 MT5(항-VEGF 단백질)를 포함하는 샘플에서의 총 숙주 세포 단백질이 상당히 감소함을 보여준다. 도 35a 및 도 35b에서 알 수 있듯이, 각각의 친화성-기반 생산 공정으로부터의 용리액은 숙주 세포 단백질을 각각 7000ppm 초과에서 약 25 ppm으로 그리고 약 55 ppm으로 감소시켰다.
친화성 크로마토그래피를 이용하기에 적합한 조건은 평형화 완충액을 사용한 친화성 크로마토그래피 칼럼의 평형화를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, pH가 약 8.3 내지 약 8.6인 트리스 하이드로클로라이드를 사용하여 평형화한 후, 친화성 크로마토그래피 칼럼에 생물학적 샘플이 로딩된다. 칼럼을 로딩한 후, 칼럼은, 예를 들어, 둘베코 포스페이트-완충 식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)와 같은 평형 완충액을 사용하여 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 칼럼을 용리하기 전에 다른 완충액을 사용하는 세척을 포함한 다른 세척이 사용될 수 있다. 칼럼 용리는 완충액 유형과 pH 및 전도도에 의해 영향을 받을 수 있으며, 당업자에게 잘 알려진 다른 용리 조건이 적용될 수 있다. 1종 이상의 유형의 용리 완충액, 예를 들어, pH가 약 2.0 내지 약 3.0인 글리신을 사용하여 용리한 후, 용리된 분획은 중화 완충액, 예를 들어, 1M 트리스(pH 7.5)를 첨가하여 중화될 수 있다.
실시형태의 일 양태에서, 세척 및 평형화 완충액 둘 다의 pH는 약 7.0 내지 약 8.6일 수 있다. 실시형태의 일 양태에서, 세척 완충액은 DPBS일 수 있다. 일 양태에서, 용리 완충액은 pH가 약 2.5인 100mM 글리신 완충액을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 용리 완충액은 pH가 약 2.0 내지 약 3.0인 완충액일 수 있다. 일 양태에서, 중화 완충액은 pH가 약 7.5인 1M tris를 포함할 수 있다.
본 실시형태의 일 양태에서, 방법은 세척 완충액으로 칼럼을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 실시형태의 일 양태에서, 방법은 용리 분획을 얻기 위해 용리 완충액으로 칼럼을 용리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 용리된 분획 내의 숙주 세포 단백질의 양은 생물학적 샘플 내의 숙주 세포 단백질의 양과 비교하여, 예를 들어, 약 70%, 약 80%, 90%, 약 95%, 약 98% 또는 약 99%까지 상당히 감소된다.
본 발명의 실시형태는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성-기반 크로마토그래피, 다중 모드 크로마토그래피, 바이러스 불활성화(예를 들어, 낮은 pH를 사용), 바이러스 여과 및/또는 한외여과/정용여과와 같은 하나 이상의 단계를 특정한 순서 없이 추가할 수 있다.
일 양태에서, 항-VEGF 단백질의 조성물의 글리코실화 프로파일은 다음과 같다: 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸.
이 실시형태의 일 양태에서, 항-VEGF 단백질은 123번 아스파라긴 잔기의 약 32.4% 및/또는 196번 아스파라긴 잔기의 약 27.1%에서 Man5 글리코실화를 갖는다. 특정 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트, 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap일 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여 원료의약품을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 다음으로부터 선택될 수 있다: 물, 완충제, 당, 염, 계면활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트제, 유화제 및 방부제. 당업자에게 잘 알려진 다른 부형제도 이 실시형태의 범위 내에 있다.
실시형태의 일 양태에서, 제형은 인간 대상체에 투여하기에 적합할 수 있다. 본 실시형태의 일 양태에서, 투여는 유리체내 주사에 의해 수행될 수 있다. 일 양태에서, 제형은 약 40 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 관심 있는 단백질을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트, 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap일 수 있다.
제형은 다음을 포함할 수 있는 혈관형성 눈 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있다: 연령-관련 황반 변성(예를 들어, 습성 또는 건성), 황반부종, 망막 정맥 폐색 후 황반부종, 망막 정맥 폐색(RVO), 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO), 분지 망막 정맥 폐색(BRVO), 당뇨병성 황반부종(DME), 맥락막 혈관신생(CNV), 홍채 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 녹내장의 수술 후 섬유화, 증식성 유리체망막병증(PVR), 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 파누스, 익상편, 혈관 망막증, 당뇨병성 황반부종을 동반한 대상체의 당뇨병성 망막병증; 또는 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 비-증식성 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 약 47 또는 53의 당뇨병성 망막병증 중증도 척도(DRSS) 수준을 특징으로 함) 또는 증식성 당뇨병성 망막병증; 예를 들어, DME를 앓고 있지 않은 대상체에서).
옥소-종의 합성
본 발명의 일 실시형태는 광(light)을 사용하여 산화된 단백질 종을 합성하는 하나 이상의 방법에 관한 것이다. 본 실시형태의 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 항-VEGF 단백질이다. 특정 양태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트이다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 단백질은 재조합 VEGF MiniTrap을 비롯한 VEGF MiniTrap이다. 본 발명의 실시형태의 또 다른 양태에서, 항-VEGF 단백질은 단일쇄 가변 단편(single-chain variable fragment: scFv)이다.
본 실시형태의 일 양태에서, 샘플은 관심 있는 단백질, 예를 들어, 옥소-변이체가 최소이거나 또는 없는 애플리버셉트 융합 단백질을 포함한다. 샘플은 산화된 애플리버셉트의 종을 합성하기 위해 광-스트레스를 받는다. 특정 양태에서, 샘플은 차가운 백색광을 사용함으로써 광-스트레스를 받는다. 또 다른 특정 양태에서, 샘플은 자외선을 사용함으로써 광-스트레스를 받는다.
본 실시형태의 특정 양태에서, 애플리버셉트 또는 또 다른 항-VEGF 단백질을 포함하는 샘플은 약 30시간 내지 약 300시간 동안 차가운 백색광에 노출되어 변형된 올리고펩타이드가 약 1.5-배 내지 약 50-배 증가한다. 이러한 펩타이드는 효소적으로 소화되고, 다음으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상을 포함하는 것이 분석된다:
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17), EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18), QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20), TNYLTH*R(서열번호 21), SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(서열번호 22), VH*EKDK(서열번호 23), SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(서열번호 64), SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(서열번호 65), TQSGSEM*K(서열번호 66), SDQGLYTC*AASSGLM*TK(서열번호 67), IIW*DSR/RIIW*DSR/IIW*DSRK(서열번호 28), TELNVGIDFNW*EYPSSK(서열번호 29), GFIISNATY*K(서열번호 69), KF*PLDTLIPDGK(서열번호 70) F*LSTLTIDGVTR(서열번호 32), 여기서 H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화된 히스티딘이고, C*는 카복시메틸화된 시스테인이며, M*은 산화된 메티오닌이고, W*는 산화된 트립토판이며, Y*는 산화된 타이로신이고, F*는 산화된 페닐알라닌이다. 소화는 이전에 언급된 프로테이스, 예를 들어, 트립신에 의해 수행될 수 있다. 올리고펩타이드는 질량 분석법을 사용하여 분석될 수 있다.
본 실시형태의 특정 양태에서, 애플리버셉트 또는 다른 항-VEGF 단백질을 포함하는 샘플은 약 4시간 내지 약 40시간 동안 자외선에 노출되어 변형된 올리고펩타이드 산물(소화를 수행하여 얻어짐)이 약 1.5-배 내지 약 25-배 증가하되, 샘플은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 올리고펩타이드를 포함한다:
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17), EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18), QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20), TNYLTH*R(서열번호 21), SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(서열번호 22), VH*EKDK(서열번호 23), SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(서열번호 64), SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(서열번호 65), TQSGSEM*K(서열번호 66), SDQGLYTC*AASSGLM*TK(서열번호 67), IIW*DSR/RIIW*DSR/IIW*DSRK(서열번호 28), TELNVGIDFNW*EYPSSK(서열번호 29), GFIISNATY*K(서열번호 69), KF*PLDTLIPDGK(서열번호 70) F*LSTLTIDGVTR(서열번호 32), 여기서 H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화된 히스티딘이고, C*는 카복시메틸화된 시스테인이며, M*은 산화된 메티오닌이고, W*는 산화된 트립토판이며, Y*는 산화된 타이로신이고, F*는 산화된 페닐알라닌이다. 소화는 이전에 언급된 프로테이스, 예를 들어, 트립신에 의해 수행될 수 있다. 올리고펩타이드는 질량 분석법을 사용하여 분석될 수 있다.
황갈색 색상을 최소화하는 방법
본 개시내용 CDM에서 생산된 애플리버셉트, MiniTrap 등의 생산 동안 황갈색 착색을 감소시키는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양한 다음(숙주 세포는 관심 있는 재조합 단백질을 발현함), 관심 있는 재조합 단백질을 포함하는 제조물을 수확하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 항-VEGF 단백질이다. 특정 양태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트, MiniTrap, 재조합 MiniTrap(그 예는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제7,279,159호에 개시됨), scFv 및 다른 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서, 방법은 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 생산할 수 있되, 제조물의 색상은 유럽 BY 방법 또는 CIELAB 방법(b*)을 사용하여 특성화된다. 추가적으로, 옥소-변이체의 존재는, 예를 들어, LC-MS를 사용하여 분석될 수 있다.
본 실시형태의 일 양태에서, 완화 조건은 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 색상 및 단백질 변이체의 감소에 해당하는 하나 이상의 배지 성분, 예를 들어, 염 및 전구체를 포함하는 아미노산, 금속 또는 항산화제의 누적 농도의 증가 또는 감소를 포함한다. 아미노산의 비제한적인 예는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린을 포함한다. 특정 양태에서, 시스테인을 낮추면 제조물의 황갈색 색상을 효과적으로 낮출 수 있다. 시스테인 농도는 또한 옥소-변이체에 영향을 미칠 수 있다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계(숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현함) 및 세포에 의해 생산된 관심 있는 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함하되, 적합한 조건은 부분적으로 CDM에서 시스테인의 누적 농도를 약 10mM 이하로 낮춤으로서 얻어진다. 적합한 배지의 예는 CDM1B, Excell 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "누적량"은 CDM을 형성하기 위해 세포 배양 과정 동안 생물반응기에 첨가되는 특정 성분의 총량을 지칭하며, 이는 성분의 배양 초기에 첨가된 양(제0일의 CDM) 및 후속적으로 첨가된 양을 포함한다. 생물반응기 생산 전(즉, 제0일의 CDM 이전) 시드-트레인(seed-train) 배양물 또는 접종물에 첨가된 성분의 양도 또한 성분의 누적량을 계산할 때 포함된다. 누적량은 배양 동안 시간 경과에 따른 성분의 손실(예를 들어, 대사 또는 화학적 소화를 통한)에 의해 영향을 받지 않는다. 따라서, 성분의 누적량이 동일한 두 배양물은 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 성분이 상이한 시간에 두 배양물에 첨가되는 경우(예를 들어, 한 배양물에는 처음에 모든 성분이 첨가되고, 또 다른 배양물에는 시간이 지남에 따라 성분이 첨가되는 경우) 상이한 절대 수준을 가질 수 있다. 누적량은 또한 배양 동안 시간 경과에 따른 성분의 제자리(in situ) 합성(예를 들어, 대사 또는 화학적 전환을 통해)에 의해서도 영향을 받지 않는다. 따라서, 주어진 성분의 누적량이 동일한 두 배양물은 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 성분이 생물전환 과정에 의해 두 배양물 중 하나에서 제자리에서 합성되는 경우 상이한 절대 수준을 가질 수 있다. 누적량은, 예를 들어, 성분의 그램 또는 몰과 같은 단위로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "누적 농도"는 배양에 사용된 임의의 접종물의 시작 부피에 대한 기여도를 포함하여 생산 배취의 시작시 생물반응기의 액체 부피로 나눈 성분의 누적량을 지칭한다. 예를 들어, 생물반응기가 생산 배취의 시작시에 2 리터의 세포 배양 배지를 포함하며 1그램의 성분 X가 제0일, 제1일, 제2일 및 제3일에 첨가된다면, 3일 후의 누적 농도는 2 g/ℓ이다(즉, 4그램을 2 리터로 나눈 값). 제4일에, 성분 X를 포함하지 않은 액체의 추가적인 1리터를 생물반응기에 첨가하면, 누적 농도는 2 g/ℓ를 유지할 것이다. 제5일에, 생물반응기에서 일정량의 액체가 손실된 경우(예를 들어, 증발을 통해), 누적 농도는 2 g/ℓ를 유지할 것이다. 누적 농도는, 예를 들어, 리터당 그램 또는 리터당 몰과 같은 단위로 표현될 수 있다.
이 실시형태의 양태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계(숙주 세포는 관심 있는 재조합 단백질을 발현함), 세포에 의해 생산된 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함하되, 적합한 조건은 약 1:10 내지 1:29의 누적 시스테인 농도 대 약 1:50 내지 약 1:30의 누적 총 아미노산 농도의 비를 낮춤으로써 얻어진다.
일 실시형태에서, 방법은 (i) 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현하는, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (ii) 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함하되, 적합한 조건은 CDM에서 철의 누적 농도를 약 55.0μM 미만으로 낮춤으로써 얻어진다. 이 실시형태의 양태에서, 이 방법에 의해 얻어진 제조물은 CDM에서 철의 누적 농도가 약 55.0μM을 초과하는 방법에 의해 얻어진 제조물보다 황갈색 색상이 덜 나타난다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현한다. 방법은 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 더 포함하되, 적합한 조건은 CDM에서 구리의 누적 농도를 약 0.8μM 이하로 낮춤으로써 얻어진다. 이 실시형태의 양태에서, 이 방법에 의해 얻어진 제조물은 CDM에서 구리의 누적 농도가 약 0.8μM을 초과하는 방법에 의해 얻어진 제조물보다 황갈색 색상이 덜 나타난다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계(숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현함) 및 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함하되, 적합한 조건은 CDM에서 니켈의 누적 농도를 약 0.40μM 이하로 낮춤으로써 얻어진다. 이 실시형태의 양태에서, 이 방법에 의해 얻어진 제조물은 CDM에서 니켈의 누적 농도가 약 0.40μM을 초과하는 방법에 의해 얻어진 제조물보다 황갈색 색상을 덜 나타낸다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현한다. 방법은 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 더 포함하되, 적합한 조건은 CDM에서 아연의 누적 농도를 약 56μM 이하로 낮춤으로써 얻어진다. 이 실시형태의 양태에서, 이 방법에 의해 얻어진 제조물은 CDM에서 아연의 누적 농도가 약 56μM을 초과하는 방법에 의해 얻어진 제조물보다 황갈색 색상을 덜 나타낸다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현한다. 방법은 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 더 포함하되, 적합한 조건은 단일 항산화제의 경우 약 0.001mM 내지 약 10mM의 누적 농도로 CDM에 항산화제가 존재하고, 여러 항산화제가 상기 CDM에 첨가되는 경우 약 30mM 누적 농도 이하로 존재함으로써 얻어진다. 이 실시형태의 양태에서, 이 방법에 의해 얻어진 제조물은 CDM에 약 0.01mM 미만 또는 약 100mM 초과의 누적 농도의 항산화제가 없는 방법에 의해 얻어진 제조물보다 황갈색 색상을 덜 나타낸다. 항산화제의 비제한적인 예는 타우린, 하이포타우린, 글리신, 티옥트산, 글루타티온, 콜린 클로라이드, 하이드로코르티손, 바이타민 C, 바이타민 E, 킬레이트제, 카탈레이스, S-카복시메틸-L-시스테인 및 이들의 조합일 수 있다. 킬레이트제의 비제한적인 예는 아우린트라이카복실산(aurintricarboxylic acid: ATA), 데페록사민(deferoxamine: DFO), EDTA 및 시트레이트를 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현한다. 방법은 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 더 포함하되, 적합한 조건은 상기 CDM에서의 철의 누적 농도가 약 55μM 미만, 상기 CDM에서의 구리의 누적 농도가 약 0.8μM 이하, 상기 CDM에서 니켈의 누적 농도가 약 0.40μM 이하, 상기 CDM에서 아연의 누적 농도가 약 56μM 이하, 상기 CDM에서 시스테인의 누적 농도가 10mM 미만; 및/또는 상기 CDM에서의 항산화제의 농도가 단일 항산화제의 경우 약 0.001mM 내지 약 10mM이고 여러 항산화제가 상기 CDM에 첨가되는 경우 누적 농도가 약 30mM 이하인 CDM을 포함한다.
본 실시형태의 일 양태에서, 적합한 조건을 사용하여 얻어진 제조물은 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체를 목적하는 양의 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체로 감소시킨다(애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체의 "목표값"으로 지칭됨). 이 실시형태의 추가의 양태에서, 적합한 조건을 사용하여 얻어진 제조물은 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 변이체를 포함하는 단백질의 제조물이 5 g/ℓ 또는 10 g/ℓ의 농도로 정규화될 때 제조물의 색상을 목적하는 b* 값 또는 BY 값(각각 "목표 b* 값", "목표 BY 값"으로 지칭됨)으로 감소시킨다. 본 발명의 실시형태의 추가의 양태에서, 변이체의 목표 b* 값(또는 목표 BY 값) 및/또는 목표값은 역가가 증가하거나 또는 유의하게 감소하지 않는 제조물에서 얻어질 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 다음의 설명 및 첨부 도면과 함께 고려될 때 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 다음의 설명은 다양한 실시형태 및 이의 수많은 특정 세부사항을 나타내지만 제한이 아니라 예시의 방식으로 제공된다. 많은 치환, 수정, 추가 또는 재배열이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다.
도 1은 VEGFR1(서열번호 34), VEGFR2(서열번호 36), 힌지 도메인 단편(서열번호 60) 및 애플리버셉트로부터 절단된 Fc 단편(서열번호 55)을 포함하는 예시적인 실시형태를 사용하여 생성된 VEGF MiniTrap을 도시한다.
도 2는 2-옥소-히스티딘(14 Da)으로의 히스티딘 산화에 대해 제안된 메커니즘을 도시한다.
도 3은 2-옥소-히스티딘(16 Da)으로의 히스티딘 산화에 대해 제안된 메커니즘을 도시한다.
도 4는 N-폼일카이누레닌 및 카이누레닌으로의 트립토판의 산화에 대해 제안된 메커니즘을 도시한다.
도 5는 애플리버셉트의 생산에 대한 예시적인 실시형태를 도시한다.
도 6은 VEGF MiniTrap의 생산에 대한 예시적인 실시형태를 도시한다.
도 7은 애플리버셉트의 생산에 대한 예시적인 실시형태를 도시한다.
도 8은 VEGF MiniTrap의 생산에 대한 예시적인 실시형태를 도시한다.
도 9는 예시적인 실시형태에 따라 계산된 BY 표준 대 계산된 b* 값의 차트를 도시한다.
도 10은 환원 및 알킬화된 애플리버셉트(서열번호 55)의 단편을 포함하는 프로테이스-소화된 AEX 로딩액 및 통과액으로부터의 올리고펩타이드에서 2-옥소-히스티딘 및 트립토판 산화(여기서 밑줄은 잔기의 산화를 나타냄)의 백분율을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 도시한다.
도 11은 애플리버셉트의 단편(서열번호 55)을 포함하는 프로테이스-소화된 AEX 로딩액 및 통과액(여기서 밑줄은 펩타이드 서열에서 잔기의 산화를 나타냄)으로부터의 올리고펩타이드를 사용하여 수행된 펩타이드 매핑 분석으로부터 확인된 펩타이드의 상대적 존재비(relative abundance)를 도시한다.
도 12a는 350㎚에서 MT4 및 MT1에 대한 흡광도 대 시간(분)의 크로마토그램 차트의 전체 보기를 도시한다.
도 12b는 서열번호 21 및 28을 포함하여, 350㎚에서 MT4 및 MT1에 대한 흡광도 대 시간(16분 내지 30분)의 크로마토그램 차트의 확대도를 도시한다.
도 12c는 서열번호 17, 18, 19, 20을 포함하여, 350㎚에서 MT4 및 MT1에 대한 흡광도 대 시간(30분 내지 75분)의 크로마토그램 차트의 확대도를 도시한다.
도 13은 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 28을 포함하여, AEX 크로마토그래피에 의해 처리된 프로테이스 소화된 MT1로부터의 올리고펩타이드 및 AEX 크로마토그래피로부터 스트리핑된 프로테이스 소화된 MT1로부터의 올리고펩타이드에서 2-옥소-히스티딘(및 이산화 트립토판)의 백분율을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 도시한다.
도 14는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 28을 포함하여, 강한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 MT1 및 산성 산 분획의 상이한 생산 로트에 존재하는 산성 종을 비교하기 위해 수행된 실험의 결과를 도시한다.
도 15는 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양 수확 샘플에 존재하는 산성 종 및 다른 변이체를 농축하기 위한 예시적인 방법을 도시한다.
도 16은 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 분획을 도시한다.
도 17은 이중 염-pH 구배를 사용하는 탈시알릴화된 MiniTrap(dsMT1)의 농축된 변이체 및 CEX에 적용되는 MT1 생산(임의의 생산 절차 전, BY3 이하)을 위한 예시적인 실시형태에 따라 수행된 강한 양이온 교환 크로마토그램을 도시한다.
도 18a는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 미분획된 모 대조군에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18b는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 실험에 대한 테일링(tailing) 특징의 일부를 나타내는 MT1, 분획 1에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18c는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 MT1, 분획 2 특징에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18d는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 MT1, 분획 3 특징에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18e는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 MT1, 분획 4 특징에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18f는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 MT1, 분획 5 특징에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18g는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 MT1, 분획 6 특징에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 18h는 예시적인 실시형태에 따라 강한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된 MT1, 분획 7 특징에 대한 3D 크로마토그램을 도시한다.
도 19는 MT1 생산에 대한 예시적인 실시형태에 따라 수행된 이미지화된 모세관 등전위 포커싱(imaged capillary isoelectric focusing: icIEF) 전기영동도를 도시한다.
도 20은 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 28, 29 83을 포함하여, 차가운 백색광 또는 UVA 광에의 MT1의 노출을 산화된 아미노산 잔기의 출현과 상관시키는 연구의 결과를 도시한다.
도 21은 예시적인 실시형태에 따른 약 350㎚(예를 들어, 약 350㎚를 강조하는 원 참조)에서 흡광도를 갖는 CWL-스트레스 받은 MT1에 대한 3D SEC-PDa(광다이오드 어레이 검출에 결합된 크기 배제 크로마토그래피) 크로마토그램을 도시하며, 여기서 A는 T=0에서의 크로마토그램을 보여주고, B는 0.5× ICH에서의 크로마토그램을 보여주며, C는 2.0× ICH에서의 크로마토그램을 보여주고, D는 상이한 시간 간격 동안 CWL에 의해 스트레스를 받은 바이알(80 ㎎/㎖로 정규화됨)에서의 MT1의 이미지를 보여준다.
도 22는 예시적인 실시형태에 따라 약 350㎚(예를 들어, 약 350㎚를 강조하는 원 참조)에서 흡광도를 갖는 UVA-스트레스 MT1에 대한 3D SEC-PDA 크로마토그램을 도시하며, 여기서 A는 T=0에서의 크로마토그램을 보여주고, B는 0.5× ICH에서의 크로마토그램을 보여주며, C는 2.0× ICH에서의 크로마토그램을 보여주고, D는 상이한 시간 간격 동안 UVA에 대해 스트레스를 받은 바이알(80 ㎎/㎖로 정규화됨)에서의 MT1의 이미지를 보여준다.
도 23a는 CWL(상단 패널)을 사용하여 스트레스를 받은 샘플에 대한 SEC-PDA 크로마토그램으로부터 정량화된 A320/280 흡광도 비를 도시하고, 도 23b는 CWL(하단 패널)을 사용하여 스트레스를 받은 샘플에서 크기 변이체에 대한 A320/280 흡광도 비의 차트를 도시하며, 여기서 샘플은 예시적인 실시형태에 따라 스트레스를 받는다.
도 24a는 UVA(상단 패널)를 사용하여 스트레스를 받은 샘플에 대한 SEC-PDA 크로마토그램으로부터 정량화된 A320/280 흡광도 비를 도시하고, 도 24b는 UVA(하단 패널)을 사용하여 스트레스를 받은 샘플에서 크기 변이체에 대한 A320/280 흡광도 비의 차트를 도시하며, 여기서 샘플은 예시적인 실시형태에 따라 스트레스를 받는다.
도 25a는 애플리버셉트와 함께 다양한 성분의 인큐베이션이 색상의 생성에 미치는 영향의 스케일 추정값(scaled estimate)을 도시하고(CIE L*, a*, b* 예측된 b 값); 도 25b는 예측된 b 값 플롯에 대한 실제를 도시한다.
도 26은 애플리버셉트의 역가(A), 생존 세포 농도(B), 생존능력(C), 암모니아(D), 및 삼투압 농도(E)에 대한 낮은 시스테인 및 낮은 금속을 포함하는 CDM의 효과를 도시한다.
도 27은 예시적인 실시형태에 따른 금속 및 시스테인의 농도 증가/감소에 대한 수확물의 색상(제13일 b* 값으로 나타남)의 예측 프로파일을 보여주는 차트이다.
도 28(a 내지 b)는 색상(CIE L*, a*, b* 예측된 b 값)(a)의 생성에 대한 폐 CDM(spent CDM)에서 애플리버셉트와 다양한 성분의 인큐베이션의 효과를 도시하며; b 값(b)에 대한 예측된 영향의 스케일링된 플롯으로 표시된다.
도 28c는 진탕 플라스크 배양에서 색상(CIE L*, a*, b* 예측된 b 값)의 생성에 대한 CDM에서 애플리버셉트와 다양한 성분의 인큐베이션의 스케일링된 추정 효과를 도시한다.
도 28d는 색상(CIE L*, a*, b* 예측된 "b" 값)의 생성에 대한 폐 CDM에서 애플리버셉트와 하이포타우린 및 데페록사민 메실레이트염(DFO)의 인큐베이션의 효과를 도시한다.
도 28e는 색상(CIE L*, a*, b* 예측된 "b" 값)의 생성에 대한 진탕 플라스크 배양으로부터의 애플리버셉트와 개별적으로 다양한 성분의 인큐베이션의 효과를 도시한다.
도 29는 생산된 애플리버셉트의 생산 역가에 대한 CDM 중 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손의 첨가 효과를 보여주는 차트이다.
도 30은 애플리버셉트가 생산되는 애플리버셉트를 발현하는 세포의 생존능력에 대한 CDM 중 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손의 첨가 효과를 보여주는 차트이다.
도 31은 애플리버셉트가 생산되는 애플리버셉트를 발현하는 세포의 생존 세포수에 대한 CDM 중 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손의 첨가 효과를 보여주는 차트이다.
도 32는 Cygnus 3G(F550)의 표준 숙주 세포 단백질 용액을 사용하여 제조된 흡광도 대 숙주 세포 단백질 농도(ng/㎖)의 표준 곡선을 보여주는 차트이다.
도 33은 비-환원 SDS-PAGE 샘플 완충액을 사용하여 수행된 SDS-PAGE 분석의 이미지이다.
도 34는 환원 SDS-PAGE 샘플 완충액을 사용하여 수행된 SDS-PAGE 분석의 이미지이다.
도 35a는 각각 VEGF165, mAb1 및 mAb2를 포함하는 친화성 크로마토그래피 칼럼 1 내지 3으로부터 용리된 분획인 로딩 용액에서 검출된 총 숙주 세포 단백질의 차트이다.
도 35b는 각각 VEGF165, mAb1, mAb3 및 mAb4를 포함하는 친화성 크로마토그래피 칼럼 1, 2, 4 및 5로부터 용리된 분획인 로딩 용액에서 검출된 총 숙주 세포 단백질의 차트이다.
도 36은 친화성 크로마토그래피 생성을 수행하기 전(A) 및 수행 후(B)의 VEGF MiniTrap의 SEC 프로파일을 도시한다.
도 37은 VEGF MiniTrap의 VEGF165에 대한 동역학 연구의 만화적 표현을 도시하되, 연구된 VEGF MiniTrap 작제물은 일부 예시적인 실시형태에 따라 친화성 크로마토그래피 생성을 수행하기 전과 후에 만들어졌다.
도 38은 VEGF MiniTrap의 VEGF165에 대한 동역학 연구로부터의 SPR 센서그램을 도시하되, 연구된 VEGF MiniTrap 작제물은 일부 예시적인 실시형태에 따라 친화성 크로마토그래피 생성을 수행하기 전과 후에 만들어졌다.
도 39는 VEGF165, mAb1 및 mAb2를 포함하는 칼럼에 대해 반복적으로 사용되는 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리된 분획인 로딩 용액에서 검출된 총 숙주 세포 단백질의 차트이다.
도 40은 예시적인 실시형태에 따른 VEGF MiniTrap MT1(서열번호 46)의 구조를 도시한다.
도 41은 예시적인 실시형태에 따른 VEGF MiniTrap MT6(서열번호 51)의 구조를 도시한다.
도 42는 MT1, MT5 및 MT6의 고유한 SEC-MS 분석에 대한 상대 흡광도 대 시간(분)의 총 이온 크로마토그램(TIC) 및 TIC로부터의 저분자량 영역의 확대도를 도시한다.
도 43은 일부 PTM에 대한 설명과 함께 MiniTrap 이량체 동일성을 확인하기 위한 MT1 및 MT5에 대한 주요 피크의 비권취된(deconvoluted) 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 44는 일부 PTM에 대한 설명과 함께 단일 사슬 MiniTrap 동일성을 확인하기 위한 MT6에 대한 주요 피크의 비권취된 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 45a는 MT1에서 저분자량 불순물에 대한 상대 흡광도 대 시간(분)의 차트를 도시한다.
도 45b는 MT1에서 저분자량 불순물에 대한 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 46은 애플리버셉트를 MT1으로 절단하는데 사용되었던 FabRICATOR 효소의 부재를 나타내는 MT1에 대한 상대 흡광도 대 시간(분)을 도시한다.
도 47은 MT5에서 저분자량 불순물에 대한 상대 흡광도 대 시간(분)을 도시한다.
도 48은 MT6에서 저분자량 불순물에 대한 상대 흡광도 대 시간(분)을 도시한다.
도 49a는 VEGF MiniTrap MT6에 대해 HILIC-UV/MS를 수행하여 얻어진 흡광도 대 시간(분)의 차트를 도시하되, 차트는 21분에서 주요 피크의 용리 및 약 21.5분에서 O-글리칸의 용리를 보여준다.
도 49b는 47985.8Da에서 주요 피크를 나타내는 VEGF MiniTrap MT6에 대해 HILIC-UV/MS를 수행하여 얻어진 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 49c는 HILIC-UV/MS를 수행하여 얻어진 VEGF MiniTrap MT6의 O-글리칸의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 50은 VEGF MiniTrap의 힌지 영역(서열번호 83)의 이황화브리지가 평행하거나 또는 교차될 수 있는 VEGF MiniTrap 이량체의 이미지이다.
도 51은 MT1, MT5 및 MT6 중 서열번호 100을 포함하는 Asn36에서 관찰된 글리칸 분포의 상대적 존재비를 도시한다.
도 52는 MT1, MT5 및 MT6 중 서열번호 101을 포함하는 Asn68에서 관찰된 글리칸 분포의 상대적 존재비를 도시한다.
도 53은 MT1, MT5 및 MT6 중 서열번호 102를 포함하는 Asn123에서 관찰된 글리칸 분포의 상대적 존재비를 도시한다.
도 54는 MT1, MT5 및 MT6 중 서열번호 203을 포함하는 Asn196에서 관찰된 글리칸 분포의 상대적 존재비를 도시한다.
도 55는 형광 검출 및 질량 분석법 분석(전체 규모 및 누적)과 결합된 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)에 의한 방출된 N-연결된 글리칸 분석을 도시한다.
도 56은 MT1, MT5 및 MT6에 대한 HILIC-FLR 크로마토그램을 도시한다.
도 57은 형광 검출 및 질량 분석법 분석(전체 규모, 누적 및 정규화)에 결합된 HILIC에 의한 방출된 N-연결된 글리칸 분석을 도시한다.
도 58a는 VEGF MiniTrap 샘플 MT1, MT5 및 MT6으로부터의 상세한 글리칸 확인 및 정량화의 표이다.
도 58b는 VEGF MiniTrap 샘플 MT1, MT5 및 MT6으로부터의 상세한 글리칸 확인 및 정량화의 표이다.
도 58c는 VEGF MiniTrap 샘플 MT1, MT5 및 MT6으로부터의 상세한 글리칸 확인 및 정량화의 표이다.
도 59는 예시적인 실시형태에 따른 MiniTrap을 제조하기 위한 예시적인 생산 절차를 도시한다.
기존 혈관구조로부터의 새로운 혈관의 성장인 혈관신생은 적절한 배아 및 출생 후 혈관 발달에 중요한 고도로 조율된 과정이다. 비정상적 또는 병리학적 혈관신생은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 신생혈관형성 인자의 상향조절이 내피 증식의 증가, 혈관구조 형태의 변화 및 혈관 투과성의 증가를 초래하는 암 및 여러 망막 질환의 특징이다. 다양한 안과 질환이 있는 환자의 유리체액 및 망막 혈관구조에서 VEGF의 수준이 상승한다는 것이 발견되었다. VEGF 활성 차단은 또한 DME, 습성 AMD, CNV, 망막 정맥 폐색 및 비정상적 혈관신생이 근본적인 병인인 다른 안과 질환을 치료하기 위한 선택 요법이 되었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 애플리버셉트는 인간 IgG1의 (Fc)와의 인라인 융합(inline fusion)으로 발현되는 인간 VEGFR1의 두 번째 Ig 도메인 및 인간 VEGFR2의 세 번째 Ig 도메인을 포함하는 모든 인간 아미노산 서열을 포함하는 하나의 이러한 항-VEGF 단백질이다. 애플리버셉트는 모든 형태의 VEGF-A(VEGF)에 결합하지만, 추가적으로 PlGF 및 VEGF-B에도 결합한다. 여러 다른 동종이량체 VEGF MiniTrap은 애플리버셉트로부터 효소적으로 절단된 생성물로 생성되거나 또는 숙주 세포주로부터 직접 재조합적으로 발현되었다. VEGF MiniTrap의 하나의 이러한 한 예가 도 1에 나타나 있다. 이 도면에는, 말단 라이신이 표시되어 있고(k); 일부 배양 공정은 이 말단 라이신을 제거하는 반면 다른 것은 제거하지 않는다. 도 1은 말단 라이신이 잔류하는 과정을 나타낸다. 일반적으로, 애플리버셉트는 말단 라이신의 존재 및 부재를 모두 포함한다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 부분적으로 CDM을 사용한 항-VEGF 단백질(실시예 1)의 생산을 개시한다. 소정의 CDM을 사용하여 생산된 애플리버셉트를 포함하는 용액의 분석은 진한 황갈색 색상과 같은 소정의 색상 특성을 보여주었다. 용액의 색상의 세기는 사용된 CDM에 따라 다르다. 조사된 모든 CDM이 용액을 5 g/ℓ의 농도로 정규화한 후 뚜렷한 황갈색 색상을 갖는 샘플을 생성한 것은 아니다.
주사 가능한 치료 약물 용액에서 황갈색과 같은 색상은 바람직하지 않은 특징일 수 있다. 이는 의약품이 특정 치료제에 대해 미리 결정된 수준의 순도 및 품질을 만족하는지 여부를 결정하는 데 사용되는 중요한 매개변수일 수 있다.
생물학적 제제(biologic)의 제조 경로에서 관찰되는 황갈색과 같은 색상은 생물학적 제제의 화학적 변형, 제형 부형제의 분해 산물 또는 생물학적 제제와 제형 부형제의 반응을 통해 형성된 분해 산물에 의해 야기될 수 있다. 그러나, 이러한 정보는 색상 변화의 원인을 이해하는 데 유용할 수 있다. 또한, 이는 이러한 색상 변화를 촉진하는 변형을 방지하기 위해 단기 보관뿐만 아니라 장기 보관 조건을 설계하는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명자들은 항-VEGF 단백질 용액의 제조 동안 AEX의 사용이 황갈색 착색을 최소화함을 관찰하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 황갈색 착색이 재조합 단백질, 예컨대, 애플리버셉트 또는 MiniTrap과 같은 변형된 애플리버셉트를 생산하는데 사용되는 세포 배양을 변형시킴으로써 감소될 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 항-VEGF 단백질 및 CDM을 사용한 이의 생산을 포함한다. 추가적으로, 본 발명은 단백질 생산을 위한 상류 및 하류 공정 기술의 확인 및 최적화를 기반으로 한다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 아래 제시된 실시예 중 일부는 항-VEGF 단백질의 생산(실시예 1), 항-VEGF 단백질의 산화된 종의 생산(실시예 4), 배양 배지를 최적화함으로써(실시예 5) 그리고 생산 방법을 최적화함으로써(실시예 2) 항-VEGF 단백질의 산화된 종을 감소시키는 방법을 설명한다.
다수의 최근 특허 출원 및 등록 특허가 다양한 애플리버셉트 종 및 이를 제조하는 방법을 설명하는 것으로 알려져 있지만, 본 명세서에 기재된 항-VEGF 조성물 및 이를 생산하는 방법을 기재하거나 시사하고 있지 않다. 예를 들어, 코히러스 바이오사이언시스 인코포레이티드(Coherus Biosciences Inc.)의 미국 출원 제16/566,847호, 삼천당 컴퍼니 리미티드(Sam Chun Dang Pharm. Co., Ltd.)의 미국 특허 제10,646,546호, 포미콘 아게(Formycon AG)의 미국 특허 제10,576,128호, 암젠 인코포레이티드(Amgen Inc.)의 국제 특허 제PCT/US2020/015659호 및 미국 특허 제8,956,830호; 모멘타 파마슈티칼스 인코포레이티드(Momenta Pharmaceuticals, Inc.)의 제9,217,168호; 제9,487,810호; 제9,663,810호; 제9,926,583호; 및 제10,144,944호 참조.
I. 선택된 용어에 대한 설명
달리 기재되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당업자에게 공지된 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 명세서에 기재된 특정 실시형태의 실시에 사용될 수 있다. 언급된 모든 간행물은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
단수형 용어는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 변형을 허용하는 것으로 이해되어야 하며, 여기서 범위가 제공되고 종점이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혈관형성 눈 장애"는 혈관의 성장 또는 증식 또는 혈관 누출로 인해 유발되거나 또는 이와 관련된 임의의 눈의 질환을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화학적으로 정의된 배지" 또는 "화학적으로 정의된 배지"(둘 다 "CDM"으로 약칭됨)는 모든 성분의 동일성 및 농도가 정의된 합성 성장 배지를 지칭한다. 화학적으로 정의된 배지는 세균, 효모, 동물 또는 식물 추출물, 동물 혈청 또는 혈장을 포함하지 않지만, 개별 식물 또는 동물-유래 성분(예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드 등)이 첨가될 수 있다. 화학적으로 정의된 배지는 지지체 성장을 지원하는데 필요한 포스페이트, 설페이트 등과 같은 무기염을 포함할 수 있다. 탄소 공급원이 정의되며, 이는 일반적으로 글루코스, 락토스, 갈락토스 등과 같은 당 또는 글리세롤, 락테이트, 아세테이트 등과 같은 기타 화합물이다. 소정의 화학적으로 정의된 배양 배지는 또한 완충액으로서 포스페이트 염을 사용하지만, 소듐 바이카보네이트, HEPES, 시트레이트, 트라이에탄올아민 등과 같은 다른 완충액이 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 화학적으로 정의된 배지의 예는 다양한 둘베코 변형 이글(DME) 배지(시그마-알드리치 코포레이션(시그마-Aldrich Co); SAFC 바이오사이언시스 인코포레이티드(SAFC Biosciences, Inc.)), 함스 영양 혼합물(시그마-알드리치 코포레이션; SAFC 바이오사이언시스 인코포레이티드), 다양한 EX-CELL 배지(시그마-알드리치 코포레이션; SAFC 바이오사이언시스 인코포레이티드), 다양한 IS CHO-CD 배지(후지필름 어바인 사이언티픽(FUJIFILM Irvine Scientific)), 이들의 조합 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 화학적으로 정의된 배양 배지를 제조하는 방법은 당업계, 예를 들어, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217 및 미국 공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있으며, 이들의 전체 교시내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "누적량"은 성분의 배양 초기(제0일의 CDM)에 첨가된 양 및 후속적으로 첨가된 양을 포함하여 CDM을 형성하기 위해 세포 배양 공정에 걸쳐 생물반응기에 첨가된 특정 성분의 총량을 의미한다. 생물반응기 생산 전(즉, 제0일의 CDM 전) 시드-트레인 배양물 또는 접종물에 첨가된 성분의 양도 또한 성분의 누적량을 계산할 때 포함된다. 누적량은 배양 동안 시간 경과에 따른 성분의 손실(예를 들어, 대사 또는 화학적 소화를 통해)의 영향을 받지 않는다. 따라서, 성분의 누적량이 동일한 두 배양물은 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 성분이 상이한 시간에 두 배양물에 첨가되는 경우(예를 들어, 한 배양물에는 모든 성분이 처음에 첨가되고, 다른 배양물에는 성분이 시간이 지남에 따라 첨가되는 경우) 상이한 절대 수준을 가질 수 있다. 누적량은 또한 배양 동안 시간 경과에 따른 성분의 제자리 합성(예를 들어, 대사 또는 화학적 전환을 통해)에 영향을 받지 않는다. 따라서, 주어진 성분의 누적량이 동일한 두 배양물은 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 성분이 생물전환 과정에 의해 두 배양물 중 하나에서 제자리에서 합성되는 경우 상이한 절대 수준을 가질 수 있다. 누적량은, 예를 들어, 성분의 그램 또는 몰과 같은 단위로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "누적 농도"는 배양에 사용된 임의의 접종물의 시작 부피에 대한 기여도를 포함하여 생산 배취의 시작시 생물반응기의 액체 부피로 나눈 성분의 누적량을 지칭한다. 예를 들어, 생물반응기에 생산 배취의 시작시 2 리터의 세포 배양 배지가 포함되어 있고 1그램의 성분 X가 제0일, 제1일, 제2일 및 제3일에 첨가되면, 3일 후 누적 농도는 2 g/ℓ(즉, 4그램을 2리터로 나눈 값)이다. 제4일에, 성분 X를 포함하지 않는 추가적인 1리터의 액체를 생물반응기에 첨가하면, 누적 농도는 2 g/ℓ로 유지될 것이다. 제5일에, 일정량의 액체가 생물반응기로부터 손실된 경우(예를 들어, 증발을 통해), 누적 농도는 2 g/ℓ로 유지될 것이다. 누적 농도는, 예를 들어, 리터당 그램 또는 리터당 몰과 같은 단위로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "제형"은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 비히클과 함께 제형화되는 관심 있는 단백질을 지칭한다. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트 및/또는 MiniTrap이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 제형에서 관심 있는 단백질의 양은 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 600 ㎎/㎖ 범위일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 제형에서 관심 있는 단백질의 양은 약 0.01 ㎎/㎖, 약 0.02 ㎎/㎖, 약 0.03 ㎎/㎖, 약 0.04 ㎎/㎖, 약 0.05 ㎎/㎖, 약 0.06 ㎎/㎖, 약 0.07 ㎎/㎖, 약 0.08 ㎎/㎖, 약 0.09 ㎎/㎖, 약 0.1 ㎎/㎖, 약 0.2 ㎎/㎖, 약 0.3 ㎎/㎖, 약 0.4 ㎎/㎖, 약 0.5 ㎎/㎖, 약 0.6 ㎎/㎖, 약 0.7 ㎎/㎖, 약 0.8 ㎎/㎖, 약 0.9 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖, 약 2 ㎎/㎖, 약 3 ㎎/㎖, 약 4 ㎎/㎖, 약 5 ㎎/㎖, 약 6 ㎎/㎖, 약 7 ㎎/㎖, 약 8 ㎎/㎖, 약 9 ㎎/㎖, 약 10 ㎎/㎖, 약 15 ㎎/㎖, 약 20 ㎎/㎖, 약 25 ㎎/㎖, 약 30 ㎎/㎖, 약 35 ㎎/㎖, 약 40 ㎎/㎖, 약 45 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖, 약 55 ㎎/㎖, 약 60 ㎎/㎖, 약 65 ㎎/㎖, 약 70 ㎎/㎖, 약 5 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 85 ㎎/㎖, 약 90 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 110 ㎎/㎖, 약 120 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖, 약 140 ㎎/㎖, 약 150 ㎎/㎖, 약 160 ㎎/㎖, 약 170 ㎎/㎖, 약 180 ㎎/㎖, 약 190 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖, 약 225 ㎎/㎖, 약 250 ㎎/㎖, 약 275 ㎎/㎖, 약 300 ㎎/㎖, 약 325 ㎎/㎖, 약 350 ㎎/㎖, 약 375 ㎎/㎖, 약 400 ㎎/㎖, 약 425 ㎎/㎖, 약 450 ㎎/㎖, 약 475 ㎎/㎖, 약 500 ㎎/㎖, 약 525 ㎎/㎖, 약 550 ㎎/㎖, 약 575 ㎎/㎖ 또는 약 600 ㎎/㎖일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 조성물의 pH는 약 5.0 초과일 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, pH는 약 5.0 초과, 약 5.5 초과, 약 6 초과, 약 6.5 초과, 약 7 초과, 약 7.5 초과, 약 8 또는 약 8.5 초과일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "데이터베이스"는 데이터베이스(들)의 모든 가능한 서열에 대해 해석되지 않은 MS-MS 스펙트럼을 검색할 수 있는 가능성을 제공하는 생물정보학 도구를 지칭한다. 이러한 도구의 비제한적인 예는 Mascot(http://www.matrixscience.com), 스펙트럼 Mill(http://www.chem.agilent.com), PLGS(http://www.waters.com), PEAKS(http://www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot(http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx(http://www.phenyx-ms.com), Sorcerer(http://www.sagenresearch.com), OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem(http://www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector(http://www. http://prospector.ucsf.edu/ prospector/ mshome.htm), Byonic(http://www.proteinmetrics.com/products/byonic) 또는 Sequest(http://fields.scripps.edu/sequest)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "한외여과" 또는 "UF"는 반-투과성 막을 통해 물을 강제로 통과시키기 위해 정수압(hydrostatic pressure)을 사용하는 역삼투와 유사한 막 여과 공정을 포함할 수 있다. 한외여과는 문헌[LEOS J. ZEMAN & ANDREW L. ZYDNEY, MICROFILTRATION AND ULTRAFILTRATION: PRINCIPLES AND APPLICATIONS (1996)]에 자세히 기술되어 있으며, 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용된다. 0.1㎛보다 작은 기공 크기를 갖는 필터가 한외여과를 위해 사용될 수 있다. 이러한 작은 기공 크기를 갖는 필터를 이용함으로써, 필터를 통한 샘플 완충액의 투과를 통해 샘플의 부피는 감소될 수 있는 반면, 단백질은 필터 뒤에 남는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정용여과" 또는 "DF"는 염, 당 및 비-수성 용매를 제거 및 교환하고, 결합된 종으로부터 분리하고, 저분자량 물질을 제거하고/하거나 이온 및/또는 pH 환경의 급격한 변화를 유발하기 위해 한외여과기를 사용하는 방법을 포함할 수 있다. 미세용질(Microsolute)은 한외여과 비율과 거의 동일한 비율로 한외여과되는 용액에 용매를 첨가함으로써 가장 효율적으로 제거된다. 이는 일정한 부피로 용액으로부터 미세종을 씻어낸다. 본 발명의 소정의 예시적인 실시형태에서, 정용여과 단계는, 예를 들어, 크로마토그래피 또는 다른 생산 단계 전에 본 발명과 관련하여 사용되는 다양한 완충액을 교환할 뿐만 아니라 단백질 제조물로부터 불순물을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "하류 공정 기술"은 상류 공정 기술 이후 단백질을 생산하는데 사용되는 하나 이상의 기법을 지칭한다. 하류 공정 기술은, 예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함하는 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 VEGF 수용체(VEGFR)와 같은 동족(cognate)과 상호작용할 수 있는 VEGF와 같이 잘-정의된 분자를 갖는 고체상을 사용하는 친화성 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피와 같은 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 치환 크로마토그래피를 사용한, 예를 들어, 단백질 제품의 생산을 포함한다.
어구 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 관심 있는 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 또한 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 소정의 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 실시형태에서, 숙주 세포는 임의의 생명계로부터 선택되는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함한다. 일 양태에서, 진핵생물 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 추가의 양태에서, 숙주 세포는 식물 및/또는 동물 세포와 같은 진핵생물 세포를 포함한다. 세포는 포유동물 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 배양에서 성장하기에 적합한 다양한 포유동물 세포주는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 버지니아주 머내서스 소재) 및 다른 기탁기관뿐만 아니라 상업적 공급체로부터 입수 가능하다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 세포는 MK2.7 세포, PER-C6 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell: CHO), 예컨대, CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(문헌[Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36: 10901-10909]; 및 WO 01/92337 A2), 다이하이드로폴레이트 리덕테이스 음성 CHO 세포(CHO/-DHFR, 문헌[Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216]) 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 제5,721,121호); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); HEK 293 세포 및 Sp2/0 세포, 5L8 하이브리도마 세포, Daudi 세포, EL4 세포, HeLa 세포, HL-60 세포, K562 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, Sp2/0 세포, 일차 상피 세포(예를 들어, 각질형성세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 이들의 계통(예를 들어, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 293 세포 또는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌[Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59]); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251]); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 인간 간종양 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(문헌[Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68]); MCR 5 세포; FS4 세포; PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, BeWo 세포, Chang 세포, 디트로이트(Detroit) 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포 및 TH-I, B1 세포 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 기관으로부터의 섬유아세포(심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직(림프선, 아데노이드, 편도선, 골수 및 혈액), 비장 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주(예를 들어, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시(Dempsey) 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 계통 2071(마우스 L) 세포, L-M 계통(마우스 L) 세포, L-MTK(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인디언 문탁(Indian muntac) 세포, SIRC 세포, CII 세포 및 젠센(Jensen) 세포 또는 이들의 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지 않음) 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 세포 유형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포 단백질"(숙주 세포 단백질: HCP)은 숙주 세포로부터 유래되는 단백질을 포함하며, 목적하는 관심 있는 단백질과 관련이 없을 수 있다. 숙주 세포 단백질은 제조 과정으로부터 유래되는 공정-관련 불순물일 수 있으며, 세포 기질-유래, 세포 배양-유래 및 하류 유래의 세 가지 주요 범주를 포함할 수 있다. 세포 기질-유래 불순물은 숙주 유기체 및 핵산(숙주 세포 게놈, 벡터 또는 총 DNA)으로부터 유래되는 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포 배양-유래 불순물은 유도물질, 항생제, 혈청 및 다른 배지 성분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하류-유래 불순물은 효소적, 화학적 및 생화학적 처리 시약(예를 들어, 사이아노겐 브로마이드, 구아니딘, 산화제 및 환원제), 무기염(예를 들어, 중금속, 비소, 비금속 이온), 용매, 담체, 리간드(예를 들어, 단일클론 항체) 및 기타 침출물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 예시적인 실시형태에서, 숙주 세포 단백질은 약 4.5 내지 약 9.0 범위의 pI를 가질 수 있다. 예시적인 실시형태에서, pI는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9 또는 약 9.0일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가수분해제"는 단백질의 소화를 수행할 수 있는 다수의 상이한 작용제 중 임의의 하나 또는 조합을 지칭한다. 효소적 소화를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예는 아스퍼질러스 사이토이로부터의 프로테이스, 엘라스테이스, 서브틸리신, 프로테이스 XIII, 펩신, 트립신, Tryp-N, 키모트립신, 아스퍼질로펩신 I, LysN 프로테이스(Lys-N), LysC 엔도프로티네이스(Lys-C), 엔도프로티네이스 Asp-N(Asp-N), 엔도프로티네이스 Arg-C(Arg-C), 엔도프로티네이스 Glu-C(Glu-C) 또는 외막 단백질 T(OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린-소화 효소(IdeS), 서몰리신, 파파인, 프로네이스, V8 프로테이스 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 상동체 또는 이들의 조합을 포함한다. 비-효소적 분해를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예는 고온, 마이크로파, 초음파, 고압, 적외선, 용매(비제한적인 예는 에탄올 및 아세토나이트릴임), 고정화 효소 소화(immobilized enzyme digestion: IMER), 자성 입자 고정화 효소 및 온칩 고정화 효소의 사용을 포함한다. 단백질 소화에 이용 가능한 기법에 대한 최근의 리뷰에 대해, 그 전체 교시 내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Switzar et al., "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (Linda Switzar, Martin Giera & Wilfried M. A. Niessen, Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments, 12 Journal of Proteome Research 1067-1077 (2013)]을 참조한다. 가수분해제의 하나 또는 조합은 서열-특이적 방식으로 단백질 또는 폴리펩타이드에서 펩타이드 결합을 절단하여 예측 가능한 더 짧은 펩타이드의 모음을 생성할 수 있다. 가수분해제 대 단백질의 비 및 소화에 필요한 시간은 단백질의 최적의 소화를 얻기 위해 적절하게 선택될 수 있다. 효소 대 기질 비가 부적절하게 높을 때, 그에 상응하게 높은 소화율은 펩타이드가 질량 분석기로 분석되는데 충분한 시간을 허용하지 않을 것이며, 서열 해독범위(coverage)가 손상될 것이다. 반면에, 낮은 E/S 비는 긴 소화를 필요로 할 것이므로, 긴 데이터 수집 시간이 필요하다. 효소 대 기질 비는 약 1:0.5 내지 약 1:200 범위일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "소화"는 단백질의 하나 이상의 펩타이드 결합의 가수분해를 지칭한다. 적절한 가수분해제, 예를 들어, 효소적 소화 또는 비-효소적 분해를 사용하여 생물학적 샘플에서 단백질의 소화를 수행하는 몇 가지 접근법이 있다. 샘플에서 단백질을 소화하기 위해 널리 인정되는 방법 중 하나는 프로테이스의 사용을 포함한다. 많은 프로테이스를 이용할 수 있으며, 이들 각각은 특이성, 효율 및 최적의 소화 조건의 측면에서 고유한 특성을 갖는다. 프로테이스는 펩타이드 내의 비-말단 또는 말단 아미노산을 절단하는 프로테이스의 능력에 기초하여 분류되는 엔도펩티데이스 및 엑소펩티데이스 둘 다를 지칭한다. 대안적으로, 프로테이스는 또한 촉매 메커니즘에 기초하여 분류되는 6개의 별개의 클래스 - 아스파르트산, 글루탐산 및 메탈로프로테이스, 시스테인, 세린 및 트레오닌 프로테이스를 지칭한다. 용어 "프로테이스" 및 "펩티데이스"는 펩타이드 결합을 가수분해하는 효소를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "함께(in association with)"는 항-ANG2와 같은 또 다른 작용제와 함께 본 발명의 성분 항-VEGF 조성물이 동시 전달을 위해 단일 조성물로 제형화되거나 또는 2개 이상의 조성물(예를 들어, 각 성분을 포함하는 키트)로 별도로 제형화될 수 있음을 나타낸다. 서로 함께 투여되는 성분은 다른 성분이 투여될 때와 상이한 시간에 대상체에 투여될 수 있으며: 예를 들어, 각 투여는 주어진 기간에 걸쳐 간격을 두고 비-동시적으로(예를 들어, 개별적으로 또는 순차적으로) 주어질 수 있다. 서로 함께 투여되는 별개의 성분은 또한 동일한 투여 시간 동안 본질적으로 동시에(예를 들어, 정확히 동일한 시간에 또는 비-임상적으로 유의한 기간으로 분리하여) 투여될 수 있다. 더욱이, 서로 함께 투여되는 별개의 성분, 예를 들어, 항-ANG2와 같은 또 다른 작용제와 함께 애플리버셉트의 조성물은 동일하거나 또는 상이한 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있되, 애플리버셉트의 조성물은 이의 변이체의 약 15% 이하를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "액체 크로마토그래피"는 액체에 의해 운반되는 생물학적/화학적 혼합물이 고정 액체 또는 고체상을 통해(또는 그 안으로) 흐를 때 성분의 차등 분포의 결과로 인해 성분으로 분리될 수 있는 과정을 지칭한다. 액체 크로마토그래피의 비제한적인 예는 역상 액체 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 혼합-모드 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 혼합-모드 크로마토그래피를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "친화성 크로마토그래피"는 두 물질이 크로마토그래피 물질에 대한 친화도를 기준으로 분리되는 임의의 방법을 포함하는 분리를 포함할 수 있다. 이는 물질을 적합한 친화성 크로마토그래피 매질을 포함하는 칼럼에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 매질의 비제한적인 예는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 결합 분자(예를 들어, 항체)가 생성되는 항원을 포함하는 친화성 지지체, 관심 있는 단백질에 결합할 수 있는 단백질 및 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 지지체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 양태에서, 친화성 칼럼은 샘플 로딩 전에 적합한 완충액으로 평형화될 수 있다. 적합한 완충액의 예는 Tris/NaCl 완충액(pH 약 7.0 내지 8.0)일 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 적합한 완충액을 개발할 수 있다. 이러한 평형화 후에, 샘플은 칼럼에 로딩될 수 있다. 칼럼의 로딩 후, 칼럼은, 예를 들어, 평형 완충액을 사용하여 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 상이한 완충액을 이용하는 세척을 포함하여 다른 세척이 칼럼을 용리하기 전에 사용될 수 있다. 그런 다음, 친화성 칼럼이 적절한 용리 완충액을 사용하여 용리될 수 있다. 적합한 용리 완충액의 예는 아세트산/NaCl 완충액(pH 약 2.0 내지 3.5)일 수 있다. 다시, 당업자는 과도한 실험 없이 적절한 용리 완충액을 개발할 수 있다. 용리액은 UV를 포함하여 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 모니터링될 수 있으며, 예를 들어, 특히 관심 있는 샘플이 방향족 고리를 포함하는 경우(예를 들어, 트립토판과 같은 방향족 아미노산을 갖는 단백질) 280㎚에서의 흡광도가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이온 교환 크로마토그래피"는 두 물질이 관심 있는 분자 및/또는 크로마토그래피 물질 전체 또는 관심 있는 분자 및/또는 크로마토그래피 물질의 특정 영역에서 국부적으로 각각의 이온 전하의 차이에 기초하여 분리되므로 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질을 사용할 수 있는 임의의 방법을 포함하는 분리를 지칭한다. 이온 교환 크로마토그래피는 관심 있는 분자의 국부 전하와 크로마토그래피 물질의 국부 전하 간의 차이를 기반으로 분자를 분리한다. 팩킹된 이온-교환 크로마토그래피 칼럼 또는 이온-교환 막 장치는 결합-용리 모드, 통과 모드 또는 하이브리드 모드로 작동될 수 있다. 평형화 완충액 또는 또 다른 완충액으로 칼럼 또는 막 장치를 세척한 후, 생성물 회수는 이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁하기 위해 용리 완충액의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시켜 달성될 수 있다. pH를 변경하여 용질의 전하를 변경하는 것은 용질의 용리를 달성하기 위한 또 다른 방법이 될 수 있다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용리) 또는 단계적(단계 용리)일 수 있다. 음이온 또는 양이온 치환기가 크로마토그래피를 위한 음이온 또는 양이온 지지체를 형성하기 위해 매트릭스에 부착될 수 있다. 음이온 교환 치환기의 비제한적인 예는 다이에틸아미노에틸(diethylaminoethyl: DEAE), 4차 아미노에틸(quaternary aminoethyl: QAE) 및 4차 아민(Q)기를 포함한다. 양이온 치환기는 카복시메틸(carboxymethyl: CM), 설포에틸(sulfoethyl: SE), 설포프로필(sulfopropyl: SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)를 포함한다. 셀룰로스 이온 교환 매질 또는 지지체는 DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™ 및 CM-52™을 포함할 수 있으며, 와트만 리미티드(Whatman Ltd, 영국 메이드스톤 켄트 소재)로부터 입수 가능하다. SEPHADEX®-기반 및 -가교연결 이온 교환기도 또한 알려져 있다. 예를 들어, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-SEPHADEX® 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-SEPHAROSE® 및 SEPHAROSE® Fast Flow 및 Capto™ S가 모두 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터 입수 가능하다. 또한, 토소 하아스 컴퍼니(Toso Haas Co., 펜실베니아주 필라델피아 소재)의 TOYOPEARL™ DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL™ CM-650S 또는 M과 같은 DEAE 및 CM 유도체화된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체 또는 바이오래드(BioRad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)의 Nuvia S 및 UNOSphere™ S, 이엠디 밀리포어(EMD Millipore, 매사추세츠주 소재)의 Eshmuno® S가 이용 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피 수지"는 페닐, 옥틸, 뷰틸 등으로 공유적으로 변형될 수 있는 고체상을 포함할 수 있다. 분자를 서로 분리하기 위 소수성의 특성을 사용할 수 있다. 이러한 유형의 크로마토그래피에서, 페닐, 옥틸, 헥실 또는 뷰틸과 같은 소수성기는 칼럼의 고정상을 형성할 수 있다. 단백질, 펩타이드 등과 같은 분자는 표면 상에 하나 이상의 소수성 영역을 갖거나 또는 소수성 포켓이 있으며 HIC의 고정상을 포함하는 소수성기와 상호작용할 수 있는 HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피) 칼럼을 통과한다. HIC 수지 또는 지지체의 예는 Phenyl sepharose FF, Capto Phenyl(지이 헬스케어, 스웨덴 웁살라 소재), 페닐 650-M(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 일본 도쿄 소재) 및 Sartobind Phenyl(Sartobind Phenyl)(사르토리우스 코포레이션(Sartorius corporation), 미국 뉴욕 소재)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼합 모드 크로마토그래피" 또는 "다중 모드 크로마토그래피"(둘 다 "MMC")는 용질이 하나 이상의 상호작용 모드 또는 메커니즘을 통해 고정상과 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 포함한다. MMC는 전통적인 역상(reversed-phased: RP), 이온 교환(IEX) 및 순상 크로마토그래피(normal phase: NP)에 대한 대안적 또는 보완적 도구로서 사용될 수 있다. 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 및 이온 상호작용이 각각 지배적인 상호작용 모드인 RP, NP 및 IEX 크로마토그래피와 달리, 혼합-모드 크로마토그래피는 이들 상호작용 모드 중 둘 이상의 조합을 이용할 수 있다. 혼합 모드 크로마토그래피 매질은 단일 모드 크로마토그래피에 의해 재현될 수 없는 고유한 선택성을 제공할 수 있다. 혼합 모드 크로마토그래피는 또한 친화성-기반 방법과 비교하여 잠재적인 비용 절감, 더 긴 칼럼 수명 및 작동 유연성을 제공할 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 매질은 직접적으로 또는 스페이서를 통해 때때로 기본 매트릭스로 표시되는 유기 또는 무기 지지체에 결합되는 혼합 모드 리간드로 구성될 수 있다. 지지체는 본질적으로 구형 입자, 모노리스, 필터, 막, 표면, 모세관 등과 같은 입자의 형태일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 지지체는 가교된 탄수화물 물질, 예컨대, 아가로스, agPV, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 곤약, 카라기난, 젤란, 알기네이트 등과 같은 고유한 중합체로 제조될 수 있다. 높은 흡착 용량을 얻기 위해, 지지체는 다공성일 수 있으며, 그 후 리간드는 외부 표면뿐만 아니라 기공 표면에도 결합된다. 이러한 고유한 중합체 지지체는 역 현탁 겔화(문헌[S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398(1964)], 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨)와 같은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 대안적으로, 지지체는 가교된 합성 중합체, 예를 들어, 스타이렌 또는 스타이렌 유도체, 다이비닐벤젠, 아크릴아마이드, 아크릴레이트 에스터, 메타크릴레이트 에스터, 비닐 에스터, 비닐 아마이드 등과 같은 합성 중합체로 제조될 수 있다. 이러한 합성 중합체는 표준 방법, 예를 들어, 그 전체 교시내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L′Industria 70(9), 70-75 (1988)]에 따라 제조될 수 있다. 다공성 천연 또는 합성 중합체 지지체가 또한 지이 헬스케어(스웨덴 웁살라 소재)와 같은 상업적 공급처로부터 입수 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "질량 분석기"는 특정 분자 종을 확인하고 이들의 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 용어는 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 특성화될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미한다. 질량 분석기는 세 가지 주요 부분: 이온 공급원, 질량 분석기 및 검출기를 포함할 수 있다. 이온 공급원의 역할은 기체상 이온을 생성하는 것이다. 피분석물 원자, 분자 또는 클러스터는 기체상으로 전환되고 동시에(전자분무 이온화에서와 같이) 또는 별개의 공정을 통해 이온화될 수 있다. 이온 공급원의 선택은 적용에 따라 다르다. 일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "탠덤 질량 분석법"은 샘플 분자에 대한 구조적 정보가 여러 단계의 질량 선택 및 질량 분리를 사용하여 얻어지는 기법을 사용한다. 전제 조건은 첫 번째 질량 선택 단계 후에 단편이 예측 가능하고 제어 가능한 방식으로 형성되도록 샘플 분자가 기체상으로 변환되고 이온화하는 것이다. 다단계 MS/MS 또는 MSn은 의미 있는 정보를 얻을 수 있거나 또는 단편 이온 신호가 검출될 수 있는 있는 한 먼저 전구체 이온(MS2)을 선택 및 단리하고, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온(MS3)을 단리하고, 이를 단편화하고, 2차 단편(MS4)을 단편화하는 등에 의해 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 소정의 어플리케이션에 결합될 분석기는 민감도, 선택성 및 속도뿐만 아니라 크기, 비용 및 이용 가능성과 같은 많은 상이한 인자에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 두 가지 주요 범주는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 탠덤-인-타임 분석기가 공간에서 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 결합되는 하이브리드도 있다. 탠덤-인-스페이스 질량 분석기는 이온 공급원, 전구체 이온 활성화 장치 및 적어도 2개의 비-트래핑 질량 분석기를 포함한다. 특정 m/z 분리 기능은 기기의 한 부문에서 이온이 선택되고, 중간 영역에서 분리된 다음 생성 이온이 m/z 분리 및 데이터 수집을 위한 또 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다. 탠덤-인-타임에서, 이온 공급원에서 생성된 질량 분석기 이온은 동일한 물리적 장치에서 트래핑되고, 단리되고, 단편화되고, m/z 분리될 수 있다. 질량 분석기에 의해 확인된 펩타이드는 온전한 단백질 및 이들의 번역 후 변형의 대리 대표로서 사용될 수 있다. 이들은 실험적 및 이론적 MS/MS 데이터를 상호연관시킴으로써 단백질 특성화에 사용될 수 있으며, 후자는 단백질 서열 데이터베이스에서 가능한 펩타이드로부터 생성된다. 특성화는 단백질 단편의 아미노산의 시퀀싱, 단백질 시퀀싱의 결정, 단백질 데노보(de novo) 시퀀싱의 결정, 번역 후 변형의 위치 찾기 또는 번역 후 변형의 확인, 또는 비교 가능성 분석 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Mini-Trap" 또는 "MiniTrap" 또는 "MiniTrap 결합 분자"는 VEGF 분자에 결합할 수 있다. 이러한 MiniTrap은 (i) 키메라 폴리펩타이드뿐만 아니라 (ii) 예를 들어, 하나 이상의 이황화브리지에 의해 비-공유적으로 결합된 2개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 다량체(예를 들어, 이량체) 분자를 포함할 수 있다. MiniTrap은 화학적 변형, 효소적 활성을 통해 생산되거나 또는 재조합적으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "VEGF MiniTrap" 또는 "VEGF MiniTrap 결합 분자"는 VEGF에 결합하고, 하나 이상의 세트의 VEGF 수용체 Ig-유사 도메인(또는 이의 변이체)(예를 들어, VEGFR1 Ig 도메인 2 및/또는 VEGFR2 Ig 도메인 3 및/또는 4) 및 변형되거나 또는 존재하지 않는(absent) 다량체화 성분(multimerizing component: MC)을 갖는 분자 또는 분자의 복합체일 수 있으며, 여기서, 예를 들어, MC는 변형된 면역글로불린 Fc이다. 변형은 VEGF 트랩(예를 들어, 애플리버셉트 또는 컨버셉트(conbercept))의 단백질 분해성 소화 또는 단축된 MC 서열을 갖는 생성된 폴리펩타이드 사슬의 직접적인 발현의 결과일 수 있다. (도 1에 도시된 분자 구조 참조). 도 1은 스트렙토코커스 피오게네스 IdeS를 이용한 애플리버셉트의 단백질 분해 산물인 VEGF MiniTrap 분자를 묘사한다. 동종이량체 분자는 2개의 평행한 이황화 결합에 의해 연결된 Ig 힌지 도메인 단편을 갖는 것으로 묘사된다. VEGFR1 도메인, VEGFR2 도메인 및 힌지 도메인 단편(MC)이 표시되어 있다. 애플리버셉트에서 IdeS 절단이 일어나는 지점은 "//"로 표시된다. 애플리버셉트로부터 절단된 Fc 단편도 또한 표시된다. 이량체화되지 않은 단일의 이러한 키메라 폴리펩타이드도 또한 VEGF 결합 활성이 있는 경우 VEGF MiniTrap일 수 있다. 용어 "VEGF MiniTrap"은 MC가 결여되어 있지만 링커(예를 들어, 펩타이드 링커)와 하나 이상의 VEGF 수용체 Ig 도메인(또는 이의 변이체)의 하나 이상의 추가의 세트에 대한 링커와 융합된 하나 이상의 VEGF 수용체 Ig 도메인(또는 이의 변이체)의 제1 세트를 포함하는 단일 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 VEGF MiniTrap에서 VEGF 결합 도메인은 또 다른 도메인과 동일하거나 또는 상이할 수 있다(WO2005/00895 참조, 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨).
예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, 비변형된 면역글로불린 Fc 도메인은 아미노산 서열 또는 이의 아미노산 1 내지 226을 포함한다:
(서열번호 33; 여기서 X1은 L이거나, 또는 P 및 X2는 A 또는 T임)
VEGF의 저해는, 예를 들어, VEGF(예를 들어, VEGF110, VEGF121 및/또는 VEGF165) 결합에 대한 VEGF 수용체와의 경쟁에 의한, 예를 들어, VEGF 수용체에 대한 VEGF 결합의 길항작용을 포함한다. 이러한 저해는 VEGFR의 VEGF-매개성 활성화의 저해, 예를 들어, 세포 표면에서 IL18Rα 및/또는 IL18Rβ 세포내 도메인에 융합된 VEGFR 세포외 도메인을 갖고 또한 NFκB-루시퍼레이스-IRES-eGFP 리포터 유전자, 예를 들어, 본 명세서에 제시된 바와 같은 세포주 HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ를 갖는 키메라 VEGF 수용체(예를 들어, 이의 동종이량체)를 발현하는 세포주(예를 들어, HEK293)에서 루시퍼레이스 발현의 저해를 초래할 수 있다.
본 발명의 VEGF MiniTrap의 VEGF 수용체 Ig 도메인 성분은 다음을 포함할 수 있다:
(i) VEGFR1(Flt1)(R1D2) 면역글로불린-유사(Ig) 도메인 2 중 하나 이상,
(ii) VEGFR2(Flk1 또는 KDR)(Flk1D3)(R2D3)의 Ig 도메인 3 중 하나 이상,
(iii) VEGFR2(Flk1 또는 KDR)(Flk1D4)(R2D4)의 Ig 도메인 4 중 하나 이상 및/또는
(iv) VEGFR3(Flt4)(Flt1D3 또는 R3D3)의 Ig 도메인 3 중 하나 이상.
VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인은 본 명세서에서 VEGFR "Ig" 도메인으로 지칭될 수 있다. 본 명세서에서, 예를 들어, R1D2(본 명세서에서 VEGFR1(d2)로 지칭될 수 있음), R2D3(본 명세서에서 VEGFR2(d3)로 지칭될 수 있음), R2D4(본 명세서에서 VEGFR2(d4)로 지칭될 수 있음) 및 R3D3(본 명세서에서 VEGFR3(d3)로 지칭될 수 있음)으로도 언급되는 VEGFR Ig 도메인은 완전한 야생형 Ig 도메인뿐만 아니라, 야생형 도메인의 기능적 특징을 실질적으로 유지하는, 예를 들어, VEGF MiniTrap에 혼입될 때 기능하는 VEGF 결합 도메인을 형성하는 능력을 유지하는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 야생형 도메인과 실질적으로 동일한 기능적 특징을 유지할 위의 Ig 도메인의 수많은 변이체가 얻어질 수 있음은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 발명은 다음 도메인 구조를 포함하는 VEGF MiniTrap 폴리펩타이드를 제공한다:
((R1D2)-(R2D3))a-링커-((R1D2)-(R2D3))b;
((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-링커-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d;
((R1D2)-(R2D3))e-(MC)g;
((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f-(MC)g;
상기 식에서,
- R1D2는 VEGF 수용체 1(VEGFR1) Ig 도메인 2(D2)이고;
- R2D3은 VEGFR2 Ig 도메인 3이며;
- R2D4는 VEGFR2 Ig 도메인 4이고;
- MC는 다량체화 성분(예를 들어, IgG 힌지 도메인 또는 이의 단편, 예를 들어, IgG1로부터)이며;
-링커는 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 아미노산을 포함하는 펩타이드, 예를 들어, (GGGS)g이고;
그리고,
독립적으로,
a= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
b= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이며;
c= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
d= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이며;
e= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
f= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이며; 그리고
g= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다.
본 발명의 실시형태에서, R1D2는 아미노산 서열: SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIID(서열번호 34)을 포함한다. 일 양태에서, R1D2는 N-말단 SDT가 결여되어 있다.
본 발명의 실시형태에서, R1D2는 아미노산 서열: PFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT(서열번호 35)을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, R2D3은 아미노산 서열: VVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(서열번호 36)을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, R2D4는 아미노산 서열: PFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVL시간VSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPGPG(서열번호 37)을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, R2D4는 아미노산 서열: FVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVL시간VSERDTGNYTVILTNPIKSEKQSHVVSLVVYVP(서열번호 38)을 포함한다.
본 발명의 실시형태에서, VEGF MiniTrap에 사용하기 위한 다량체화 성분(MC)은 펩타이드, 예를 들어, 또 다른 다량체화 성분에 결합할 수 있는 변형된 Fc 면역글로불린(예를 들어, IgG1 유래)이다. 일 양태에서, MC는 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 변형된 Fc 면역글로불린이다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태에서, MC는 또 다른 MC에서 시스테인과 하나 이상의 시스테인 브리지를 형성할 수 있는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 시스테인을 포함하는 펩타이드, 예를 들어, DKTHTCPPC(서열번호 39), DKTHTCPPCPPC(서열번호 40), DKTHTCPPCPPCPPC(서열번호 41), DKTHTC(PPC)h(여기서, h는 1, 2, 3, 4 또는 5임), DKTHTCPPCPAPELLG(서열번호 60), DKTHTCPLCPAPELLG(서열번호 43), DKTHTC(서열번호 44) 또는 DKTHTCPLCPAP(서열번호 45)이다.
본 발명은 또한 다음 도메인 구조를 포함하는 VEGF MiniTrap 폴리펩타이드를 제공한다:
(i)(R1D2)a-(R2D3)b-(MC)c; 또는
(ii)(R1D2)a-(R2D3)b-(R2D4)c-(MC)d;
이는, 예를 들어, 각 폴리펩타이드의 MC 사이의 결합에 의해 상기 폴리펩타이드의 두 번째와 동종이량체화될 수 있고,
상기 식에서,
(i) 상기 R1D2 도메인이 배위하고;
(ii) 상기 R2D3 도메인이 배위하며; 그리고/또는
(iii) 상기 R2D4 도메인이 배위하여
이량체 VEGF 결합 도메인을 형성한다.
본 발명의 실시형태에서, VEGF MiniTrap 폴리펩타이드는 다음 아미노산 서열을 포함한다:
논의된 바와 같이, 이러한 폴리펩타이드는 다량체화(예를 들어, 이량체화(예를 들어, 동종이량체화))될 수 있되, 폴리펩타이드 사이의 결합은 다량체화 성분을 통해 매개된다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 단량체성 VEGF MiniTrap의 VEGFR1 Ig-유사 도메인 2는 N36 및/또는 N68에 N-연결된 글리코실화; 및/또는 C30과 C79 사이의 사슬내 이황화브리지를 갖고; 그리고/또는, 본 발명의 단량체성 VEGF MiniTrap의 VEGFR2 Ig-유사 도메인 3은 N123 및/또는 N196에 N-연결된 글리코실화; 및/또는 C124와 C185 사이에 사슬내 이황화브리지를 갖는다.
본 발명의 실시형태에서, VEGF MiniTrap은 다음 구조를 포함한다:
(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)3-(R1D2)1-(R2D3)1;
(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)6-(R1D2)1-(R2D3)1;
(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)9-(R1D2)1-(R2D3)1; 또는
(R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)12-(R1D2)1-(R2D3)1.
G4S는 -Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-이다.
본 발명의 실시형태에서, VEGF MiniTrap은 다음 아미노산 서열을 포함한다:
(i)
(iii)
(iv)
(v)
또는
(vi)
(여기서 x는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15임). 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 이들 폴리펩타이드는 사슬내 VEGF 결합 도메인을 형성하기 위해 VEGFR Ig 도메인과 같이 회합하는 2차 구조를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 2). 본 발명의 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드 중 2개 이상이 다량체화(예를 들어, 이량체화(예를 들어, 동종이량체화))되되, 각 사슬의 VEGFR Ig 도메인은 사슬간 VEGF 결합 도메인을 형성하기 위해 또 다른 사슬의 Ig 도메인과 같이 회합한다.
본 발명의 소정의 실시형태에서, 본 발명의 VEGF MiniTrap은 VEGF MiniTrap 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 임의의 유의한 변형(예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단에서 페길화 또는 아이오도아세트아마이드화와 같은, 예를 들어, 지시된 화학적 변형)이 결여되어 있다.
본 발명의 실시형태에서, 폴리펩타이드는 VEGF 결합 도메인을 형성하기 위해 단일 키메라 폴리펩타이드(예를 들어, (R1D2)a-(R2D3)b-링커-(R1D2)c-(R2D3)d; 또는 (R1D2)a-(R2D3)b-(R2D4)c-링커-(R1D2)d-(R2D3)e-(R2D4)f) 또는 별개의 키메라 폴리펩타이드(예를 들어, 동종이량체)에서 VEGFR Ig 도메인과 같이 배위하는 2차 구조를 포함한다. 예를 들어,
(i) 상기 R1D2 도메인이 배위하고;
(ii) 상기 R2D3 도메인 배위하며; 그리고/또는
(iii) 상기 R2D4 도메인 배위하여
VEGF 결합 도메인을 형성한다. 도 2는 이러한 도메인 배위를 나타내는 단일 사슬 VEGF MiniTrap의 설명이다. VEGFR1, VEGFR2 및 링커 도메인이 표시되어 있다. 표시된 링커는 (G4S)6이다. 본 발명은 (G4S)3; (G4S)9 또는 (G4S)12 링커를 갖는 단일 사슬 VEGF MiniTrap을 포함한다.
또한, 본 발명은 또한 VEGF 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 이의 융합체와 복합체화된 본 명세서에서 논의된 바와 같은 VEGF MiniTrap을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 실시형태에서, VEGF(예를 들어, VEGF165)는 동종이량체화되고/되거나 VEGF MiniTrap은 2:2 복합체(2 VEGF:2 MiniTrap)로 동종이량체화되고/되거나 VEGF MiniTrap은 1:1 복합체로 동종이량체화된다. 복합체는 동종이량체화된 VEGF MiniTrap 폴리펩타이드에 결합된 동종이량체화된 VEGF 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 복합체는 시험관내(예를 들어, 고체 기질에 고정화됨)에 있거나 또는 대상체의 신체에 있다. 본 발명은 또한 VEGF MiniTrap과 복합체화된 VEGF 이량체(예를 들어, VEGF165)의 복합체의 조성물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질" 또는 "관심 있는 단백질"은 공유적으로 연결된 아마이드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 관심 있는 단백질의 예는 애플리버셉트 및 MiniTrap을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 단백질은 일반적으로 당업계에 "폴리펩타이드"로 알려져 있는 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연 발생적 구조 변이체 및 펩타이드 결합을 통해 연결된 이의 합성 비-자연 발생적 유사체, 관련된 자연 발생적 구조적 변이체 및 이의 합성 비-자연 발생적 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드"는 비-자연 발생적 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체상 펩타이드 합성 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 단백질은 단일 기능 생체분자를 형성하기 위해 하나 또는 여러 개의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 양태에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩타이드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 관심 있는 단백질은 임의의 생물-치료 단백질, 연구 또는 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 다른 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단일클론 항체, 다클론 항체, 인간 항체 및 이중특이성 항체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 관심 있는 단백질은 항-VEGF 융합 단백질(예를 들어, 애플리버셉트 또는 MiniTrap)이다. 단백질은 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템(예를 들어, 피키아 종(Pichia sp.)), 포유동물 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 파생물)과 같은 재조합 세포-기반 생산 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 생물치료제 단백질 및 이의 생산에 대한 최근 리뷰에 대해, 이들의 전체 교시내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation" (Darius Ghaderi et al., Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS 147-176 (2012)]을 참조한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 변형, 부가물 및 기타 공유적으로 연결된 모이어티를 포함한다. 이러한 변형, 부가물 및 모이어티는, 예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 퓨코스, 만노스 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAGtag, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein: CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(glutathione-S-transferase: GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도를 기반으로 분류될 수 있으므로, 단순 단백질, 예컨대, 구상 단백질 및 섬유상 단백질; 접합 단백질, 예컨대, 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 발색단백질, 인단백질, 금속단백질 및 지방단백질; 및 파생 단백질, 예컨대, 일차 파생 단백질 및 2차 파생 단백질을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 관심 있는 단백질은 재조합 단백질, 항체, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 항체 단편, 단일클론 항체, 융합 단백질, scFv 및 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 단백질"은 적합한 숙주 세포에 도입된 재조합 발현 벡터에 운반된 유전자의 전사 및 번역의 결과로 생성된 단백질을 지칭한다. 소정의 예시적인 실시형태에서에서, 재조합 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 특정 양태에서, 재조합 단백질은 항-VEGF 융합 단백질(예를 들어, 애플리버셉트 또는 MiniTrap)이다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화된 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 재조합 단백질은 IgG, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소타입의 항체일 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서 항체 분자는 전장 항체(예를 들어, IgG1)이거나, 또는 대안적으로 항체는 단편(예를 들어, Fc 단편 또는 Fab 단편)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 이황화결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)뿐만 아니라 이들의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework region: FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된다. 본 발명의 상이한 실시형태에서, 항-big-ET-1 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열세포 서열과 동일할 수 있거나 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 완전한 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 임의의 자연 발생적, 효소적으로 수득 가능한, 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 복합체를 형성하기 위해 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 단백질 분해성 소화 또는 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전 공학 기법과 같은 임의의 적합한 표준 기법을 사용하여 완전한 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 용이하게 이용 가능하거나 또는 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배열로 배열하거나 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산 등을 변형, 추가 또는 결실하기 위해 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 시퀀싱 및 조작될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 다이어바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)뿐만 아니라 트라이어바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이며, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 항체 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합하는 단편인 모 항체의 충분한 아미노산 서열을 포함하고; 일부 예시적인 실시형태에서, 단편은 모 항체의 것과 유사한 친화도로 항원에 결합하고/하거나 항원에 대한 결합에 대해 모 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은, 예를 들어, 이황화연결에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 보다 전형적으로 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.
용어 "이중특이성 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 2개의 상이한 분자(예를 들어, 항원)에서 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원)에서 상이한 에피토프에 각각의 중쇄가 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 중쇄를 포함한다. 이중특이성 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 1배 내지 2배, 또는 3배 또는 4배 더 낮을 것이며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적(예를 들어, 동일한 또는 상이한 단백질)에 있을 수 있다. 이중특이성 항체는, 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 결합하여 만들 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다.
전형적인 이중특이성 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR을 갖는 2개의 중쇄, 이어서 CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄와 회합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 중쇄 중 하나 또는 둘 모두의 결합을 가능하게 하는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. BsAb는 Fc 영역(IgG-유사)을 보유하는 것 및 Fc 영역이 결여되어 있는 것의 두 가지 주요 클래스로 나뉠 수 있으며, 후자는 일반적으로 Fc를 포함하는 IgG 및 IgG-유사 이중특이성 분자보다 작다. IgG-유사 BsAb는 트라이오맙, 놉 인투 홀 IgG(knobs into holes IgG: kih IgG), crossMab, orth-Fab IgG, 이중-가변 도메인 Ig(Dual-variable domains Ig: DVD-Ig), 투-인-원 또는 이중 작용 Fab(dual action Fab: DAF), IgG-단일쇄 Fv(IgG-scFv) 또는 κλ-바디와 같지만 이들로 제한되지 않는 상이한 형식을 가질 수 있다. 비-IgG-유사 상이한 형식은 탠덤 scFv, 다이어바디 형식, 단일쇄 다이어바디, 탠덤 다이어바디(TandAb), 이중-친화성 재표적 분자(Dual-affinity retargeting molecule: DART), DART-Fc, 나노바디 또는 독-앤-락(dock-and-lock: DNL) 방법에 의해 생성된 항체(문헌[Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao, Bispecific antibodies and their applications, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130; Dafne & Roland E. Kontermann, Bispecific Antibodies, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES 265-310 (2014)], 이들의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨)를 포함한다. BsAb를 생산하는 방법은 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합, 화학적 가교-링커를 포함하는 화학적 접합 및 재조합 DNA 기술을 이용하는 유전적 접근법에 기반한 쿼드로마 기술에 국한되지 않는다. BsAb의 예는 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 다음 특허 출원에 개시되어 있는 것들을 포함한다: 2010년 6월 25일자로 출원된 미국 출원 제12/823838호; 2012년 6월 5일자로 출원된 미국 출원 제13/488628호; 2013년 9월 19일자로 출원된 미국 출원 제14/031075호; 2015년 7월 24일자로 출원된 미국 출원 제14/808171; 2017년 9월 22일자로 출원된 미국 출원 제15/713574호; 2017년 9월 22일자로 출원된 미국 출원 제15/713569호; 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 출원 제15/386453호; 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 출원 제15/386443호; 2016년 7월 29일자로 출원된 미국 출원 제15/22343호; 및 2017년 11월 15일자로 출원된 미국 출원 제15814095호. 낮은 수준의 동종이량체 불순물은 이중특이성 항체의 제조 동안 여러 단계에 존재할 수 있다. 이러한 동종이량체 불순물의 검출은 동종이량체 불순물의 낮은 존재비 및 일반 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 때 주요 종과 이들 불순물의 동시-용리로 인해 온전한 질량 분석을 사용하여 수행될 때 어려움이 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "다중특이성 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 분자는 일반적으로 2개의 항원에만 결합할 것이지만(즉, 이중특이성 항체, BsAb), 삼중특이성 항체 및 KIH 삼중특이성과 같은 추가적인 특이성을 갖는 항체도 또한 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 의해 처리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다. 단일클론 항체는 당업계에서 이용 가능하거나 또는 공지된 임의의 수단에 의해 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 단일클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 관심 있는 단백질은 약 4.5 내지 약 9.0 범위의 pI를 가질 수 있다. 하나의 예시적인 특정 실시형태에서, pI는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9 또는 약 9.0일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 조성물에서 관심 있는 단백질의 유형은 하나 이상일 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 관심 있는 단백질은 포유동물 세포로부터 생산될 수 있다. 포유동물 세포는 인간 기원일 수 있거나, 또는 비-인간 기원은 일차 상피 세포(예를 들어, 각질형성세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포), 확립된 세포주 및 이들의 계통(예를 들어, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포 및 PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, CHO 세포, BeWo 세포, Chang 세포, 디트로이트 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LSI80 세포, LS174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-l 세포, LLC-PKi 세포, PK(15) 세포, GHi 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MHiCi 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포 및 TH-I, B1 세포, BSC-1 세포, RAf 세포, RK-세포, PK-15 세포 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 기관으로부터의 섬유아세포 세포(심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직(림프선, 아데노이드, 편도선, 골수 및 혈액), 비장 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주(예를 들어, CHO 세포, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프시 세포, 디트로이트 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, Midi 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDMiC3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 계통 2071(마우스 L) 세포, L-M 계통(마우스 L) 세포, L-MTK'(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인디언 문탁 세포, SIRC 세포, Cn 세포 및 젠센 세포, Sp2/0, NS0, NS1 세포 또는 이들의 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질 알킬화제"는 단백질에서 소정의 유리 아미노산 잔기를 알칼화하기 위해 사용되는 작용제를 지칭한다. 단백질 알킬화제의 비제한적인 예는 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide: IOA), 클로로아세트아마이드(chloroacetamide: CAA), 아크릴아마이드(acrylamide: AA), N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide: NEM), 메틸 메테인티오설포네이트(methyl methanethiosulfonate: MMTS) 및 4-비닐피리딘 또는 이들의 조합이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단백질 변성"은 분자의 3차원적 형태가 이의 고유한 상태로부터 변화되는 과정을 지칭할 수 있다. 단백질 변성은 단백질 변성제를 사용하여 수행될 수 있다. 단백질 변성제의 비제한적인 예는 열, 높은 또는 낮은 pH, DTT(아래 참조)와 같은 환원제 또는 무질서 유발제(chaotropic agent)에 대한 노출을 포함한다. 여러 무질서 유발제가 단백질 변성제로 사용될 수 있다. 무질서 유발 용질은 수소 결합, 반 데르 발스 힘 및 소수성 효과와 같은 비-공유 힘에 의해 매개되는 분자내 상호작용을 방해함으로써 시스템의 엔트로피를 증가시킨다. 무질서 유발제의 비제한적인 예는 뷰탄올, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드, 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 페놀, 프로판올, 소듐 도데실 설페이트, 티오우레아, N-라우로일사르코신, 우레아 및 이들의 염을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질 환원제"는 단백질에서 이황화브리지의 환원에 사용되는 작용제를 지칭한다. 단백질을 환원시키는데 사용되는 단백질 환원제의 비제한적인 예는 다이티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), β-머캅토에탄올, Ellman 시약, 하이드록실아민 하이드로클로라이드, 소듐 사이아노보로하이드라이드, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP-HCl) 또는 이들의 조합이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 폴리펩타이드(예를 들어, VEGFR Ig 도메인의)의 "변이체"는 관심 있는 단백질의 참조 또는 고유한 아미노산 서열과 적어도 약 70% 내지 99.9%(예를 들어, 70%, 71%, 72%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%) 동일한 또는 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 서열 비교는, 예를 들어, BLAST 알고리즘에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 알고리즘의 매개변수는 각 참조 서열(예를 들어, expect 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위에서 최대 매치: 0; BLOSUM 62 행렬; 간격 비용: 존재 11, 확장 1; 조건부 구성 점수 행렬 조정)의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 간에 가장 큰 매치를 제공하도록 선택된다. 폴리펩타이드(예를 들어, VEGFR Ig 도메인의)의 변이체는 또한, 예를 들어, 미스센스 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환), 넌센스 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 하나 이상의(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개) 돌연변이를 제외한 참조된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 다음 참조는 서열 분석에 자주 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: BLAST 알고리즘: 문헌[Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J. C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J. M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70]; 정렬 점수 시스템: 문헌[Dayhoff, M. O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.; Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3.'' M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.; Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D. J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; 정렬 통계: 문헌[Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; 및 Altschul, S. F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, N.Y]; 이들 전체의 교시내용은 본 명세서에 원용된다.
일부 변이체는 리보솜 합성 동안(동시-번역 변형) 또는 후(번역 후 변형 "PTM(post-translational modification)")에 폴리펩타이드가 겪는 공유 변형(covalent modification)일 수 있다. PTM은 일반적으로 특정 효소 또는 효소 경로에 의해 도입된다. 많은 것들이 단백질 백본 내의 특정한 특징적 단백질 서열(예를 들어, 시그니처 서열)의 부위에서 발생한다. 수백 개의 PTM이 기록되어 있으며, 이러한 변형은 항상 단백질의 구조 또는 기능의 일부 양태에 영향을 미친다(문헌[Walsh, G. "Proteins" (2014) second edition, published by Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853], 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨). 소정의 예시적인 실시형태에서, 단백질 조성물은 관심 있는 단백질의 하나 이상의 유형의 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
애플리버셉트의 경우 단백질 변이체(및 애플리버셉트의 구조적 특징, 예를 들어, 애플리버셉트의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 영역을 공유하는 단백질)는, 예를 들어, 히스티딘, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌 및/또는 타이로신 잔기에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 산화로부터 야기될 수 있는 산화 변이체; 아스파라긴 잔기에서의 탈아마이드화 및/또는 아르기닌 잔기에서의 데옥시글루코소화로부터 야기될 수 있는 탈아마이드화 변이체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
애플리버셉트(및 애플리버셉트의 구조적 특징, 예를 들어, 애플리버셉트의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 영역을 공유하는 단백질)와 관련하여, 산화 변이체는 His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 히스티딘 잔기의 산화; Trp58 및/또는 Trp138(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 트립토판 잔기의 산화; Tyr64(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 위치)에서 타이로신 잔기의 산화; Phe44 및/또는 Phe166(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 페닐알라닌 잔기의 산화; 및/또는 Met10, Met20, Met163 및/또는 Met192(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 메티오닌 잔기의 산화를 포함할 수 있다.
애플리버셉트(및 애플리버셉트의 구조적 특징, 예를 들어, 애플리버셉트의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 영역을 공유하는 단백질)와 관련하여, 탈아마이드화 변이체는 Asn84 및/또는 Asn99(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 아스파라긴 잔기의 탈아마이드화를 포함할 수 있다.
애플리버셉트(및 애플리버셉트의 구조적 특징, 예를 들어, 애플리버셉트의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 영역을 공유하는 단백질)와 관련하여, 데옥시글루코소화 변이체는 Arg5(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 아르기닌 잔기의 3-데옥시글루코소화를 포함할 수 있다.
단백질 변이체는 산성 종과 염기성 종을 모두 포함할 수 있다. 산성 종은 전형적으로 CEX로부터의 주요 피크보다 먼저 또는 AEX로부터의 주요 피크보다 늦게 용리되는 변이체인 반면, 염기성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 늦게 또는 AEX로부터의 주요 피크보다 먼저 용리되는 변이체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "산성 종", "AS", "산성 영역" 및 "AR"은 전체 산성 전하를 특징으로 하는 단백질의 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 재조합 단백질 제조물에서, 이러한 산성 종은 이온 교환, 예를 들어, WCX-10 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)과 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 항체의 산성 종은 변이체, 구조 변이체 및/또는 단편화 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 변이체는 탈아마이드화 변이체, 어퓨코실화 변이체, 산화 변이체, 메틸글리옥살(methylglyoxal: MGO) 변이체, 글리코실화 변이체 및 시트르산 변이체. 예시적인 구조 변이체 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다, 글리코실화 변이체 및 아세톤화 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 단편화 변이체는 Fc 및 Fab 단편, Fab가 누락된 단편, 중쇄 가변 도메인이 누락된 단편, C-말단 절단 변이체, 경쇄에서 N-말단 Asp의 절단을 갖는 변이체 및 경쇄의 N-말단 절단을 갖는 변이체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 펩타이드 사슬의 해리, 효소적 및/또는 화학적 변형으로 인한 표적 분자로부터의 임의의 변형된 단백질 종을 포함한다. 다른 산성 종 변이체는 짝을 이루지 않은 이황화물, 숙주 세포 단백질 및 숙주 핵산, 크로마토그래피 물질 및 배지 성분을 포함하는 변이체를 포함한다. 일반적으로, 산성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 먼저 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 늦게 용리된다(도 16 및 도 17 참조).
소정의 실시형태에서, 단백질 조성물은 하나 이상의 유형의 산성 종 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 총 산성 종은 나타나는 피크의 크로마토그래피 머무름 시간을 기준으로 분류될 수 있다. 총 산성 종이 분류될 수 있는 또 다른 예는 변이체의 유형 - 변이체, 구조 변이체 또는 단편화 변이체를 기준으로 할 수 있다.
용어 "산성 종" 또는 "AS"는 공정-관련 불순물을 지칭하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "공정-관련 불순물"은 단백질을 포함하는 조성물에 존재하지만, 단백질 자체에서 유래하지 않는 불순물을 지칭한다. 공정-관련 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 핵산, 크로마토그래피 물질 및 배지 성분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 항-VEGF 조성물에서 산성 종의 양은 관심 있는 단백질과 비교하여 최대 약 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 항-VEGF 조성물의 예는 아래 부문 III에서 논의된다. 일 양태에서, 항-VEGF 조성물은 애플리버셉트, 재조합 MiniTrap(미국 특허 제7,279,159호에 개시된 것의 예), scFv 및 다른 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 애플리버셉트이다.
산성 또는 염기성 종의 원인이 되는 화학적 분해 경로 중에서, 단백질 및 펩타이드에서 발생하는 가장 일반적으로 관찰되는 두 가지 공유 변형은 탈아미노화 및 산화이다. 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판 및 타이로신은 산화에 가장 민감한 아미노산의 일부이다: Met 및 Cys는 황 원자로 인해 그리고 His, Trp 및 Tyr은 이들의 방향족 고리로 인해.
본 명세서에서 사용되는 용어 "산화 종", "OS" 또는 "산화 변이체"는 산화에 의해 형성된 단백질의 변이체를 지칭한다. 이러한 산화 종은 또한 이온 교환, 예를 들어, WCX-10 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)와 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 산화 변이체는 히스티딘, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌 및/또는 타이로신 잔기에서 발생하는 산화로 인해 생성될 수 있다. 특히, 애플리버셉트(및 애플리버셉트의 구조적 특징, 예를 들어, 애플리버셉트의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 영역을 공유하는 단백질)와 관련하여, 산화 변이체는 His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 히스티딘 잔기의 산화; Trp58 및/또는 Trp138(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 트립토판 잔기의 산화; Tyr64(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 위치)에서 타이로신 잔기의 산화; Phe44 및/또는 Phe166(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 페닐알라닌 잔기의 산화; 및/또는 Met10, Met 20, Met163 및/또는 Met192(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)에서 메티오닌 잔기의 산화를 포함할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 항-VEGF 조성물에서 산화 종의 양은 관심 있는 단백질과 비교하여 최대 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 항-VEGF 조성물의 예는 아래 부문 III에서 논의된다. 일 양태에서, 항-VEGF 조성물은 애플리버셉트, 재조합 MiniTrap(미국 특허 제7,279,159호에 개시된 것의 예), scFv 및 다른 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 애플리버셉트 또는 MiniTrap이다.
시스테인 잔기는 자발적 산화를 거쳐 분자내 또는 분자간 이황화결합 또는 설펜산과 같은 단분자 부산물을 형성할 수 있다.
히스티딘 잔기는 또한 이미다졸 고리와의 반응을 통해 산화에 매우 민감하며, 이는 후속적으로 추가적인 하이드록실 종을 생성할 수 있다(문헌[Li, S, C Schoneich, and RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48:490-500], 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨). 히스티딘 산화에 대해 제안된 메커니즘은 도 2 및 도 3에 강조표시되어 있다. 자세한 메커니즘적 연구는 그 전체 교시내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Anal. Chem. 2014, 86, 4940-4948 및 J. Pharm. Biomed. Anal. 21 (2000) 1093-1097]에서 이용할 수 있다.
메티오닌의 산화는 메티오닌 설폭사이드의 형성을 초래할 수 있다(문헌[Li, S, C Schoneich, and RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48:490-500]). 메티오닌 잔기의 다양한 가능한 산화 메커니즘이 문헌(Brot, N., Weissbach, H. 1982. The biochemistry of methionine sulfoxide residues in proteins. Trends Biochem. Sci. 7: 137-139, 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨)에 논의되어 있다.
트립토판의 산화는 생성물의 복잡한 혼합물을 생성할 수 있다. 일차 생성물은 일산화, 이산화 및/또는 삼산화 생성물과 함께 N-폼일카이누레닌 및 카이누레닌일 수 있다(도 4). 산화된 Trp 변형을 포함하는 펩타이드는 일반적으로 카이누레닌(KYN), 하이드록시트립토판(Wox1) 및 N-폼일카이누레닌/다이하이드록시트립토판(NFK/Wox2, "이중 산화된 Trp"로도 지칭됨), 트라이하이드록시트립토판(Wox3, "삼중 산화된 Trp"로도 지칭됨) 및 이들의 조합, 예컨대, 하이드록시카이누레닌(KYNox1, +20Da)의 형성에 해당하는 4Da, 16Da, 32Da 및 48Da의 질량 증가를 나타낸다. 하이드록시트립토판으로의 산화(Wox1)(문헌[(Mass spectrometric identification of oxidative modifications of tryptophan residues in proteins: chemical artifact or post-translational modification? J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010 Jul; 21(7): 1114-1117], 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨). 메티오닌 및 히스티딘 산화가 아닌 트립토판 산화는 단백질 제품에서 색상 변화를 일으키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Characterization of the Degradation Products of a Color-Changed Monoclonal Antibody: Tryptophan-Derived Chromophores. dx.doi.org/10.1021/ac404218t | Anal. Chem. 2014, 86, 6850-6857]). 트립토판과 유사하게, 타이로신의 산화는 주로 3,4-다이하이드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanin: DOPA) 및 다이타이로신을 생성한다(문헌[Li, S, C Schoneich, and RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48:490-500]).
본 명세서에서 사용되는 용어 "염기성 종", "염기성 영역" 및 "BR"은 단백질의 변이체, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭하며, 이는 단백질 내제 존재하는 1차 전하 변이체 종에 비해 전반적인 염기성 전하를 특징으로 한다. 예를 들어, 재조합 단백질 제조물에서, 이러한 염기성 종은 이온 교환, 예를 들어, WCX-10 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)와 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예시적인 변이체는 라이신 변이체, 아스파르트산의 이성질체화, 아스파라긴에서 석신이미드 형성, 메티오닌 산화, 아마이드화, 불완전한 이황화결합 형성, 세린에서 아르기닌으로의 돌연변이, 비글리코실화, 단편화 및 응집을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 염기성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 늦게 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 먼저 용리된다. (문헌[Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs. 2012 Sep 1; 4(5): 578-585. doi: 10.4161/mabs.21328], 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨)
소정의 실시형태에서, 단백질 조성물은 하나 이상의 유형의 염기성 종 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 총 염기성 종은 나타나는 피크의 크로마토그래피 머무름 시간을 기준으로 나뉠 수 있다. 총 염기성 종이 나뉠 수 있는 또 다른 예는 변이체의 유형 - 변이체, 구조 변이체 또는 단편화 변이체를 기준으로 할 수 있다.
산성 종에 대해 논의된 바와 같이, 용어 "염기성 종"은 공정-관련 불순물을 포함하지 않으며, 염기성 종은 제품 제조의 결과(본 명세서에서 "제조-유래 염기성 종"으로 지칭됨) 또는 보관의 결과(본 명세서에서 "보관-유래 염기성 종"으로 지칭됨)일 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 항-VEGF 조성물에서 염기성 종의 양은 관심 있는 단백질과 비교하여 최대 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 항-VEGF 조성물의 예는 아래 부문 III에서 논의된다. 일 양태에서, 항-VEGF 조성물은 애플리버셉트, 재조합 MiniTrap(미국 특허 제7,279,159호에 개시된 것의 예), scFv 및 다른 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 애플리버셉트이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "샘플 매트릭스" 또는 "생물학적 샘플"은 세포 배양액(cell culture fluid: CCF), 수확된 세포 배양액(harvested cell culture fluid: HCCF), 하류 처리의 임의의 단계, 최종 제형화된 제품을 포함하는 원료의약품(drug substance: DS) 또는 의약품(drug product: DP)과 같은 생물공정의 임의의 단계에서 얻어질 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 실시형태에서, 생물학적 샘플은 정화, 크로마토그래피 생성, 바이러스 불활성화 또는 여과의 하류 공정의 임의의 단계로부터 선택될 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 의약품은 진료소에서 제조된 의약품, 배송, 보관 또는 취급으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 암 또는 혈관형성 눈 장애의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물(예를 들어, 래트, 마우스, 고양이, 개, 소, 양, 말, 염소, 토끼), 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상체는 암 또는 혈관형성 눈 장애가 있을 수 있거나, 또는 암 또는 혈관형성 눈 장애가 발생할 경향이 있을 수 있다.
단백질 제형의 측면에서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "안정한"은 본 명세서에 정의된 예시적인 조건하에 보관 후에 허용 가능한 정도의 화학적 구조 또는 생물학적 기능을 유지할 수 있는 제형 내의 관심 있는 단백질을 지칭한다. 제형은 그 안에 포함된 관심 있는 단백질이 정의된 시간 동안 보관 후 화학적 구조 또는 생물학적 기능을 100% 유지하지 못하더라도 안정할 수 있다. 소정의 상황하에, 정의된 시간 동안 보관 후 단백질의 구조 또는 기능의 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 유지는 "안정한" 것으로 간주될 수 있다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는, 예를 들어, 혈관형성 눈 장애와 관련하여 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도까지 이러한 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후의 퇴행, 안정화 또는 제거를 야기함으로써, 당뇨병성 망막병증 중증도 점수(DRSS)의 감소 또는 유지를 야기함으로써, 시력을 개선하거나 유지(예를 들어, ETDRS 문자의 증가로 측정된, 예를 들어, 최상의 교정된 시력), 시야를 증가시키거나 또는 유지 및/또는 중심 망막 두께를 감소시키거나 또는 유지함으로써, 그리고 암과 관련하여, 대상체에서 암 세포의 성장, 생존 및/또는 전이를 중지 또는 역전시킴으로써, 원치 않는 질환 또는 장애(예를 들어, 혈관형성 눈 장애 또는 암)를 역전, 안정화 또는 제거하는 치료적 조치(measure)를 지칭한다. 전형적으로, 치료적 조치는 질환 또는 장애가 있는 대상체에 치료적 유효량의 VEGF MiniTrap의 하나 이상의 투여량을 투여하는 것이다.
단백질 제조물의 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 용어 "상류 공정 기술"은 관심 있는 단백질의 세포 배양 동안 또는 이후에 세포로부터의 단백질의 생산 및 수집과 관련된 활동을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 배양"은 관심 있는 재조합 단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포의 집단을 생성 및 유지하는 방법뿐만 아니라 관심 있는 단백질의 생산 및 수집을 최적화하기 위한 방법 및 기법을 지칭한다. 예를 들어, 발현 벡터가 적절한 숙주 세포에 혼입되면, 숙주 세포는 관련 뉴클레오타이드 코딩 서열의 발현 및 목적하는 재조합 단백질의 수집 및 생산에 적합한 조건하에 유지될 수 있다.
본 발명의 세포 배양 기법을 사용할 때, 관심 있는 단백질은 세포내, 주변 세포질 공간에서 생성되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 관심 있는 단백질이 세포내에서 생성되는 실시형태에서, 미립자 찌꺼기 - 숙주 세포 또는 용해된 세포(예를 들어, 균질화로 인한 것)는 원심분리 또는 한외여과를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 제거될 수 있다. 관심 있는 단백질이 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 먼저 상업적으로 이용 가능한 단백질 농도 필터를 사용하여, 예를 들어, Amicon™ 또는 Millipore Pellicon™ 한외여과 유닛을 사용하여 농축될 수 있다. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 원심분리 후 심층 여과한 다음 친화성 포획 크로마토그래피에 의해 수확될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "VEGF 길항제"는 VEGF에 결합하거나 또는 이와 상호작용하는 임의의 단백질 또는 펩타이드이다. 전형적으로, 이러한 결합 또는 상호작용은 VEGF의 수용체(VEGFR1 및 VEGFR2)에 대한 결합을 저해하고/하거나 VEGF의 생물학적 신호전달 및 활성을 저해한다. VEGF 길항제는 VEGF와 천연 VEGF 수용체 간의 상호작용을 방해하는 분자, 예를 들어, VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하고 VEGF와 VEGF 수용체 간의 상호작용을 방지하거나 또는 그렇지 않으면 방해하는 분자를 포함한다. 특정 예시적인 VEGF 길항제는 항-VEGF 항체(예를 들어, 라니비주맙(ranibizumab)[LUCENTIS®]), 항-VEGF 수용체 항체(예를 들어, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체 등) 및 VEGF 수용체-기반 키메라 분자 또는 VEGF-저해 융합 단백질(본 명세서에서 "VEGF-Trap" 또는 "VEGF MiniTrap"으로도 지칭됨), 예컨대, 애플리버셉트, ziv-애플리버셉트 및 서열번호 60을 갖는 아미노산을 갖는 단백질을 포함한다. VEGF-Trap의 다른 예는 ALT-L9, M710, FYB203 및 CHS-2020이다. VEGF-Trap의 추가적인 예는 미국 특허 제7,070,959호; 제7,306,799호; 제7,374,757호; 제7,374,758호; 제7,531,173호; 제7,608,261호; 제5,952,199호; 제6,100,071호; 제6,383,486호; 제6,897,294호 및 제7,771,721호에서 찾을 수 있으며, 이들은 특히 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
VEGF 수용체-기반 키메라 분자는 VEGFR1(Flt1로도 지칭됨) 및/또는 VEGFR2(Flk1 또는 KDR로도 지칭됨)와 같은 VEGF 수용체의 2개 이상의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 포함하며, 또한 다량체화 도메인(예를 들어, 2개 이상의 키메라 폴리펩타이드의 다량체화[예를 들어, 이량체화]를 용이하게 하는 Fc 도메인)을 포함할 수도 있다. 예시적인 VEGF 수용체-기반 키메라 분자는 VEGFR1R2-FcΔC1(a)(애플리버셉트로도 알려짐; 제품명 EYLEA®로 시판됨)로 지칭되는 분자이다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 애플리버셉트는 다음에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이러스 여과"는 아사히 카세이 파르마(Asahi Kasei Pharma)의 Planova 20N™, 50N 또는 BioEx, 이엠디 밀리포어의 Viresolve™ 필터, 사토리우스(Sartorius)의 ViroSart CPV 또는 폴 코포레이션(Pall corporation)의 Ultipor DV20 또는 DV50™ 필터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 적합한 필터를 사용하는 여과를 포함할 수 있다. 목적하는 여과 성능을 얻기 위해 적합한 필터를 선택하는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
II. 색상 결정
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 단백질, 특히, 항-VEGF 단백질의 생산 동안 관찰되는 색상은 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 비제한적인 예는 아이오다인 색상 번호, hazen 색상 번호, gardner 색상 번호, lovibond 색상 번호, Saybolt 색상 번호, 미네랄 오일 색상 번호, 유럽 약전 색상 번호, US 약전 색상 번호, CIE L*, a*, b*(또는 CIELAB), Klett 색상 번호, Hess-Ives 색상 번호, 황색도 지수, ADMI 색상 번호 및 ASBC 및 EBC 양조장 색상 번호를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 척도에 대한 세부사항은 그 전체 교시내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Lange의 Application Report No. 3.9]에서 찾을 수 있다.
유럽 약전(Ph Eur)(유럽 색상 표준, 문헌[European Pharmacopoeia. Chapter 2.2.2. Degree of coloration of liquids. 8th ed. EP] 참조, 이의 전체 교시내용은 본 명세서에 원용됨)에 기초한 시각적 색상 매칭은 유럽 약전(EP 2.2.2. 액체의 착색 정도 2)에 기재된 바와 같은 색상 참조 용액을 제조하는 것을 포함할 수 있다 - 적색(염화코발트(II)), 황색(염화제1철(III)) 및 청색 색상(황산제1구리(II)) 및 1% 염산에 대한 3개의 모 용액, 황색(Y), 녹황색(GY), 갈황색(BY), 갈색(B) 및 적색(R) 색조에 대한 5개의 색상 참조 용액이 제조된다. 이들 5개의 참조 용액을 차례로 사용하여, 총 37개의 색상 참조 용액이 제조된다(Y1-Y7, GY1-GY7, BY1-BY7, B1-B9 및 R1-R7). 각 참조 용액은 CIE-Lab 색 공간에서, 예를 들어, 명도, 색조 및 채도에 의해 명확하게 정의된다. 7개의 황갈색 표준(BY 표준) 중, BY1이 가장 어두운 표준이고, BY7이 가장 어둡다. 주어진 샘플을 BY 색상 표준의 샘플과 매칭하는 것은 전형적으로 산광(diffused daylight)하에 수행된다. 유럽 황갈색 색상 표준의 조성은 아래 표 1에 기재되어 있다.
액체의 색상에 대한 테스트는 테스트 용액과 표준 색상 용액을 비교하여 수행된다. 표준 색상 용액의 조성은 테스트 용액의 색상의 색조 및 세기에 따라 선택된다. 전형적으로, 비교는 내부 직경 및 기타 모든 측면에서 가능한 한 가깝게 매칭되는 무색의 투명한 중성 유리의 평평한-바닥 튜브(예를 들어, 약 12㎜, 15㎜, 16㎜ 또는 25㎜ 직경의 튜브)에서 수행된다. 예를 들어, 비교는 2㎖ 또는 10㎖의 테스트 용액과 표준 색상 용액 사이일 수 있다. 액체의 깊이는, 예를 들어, 약 15㎜, 25㎜, 40㎜ 또는 50㎜일 수 있다. 테스트 용액에 부여된 색상은 표준 색상보다 진하지 않아야 한다. 색상 비교는 전형적으로 흰색 배경에 대해 산광(예를 들어, 일광)에서 수행된다. 색상은 튜브의 수직 축 또는 수평 축을 따라 비교될 수 있다.
EP 색상 측정과 대조적으로, USP 모노그래프 1061 색상 - 기기 측정은 색상을 정확하고 객관적으로 정량화하기 위해 CIE L*, a*, b*(또는 CIELAB) 색상 측정의 사용을 참조한다. 총 20개의 색상 참조 용액(문자 A에서 T로 순차적으로 확인됨)이 U.S. 약전에 정의되어 있다. 측정된 샘플의 색상은 색상 참조 용액과 자동으로 연관된다. 이는 샘플에 가장 가까운 색상 참조 용액(즉, 샘플의 색상에 대한 색상의 차이 ΔE*가 가장 적은 참조 용액)이 표시됨을 의미한다. ΔL*, Δ* 및 Δ* 값은 샘플의 L*, a*, b* 값과 표시된 USP 용액의 값 사이의 정량적 차이를 제공한다. CIE L*a*b* 좌표계(coordinate system)에서, L*은 0에서 100까지 등급의 색상의 밝기 정도를 나타내고(0은 가장 어둡고, 100은 가장 밝음), a*는 적색 또는 녹색의 색상을 나타내며(a*의 양의 값은 적색을 나타내는 반면, a*의 음의 값은 녹색을 나타냄), b*는 샘플의 황색 또는 청색을 나타낸다(b*의 양의 값은 황색을 나타내고, b*의 음의 값은 청색을 나타냄). 표준 또는 평가 초기 샘플의 색상 차이는 개별 색상 성분 ΔL*, Δ* 및 Δ*의 변화로 나타낼 수 있다. 색상의 종합적 변화 또는 차이는 다음 공식을 사용하여 공간에서 단순 유클리디안 거리(simple Euclidian distance)로 계산될 수 있다: . CIE L*, a*, b* 색상 좌표는, 예를 들어, Hunter Labs UltrascanPro(헌터 어소시에이트 래보래토리(Hunter Associates Laboratory), 버지니아주 레스턴 소재)를 사용하여 또는 BYK Gardner LCS IV(BYK-가드너(BYK-Gardner), 메릴랜드주 컬럼비아 소재)에서 생성될 수 있다. Hunter Labs Ultrascan Pro의 경우, 디디윰 필터 테스트가 파장 보정을 위해 실행될 수 있다. 기기는 사용 전에 0.780-인치 포트 인서트 및 DIW를 사용하여 TTRAN으로 표준화될 수 있다; 따라서, 유아등(light trap) 및 검은색 카드를 이용하여 측광 척도의 상단(L = 100) 및 하단(L = 0)을 확립한다. 그 전체 교시내용이 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Pack et al., Modernization of Physical Appearance and Solution Color Tests Using Quantitative Tristimulus Colorimetry: Advantages, Harmonization, and Validation Strategies, J. Pharmaceutical Sci. 104: 3299-3313 (2015)] 참조. BY 표준 색상은 또한 CIE L*, a*, b* 색 공간("CIELAB" 또는 "CIELab" 색 공간)하에 표현될 수도 있다. 표 2 참조
색상 검정에 대한 고처리량 스크리닝을 가능하게 하기 위해, 분광 광도 검정 방법(CIELAB)은 BY 색상 표준보다 더 적합하고 정량적인 측정이다. 대리 검정은 실시예 부문에 기재된 바와 같이 추가로 최적화되었다.
색상에 대해 평가된 임의의 샘플에 대해, 테스트 샘플의 단백질 농도는 샘플의 단백질 농도에 대해 표준화되어야 한다(예를 들어, 비교를 위해 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 등).
III. 항-VEGF 조성물
VEGF 신호전달 경로를 조절하는 단백질의 VEGF 패밀리의 적어도 5개의 구성원이 있다: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 태반 성장 인자(placental growth factor: PlGF). 항-VEGF 조성물은 VEGF 길항제를 포함할 수 있으며, 이는 단백질의 VEGF 패밀리의 하나 이상의 구성원과 특이적으로 상호작용하며 이의 생물학적 활성, 예를 들어, 이의 유사분열, 혈관형성 및/또는 혈관 투과성 활성 중 하나 이상을 저해한다.
일 실시형태에서, 항-VEGF 단백질을 생산하는 방법은 (a) 항-VEGF 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 세포가 항-VEGF 단백질을 발현하기에 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 세포에 의해 생산된 항-VEGF 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트, 재조합 MiniTrap(미국 특허 제7,279,159호에 개시된 것의 예), scFv 및 다른 항-VEGF 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 관심 있는 재조합 단백질은 애플리버셉트이다.
본 발명자들은 소정의 CDM에서 항-VEGF 단백질(예를 들어, 애플리버셉트)을 제조하면 독특한 색상을 나타내는 생물학적 샘플이 생성된다는 것을 발견하였다. 상이한 제조 단계에서 그리고 항-VEGF 단백질을 포함하는 최종 제형에서도 뚜렷한 색상 특성이 관찰되었다. 실시예 9에서 관찰된 바와 같이, VEGF MiniTrap의 생산을 위해, CDM에서 세포를 배양하면 진한 황갈색 색상의 항-VEGF 단백질(예를 들어, 애플리버셉트)이 생성된다. 수확 후 친화성 포획 단계에서도 또한 소정의 색상 - 황갈색 색상을 나타내는 용리액이 생성된다. AEX를 사용한 추가의 생산 단계에서도 또한 황갈색 색상을 나타내었지만, 세기는 감소되었다.
아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 색상은 (i) 정성적 육안 검사가 이루어지는 유럽 색상 표준 BY 또는 (ii) BY 시스템보다 더 정량적인 비색 검정인 CIELAB를 사용하여 평가될 수 있다. 그러나, 두 경우 모두에서, 의미 있는 평가/비교를 보장하기 위해 여러 샘플 간의 색상 평가는 단백질 농도에 대해 정규되었다. 예를 들어, 실시예 9, 특히 표 9-2를 참조하면, 단백질 용리액은 대략 BY5의 BY 값(단백질 용리액에서 5 g/ℓ의 단백질의 농도에서 측정될 때)에 해당하는 약 2.52의 b* 값을 갖는다. 단백질 용리액의 색상이 또 다른 샘플과 비교된다면, 비교는 동일한 단백질 농도를 사용하여 비교되어야 한다. 따라서, 단백질 용리액과 약 0.74의 b* 값(단백질 용리액에서 5 g/ℓ의 단백질 농도에서 측정될 때)을 갖는 AEX 풀을 비교하면, 생산 방법은 AEX 크로마토그래피 후 단백질 용리액에서 AEX 풀까지 샘플의 황갈색 색상이 상당히 감소함을 보여준다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않은 및/또는 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 b* 값을 갖는 본 명세서에서 논의된 바와 같은 황갈색 색상을 특징으로 할 수 있되, 조성물은 약 5 g/ℓ의 항-VEGF 단백질 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물은 정화된 수확물 또는 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다.
일 실시형태에서, CDM을 사용하여 생산된 본 발명의 조성물은 뚜렷한 황갈색 색상을 갖는 생물학적 샘플을 생성하되, 샘플은 다음의 인정된 표준 색상 특성을 특징으로 할 수 있다:
(i) 유럽 색상 표준 BY2보다 더 황갈색이 아님;
(ii) 유럽 색상 표준 BY3보다 더 황갈색이 아님;
(iii) 유럽 색상 표준 BY4보다 더 황갈색이 아님;
(iv) 유럽 색상 표준 BY5보다 더 황갈색이 아님;
(v) 유럽 색상 표준 BY2와 BY3 사이;
(vi) 유럽 색상 표준 BY3과 BY4 사이;
(vii) 유럽 색상 표준 BY4와 BY5 사이, 여기서 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물은 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다
또 다른 실시형태에서, CDM을 사용하여 생성된 본 발명의 조성물은 뚜렷한 황갈색 색상을 갖는 생물학적 샘플을 생성하되, 조성물은 CIELAB 척도에서 인정된 표준 색상 특성을 특징으로 한다:
(i) b* 값이 약 22 내지 23 이하인 황갈색;
(ii) b* 값이 약 16 내지 17 이하인 황갈색;
(iii) b* 값이 9 내지10 이하인 황갈색;
(iv) b* 값이 4 내지 5 이하인 황갈색;
(v) b* 값이 2 내지 3 이하인 황갈색;
(vi) 17 내지 23의 b* 값 사이;
(vii) 10 내지 17의 b* 값 사이;
(viii) 5 내지 10의 b* 값 사이;
(ix) 3 내지 5의 b* 값 사이; 또는
(x) 1 내지 3의 b* 값 사이, 여기서 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물은 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다.
일 실시형태에서, CDM을 사용하여 생성된 본 발명의 조성물은 항-VEGF 단백질의 다른 종 또는 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 집합적으로 옥소-변이체로 지칭되는 하나 이상의 산화된 아미노산 잔기를 포함하는 항-VEGF 단백질은 아이소형을 포함한다. 항-VEGF 단백질 및 이의 옥소-변이체를 포함하는 이러한 조성물의 효소적 소화는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
약 0.004% 내지 0.013%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18),
약 0.006% 내지 0.028%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19),
약 0.049% 내지 0.085%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20),
약 0.057% 내지 0.092%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17),
약 0.008% 내지 0.022%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열번호 21) 및/또는
약 0.185% 내지 0.298%의 이산화된 트립토판을 포함하는 IIWDSR(서열번호 56);
또는
약 0.008%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18),
약 0.02%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19),
약 0.06%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20),
약 0.07%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17),
약 0.01%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열번호 21) 및/또는
약 0.23%의 다이-옥소-트립토판을 포함하는 IIWDSR(서열번호 56),
여기서 H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화될 수 있는 히스티딘이고, C*는 카복시메틸화될 수 있는 시스테인이다. 특정 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 애플리버셉트이다. 또 다른 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 VEGF MiniTrap이다.
하나의 예시적인 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, 항-VEGF 단백질의 히스티딘 잔기의 약 1% 이하, 약 0.1% 이하 또는 약 0.1% 내지 1%, 0.2% 내지 1%, 0.3% 내지 1%, 0.4% 내지 1%, 0.5% 내지 1%, 0.6% 내지 1%, 0.7% 내지 1%, 0.8% 내지 1% 또는 0.9% 내지 1%는 2-옥소-히스티딘이다. 이러한 조성물에, 각각 다양한 양의 2-옥소-히스티딘 잔기 및 산화되지 않은 히스티딘 잔기를 갖는 항-VEGF 단백질 변이체의 이종 집단이 있을 수 있다. 따라서, 조성물에서 2-옥소-히스티딘 항-VEGF 단백질의 백분율은 항-VEGF 분자 중 부위-특이적 2-옥소-히스티딘을 항-VEGF 단백질의 분자 내 총 부위-특이적 히스티딘으로 나눈 값(산화된 것과 산화되지 않은 것)에 100을 곱한 값을 지칭한다. 조성물에서 2-옥소-히스티딘의 수준을 정량화하는 한 가지 방법은 폴리펩타이드를 프로테이스(예를 들어, Lys-C 및/또는 트립신)로 분해시키고, 생성된 펩타이드에서 2-옥소-히스티딘의 양을, 예를 들어, 질량 분석법(ms)에 의해 분석하는 것이다.
항-VEGF 단백질의 분해 전, 시스테인 설피드릴기는 아이오도아세트아마이드(IAM)와의 반응에 의해 차단되어 하기 화학적 구조로 표시되는 잔기를 생성한다: . 이러한 변형은 유리 티올이 이황화브리지를 재형성하는 것을 방지하고, 이황화결합 스크램블을 방지한다. 본 발명은 항-VEGF 단백질 및 이의 변이체를 포함하는 조성물(예를 들어, 수성 조성물)을 포함하며, 이는 IAM으로 변형되고 프로테이스(예를 들어, Lys-C 및 트립신)로 소화되고 질량 분석법으로 분석될 때 다음 펩타이드를 포함한다:
약 0.004% 내지 0.013%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18),
약 0.006% 내지 0.028%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19),
약 0.049% 내지 0.085%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20),
약 0.057% 내지 0.092%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17),
약 0.008% 내지 0.022%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열번호 21) 및/또는
약 0.185% 내지 0.298%의 이산화된 트립토판을 포함하는 IIWDSR(서열번호 56);
또는
약 0.008%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18),
약 0.02%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19),
약 0.06%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20),
약 0.07%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17),
약 0.01%의 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열번호 21) 및/또는
약 0.23%의 다이-옥소-트립토판을 포함하는 IIWDSR(서열번호 56),
여기서 H*는 2-옥소-히스티딘이고, C*는 카복시메틸화된 시스테인이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 펩타이드는 PNGase F로 탈글리코실화된다.
본 발명은 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물을 포함하되, 항-VEGF 단백질의 모든 히스티딘의 약 0.1% 내지 10%가 2-옥소-히스티딘으로 변형된다. 또한, 조성물의 색상은, 예를 들어, 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않거나, 대안적으로 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*를 사용하여 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다. 조성물은 정화된 수확물 또는 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다. 이러한 조성물은 수확 물질이 포획 크로마토그래피 절차를 거칠 때 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 일 양태에서, 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 A 친화성 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 친화성 샘플이 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 하나 이상의 변이체가 검출될 수 있다.
본 발명은 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물을 포함하되, 항-VEGF 단백질의 모든 트립토판의 약 0.1% 내지 10%가 카이누레닌으로 변형된다. 또한, 조성물의 색상은 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*로 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ의 항-VEGF 단백질 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다. 조성물은 정화된 수확물 또는 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다. 이러한 조성물은 포획 크로마토그래피 절차를 거칠 때 정화된 수확물로 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 A 친화성 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 친화성 샘플이 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
본 발명은 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물을 포함하되, 항-VEGF 단백질의 모든 트립토판의 약 0.1% 내지 10%가 모노-하이드록실 트립토판으로 변형된다. 또한, 조성물의 색상은 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*로 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ의 항-VEGF 단백질 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다. 조성물은 정화된 수확물 또는 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다. 이러한 조성물은 포획 크로마토그래피 절차를 거칠 때 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 A 친화성 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 친화성 단계로부터 추출된 샘플이 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
본 발명은 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물을 포함하되, 항-VEGF 단백질의 모든 트립토판의 약 0.1% 내지 10%가 다이-하이드록실 트립토판으로 변형된다. 또한, 색상은 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*를 사용하여 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ의 항-VEGF 단백질 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다. 조성물은 정화된 수확물 또는 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다. 이러한 조성물은 항-VEGF 단백질뿐만 아니라 포획 크로마토그래피 절차를 거친 이의 옥소-변이체를 포함하는 CDM을 사용하여 제조된 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 A 친화성 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 친화성 단계로부터 추출된 샘플이 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
본 발명은 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물을 포함하되, 항-VEGF 단백질의 모든 트립토판의 약 0.1% 내지 10%가 트라이-하이드록실 트립토판으로 변형된다. 또한, 조성물의 색상은 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*으로 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ의 항-VEGF 단백질 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다. 조성물은 정화된 수확물 또는 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다. 이러한 조성물은 포획 크로마토그래피를 사용하여 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 A 친화성 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 친화성 단계로부터 추출된 샘플이 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, 항-VEGF 단백질은 다음과 같은 하나 이상의 잔기의 변형을 포함할 수 있다: 하나 이상의 아스파라긴이 탈아마이드화되고; 하나 이상의 아스파르트산이 아이소-아스파테이트 및/또는 Asn으로 전환되며; 하나 이상의 메티오닌이 산화되고; 하나 이상의 트립토판이 N-폼일카이누레닌으로 전환되고; 하나 이상의 트립토판이 모노-하이드록실 트립토판이며; 하나 이상의 트립토판이 다이-하이드록실 트립토판이고; 하나 이상의 트립토판이 트라이-하이드록실 트립토판이며; 하나 이상의 아르기닌이 Arg 3-데옥시글루코손으로 전환되고, C-말단 글리신이 존재하지 않으며; 그리고/또는 하나 이상의 비-글리코실화 글리코사이트가 있다.
이러한 조성물은 항-VEGF 단백질뿐만 아니라, 예를 들어, 포획 크로마토그래피 절차를 거친 이의 변이체를 포함하는 CDM을 사용하여 제조된 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 친화성 단계로부터 추출된 샘플이, 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 다음 중 하나 이상에서 산화될 수 있는 애플리버셉트의 구조적 특징을 공유하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있다: His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치); Trp58 및/또는 Trp138(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치); Tyr64(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 위치); Phe44 및/또는 Phe166(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치); 및/또는 Met10, Met 20, Met163 및/또는 Met192(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치). 이러한 조성물은 애플리버셉트뿐만 아니라 포획 크로마토그래피 절차를 거친 이의 옥소-변이체를 포함하는 CDM을 사용하여 제조된 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차일 수 있다. 친화성 단계로부터 추출된 샘플이, 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203; Trp58 및/또는 Trp138; Tyr64; Phe44 및/또는 Phe166; 및/또는 Met10, Met 20, Met163 및/또는 Met192에서 산화될 수 있는, 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 VEGF MiniTrap을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 VEGF MiniTrap뿐만 아니라 포획 크로마토그래피 절차를 거친 이의 옥소-변이체를 포함하는 CDM을 사용하여 제조된 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이며 - 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-VEGF 단백질 및 이의 변이체(옥소-변이체 포함)를 포함할 수 있되, 조성물에서 단백질 변이체의 양은 최대 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 이러한 조성물은 항-VEGF 단백질뿐만 아니라 포획 크로마토그래피 절차를 거친 이의 변이체를 포함하는 CDM을 사용하여 제조된 정화된 수확물로부터 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이며 - 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다. 일 양태에서, 이러한 조성물의 색상은, 예를 들어, 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*로 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다.
다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-VEGF 단백질 및 이의 변이체를 포함할 수 있되, 조성물에서 단백질 변이체의 양은 약 0% 내지 약 20%, 예를 들어, 약 0% 내지 약 20%, 약 0.05% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 20%, 약 0.4% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.6% 내지 약 20%, 약 0.7% 내지 약 20%, 약 0.8% 내지 약 20%, 약 0.9% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1.5% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 6% 내지 약 20%, 약 7% 내지 약 20%, 약 8% 내지 약 20%, 약 9% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 0% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.2% 내지 약 10%, 약 0.3% 내지 약 10%, 약 0.4% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.6% 내지 약 10%, 약 0.7% 내지 약 10%, 약 0.8% 내지 약 10%, 약 0.9% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1.5% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 7.5%, 약 0.05% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.2% 내지 약 7.5%, 약 0.3% 내지 약 7.5%, 약 0.4% 내지 약 7.5%, 약 0.5% 내지 약 7.5%, 약 0.6% 내지 약 7.5%, 약 0.7% 내지 약 7.5%, 약 0.8% 내지 약 7.5%, 약 0.9% 내지 약 7.5%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 1.5% 내지 약 7.5%, 약 2% 내지 약 7.5%, 약 3% 내지 약 7.5%, 약 4% 내지 약 7.5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 약 6% 내지 약 7.5%, 약 7% 내지 약 7.5%, 약 0% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.3% 내지 약 5%, 약 0.4% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.6% 내지 약 5%, 약 0.7% 내지 약 5%, 약 0.8% 내지 약 5%, 약 0.9% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 이러한 조성물은 수확 샘플에 대한 포획 크로마토그래피를 수행하여 얻어질 수 있다. 포획 단계는, 예를 들어, 단백질 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 절차이다. 샘플이 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석될 때, 이들 변이체 중 하나 이상이 검출될 수 있다. 일 양태에서, 이러한 조성물의 색상은, 예를 들어, 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*로 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 산성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, 조성물에서 산성 종의 양은 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 위에 논의된 바와 같이, 이러한 산성 종은 이온 교환, 예를 들어, WCX(WCX-10 HPLC, 약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)와 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, 산성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 먼저 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 늦게 용리된다(도 16 및 도 17 참조). 산성 종을 포함하는 조성물은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수확물 또는 친화성 생성 물질과 같은 생물학적 물질로부터 얻어질 수 있다.
일 양태에서, 이러한 조성물의 색상은, 예를 들어, 유럽 갈색-황색 색상 표준 BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 또는 BY5-BY6보다 더 어둡거나/더 진하지 않고/않거나 약 17 내지 23, 10 내지 17, 5 내지 10, 3 내지 5 또는 1 내지 3의 CIE L*, a*, b*로 특징지어지는 b* 값을 갖되, 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ를 포함한다. 예로서, 도 16 및 도 17을 참조하면, 분획 F1 및 분획 F2는 대부분의 산성 종을 포함하는 산성 분획을 나타낸다. 도 17에서 MT1의 피크 1 및 피크 2는 산성 종을 포함하고, 분획 F1 및 분획 F2는 대부분의 산성 분획을 포함한다. 이러한 산성 종(F1 및 F2)을 포함하는 분획은 또한 다른 분획과 비교하여 황갈색 색상을 보여준다(도 18b 및 도 18c).
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 산성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함하되, 조성물에서 산성 종의 양은 약 0% 내지 약 20%, 예를 들어, 약 0% 내지 약 20%, 약 0.05% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 20%, 약 0.4% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.6% 내지 약 20%, 약 0.7% 내지 약 20%, 약 0.8% 내지 약 20%, 약 0.9% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1.5% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 6% 내지 약 20%, 약 7% 내지 약 20%, 약 8% 내지 약 20%, 약 9% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 0% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.2% 내지 약 10%, 약 0.3% 내지 약 10%, 약 0.4% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.6% 내지 약 10%, 약 0.7% 내지 약 10%, 약 0.8% 내지 약 10%, 약 0.9% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1.5% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 7.5%, 약 0.05% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.2% 내지 약 7.5%, 약 0.3% 내지 약 7.5%, 약 0.4% 내지 약 7.5%, 약 0.5% 내지 약 7.5%, 약 0.6% 내지 약 7.5%, 약 0.7% 내지 약 7.5%, 약 0.8% 내지 약 7.5%, 약 0.9% 내지 약 7.5%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 1.5% 내지 약 7.5%, 약 2% 내지 약 7.5%, 약 3% 내지 약 7.5%, 약 4% 내지 약 7.5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 약 6% 내지 약 7.5%, 약 7% 내지 약 7.5%, 약 0% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.3% 내지 약 5%, 약 0.4% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.6% 내지 약 5%, 약 0.7% 내지 약 5%, 약 0.8% 내지 약 5%, 약 0.9% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 위에 논의된 바와 같이, 이러한 산성 종은 이온 교환, 예를 들어, WCX(WCX-10 HPLC, 약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)와 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 전형적으로, 산성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 먼저 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 늦게 용리된다(도 16 및 도 17 참조).
양이온 교환 칼럼을 사용하여, 관심 있는 주요 피크 이전에 용리된 모든 피크는 산성 영역으로 합산되었고, 관심 있는 단백질 후에 용리된 모든 피크는 염기성 영역으로 합산되었다. 예시적인 실시형태에서, 산성 종은 2개 이상의 산성 영역으로 용리될 수 있고, 피크의 소정의 머무름 시간 및 사용된 이온 교환 칼럼을 기준으로 AR1, AR2, AR3 등으로 번호가 매겨질 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 산성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, AR1은 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다. 일 양태에서, 조성물은 산성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, AR1은 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 10% 또는 약 10% 내지 약 15% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다. 위에 논의된 바와 같이, 이러한 산성 영역은 이온 교환, 예를 들어, WCX(WCX-10 HPLC, 약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)와 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, 산성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 먼저 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 늦게 용리된다(도 16 및 도 17 참조).
또 다른 실시형태에서, 조성물은 산성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, AR2는 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다. 일 양태에서, 조성물은 산성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, AR2는 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 10% 또는 약 10% 내지 약 15% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다.
일 실시형태에서, 조성물은 염기성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, 조성물에서 염기성 종의 양은 최대 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 일 양태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질 및 이의 염기성 종을 포함할 수 있되, 조성물에서 염기성 종의 양은 항-VEGF 단백질과 비교하여 0% 내지 약 20%, 예를 들어, 약 0% 내지 약 20%, 약 0.05% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 20%, 약 0.4% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.6% 내지 약 20%, 약 0.7% 내지 약 20%, 약 0.8% 내지 약 20%, 약 0.9% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1.5% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 6% 내지 약 20%, 약 7% 내지 약 20%, 약 8% 내지 약 20%, 약 9% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 0% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.2% 내지 약 10%, 약 0.3% 내지 약 10%, 약 0.4% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.6% 내지 약 10%, 약 0.7% 내지 약 10%, 약 0.8% 내지 약 10%, 약 0.9% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1.5% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 7.5%, 약 0.05% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.2% 내지 약 7.5%, 약 0.3% 내지 약 7.5%, 약 0.4% 내지 약 7.5%, 약 0.5% 내지 약 7.5%, 약 0.6% 내지 약 7.5%, 약 0.7% 내지 약 7.5%, 약 0.8% 내지 약 7.5%, 약 0.9% 내지 약 7.5%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 1.5% 내지 약 7.5%, 약 2% 내지 약 7.5%, 약 3% 내지 약 7.5%, 약 4% 내지 약 7.5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 약 6% 내지 약 7.5%, 약 7% 내지 약 7.5%, 약 0% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.3% 내지 약 5%, 약 0.4% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.6% 내지 약 5%, 약 0.7% 내지 약 5%, 약 0.8% 내지 약 5%, 약 0.9% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다.
염기성 종은 2개 이상의 염기성 영역으로 용리될 수 있고, 피크의 소정의 머무름 시간 및 사용되는 이온 교환을 기준으로 BR1, BR2, BR3 등으로 번호가 매겨질 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 염기성 종을 포함하는 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, BR1은 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다. 일 양태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질 및 이의 염기성 종을 포함할 수 있되, BR1은 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 10% 또는 약 10% 내지 약 15% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질 및 이의 염기성 종을 포함할 수 있되, BR2는 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다. 일 양태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질 및 항-VEGF 단백질의 염기성 종을 포함할 수 있되, BR2는 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 10% 또는 약 10% 내지 약 15% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질 및 이의 염기성 종을 포함할 수 있되, BR3은 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 또는 0.0% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다. 일 양태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질 및 항-VEGF 단백질의 염기성 종을 포함할 수 있되, BR3은 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 10% 또는 약 10% 내지 약 15% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위이다.
애플리버셉트의 광-유도성 산화
CDM을 사용하여 생산된 항-VEGF 단백질 조성물의 상이한 색상 특징 또는 변이체를 발견하는 것에 추가하여, 본 발명자들은 또한 이러한 조성물이 광에 노출됨으로써 실험실에서 인공적으로 생성될 수 있음을 발견하였다.
산화된 것을 포함하는 변형된, 항-VEGF 조성물의 변이체는 항-VEGF 단백질을 차가운 백색광 또는 자외선에 노출시킴으로써 생성될 수 있다. 일 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플과 비교하여 하나 이상의 변형된 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 50-배의 증가를 포함할 수 있되, 올리고펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17), EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열번호 18), QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20), TNYLTH*R(서열번호 21), SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR(서열번호 22), VH*EKDK(서열번호 23), SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR(서열번호 64), SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR(서열번호 65), TQSGSEM*K(서열번호 66), SDQGLYTC*AASSGLM*TK(서열번호 67), IIW*DSR/RIIW*DSR/IIW*DSRK(서열번호 28), TELNVGIDFNW*EYPSSK(서열번호 29), GFIISNATY*K(서열번호 69), KF*PLDTLIPDGK(서열번호 70) F*LSTLTIDGVTR(서열번호 32), 여기서 H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화되는 히스티딘이고, C*는 카복시메틸화되는 시스테인이며, M*은 산화된 메티오닌이고, W*는 산화된 트립토판이며, Y*는 산화된 타이로신이고, F*는 산화된 페닐알라닌이다. 추가의 양태에서, 항-VEGF 조성물은 항-VEGF 조성물을 차가운 백색광에 일정 기간, 예를 들어, 약 30시간 동안 노출시킴으로써 하나 이상의 변형된 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 10-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 차가운 백색광에 약 75시간 동안 노출시킴으로써 하나 이상의 변형된 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 10-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 차가운 백색광에 약 100시간 동안 노출시킴으로써 이전에 기재된 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 20-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 차가운 백색광에 약 150시간 동안 노출시킴으로써 이전에 기재된 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 20-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 차가운 백색광에 약 300시간 동안 노출시킴으로써 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 50-배의 증가를 포함할 수 있다 - 아래 실시예 4를 참조한다.
항-VEGF 조성물은 항-VEGF 조성물의 샘플을 자외선에 약 4시간 동안 노출시킴으로서 위에 기재된 바와 같이 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 3-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 자외선에 약 10시간 동안 노출시킴으로써 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 10-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 자외선에 약 16시간 동안 노출시킴으로써 기재된 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 10-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플을 자외선에 약 20시간 동안 노출시킴으로써 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 25-배의 증가를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 항-VEGF 조성물은 샘플 매트릭스를 자외선에 약 40시간 동안 노출시킴으로써 하나 이상의 올리고펩타이드에서 약 1.5-배 내지 약 25-배의 증가를 포함할 수 있다. 실시예 4 참조.
글리코다양성 - CDM을 사용하여 생성된 항-VEGF 단백질
본 발명의 조성물은 항-VEGF 단백질을 포함하되, CDM에서 생성된 항-VEGF 단백질은 다양한 글리코다양성(glycodiversity)을 갖는다. 항-VEGF 단백질의 상이한 글리코실화 프로파일은 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 예시적인 본 발명의 실시형태에서, 조성물은 다음과 같은 하나 이상의 아스파라긴에서 항-VEGF 단백질 글리코실화를 포함할 수 있다: G0-GlcNAc 글리코실화; G1-GlcNAc 글리코실화; G1S-GlcNAc 글리코실화; G0 글리코실화; G1 글리코실화; G1S 글리코실화; G2 글리코실화; G2S 글리코실화; G2S2 글리코실화; G0F 글리코실화; G2F2S 글리코실화; G2F2S2 글리코실화; G1F 글리코실화; G1FS 글리코실화; G2F 글리코실화; G2FS 글리코실화; G2FS2 글리코실화; G3FS 글리코실화; G3FS3 글리코실화; G0-2GlcNAc 글리코실화; Man4 글리코실화; Man4_A1G1 글리코실화; Man4_A1G1S1 글리코실화; Man5 글리코실화; Man5_A1G1 글리코실화; Man5_A1G1S1 글리코실화; Man6 글리코실화; Man6_G0+포스페이트 글리코실화; Man6+포스페이트 글리코실화; 및/또는 Man7 글리코실화. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트, 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap일 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 다음과 같은 글리코실화 프로파일을 가질 수 있다: 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 50%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸(실시예 6).
일 실시형태에서, 조성물은 항-VEGF 단백질을 포함할 수 있되, 관심 있는 단백질은 123번 아스파라긴 잔기의 약 32.4% 및/또는 196번 아스파라긴 잔기의 약 27.1%에서 Man5 글리코실화를 갖는다. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트, 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%의 총 시알릴화된 글리칸을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 8%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14% 또는 약 15%의 만노스-5를 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78% 또는 약 79%의 총 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 감소된 수준의 퓨코실화된 글리칸을 가질 수 있다. 대두 가수분해물을 사용하여 생성된 항-VEGF 단백질에서 퓨코실화된 글리칸의 수준과 비교하여, 하나 이상의 선행하는 값, 예를 들어, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 1% 내지 35%, 1% 내지 40%, 1% 내지 41%, 1% 내지 42%, 1% 내지 43%, 1% 내지 44%, 1% 내지 45%, 1% 내지 46%, 1% 내지 47%, 1% 내지 48%, 1% 내지 49%, 1% 내지 50%, 2% 내지 10%, 2% 내지 15%, 2% 내지 20%, 2% 내지 25%, 2% 내지 30%, 2% 내지 35%, 2% 내지 40%, 2% 내지 41%, 2% 내지 42%, 2% 내지 43%, 2% 내지 44%, 2% 내지 45%, 2% 내지 46%, 2% 내지 47%, 2% 내지 48%, 2% 내지 49%, 2% 내지 50%, 3% 내지 10%, 3% 내지 15%, 3% 내지 20%, 3% 내지 25%, 3% 내지 30%, 3% 내지 35%, 3% 내지 40%, 3% 내지 41%, 3% 내지 42%, 3% 내지 43%, 3% 내지 44%, 3% 내지 45%, 3% 내지 46%, 3% 내지 47%, 3% 내지 48%, 3% 내지 49%, 3% 내지 50%, 4% 내지 10%, 4% 내지 15%, 4% 내지 20%, 4% 내지 25%, 4% 내지 30%, 4% 내지 35%, 4% 내지 40%, 4% 내지 41%, 4% 내지 42%, 4% 내지 43%, 4% 내지 44%, 4% 내지 45%, 4% 내지 46%, 4% 내지 47%, 4% 내지 48%, 4% 내지 49%, 4% 내지 50% 또는 1% 내지 99% 내의 범위이다.
일 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 감소된 수준의 시알릴화된 글리칸을 가질 수 있다. 대두 가수분해물을 사용하여 생성된 항-VEGF 단백질에서 시알릴화된 글리칸의 수준과 비교하여, 하나 이상의 선행하는 값, 예를 들어, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 1% 내지 35%, 1% 내지 40%, 1% 내지 41%, 1% 내지 42%, 1% 내지 43%, 1% 내지 44%, 1% 내지 45%, 1% 내지 46%, 1% 내지 47%, 1% 내지 48%, 1% 내지 49%, 1% 내지 50%, 2% 내지 10%, 2% 내지 15%, 2% 내지 20%, 2% 내지 25%, 2% 내지 30%, 2% 내지 35%, 2% 내지 40%, 2% 내지 41%, 2% 내지 42%, 2% 내지 43%, 2% 내지 44%, 2% 내지 45%, 2% 내지 46%, 2% 내지 47%, 2% 내지 48%, 2% 내지 49%, 2% 내지 50%, 3% 내지 10%, 3% 내지 15%, 3% 내지 20%, 3% 내지 25%, 3% 내지 30%, 3% 내지 35%, 3% 내지 40%, 3% 내지 41%, 3% 내지 42%, 3% 내지 43%, 3% 내지 44%, 3% 내지 45%, 3% 내지 46%, 3% 내지 47%, 3% 내지 48%, 3% 내지 49%, 3% 내지 50%, 4% 내지 10%, 4% 내지 15%, 4% 내지 20%, 4% 내지 25%, 4% 내지 30%, 4% 내지 35%, 4% 내지 40%, 4% 내지 41%, 4% 내지 42%, 4% 내지 43%, 4% 내지 44%, 4% 내지 45%, 4% 내지 46%, 4% 내지 47%, 4% 내지 48%, 4% 내지 49%, 4% 내지 50% 또는 1% 내지 99% 내의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 감소된 수준의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다. 대두 가수분해물을 사용하여 생산된 항-VEGF 단백질에서 갈락토실화된 글리칸의 수준과 비교하여, 하나 이상의 선행하는 값, 예를 들어, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 1% 내지 35%, 1% 내지 40%, 1% 내지 41%, 1% 내지 42%, 1% 내지 43%, 1% 내지 44%, 1% 내지 45%, 1% 내지 46%, 1% 내지 47%, 1% 내지 48%, 1% 내지 49%, 1% 내지 50%, 2% 내지 10%, 2% 내지 15%, 2% 내지 20%, 2% 내지 25%, 2% 내지 30%, 2% 내지 35%, 2% 내지 40%, 2% 내지 41%, 2% 내지 42%, 2% 내지 43%, 2% 내지 44%, 2% 내지 45%, 2% 내지 46%, 2% 내지 47%, 2% 내지 48%, 2% 내지 49%, 2% 내지 50%, 3% 내지 10%, 3% 내지 15%, 3% 내지 20%, 3% 내지 25%, 3% 내지 30%, 3% 내지 35%, 3% 내지 40%, 3% 내지 41%, 3% 내지 42%, 3% 내지 43%, 3% 내지 44%, 3% 내지 45%, 3% 내지 46%, 3% 내지 47%, 3% 내지 48%, 3% 내지 49%, 3% 내지 50%, 4% 내지 10%, 4% 내지 15%, 4% 내지 20%, 4% 내지 25%, 4% 내지 30%, 4% 내지 35%, 4% 내지 40%, 4% 내지 41%, 4% 내지 42%, 4% 내지 43%, 4% 내지 44%, 4% 내지 45%, 4% 내지 46%, 4% 내지 47%, 4% 내지 48%, 4% 내지 49%, 4% 내지 50% 또는 1% 내지 99% 내의 범위이다.
일 실시형태에서, 항-VEGF 단백질은 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 증가된 수준의 만노실화된 글리칸을 가질 수 있다. 대두 가수분해물을 사용하여 생성된 항-VEGF 단백질에서 만노실화된 글리칸의 수준과 비교하여, 하나 이상의 선행하는 값, 예를 들어, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 1% 내지 35%, 1% 내지 40%, 1% 내지 41%, 1% 내지 42%, 1% 내지 43%, 1% 내지 44%, 1% 내지 45%, 1% 내지 46%, 1% 내지 47%, 1% 내지 48%, 1% 내지 49%, 1% 내지 50%, 2% 내지 10%, 2% 내지 15%, 2% 내지 20%, 2% 내지 25%, 2% 내지 30%, 2% 내지 35%, 2% 내지 40%, 2% 내지 41%, 2% 내지 42%, 2% 내지 43%, 2% 내지 44%, 2% 내지 45%, 2% 내지 46%, 2% 내지 47%, 2% 내지 48%, 2% 내지 49%, 2% 내지 50%, 3% 내지 10%, 3% 내지 15%, 3% 내지 20%, 3% 내지 25%, 3% 내지 30%, 3% 내지 35%, 3% 내지 40%, 3% 내지 41%, 3% 내지 42%, 3% 내지 43%, 3% 내지 44%, 3% 내지 45%, 3% 내지 46%, 3% 내지 47%, 3% 내지 48%, 3% 내지 49%, 3% 내지 50%, 4% 내지 10%, 4% 내지 15%, 4% 내지 20%, 4% 내지 25%, 4% 내지 30%, 4% 내지 35%, 4% 내지 40%, 4% 내지 41%, 4% 내지 42%, 4% 내지 43%, 4% 내지 44%, 4% 내지 45%, 4% 내지 46%, 4% 내지 47%, 4% 내지 48%, 4% 내지 49%, 4% 내지 50% 또는 1% 내지 99% 내의 범위이다.
이 부문에 기재된 조성물은 아래 부문 IV 및 V에 각각 기재된 바와 같이 여러 상류 및 하류 매개변수에 의해 생성될 수 있다.
IV. 상류 공정 기술을 사용한 조성물의 제조
생물학적 제제의 경우, 강력하고 유연한 상류 공정의 구현이 바람직하다. 효율적인 상류 공정은 관심 있는 단백질의 목적하는 생산 및 규모 확대로 이어질 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물이 CDM의 배지 성분의 변화와 같은 상류 단백질 생산 동안 조건을 조절함으로써 생산될 수 있음을 발견하였다. 상류 공정의 각 단계는 제조된 단백질의 품질, 순도 및 양에 영향을 미칠 수 있다.
본 개시내용은 CDM을 사용하여 생산된 애플리버셉트 및/또는 MiniTrap의 소정의 변이체의 존재에 대한 증거를 제공한다. 이러한 변이체는 하나 이상의 산화된 아미노산 잔기를 포함하는 아이소형을 포함한다. 산화된 잔기의 예는 하나 이상의 히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 페닐알라닌 또는 타이로신 잔기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형된 CDM을 사용하여 생산된 조성물은 애플리버셉트 및/또는 MiniTrap의 단백질 변이체의 목적하는 목표값을 갖는 항-VEGF 단백질의 제조물을 생성할 수 있다. 위에 언급된 바와 같이, CDM을 사용하여 생성된 분획과 관련된 황갈색 색상이 있을 수도 있다. (위에 언급된 바와 같이, 본 발명자들에 의해 테스트된 모든 CDM이 뚜렷한 변색을 나타내지는 않음)
본 발명은 세포가 관심 있는 재조합 단백질을 발현하기에 적합한 조건하에 변형된 CDM에서 숙주 세포를 배양한 후 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 포함한다. 이러한 변형된 CDM은 부문 III에 기재된 바와 같은 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. (CDM은 애플리버셉트가 발현될 때 황갈색 색상을 띄는 배지임에 유의하여야 함)
일 실시형태에서, 방법은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 숙주 세포는 애플리버셉트와 같은 관심 있는 재조합 단백질을 발현한다. 방법은 세포에 의해 생산된 관심 있는 재조합 단백질의 제조물을 수확하는 단계를 더 포함하되, 적합한 조건은 다음이 포함된 CDM을 포함한다: 상기 CDM에서의 철의 누적 농도는 약 55μM 미만, 상기 CDM에서의 구리의 누적 농도는 약 0.8μM 이하, 상기 CDM에서 니켈의 누적 농도는 약 0.40μM 이하, 상기 CDM에서 아연의 누적 농도는 약 56μM 이하, 상기 CDM에서 시스테인의 누적 농도는 10mM 미만; 및/또는 상기 CDM에서의 항산화제의 농도는 단일 항산화제의 경우 약 0.001mM 내지 약 10mM이고 여러 항산화제가 상기 CDM에 첨가되는 경우 누적 농도는 약 30mM 이하.
본 실시형태의 일 양태에서, 적합한 조건을 사용하여 얻어진 제조물은 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체를 목적하는 양의 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체로 감소시킨다(애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체의 "목표값"으로 지칭됨). 이 실시형태의 추가의 양태에서, 적합한 조건을 사용하여 얻어진 제조물은 애플리버셉트 및 VEGF MiniTrap의 변이체를 포함하는 단백질의 제조물이 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 또는 그 이상의 농도로 정규화될 때, 제조물의 색상을 목적하는 BY 값("목표 BY 값"으로 지칭됨)으로 감소시킨다.
본 발명의 실시형태의 추가의 양태에서, 변이체의 목표 BY 값 및/또는 목표값은 역가가 증가하거나 또는 유의하게 감소하지 않는 제조물에서 얻어질 수 있다(실시예 5 참조).
일부 실시형태에서, 변형된 CDM을 사용하여 생산된 조성물은 목적하는 목표 BY 값을 갖는 항-VEGF 단백질의 제조물을 생성할 수 있되, 제조물의 색상은 다음과 같이 특징지어진다:
(i) 유럽 색상 표준 BY2보다 더 황갈색이 아님;
(ii) 유럽 색상 표준 BY3보다 더 황갈색이 아님;
(iii) 유럽 색상 표준 BY4보다 더 황갈색이 아님;
(iv) 유럽 색상 표준 BY5보다 더 황갈색이 아님;
(v) 유럽 색상 표준 BY2와 BY3 사이;
(vi) 유럽 색상 표준 BY3과 BY4 사이;
(vii) 유럽 색상 표준 BY4와 BY5 사이,
여기서 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물의 샘플은 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어질 수 있다. 실시예 9, 아래 표 9-3에서 볼 수 있는 바와 같이, 5 g/ℓ의 애플리버셉트를 포함하는 단백질 용리액은 1.77의 b* 값을 갖는 것으로 측정된 황갈색 색상을 나타낸다. AEX에 이어 하류에서 생산될 때 이러한 샘플은 0.50의 b* 값을 가졌으며, 이는 샘플의 황갈색 착색을 낮추는 AEX의 유용성을 보여준다(표 9-3).
변형된 CDM을 사용하여 생산된 조성물은 항-VEGF 단백질의 제조물을 생성할 수 있되, 제조물의 색상은 CIELAB 척도에서 인정된 표준 색상 특성을 특징으로 한다:
(i) b* 값이 약 22 내지 23 이하인 황갈색;
(ii) b* 값이 약 16 내지 17 이하인 황갈색;
(iii) b* 값이 9 내지10 이하인 황갈색;
(iv) b* 값이 4 내지 5 이하인 황갈색;
(v) b* 값이 2 내지 3 이하인 황갈색;
(vi) 17 내지 23의 b* 값 사이;
(vii) 10 내지 17의 b* 값 사이;
(viii) 5 내지 10의 b* 값 사이;
(ix) 3 내지 5의 b* 값 사이; 또는
(x) 1 내지 3의 b* 값 사이,
여기서 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물은 정화된 수확물의 단백질 용리액으로부터의 샘플로 얻어진다. 실시예 9, 표 9-3 참조.
변형된 CDM을 형성하기 위해 세포 배양에 첨가되는 성분의 경우, 용어 "누적량"은 배양 시작시(제0일의 CDM) 첨가된 양 및 후속적으로 첨가된 성분의 양을 포함하여 CDM을 형성하기 위해 세포 배양 과정에 걸쳐 생물반응기에 첨가된 특정 성분의 총량을 지칭한다. 생물반응기 생산 전(즉, 제0일의 CDM 전) 시드-트레인 배양물 또는 접종물에 첨가된 성분의 양도 또한 성분의 누적량을 계산할 때 포함된다. 누적량은 배양 동안 시간 경과에 따른 성분의 손실(예를 들어, 대사 또는 화학적 분해를 통해)에 영향을 받지 않는다. 따라서, 성분의 누적량이 동일한 두 배양물은 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 성분이 상이한 시간에 두 배양물에 첨가되는 경우(예를 들어, 한 배양물에는 처음에 모든 성분이 첨가되고, 또 다른 배양물에는 시간이 지남에 따라 성분이 첨가되는 경우) 상이한 절대 수준을 가질 수 있다. 누적량은 또한 배양 동안 시간 경과에 따른 성분의 제자리 합성(예를 들어, 대사 또는 화학적 전환을 통해)에 의해서도 영향을 받지 않는다. 따라서, 주어진 성분의 누적량이 동일한 두 배양물은 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 성분이 생물전환 과정에 의해 두 배양물 중 하나에서 제자리에서 합성되는 경우 상이한 절대 수준을 가질 수 있다. 누적량은, 예를 들어, 성분의 그램 또는 몰과 같은 단위로 표현될 수 있다. 용어 "누적 농도"는 배양에 사용된 임의의 접종물의 시작 부피에 대한 기여도를 포함하여 생산 배취의 시작시 생물반응기의 액체 부피로 나눈 성분의 누적량을 지칭한다. 예를 들어, 생물반응기가 생산 배취의 시작시에 2 리터의 세포 배양 배지를 포함하며 1그램의 성분 X가 제0일, 제1일, 제2일 및 제3일에 첨가된다면, 3일 후의 누적 농도는 2 g/ℓ이다(즉, 4그램을 2 리터로 나눈 값). 제4일에, 성분 X를 포함하지 않은 액체의 추가적인 1리터를 생물반응기에 첨가하면, 누적 농도는 2 g/ℓ를 유지할 것이다. 제5일에, 생물반응기에서 일정량의 액체가 손실된 경우(예를 들어, 증발을 통해), 누적 농도는 2 g/ℓ를 유지할 것이다. 누적 농도는, 예를 들어, 리터당 그램 또는 리터당 몰과 같은 단위로 표현될 수 있다.
A. 아미노산:
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 CDM에서 아미노산의 누적 농도를 감소 또는 증가시켜 얻어질 수 있다. 이러한 아미노산의 비제한적인 예는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린(또는 이의 염)을 포함한다. 변형된 CDM에서 이러한 아미노산의 누적량의 증가 또는 감소는 출발 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 변형된 CDM에서 하나 이상의 아미노산의 누적량의 증가 또는 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90% 또는 약 90% 내지 약 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다.(도 25 내지 도 27 및 실시예 5 참조).
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 CDM에서 시스테인의 누적 농도를 감소시킴으로써 얻어질 수 있다. 변형된 CDM을 형성하기 위한 CDM에서의 시스테인 양의 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 변형된 CDM에서 시스테인의 누적량의 감소는 CDM과 비교하여 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90% 또는 약 90% 내지 약 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 일 양태에서, 변형된 CDM에서 누적 시스테인의 양은 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM 또는 약 10mM 미만이다(도 25 내지 도 27 및 실시예 5 참조).
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 CDM에 있는 적어도 소정의 백분율의 누적 시스테인을 시스틴으로 대체함으로써 얻어질 수 있다. 대체는 비변형된 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 대체는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90% 또는 약 90% 내지 약 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다.(도 25 내지 도 27 및 실시예 5 참조).
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 CDM에 있는 적어도 소정의 백분율의 누적 시스테인 시스테인 설페이트로 대체함으로써 얻어질 수 있다. 대체는 비변형된 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 대체는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90% 또는 약 90% 내지 약 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다.
B. 금속:
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 CDM에서 금속의 누적 농도를 감소 또는 증가시킴으로써 얻어질 수 있다. 금속의 비제한적인 예는 철, 구리, 망가니즈, 몰리브데넘, 아연, 니켈, 칼슘, 포타슘 및 소듐을 포함한다. 변형된 CDM에서 하나 이상의 금속의 양의 증가 또는 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 변형된 CDM에서 하나 이상의 금속의 누적량의 증가 또는 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90% 또는 약 90% 내지 약 100% 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위일 수 있다.(도 25 내지 도 27 및 실시예 5 참조).
C. 항산화제:
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 하나 이상의 항산화제를 포함한다. 항산화제의 비제한적인 예는 타우린, 하이포타우린, 글리신, 티옥트산, 글루타티온, 콜린 클로라이드, 하이드로코르티손, 바이타민 C, 바이타민 E 및 이들의 조합을 포함할 수 있다(도 28a 내지 도 28e 및 실시예 5 참조).
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 0.01mM 내지 약 20mM, 즉, 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 10mM, 0.1mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 10mM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 타우린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 0.01mM 내지 약 20mM, 즉, 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 10mM, 0.1mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 10mM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 하이포타우린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 0.01mM 내지 약 20mM, 즉, 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 10mM, 0.1mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 10mM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 글리신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 0.01μM 내지 약 5μM, 즉, 약 0.01μM 내지 약 0.1μM, 약 0.1μM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 2.5μM, 약 1μM 내지 약 3μM, 약 1μM 내지 약 5μM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 티옥트산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 0.01M 내지 약 5mM, 즉, 0.01mM 내지 약 1mM, 0.1mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 5mM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 글루타티온을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 0.01μM 내지 약 5μM, 즉, 약 0.01μM 내지 약 0.1μM, 약 0.1μM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 2.5μM, 약 1μM 내지 약 3μM, 약 1μM 내지 약 5μM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 하이드로코르티손을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 CDM은 약 1μM 내지 약 50μM, 즉, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 20μM, 약 10μM 내지 약 30μM, 약 5μM 내지 약 30μM, 약 20μM 내지 약 50μM, 약 25μM 내지 약 50μM 및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위의 바이타민 C를 포함한다.
D. 글리코실화를 조절하기 위한 배지의 변화:
본 개시내용은 또한 CDM에서 소정의 성분의 누적 농도를 변화시킴으로써 항-VEGF 단백질의 글리코실화를 조절하는 방법을 포함한다. CDM에 첨가된 성분의 누적량에 기초하여, 총 퓨코실화%, 총 갈락토실화%, 총 시알릴화% 및 만노스-5가 변할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 항-VEGF 단백질의 글리코실화를 조절하는 방법은 CDM에 우리딘을 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 항-VEGF 단백질은 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 2% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다. (실시예 6).
일부 실시형태에서, 항-VEGF 단백질의 글리코실화를 조절하는 방법은 CDM에 망가니즈를 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, CDM에는 보충 전에 망가니즈가 없다. 항-VEGF 단백질은 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 2% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다. (실시예 6).
일부 실시형태에서, 항-VEGF 단백질의 글리코실화를 조절하는 방법은 CDM에 갈락토스를 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, CDM에는 보충 전에 갈락토스가 없다. 항-VEGF 단백질은 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 2% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다. (아래 실시예 6 참조).
일부 실시형태에서, 항-VEGF 단백질의 글리코실화를 조절하는 방법은 CDM에 덱사메타손을 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, CDM에는 보충 전에 덱사메타손이 없다. 항-VEGF 단백질은 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 2% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다. (아래 실시예 6 참조).
일부 실시형태에서, 항-VEGF 단백질의 글리코실화를 조절하는 방법은 CDM에 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손 중 하나 이상을 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, CDM에는 보충 전에 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손 중 하나 이상이 없다. 항-VEGF 단백질은 약 40% 내지 약 50%의 총 퓨코실화된 글리칸, 약 30% 내지 약 55%의 총 시알릴화된 글리칸, 약 2% 내지 약 15%의 만노스-5 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다. (아래 실시예 6 참조).
V. 하류 공정 기술을 사용한 조성물의 제조
본 발명의 항-VEGF 단백질을 포함하는 조성물은 하류 단백질 생산 동안 조건을 조절함으로써 생산될 수 있다. 본 발명자들은 하류 절차를 최적화하면 항-VEGF 단백질의 소정의 변이체뿐만 아니라 변색을 최소화할 수 있다는 것을 발견하였다. 하류 공정의 최적화는 감소된 옥소-변이체뿐만 아니라 최적화된 색상 특징을 갖는 조성물을 생성할 수 있다.
하류 공정 기술은 단독으로 또는 위의 부문 IV에 기재된 상류 공정 기술과 조합하여 사용될 수 있다.
A. 음이온-교환 크로마토그래피:
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 CDM의 숙주 세포에서 항-VEGF 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 과정을 포함할 수 있되, 항-VEGF 단백질은 숙주 세포에서 배지로 분비되고 정화된 수확물이 얻어진다. 수확물은 다음 단계를 거친다: (a) 수확물로부터 얻은 생물학적 샘플을 음이온-교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼에 로딩하는 단계; (b) 적합한 세척 완충액으로 AEX 칼럼을 세척하는 단계, (c) 통과 분획(들)을 수집하는 단계, 선택적으로, (d) 적합한 스트립 완충액으로 칼럼을 세척하는 단계 및 (e) 스트리핑된 분획을 수집하는 단계.
통과 분획은 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼의 스트리핑된 분획에서의 옥소-변이체와 비교될 때 항-VEGF 단백질 샘플의 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%인 항-VEGF 단백질의 옥소-변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표 9-5 및 표 9-6을 참조하면, 통과 분획은 스트리핑된 분획에서 산화된 변이체와 비교할 때 여러 히스티딘 및 트립토판 잔기가 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%(및 선행하는 것 중 하나 이상 내의 범위) 산화된 항-VEGF 단백질의 산화된 변이체를 포함한다.
AEX 칼럼에 대한 평형 및 세척 완충액 둘 다의 pH는 약 8.20 내지 약 8.60일 수 있다. 또 다른 양태에서, AEX 칼럼에 대한 평형 및 세척 완충액 둘 다의 전도도는 약 1.50 내지 약 3.0 mS/㎝일 수 있다. 일 양태에서, 평형 및 세척 완충액은 약 50mM 트리스 하이드로클로라이드일 수 있다. 일 양태에서, 스트립 완충액은 2M 소듐 클로라이드 또는 1N 소듐 하이드록사이드 또는 둘 다를 포함한다(표 2-2 참조). 실시예 2는 평형 및 세척 완충액의 농도 및 전도도를 최적화하는 것을 추가로 설명한다.
단백질 변이체는 다음과 같은 하나 이상의 잔기의 변형을 포함할 수 있다: 하나 이상의 아스파라긴이 탈아마이드화되고; 하나 이상의 아스파르트산이 아이소-아스파테이트 및/또는 Asn으로 전환되며; 하나 이상의 메티오닌이 산화되고; 하나 이상의 트립토판이 N-폼일카이누레닌으로 전환되며; 하나 이상의 트립토판은 모노-하이드록실 트립토판이고; 하나 이상의 트립토판은 다이-하이드록실 트립토판이며; 하나 이상의 트립토판은 트라이-하이드록실 트립토판이고; 하나 이상의 아르기닌은 Arg 3-데옥시글루코손으로 전환되며; C-말단 글리신이 존재하고; 그리고/또는 하나 이상의 비-글리코실화 글리코사이트가 존재한다.
관심 있는 단백질은 애플리버셉트, 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap일 수 있다. 단백질 변이체는 (i) His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)로부터 선택되는 히스티딘 잔기로부터 히스티딘의 산화; (ii) Trp58 및/또는 Trp138(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)의 트립토판 잔기로부터 선택되는 트립토판 잔기의 산화; (iii) Tyr64(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 위치)에서 타이로신 잔기의 산화; (iv) Phe44 및/또는 Phe166(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)으로부터 선택되는 페닐알라닌 잔기의 산화; 및/또는 (v) Met10, Met 20, Met163 및/또는 Met192(또는 애플리버셉트의 소정의 구조적 특징을 공유하는 단백질 상의 동등한 잔기 위치)로부터 선택되는 메티오닌 잔기의 산화 중 하나 이상에 의해 형성될 수 있다.
통과 분획은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(a) 2-옥소-히스티딘으로 산화된 히스티딘 잔기의 백분율, 여기서 색상 특성은 다음과 같다:
(i) 유럽 색상 표준 BY2보다 더 황갈색이 아님;
(ii) 유럽 색상 표준 BY3보다 더 황갈색이 아님;
(iii) 유럽 색상 표준 BY4보다 더 황갈색이 아님;
(iv) 유럽 색상 표준 BY5보다 더 황갈색이 아님;
(v) 유럽 색상 표준 BY2와 BY3 사이;
(vi) 유럽 색상 표준 BY3과 BY4 사이;
(vii) 유럽 색상 표준 BY4와 BY5 사이, 여기서 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물은 통과 분획으로부터 샘플로 얻어진다.
(b) 2-옥소-히스티딘으로 산화된 히스티딘 잔기의 백분율. 또한, 이들의 색상은 BY2, BY3, BY4, BY5, BY6, BY7에 가까운 황갈색 색상을 갖는 것을 특징으로 하거나; 또는 BY2보다 더 어둡거나/더 진하지 않고, BY3보다 더 어둡지 않고, BY4보다 더 어둡지 않고, BY5보다 더 어둡지 않고, BY6보다 더 어둡지 않고, BY7보다 더 어둡지 않거나; 또는 BY2와 BY3 사이, BY2와 BY4 사이, BY3과 BY4 사이 또는 BY3과 BY5 사이에 있다.
(c) 2-옥소-히스티딘으로 산화된 히스티딘 잔기의 백분율, 여기서 색상은 다음과 같은 CIE L*, a*, b* 색 공간의 색상을 특징으로 한다:
(i) b* 값이 약 22 내지 23 이하인 황갈색;
(ii) b* 값이 약 16 내지 17 이하인 황갈색;
(iii) b* 값이 9 내지10 이하인 황갈색;
(iv) b* 값이 4 내지 5 이하인 황갈색;
(v) b* 값이 2 내지 3 이하인 황갈색;
(vi) 17 내지 23의 b* 값 사이;
(vii) 10 내지 17의 b* 값 사이;
(viii) 5 내지 10의 b* 값 사이;
(ix) 3 내지 5의 b* 값 사이; 또는
(x) 1 내지 3의 b* 값 사이, 여기서 조성물은 약 5 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ의 항-VEGF 단백질을 포함하고, 조성물은 통과 분획으로부터 샘플로 얻어진다.
(d) 조성물에서 히스티딘 잔기의 약 1% 이하, 약 0.1% 이하 또는 약 0.1% 내지 1%, 0.2% 내지 1%, 0.3% 내지 1%, 0.4% 내지 1%, 0.5% 내지 1%, 0.6% 내지 1%, 0.7% 내지 1%, 0.8% 내지 1% 또는 0.9% 내지 1%가 2-옥소-히스티딘으로 산화된다. 백분율 계산은 부문 II에 설명되어 있다.
B. 친화성 크로마토그래피:
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 숙주 세포에서 항-VEGF 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 과정을 사용하여 생산될 수 있되, 항-VEGF 단백질은 숙주 세포에서 배지로 분비되고, 정화된 수확물이 얻어진다. 수확물은 (a) 정화된 수확물로부터 얻어진 생물학적 샘플을 친화성 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계로서, 친화성 크로마토그래피는 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함하는, 상기 생물학적 샘플을 친화성 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계; (b) 친화성 크로마토그래피 칼럼을 적합한 용리 완충액으로 세척하는 단계 및 (c) 용리된 분획(들)을 수집하는 단계를 거친다. 예를 들어, 표 7-1 및 표 7-7 내지 표 7-10에 예시된 바와 같이, 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 단백질로서 VEGF165를 사용하고 위의 방법에 따라 용리된 분획을 수집하여 MT5(항-VEGF 단백질), 애플리버셉트 및 항-VEGF scFv 단편의 성공적인 생산을 유도하였다. 표 7-1은 또한 MT5에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 상이한 단백질로서 (i) mAb1(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 73은 중쇄이고 서열번호 74는 경쇄임); (ii) mAb2(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 75는 중쇄이고 서열번호 76은 경쇄임); (iii) mAb3(마우스 항-VEGF-R1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 77은 중쇄이고 서열번호 78은 경쇄임) 및 (iv) mAb4(마우스 항-VEGFR1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 79는 중쇄이고 서열번호 80은 경쇄임)를 사용한 MT5의 성공적인 생산을 개시한다.
위의 (a) 단계와 관련하여, 친화성 칼럼에 로딩될 생물학적 샘플은 정화된 수확물이 이온 교환 크로마토그래피(음이온 또는 양이온)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 친화성 전에 생산을 거칠 수 있는 샘플로부터 유래할 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 크로마토그래피 절차가 또한 친화성 단계의 사용 전에 이용될 수 있다. 중요한 점은 항-VEGF 단백질을 포함하는 생물학적 샘플이 친화성 크로마토그래피를 거칠 수 있다는 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 숙주 세포에서 VEGF MiniTrap 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 과정을 사용하여 생산될 수 있되, VEGF MiniTrap은 숙주 세포에서 배지로 분비되고, 배지는 정화된 수확물을 형성하기 위해 추가로 처리될 수 있다. 이 수확물은 VEGF MiniTrap을 포함하는 생물학적 샘플을 생성하는 공지의 크로마토그래피 절차에 의해 추가로 처리될 수 있다. 이 생물학적 샘플은 (a) 생물학적 샘플을 친화성 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계로서, 친화성 크로마토그래피는 VEGF MiniTrap 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 단백질을 포함하는, 상기 생물학적 샘플을 친화성 크로마토그래피 칼럼에 로딩하는 단계; (b) 친화성 크로마토그래피 칼럼을 적합한 용리 완충액으로 세척하는 단계 및 (c) 용리된 분획(들)을 수집하는 단계를 이용하여 추가로 처리될 수 있다. 다시 표 7-1을 참조하면, 이 표에는 MT5에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 상이한 단백질로서 (i) VEGF165; (ii) mAb1(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 73은 중쇄이고 서열번호 74는 경쇄임); (iii) mAb2(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 75는 중쇄이고 서열번호 76은 경쇄임); (iv) mAb3(마우스 항-VEGF-R1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 77은 중쇄이고 서열번호 78은 경쇄임) 및 (v) mAb4(마우스 항-VEGFR1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 79는 중쇄이고 서열번호 80은 경쇄임)를 사용한 MT5(VEGF MiniTrap)의 성공적인 생산이 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 친화성 크로마토그래피가 또한 다른 MiniTrap 단백질을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 애플리버셉트의 절단 후, 절단된 애플리버셉트를 포함하는 샘플은 절단된 애플리버셉트에 특이적인 결합제를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 거칠 수 있다. 일 양태에서, 결합제는 항체 또는 이의 일부일 수 있다.
애플리버셉트의 절단은, 예를 들어, VEGF MiniTrap을 생성하기 위한 IdeS 프로테이스(FabRICATOR) 또는 이의 변이체를 사용한 애플리버셉트의 단백질 분해성 소화를 사용하여 촉진될 수 있다. IdeS 프로테이스 또는 이의 변이체를 이용한 애플리버셉트의 절단은 Fc 단편 및 VEGF MiniTrap을 포함하는 생성물의 혼합물을 생성할 수 있다. VEGF MiniTrap은 본 명세서에 기재된 생산 전략 중 하나 이상을 사용하여 추가로 처리될 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 애플리버셉트 또는 MiniTrap과 같은 항-VEGF 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합("결합제")하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 단백질은 인간 또는 마우스로부터 기원할 수 있다.
친화성 생산 공정은 생물학적 샘플을 로딩하기 전 평형화 완충액을 사용하는 평형 친화성 칼럼을 더 포함할 수 있다. 예시적인 평형화 완충액은 20mM 소듐 포스페이트(pH 6 내지 8(특히, 7.2)), 10mM 소듐 포스페이트, 500mM NaCl(pH 6 내지 8(특히, 7.2), 50mM Tris(pH 7 내지 8), DPBS(pH 7.4)일 수 있다.
생물학적 샘플은 DPBS와 같은 적합한 완충액을 사용하여 로딩될 수 있다.
이러한 친화성 생산 공정은 하나 이상의 세척 완충액으로 친화성 칼럼을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 칼럼은 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 또한, 세척액은 또한 세척 분획으로 수집될 수도 있다. 세척 완충액의 pH는 약 7.0 내지 약 8.60일 수 있다. 일 양태에서, 세척 완충액은 DPBS일 수 있다. 또 다른 양태에서, 세척 완충액은 20mM 소듐 포스페이트(pH 6 내지 8(특히, 7.2)), 10mM 소듐 포스페이트, 500mM NaCl(pH 6 내지 8(특히, 7.2)), 50mM Tris(pH 7 내지 8) 또는 DPBS(pH 7.4)일 수 있다.
이러한 친화성 공정은 하나 이상의 적합한 용리 완충액으로 친화성 칼럼을 세척하는 단계 및 용리된 분획을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 칼럼은 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 이러한 적합한 용리 완충액의 비제한적인 예는 암모늄 아세테이트(약 2.0 내지 약 3.0의 pH), 아세트산(약 2.0 내지 약 3.2의 pH), 글리신-HCl(약 2.0 내지 약 3.0의 pH), 소듐 시트레이트(약 2.0 내지 약 3.0의 pH), 시트르산(약 2.0 내지 약 3.0의 pH), 포타슘 아이소티오사이아네이트(약 2.0 내지 약 3.0의 pH) 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 용리된 분획은 중화 완충액을 사용하여 중화될 수 있다. 이러한 중화 완충액의 예는 Tris에서 Tris-HCl(약 7.0 내지 약 9.0의 pH)이다.
C. IdeS 돌연변이체:
애플리버셉트와 같은 Fc 융합 단백질의 절단에 사용되는 IdeS 프로테이스는 염기성 pH 조건하에 효소적 활성을 빠르게 상실할 것이며, 이는 VEGF MiniTrap의 제조 동안 이의 사용을 제한할 수 있다. 따라서, 염기성 pH에서, 예를 들어, NaOH와 같은 강한 염기의 존재하에 더욱 안정하도록 변이체가 개발되었다. 이러한 염기성 조건은 1시간 동안 0.05N NaOH 또는 0.5시간 동안 0.1N NaOH일 수 있다.
일부 실시형태에서, IdeS 돌연변이체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 적어도 약 70%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 서열은 바로 위에 언급된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, IdeS 돌연변이체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 서열은 바로 위에 언급된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 확인된 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 적합한 벡터를 갖는 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다. 일 양태에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 이의 발현을 지시할 수 있는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일 양태에서, 벡터는 플라스미드일 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산 서열은 바로 위에 언급된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 단리된 핵산 분자는 폴리펩타이드를 암호화하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, IdeS 돌연변이체는 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이된 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에서 아스파라긴 잔기를 갖는 서열번호 1(IdeS)로 정의된 모 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일 양태에서, 돌연변이는 모 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH-값에서 화학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 돌연변이는 모 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH-값에서 화학적 안정성을 50%까지 증가시킬 수 있다. 일 양태에서, 아미노산은 아스파르트산, 류신 및 아르기닌으로부터 선택될 수 있다. 특정 양태에서, 87번 위치의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 130번 위치의 아스파라긴 잔기는 아르기닌 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 182번 위치의 아스파라긴 잔기는 류신 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 274번 위치의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 87번 및 130번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 87번 및 182번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 87번 및 274번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 130번 및 182번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 130번 및 274번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 182번 및 274번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 87번, 130번 및 182번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 87번, 182번 및 274번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 130번, 182번 및 274번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 또 다른 특정 양태에서, 87번, 130번, 182번 및 274번 위치의 아스파라긴 잔기가 돌연변이된다. 일부 양태에서, 아미노산 서열은 위에 기재된 아미노산 서열에 대해 전장에 걸쳐 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 단리된 핵산 분자는 폴리펩타이드를 암호화하는데 사용될 수 있다.
표준 분자 생물학 기법에 익숙한 당업자는 과도한 실험 없이 본 발명의 IdeS 돌연변이체를 제조하고 사용할 수 있다. 표준 기법은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra] 참조. 효소적 반응 및 생산 기법은 제조사의 사양에 따라 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
VI. 일반적인 단백질 생산
단독으로 또는 조합하여 친화성, 이온 교환, 혼합 모드, 크기 배제 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 상이한 생산 기법이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 구상된다. 이러한 크로마토그래피 단계는 특정 분리 형태에 따라 전하, 소수성의 정도 또는 크기 또는 이들의 조합에 기초하여 생물학적 샘플의 단백질 혼합물을 분리한다. 위에서 언급된 각 기법에 대해 여러 상이한 크로마토그래피 수지를 사용할 수 있으므로 관련된 특정 단백질에 대한 생산 계획을 정확하게 조정할 수 있다. 각 분리 방법은 단백질을 칼럼을 통해 상이한 속도로 횡단하게 하여 칼럼을 더 통과하거나 또는 분리 매질에 선택적으로 부착됨에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성한다. 그런 다음, 단백질은 (i) 적절한 용리 완충액을 사용하여 차등적으로 용리되고/되거나 (ii) 선택적으로 적절한 평형화 완충액으로 칼럼을 세척하여 사용된 칼럼으로부터 얻어진 통과 분획으로부터 수집된다. 일부 경우에, 불순물이 칼럼에 우선적으로 부착되어 관심 있는 단백질이 덜 부착되는 경우, 즉, 관심 있는 단백질이 특정 칼럼의 고체상에 흡착되지 않아서 칼럼을 통해 흐르는 경우, 관심 있는 단백질이 불순물(HCP, 단백질 변이체 등)로부터 분리된다. 일부 경우에, 불순물은 칼럼에 흡착되지 않아 칼럼을 통해 흐를 때 관심 있는 단백질로부터 분리된다.
생산 공정은 재조합 단백질이 위에 기재된 상류 생산 방법을 사용하고/하거나 당업계의 종래의 대안적 생산 방법에 의해 생산된 후 분리 단계에서 시작될 수 있다. 관심 있는 단백질, 예를 들어, 융합 단백질을 포함하는 정화된 용액 또는 혼합물이 얻어지면, 공정-관련 불순물(예컨대, 세포(HCP)에 의해 생산된 다른 단백질뿐만 아니라 산성 또는 염기성 변이체와 같은 제품-관련 물질)로부터의 관심 있는 단백질의 분리가 수행된다. 친화성, 이온 교환(예를 들어, CEX, AEX), 혼합-모드(MM) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한 하나 이상의 상이한 생산 기법의 조합이 이용될 수 있다. 이러한 생산 단계는, 예를 들어, 전하, 소수성의 정도 및/또는 겉보기 크기에 기초하여 생물학적 샘플 내의 성분의 혼합물을 분리한다. 많은 크로마토그래피 수지가 본 명세서에 언급된 각 크로마토그래피 기법에 대해 상업적으로 입수 가능하여 관련된 특정 단백질에 대한 생산 계획의 정확한 조정을 가능하게 한다. 각각의 분리 방법은 단백질을 칼럼을 통해 상이한 속도로 횡단하게 하여 칼럼을 더 통과하거나 또는 분리 수지(또는 매질)에 선택적으로 흡착됨에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성한다. 그런 다음, 단백질은 차등적으로 수집될 수 있다. 일부 경우에, 관심 있는 단백질은 다른 성분이 칼럼의 수지에 특이적으로 흡착하는 반면 관심 있는 단백질은 그렇지 않을 때 생물학적 샘플의 성분으로부터 분리된다.
A. 1차 회수 및 바이러스 불활성화
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 생산 방법의 초기 단계는 생물학적 샘플로부터 관심 있는 단백질의 정화 및 1차 회수를 포함한다. 1차 회수는 숙주 세포 및 수반되는 세포 찌꺼기로부터 관심 있는 단백질을 분리하기 위해 하나 이상의 원심분리 단계를 포함할 것이다. 샘플의 원심분리는, 예를 들어, 제한 없이, 7,000x g 내지 대략 12,750x g에서 수행될 수 있다. 대규모 생산의 맥락에서, 이러한 원심분리는, 예를 들어, 생성된 상청액에서 150 NTU의 탁도 수준을 달성하도록 설정된 유속으로 온-라인(on-line)에서 발생할 수 있다. 그런 다음, 이러한 상청액은 추가 처리를 위해 수집되거나 또는 샘플의 추가 정화를 위해 하나 이상의 심층 필터를 통해 인-라인(in-line) 여과될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 1차 회수는 샘플을 정화하고 이에 따라 관심 있는 단백질의 처리를 돕기 위해 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 1차 회수는 원심분리 후 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 심층 필터의 비제한적인 예는 Millistak+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, B1HC 심층 필터(이엠디 밀리포어), 3M™ 모델 30/60ZA, 60/90 ZA, VR05, VR07, delipid 심층 필터(쓰리엠 코포레이션(3M Corp.))를 포함한다. 사토리우스의 0.45/0.2㎛ Sartopore™ 이중층 또는 밀리포어의 Express SHR 또는 SHC 필터 카트리지와 같은 0.2㎛ 필터가 전형적으로 심층 필터에 뒤따른다. 당업자에게 잘 알려진 다른 필터가 또한 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 1차 회수 과정은 또한 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 바이러스를 줄이거나 또는 불활성화하는 지점이 될 수 있다. 열 불활성화(저온멸균), pH 불활성화, 완충액/세제 처리, UV 및 γ-선 조사 및 β-프로피오락톤 또는, 예를 들어, 그 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제4,534,972호에 기술되어 있는 구리 페난트롤린과 같은 소정의 화학적 불활성화제의 첨가를 포함하여 생산의 1차 회수 단계 동안 다양한 바이러스 감소/불활성화 방법 중 임의의 하나 이상이 사용될 수 있다. 본 발명의 소정의 예시적인 실시형태에서, 샘플은 1차 회수 단계 동안 세제 바이러스 불활성화에 노출된다. 다른 실시형태에서, 샘플은 1차 회수 단계 동안 낮은 pH 불활성화에 노출될 수 있다.
바이러스 감소/불활성화가 이용되는 실시형태에서, 생물학적 샘플은 추가 생산 단계를 위해 필요에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 낮은 pH 바이러스 불활성화 후, 샘플의 pH는 전형적으로 생산 공정을 계속하기 전 더 중성인 pH, 예를 들어, 약 4.5 내지 약 8.5로 조정된다. 추가적으로, 혼합물은 목적하는 전도도를 얻기 위해 주사용수(water for injection: WFI)로 희석될 수 있다.
B. 친화성 크로마토그래피
소정의 예시적인 실시형태에서, 관심 있는 단백질의 생산을 위해 생물학적 샘플을 친화성 크로마토그래피에 적용하는 것이 유리할 수 있다. 크로마토그래피 물질은 관심 있는 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 물질의 비제한적인 예는 단백질 A 및 단백질 G를 포함한다. 예를 들어, 단백질 또는 관심 있는 단백질에 결합하거나 또는 이와 상호작용할 수 있는 이의 일부를 포함하는 크로마토그래피 물질이 또한 포함된다. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트, MiniTrap과 같은 항-VEGF 단백질 또는 이와 관련된 단백질이다.
친화성 크로마토그래피는 생물학적 샘플을 적합한 단백질 A 수지를 포함하는 칼럼에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "단백질 A"는 이의 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성에 의해(예를 들어, 펩타이드 합성 또는 재조합 기법에 의해) 생성된 단백질 A 및 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 이의 변이체를 포함한다. 소정의 양태에서, 단백질 A 수지는 해당 영역을 가져야만 하는 분자의 Fc 부분과 특이적으로 상호작용함으로써 다양한 항체 아이소타입의 친화성-기반 생산 및 단리에 유용하다.
단백질 A 수지에 대한 여러 상업적 공급원이 있다. 하나의 적합한 수지는 지이 헬스케어의 MabSelect™이다. 적합한 수지는 지이 헬스케어의 MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect, MabSelect SuRe pcc, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose, 이엠디 밀리포어의 ProSep HC, ProSep Ultra 및 ProSep Ultra Plus, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)의 MapCapture를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. MabSelect™로 패킹된 적합한 칼럼의 비제한적인 예는 약 1.0㎝ 직경×약 21.6㎝ 길이의 칼럼(17㎖ 베드 부피)이다. 적합한 칼럼은 MabSelect™ SuRe과 같은 수지 또는 유사 수지를 포함할 수 있다. 단백질 A는 또한 레플리젠(Repligen), 파마시아(Pharmacia) 및 페르마테크(Fermatech)에서 상업적으로 구입할 수 있다.
친화성 칼럼은 샘플 로딩 전에 적합한 완충액으로 평형화될 수 있다. 칼럼의 로딩 후, 칼럼은 적합한 세척 완충액을 사용하여 한 번 또는 여러 번 세척될 수 있다. 그런 다음, 칼럼은 적절한 용리 완충액, 예를 들어, 글리신-HCl, 아세트산 또는 시트르산을 사용하여 용리될 수 있다. 용리액은 UV 검출기와 같은 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 관심 있는 용리된 분획은 수집된 다음 추가 처리를 위해 준비될 수 있다.
일 양태에서, 용리액은, 예를 들어, 세제 또는 낮은 pH에 의한 바이러스 불활성화를 거질 수 있다. 목적하는 바이러스 불활성화 결과를 얻기 위해 적합한 세제 농도 또는 pH(및 시간)가 선택될 수 있다. 바이러스 불활성화 후, 용리액은 일반적으로 후속 생산 단계를 위해 pH 및/또는 전도도가 조정된다.
용리액은 추가적인 크로마토그래피 연마 단계 전에 관심 있는 단백질로부터 탁도 및/또는 다양한 불순물을 제거하기 위해 심층 필터를 통해 여과를 거칠 수 있다. 적합한 심층 필터의 예는 Millistak+ XOHC, FOHC, DOHC, AIHC, X0SP 및 BIHC Pod 필터(이엠디 밀리포어) 또는 Zeta Plus 30ZA/60ZA, 60ZA/90ZA, delipid, VR07 및 VR05 필터(3M)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Emphaze AEX 하이브리드 정화장치 멀티-메커니즘 필터가 또한 용리액을 정화하는데 사용될 수 있다. 용리액 풀은 심층 여과 단계에서 목적하는 불순물 제거 및 생성물 회수를 위해 특정 pH 및 전도도로 조정될 필요가 있을 수 있다.
C. 음이온 교환 크로마토그래피
소정의 실시형태에서, 관심 있는 단백질은 생물학적 샘플에 적어도 하나의 음이온 교환 분리 단계를 적용하여 생성된다. 한 시나리오에서, 음이온 교환 단계는 친화성 크로마토그래피 절차(예를 들어, 단백질 A 친화성) 후에 발생할 수 있다. 다른 시나리오에서, 음이온 교환 단계는 친화성 크로마토그래피 단계 전에 발생할 수 있다. 또 다른 프로토콜에서, 음이온 교환은 친화성 크로마토그래피 단계 전과 후에 발생할 수 있다. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트 또는 MiniTrap이다.
음이온 교환 물질 대 양이온 교환 물질의 사용은 부분적으로 관심 있는 단백질의 국부 전하에 기초한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 크로마토그래피 방식과 같은 다른 크로마토그래피 절차와 조합하여 사용될 수 있다.
분리를 수행할 때, 초기 단백질 조성물(생물학적 샘플)은 임의의 다양한 기법을 사용하여, 예를 들어, 배취 생산 기법 또는 크로마토그래피 기법을 사용하여 음이온 교환 물질과 접촉되도록 배치될 수 있다.
배취 생산의 맥락에서, 음이온 교환 물질은 목적하는 출발 완충액에서 준비되거나 또는 평형화된다. 제조시, 음이온 교환 물질의 슬러리가 얻어진다. 생물학적 샘플은 슬러리와 접촉되어 단백질이 음이온 교환 물질에 흡착되도록 한다. AEX 물질에 결합하지 않는 산성 종을 포함하는 용액은 슬러리를 침전시키고 상청액을 제거함으로써 슬러리로부터 분리된다. 슬러리는 하나 이상의 세척 단계 및/또는 용리 단계를 거칠 수 있다.
크로마토그래피 분리의 맥락에서, 크로마토그래피 칼럼은 크로마토그래피 지지체 물질(수지 또는 고체상)을 수용하는데 사용된다. 관심 있는 단백질을 포함하는 샘플이 특정 크로마토그래피 칼럼에 로딩된다. 그런 다음, 칼럼은 적합한 세척 완충액을 사용하는 하나 이상의 세척 단계를 거칠 수 있다. 수지에 흡착되지 않은 샘플의 성분은 칼럼을 통해 흐를 수 있을 것이다. 수지에 흡착된 성분은 적절한 용리 완충액을 사용하여 차등적으로 용리될 수 있다.
세척 단계는 전형적으로 로딩 조건과 유사한 조건을 사용하거나 또는 대안적으로 pH를 감소시키고/시키거나 단계적 또는 선형 구배 방식으로 세척의 이온 강도/전도도를 증가시킴으로써 AEX 크로마토그래피에서 수행된다. 일 양태에서, 로딩 및 세척 완충액에 사용되는 수성 염 용액은 pH가 관심 있는 단백질의 등전점(isoelectric point: pI) 또는 그 근처에 있다. 전형적으로, pH는 관심 있는 단백질의 pI보다 약 0 내지 2 단위 더 높거나 낮을 수 있지만, 0 내지 0.5 단위 더 높거나 또는 낮은 범위일 수 있다. 또한, 관심 있는 단백질의 pI에 있을 수 있다.
음이온성 작용제는 아세테이트, 클로라이드, 폼에이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 양이온성 작용제는 Tris, 아르기닌, 소듐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 예에서, 완충 용액은 Tris/폼에이트 완충액이다. 완충액은 피리딘, 피페라진, L-히스티딘, 비스-tris, 비스-Tris 프로페인, 이미다졸, N-에틸모폴린, TEA(트라이에탄올아민), Tris, 모폴린, N-메틸다이에탄올아민, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로페인다이올), 다이에탄올아민, 에탄올아민, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 피페라진, 1,3-다이아미노프로페인 및 피페리딘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
패킹된 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼, 음이온-교환 막 장치, 음이온-교환 모놀리식 장치 또는 심층 여과재는 결합-용리 모드, 통과 모드 또는 단백질이 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 나타내지만 로딩 완충액과 동일하거나 실질적으로 유사한 완충액을 사용하여 이러한 물질로부터 세척될 수 있는 하이브리드 모드에서 작동될 수 있다.
결합-용리 모드에서, 칼럼 또는 막 장치는 먼저 소정의 단백질이 수지-기반 매트릭스에 흡착될 조건하에 적절한 이온 강도 및 pH를 갖는 완충액으로 조절(조건ed)된다. 예를 들어, 공급 로딩 동안, 관심 있는 단백질은 정전기적 인력으로 인해 수지에 흡착될 수 있다. 상이한 pH 및/또는 전도도를 갖는 평형화 완충액 또는 또 다른 완충액으로 칼럼 또는 막 장치를 세척한 후, 제품 회수는 용리 완충액의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시켜 음이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁함으로써 달성된다. pH를 변경하여 용질의 전하를 변경하는 것은 용질의 용리를 달성하기 위한 또 다른 방식이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용리) 또는 단계적(단계 용리)일 수 있다.
통과 모드에서, 칼럼 또는 막 장치는 관심 있는 단백질이 수지 또는 막에 결합하지 않도록 선택된 pH 및 전도도에서 작동되는 반면 산성 종은 칼럼에 남아 있거나 또는 관심 있는 단백질과 비교하여 뚜렷한 용리 프로파일을 갖게 될 것이다. 이러한 전략의 맥락에서, 산성 종은 적합한 조건하에 크로마토그래피 물질과 상호작용하거나 또는 이에 결합하는 반면 관심 있는 단백질 및 관심 있는 단백질의 소정의 응집체 및/또는 단편은 칼럼을 통해 흐를 것이다.
음이온 교환 수지의 비제한적인 예는 다이에틸아미노에틸(DEAE), 4차 아미노에틸(QAE) 및 4차 아민(Q)기를 포함한다. 추가적인 비제한적인 예는 가교된 폴리[스타이렌-다이비닐벤젠]으로 구성된 골격을 갖는 경질 중합체 비드인 Poros 50PI 및 Poros 50HQ; 고유량 아가로스 비드인 Capto Q Impres 및 Capto DEAE; 중합체 기반 비드인 Toyopearl QAE-550, Toyopearl DEAE-650 및 Toyopearl GigaCap Q-650; 촉수형 이온 교환체(tentacle ion exchanger)가 있는 합성 중합체 수지인 Fractogel® EMD TMAE Hicap; 일차 아민 리간드를 갖는 염-내성 크로마토그래피 막인 Sartobind STIC® PA nano; 강한 음이온 교환 크로마토그래피 막인 Sartobind Q nano; 무기 여과 보조제, 정제된 셀룰로스 및 이온 교환 수지로 구성된 zeta-plus 심층 여과재인 CUNO BioCap; 및 무기 여과 보조제, 셀룰로스 및 혼합 셀룰로스 에스터로 구성된 심층-여과재인 XOHC를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 샘플의 단백질 로딩은 약 50 g/ℓ 내지 약 500 g/ℓ 또는 약 75 g/ℓ 내지 약 350 g/ℓ 또는 약 200 g/ℓ 내지 약 300 g/ℓ의 칼럼에 대한 총 단백질 로딩으로 조정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 로딩 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 0.5 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ 또는 약 3 g/ℓ 내지 약 10 g/ℓ의 칼럼에 로딩된 물질의 단백질 농도로 조정된다. 또 다른 실시형태에서, 로딩 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 37 g/ℓ의 칼럼에 대한 물질의 단백질 농도로 조정된다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG), 세제, 아미노산, 당, 무질서 유발제와 같은 첨가제는 더 나은 분리, 회수 및/또는 제품 품질을 달성하기 위해 분리 성능을 향상시키기 위해 첨가될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 애플리버셉트 및/또는 VEGF MiniTrap과 관련된 것들을 포함하여, 본 발명의 방법은 단백질 변이체의 적어도 10%를 선택적으로 제거하거나, 상당히 감소시키거나 또는 본질적으로 제거하는데 사용될 수 있으며, 이로 인해 감소된 단백질 변이체를 갖는 단백질 조성물이 생성된다.
단백질 변이체는 다음과 같은 하나 이상의 잔기의 변형을 포함할 수 있다: 하나 이상의 아스파라긴이 탈아마이드화되고; 하나 이상의 아스파르트산이 아스파테이트-글리신 및/또는 Asn-Gly로 전환되며; 하나 이상의 메티오닌이 산화되고; 하나 이상의 트립토판이 N-폼일카이누레닌으로 전환되며; 하나 이상의 트립토판이 모노-하이드록실 트립토판이고; 하나 이상의 트립토판이 다이-하이드록실 트립토판이며; 하나 이상의 트립토판이 트라이-하이드록실 트립토판이고; 하나 이상의 아르기닌이 Arg 3-데옥시글루코손으로 전환되며; C-말단 글리신이 존재하고; 그리고/또는 하나 이상의 비-글리코실화 글리코사이트가 있다. AEX의 사용은 또한 상기 친화성 용리액에서 항-VEGF 변이체의 산화 및 산성 종을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 친화성 용리액과 비교하여, AEX의 사용 후, 통과 분획은 항-VEGF 변이체의 산화 및/또는 산성 종에서 적어도 약 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%의 감소를 나타낼 수 있다.
애플리버셉트 및/또는 VEGF MiniTrap의 단백질 변이체는 (i) His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203로부터 선택된 히스티딘 잔기로부터의 산화된 히스티딘; (ii) Trp58 및/또는 Trp138의 트립토판 잔기로부터 선택된 산화된 트립토판 잔기; (iii) Tyr64의 산화된 타이로신 잔기; (iv) Phe44 및/또는 Phe166으로부터 선택된 산화된 페닐알라닌 잔기; 및/또는 (v) Met10, Met 20, Met163 및/또는 Met192로부터 선택된 산화된 메티오닌 잔기 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
D. 양이온 교환 크로마토그래피
본 발명의 조성물은 생물학적 관심 있는 단백질을 포함하는 샘플에 적어도 하나의 양이온 교환(CEX) 단계를 적용함으로써 생산될 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, CEX 단계는 AEX 단계에 추가될 것이며, AEX 단계 전 또는 후에 발생한다. 일 양태에서, 관심 있는 단백질은 애플리버셉트, MiniTrap 또는 이와 관련된 분자이다.
위에 논의된 음이온 교환 물질과 같은 양이온 교환 물질 대 음이온 교환 물질의 사용은 부분적으로 주어진 용액에서 관심 있는 단백질의 국부 전하 및 목적하는 분리 조건에 기초한다. 음이온 교환 단계를 사용하기 전에 양이온 교환 단계를 사용하거나 또는 양이온 교환 단계의 사용 전에 음이온 교환 단계를 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 다른 크로마토그래피 절차와 조합하여 양이온 교환 단계만을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
양이온 교환을 수행할 때, 관심 있는 단백질을 포함하는 샘플은 AEX에 대해 위에 기재된 바와 같이 임의의 다양한 기법을 사용하여, 예를 들어, 배취 생산 기법 또는 크로마토그래피 기법을 사용하여 양이온 교환 물질과 접촉될 수 있다.
수성 염 용액은 관심 있는 단백질의 등전점(pI)보다 낮은 pH를 갖는 로딩 및 세척 완충액으로 사용될 수 있다. 일 양태에서, pH는 단백질의 pI보다 약 0 내지 5 단위 낮다. 또 다른 양태에서, 이는 단백질의 pI보다 1 내지 2 단위 낮은 범위이다. 또 다른 양태에서, 이는 단백질의 pI보다 1 내지 1.5 단위 낮은 범위이다.
소정의 실시형태에서, 수성 염 용액에서 음이온성 작용제의 농도는 약 3.5 내지 약 10.5 또는 약 4 내지 약 10 또는 약 4.5 내지 약 9.5 또는 약 5 내지 약 9 또는 약 5.5 내지 약 8.5 또는 약 6 내지 약 8 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 달성하도록 증가 또는 감소된다. 일 양태에서, 음이온성 작용제의 농도는 5 또는 5.5 또는 6 또는 6.5 또는 6.8 또는 7.5의 pH를 달성하기 위해 수성 염 용액에서 증가 또는 감소된다. CEX 방법에 사용하기에 적합한 완충액 시스템은 Tris 폼에이트, Tris 아세테이트, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드 및 소듐 설페이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
소정의 실시형태에서, 수성 염 용액의 전도도 및 pH는 양이온성 작용제의 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 조정된다. 일 양태에서, 양이온성 작용제는 약 20mM 내지 약 500mM, 약 50mM 내지 약 350mM, 약 100mM 내지 약 300mM 또는 약 100mM 내지 약 200mM 범위의 농도로 유지된다. 양이온성 작용제의 비제한적인 예는 소듐, Tris, 트라이에틸아민, 암모늄, 아르기닌 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
패킹된 양이온-교환 크로마토그래피 칼럼 또는 양이온-교환 막 장치는 결합-용리 모드, 통과 모드 또는 하이브리드 모드에서 작동될 수 있으며, 여기서 생성물은 크로마토그래피 물질에 대한 결합 또는 이와의 상호작용을 나타내지만 로딩 완충액과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 완충액을 사용하여 이러한 물질로부터 세척될 수 있다(이들 모드에 대한 자세한 내용은 위에 설명되어 있음).
양이온 치환기는 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)를 포함한다. 추가적인 양이온 물질은 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 고유량 아가로스 비드인 Capto SP ImpRes; 250 내지 400 이온기 μeq/㎖의 작용화된 하이드로겔로 코팅되고 침투된 세라믹 비드인 CM Hyper D 등급 F; 50 내지 100 μeq/㎖의 이온 용량을 갖는 친수성 폴리비닐 에터 기반 매트릭스인 Eshmuno S; 매크로다공성의 고도로 가교된 친수성 중합체 매트릭스 55 내지 75 με/㎖로 구성된 소수성 양이온 교환 매질인 Nuvia C Prime; 90 내지 150 με/㎖ 이온기가 있는 UNOsphere 기반 매트릭스를 갖는 것인 Nuvia S; 가교된 폴리[스타이렌-다이비닐벤젠]으로 구성된 골격을 갖는 경질 중합체 비드인 Poros HS; 가교된 폴리[스타이렌 다이비닐-벤젠]으로 구성된 골격을 갖는 경질 중합체 비드인 Poros XS; 0.225 meq/㎖의 이온 용량을 갖는 중합체 기반 비드인 Toyo Pearl Giga Cap㎝ 650M; 중합체 기반 비드인 Toyo Pearl Giga Cap S 650M; 중합체 기반 비드인 Toyo Pearl MX TRP. CEX 크로마토그래피는 본 명세서에 기재된 MM 수지와 함께 사용될 수 있음에 유의한다.
관심 있는 단백질을 포함하는 샘플의 단백질 로딩은 약 5 g/ℓ 내지 약 150 g/ℓ 또는 약 10 g/ℓ 내지 약 100 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 약 80 g/ℓ, 약 30 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 40 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ의 칼럼에 대한 총 단백질 로딩으로 조정된다. 소정의 실시형태에서, 로딩 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 0.5 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 1 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ의 칼럼에 로딩될 물질의 단백질 농도로 조정된다.
폴리에틸렌 글리콜, 세제, 아미노산, 당, 무질서 유발제와 같은 첨가제는 더 나은 분리, 회수 및/또는 제품 품질을 달성하기 위해 분리 성능을 향상시키기 위해 첨가될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 애플리버셉트 또는 항-VEGF 항체 또는 VEGF MiniTrap에 관련된 것들을 포함하여, 본 발명의 방법은 관심 있는 단백질이 본질적으로 CEX 절차의 통과액에 있는 반면 옥소-변이체는 칼럼 매질에 의해 실질적으로 포획될 샘플에서 모든 옥소-변이체를 선택적으로 제거하거나, 상당히 감소시키거나 또는 본질적으로 제거하는데 사용될 수 있다.
E. 혼합 모드 크로마토그래피
혼합 모드("MM") 크로마토그래피가 또한 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "다중 모드 크로마토그래피"로도 지칭되는 MM 크로마토그래피는 샘플로부터 피분석물 또는 관심 있는 단백질과 적어도 2개의 상이한 상호작용을 제공할 수 있는 리간드를 포함하는 지지체를 이용하는 크로마토그래피 전략이다. 이들 부위 중 하나는 리간드와 관심 있는 단백질 사이에 매력적인 유형의 전하-전하 상호작용을 제공하고, 다른 부위는 전자 수여체-공여체 상호작용 및/또는 소수성 및/또는 친수성 상호작용을 제공한다. 전자 공여체-수여체 상호작용은 수소-결합, π-π, 양이온-π, 전하 이동, 쌍극자-쌍극자, 유도 쌍극자 등과 같은 상호작용을 포함한다.
혼합 모드 분리에 이용되는 칼럼 수지는 Capto Adhere일 수 있다. Capto Adhere는 다중 모드 기능이 있는 강한 음이온 교환기이다. 이의 기본 매트릭스는 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용과 같은 상호작용에 대해 다양한 기능을 나타내는 리간드(N-벤질-N-메틸 에탄올 아민)가 있는 고도로 가교된 아가로스이다. 소정의 양태에서, 혼합 모드 분리에 사용되는 수지는 PPA-HyperCel 및 HEA-HyperCel로부터 선택된다. PPA-HyperCel 및 HEA-HyperCel의 기본 매트릭스는 높은 다공성 가교된 셀룰로스이다. 이들의 리간드는 각각 페닐프로필아민 및 헥실아민이다. 페닐프로필아민 및 헥실아민은 단백질 분리를 위한 다양한 선택성 및 소수성 옵션을 제공한다. 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 지지체는 Nuvia C Prime, Toyo Pearl MX Trp 650M 및 Eshmuno® HCX를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 때때로 직접적으로 또는 스페이서를 통해 기본 매트릭스로 표시되는 유기 또는 무기 지지체에 커플링된 리간드로 구성된다. 지지체는 본질적으로 구형 입자, 모노리스, 필터, 막, 표면, 모세관 등과 같은 입자의 형태일 수 있다. 소정의 양태에서, 지지체는 가교된 탄수화물 물질, 예컨대, 아가로스, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 곤약, 카라기난, 젤란, 알기네이트 등과 같은 고유한 중합체로 제조된다. 높은 흡착 능력을 얻기 위해, 지지체는 다공성일 수 있으며, 리간드는 외부 표면뿐만 아니라 기공 표면에 커플링된다. 이러한 고유한 중합체 지지체는 역 현탁 겔화(문헌[S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398(1964)], 이의 전체 교시내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)와 같은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 대안적으로, 지지체는 가교된 합성 중합체, 예를 들어, 스타이렌 또는 스타이렌 유도체, 다이비닐벤젠, 아크릴아마이드, 아크릴레이트 에스터, 메타크릴레이트 에스터, 비닐 에스터, 비닐 아마이드 등과 같은 합성 중합체로 제조될 수 있다. 이러한 합성 중합체는 표준 방법에 따라 생성될 수 있으며, 문헌["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)](그 전체 교시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)을 참조한다. 다공성 천연 또는 합성 중합체 지지체는 또한 지이 헬스케어(스웨덴 웁살라 소재)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다.
관심 있는 단백질을 포함하는 생물학적 샘플 혼합물의 단백질 로딩은 약 25 g/ℓ 내지 약 750 g/ℓ 또는 약 75 g/ℓ 내지 약 500 g/ℓ 또는 약 100 g/ℓ 내지 약 300 g/ℓ의 칼럼에 대한 총 단백질 로딩으로 조정될 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 로딩 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 1 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 9 g/ℓ 내지 약 25 g/ℓ의 칼럼에 대해 로딩된 물질의 단백질 농도로 조정될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜, 세제, 아미노산, 당, 무질서 유발제와 같은 첨가제는 더 나은 분리, 회수 및/또는 제품 품질을 달성하기 위해 분리 성능을 향상시키기 위해 첨가될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 애플리버셉트 및/또는 MiniTrap과 관련된 것들을 포함하여, 본 발명의 방법은 옥소-변이체를 포함하는 모든 PTM을 선택적으로 제거하거나, 상당히 감소시키거나 또는 본질적으로 제거하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 생산하는 방법은 또한 연속 크로마토그래피 모드로 실행될 수 있다. 이 모드에서, 적어도 2개의 칼럼이 이용된다("제1" 칼럼 및 "제2" 칼럼으로 지칭됨). 소정의 실시형태에서, 이러한 연속 크로마토그래피 모드는 PTM, 예를 들어, 옥소-변이체를 포함하는 용리된 분획 및/또는 스트리핑된 분획을 후속적으로 또는 동시에 제2 칼럼(희석 유무에 관계없이)에 로딩할 수 있도록 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 연속 모드에 대한 매질 선택은 펜던트 소수성 및 음이온 교환 작용기가 있는 많은 크로마토그래피 수지, 모놀리식 매질, 막 흡착 매질 또는 심층 여과 매질 중 하나일 수 있다.
F. 소수성 상호작용 크로마토그래피
본 발명의 조성물은 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 제조될 수 있다.
분리를 수행할 때, 생물학적 샘플은, 예를 들어, 배취 생산 기법을 사용하거나 또는 칼럼 또는 막 크로마토그래피를 사용하여 HIC 물질과 접촉된다. HIC 처리 전에, 수지 또는 막에 대한 목적하는 단백질 결합/상호작용을 달성하기 위해 염 완충액의 농도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 선택적 분리를 위해 관심 있는 단백질의 국부 전하에 의존하는 반면, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 선택적 분리를 달성하기 위해 단백질의 소수성 특성을 이용한다. 단백질 위 또는 내의 소수성기는 크로마토그래피 수지 또는 막의 소수성기와 상호작용한다. 전형적으로, 적합한 조건하에, 단백질(또는 단백질의 일부)이 더 소수성일수록 칼럼 또는 막과의 상호작용이 더 강해질 것이다. 따라서, 적합한 조건하에, HIC는 샘플의 관심 있는 단백질로부터 공정-관련 불순물(예를 들어, HCP)뿐만 아니라 제품-관련 물질(예를 들어, 응집체 및 단편)의 분리를 용이하게 하는데 사용될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피와 마찬가지로, HIC 칼럼 또는 HIC 막 장치는 생성물이 크로마토그래피 물질에 결합하거나 또는 이와 상호작용을 나타내지만 로딩 완충액과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 완충액을 사용하여 이러한 물질로부터 세척될 수 있는 용리 모드, 통과액 또는 하이브리드 모드에서 작동될 수 있다. (이러한 모드에 대한 세부 사항은 AEX 처리와 관련하여 위에 요약되어 있음) 소수성 상호작용은 높은 이온 강도에서 가장 강하기 때문에, 이러한 형태의 분리는 이온 교환 크로마토그래피와 관련하여 전형적으로 사용되는 것과 같은 염 용리 단계 후에 편리하게 수행된다. 대안적으로, 염은 HIC 단계를 이용하기 전 샘플에 첨가될 수 있다. HIC 칼럼에의 단백질의 흡착은 높은 염 농도에 의해 선호되지만, 실제 농도는 관심 있는 단백질, 염 유형 및 선택된 특정 HIC 리간드의 특성에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 다양한 이온은 소수성 상호작용을 촉진(염석 효과(salting-out 효과))하거나 또는 물의 구조를 파괴(무질서 유발 효과)하여 소수성 상호작용의 약화를 유도하는지 여부에 따라 소위 소용질성(soluphobic) 시리즈로 배열될 수 있다. 양이온은 증가하는 염석 효과의 측면에서 Ba2+; Ca2+; Mg2+; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+로 순위가 매겨지는 반면, 음이온은 증가 무질서 유발 효과의 측면에서 PO4 3-; SO4 2-; CH3CO3 - ; CI-; Br-; NO3 - ; ClO4 - ; I-; SCN-로 순위가 매겨질 수 있다.
일반적으로, Na+, K+ 또는 NH4+ 설페이트는 HIC를 사용하여 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진한다. 염은 (NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4C1 > NaBr > NaSCN의 관계식으로 주어지는 바와 같이 상호작용의 강도에 영향을 미치도록 제형화될 수 있다. 일반적으로, 약 0.75M 내지 약 2M 암모늄 설페이트 또는 약 1M 내지 약 4M NaCl의 염 농도가 유용하다.
HIC 매질은 일반적으로 소수성 리간드(예를 들어, 알킬 또는 아릴기)가 커플링된 기본 매트릭스(예를 들어, 가교된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)를 포함한다. 적합한 HIC 매질은 페닐기(예를 들어, 지이 헬스케어의 Phenyl Sepharose™ 또는 사토리우스의 페닐 막)로 작용화된 아가로스 수지 또는 막을 포함한다. 많은 HIC 수지가 상업적으로 이용 가능하다. 예로는 Capto Phenyl, 낮거나 또는 높은 치환도를 갖는 Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose™ High Performance, 옥틸 Sepharose™ High Performance(지이 헬스케어); Fractogel™ EMD Propyl 또는 Fractogel™ EMD Phenyl(이. 머크(E. Merck), 독일 소재); Macro-Prep™ Methyl 또는 Macro-Prep™ t-Butyl 칼럼(바이오-래드(Bio-Rad), 캘리포니아 소재); WP HI-프로필(C3)™(제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지 소재); 및 Toyopearl™ ether, phenyl 또는 butyl(토소하스(TosoHaas), 펜실베이니아 소재); ToyoScreen PPG; ToyoScreen Phenyl; ToyoScreen Butyl; ToyoScreen Hexyl; GE HiScreen 및 Butyl FF HiScreen Octyl FF를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
관심 있는 단백질을 포함하는 샘플의 단백질 로딩은 약 50 g/ℓ 내지 약 1000 g/ℓ; 약 5 g/ℓ 내지 약 150 g/ℓ, 약 10 g/ℓ 내지 약 100 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 약 80 g/ℓ, 약 30 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 40 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ의 칼럼에 대한 총 단백질 로딩으로 조정된다. 소정의 실시형태에서, 로딩 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 0.5 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 1 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ의 칼럼 상에 로딩될 물질의 단백질 농도로 조정된다.
임의의 특정 생산 공정을 위해 선택된 pH는 단백질 안정성 및 활성과 양립 가능하여야 하기 때문에, 특정 pH 조건은 각 적용에 대해 특이적일 수 있다. 그러나, pH 5.0 내지 8.5에서 특정 pH 값은 HIC 분리의 최종 선택성 및 분리능에 거의 중요하지 않기 때문에, 이러한 조건이 선호될 수 있다. pH의 증가는 소수성 상호작용을 약화시키고, 단백질의 머무름은 8.5 이상 또는 5.0 이하의 pH 값에서 더 급격하게 변한다. 또한, 이온 강도, 유기 용매의 존재, 온도 및 pH(특히 순 표면 전하가 없는 경우, 등전점인 pI에서)의 변화는 단백질 구조 및 용해도, 결과적으로, HIC 매질에 있는 것과 같은 다른 소수성 표면과의 상호작용에 영향을 미치며, 따라서 소정의 실시형태에서, 본 발명은 공정-관련 불순물 및/또는 제품-관련 물질에서 목적하는 감소를 달성하기 위해 전술한 것 중 하나 이상이 조정되는 생산 전략을 포함한다.
소정의 실시형태에서, UV, NIR, FTIR, 형광, Raman과 같은 분광법은 관심 있는 단백질 및 불순물을 온-라인, 엣-라인(at-line) 또는 인-라인 모드에서 모니터링한 다음 HIC 흡착 폐수로부터 수집된 풀링된 물질의 응집체의 수준을 제어하는데 사용될 수있다. 소정의 실시형태에서, 온-라인, 엣-라인 또는 인-라인 모니터링 방법은 크로마토그래피 단계의 폐수 라인 또는 수집 용기에서 사용되어 목적하는 제품 품질/회수를 달성할 수 있다. 소정의 실시형태에서, UV 신호는 적절한 제품 품질/회수를 달성하기 위해 대리물로서 사용될 수 있되, UV 신호는 적분, 미분 및 이동 평균과 같은 처리 기법을 포함하지만 이들로 제한되지 않고 적절하게 처리될 수 있으므로, 정상적인 공정 변동성이 다뤄질 수 있으며 목표 제품 품질이 달성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이러한 측정은 로딩/세척의 이온 농도/전도도가 피드백에 의해 제어될 수 있으므로 제품 품질 제어를 용이하게 하는 인-라인 희석 방법과 조합될 수 있다.
G. 크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 여과는 분자 크기의 함수로서 성분의 분리에 의존한다. 분리는 유체에서의 시간과 비교하여 물질이 다공성 고정상에서 보내는 시간의 양에 따라 다르다. 분자가 기공에 존재할 확률은 분자 및 기공의 크기에 따라 다르다. 또한, 기공으로 침투하는 물질의 능력은 작은 거대분자에 대해 더 높은 거대분자의 확산 이동성에 의해 결정된다. 매우 큰 거대분자는 고정상의 기공을 전혀 침투하지 않을 수 있고; 그리고, 매우 작은 거대분자의 경우 침투의 확률은 거의 1에 가깝다. 분자 크기가 더 큰 성분은 고정상을 지나 더 빠르게 이동하는 반면, 분자 크기가 작은 성분은 고정상의 기공을 통과하는 경로 길이가 더 길어져서 고정상에서 더 오래 남아있게 된다.
크로마토그래피 물질은 크기 배제 물질을 포함할 수 있되, 크기 배제 물질은 수지 또는 막이다. 크기 배제에 사용되는 매트릭스는 바람직하게는 가교된 다당류, 예를 들어, 구형 비드 형태의 가교된 아가로스 및/또는 덱스트란의 복합재료(composite)일 수 있는 불활성 겔 매질이다. 가교의 정도는 팽윤된 겔 비드에 존재하는 기공의 크기를 결정한다. 소정의 크기 이상의 분자는 겔 비드에 들어가지 않으므로, 크로마토그래피 베드를 가장 빠르게 이동한다. 크기와 모양에 따라 다양한 정도로 겔 비드에 들어가는 세제, 단백질, DNA 등과 같은 더 작은 분자는 베드를 통과할 때 지연된다. 따라서, 분자는 일반적으로 분자 크기가 감소하는 순서로 용리된다.
바이러스의 크기-배제 크로마토그래피에 적절한 다공성 크로마토그래피 수지는 물리적 특징이 다른 덱스트로스, 아가로스, 폴리아크릴아마이드 또는 실리카로 만들어질 수 있다. 중합체 조합이 또한 사용될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)로부터 입수 가능한 상표면 "SEPHADEX"로 사용되는 것이다. 다양한 구성 물질의 다른 크기 배제 지지체, 예를 들어, Toyopearl 55F(폴리메타크릴레이트, 토소 바이오사이언스, 펜실베이니아 몽고메리주 소재) 및 Bio-Gel P-30 Fine(바이오래드 래보래토리즈, 캘리포니아 에르쿨레스 소재)도 적절하다.
관심 있는 단백질을 포함하는 샘플의 단백질 로딩은 약 50 g/ℓ 내지 약 1000 g/ℓ; 약 5 g/ℓ 내지 약 150 g/ℓ, 약 10 g/ℓ 내지 약 100 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 약 80 g/ℓ, 약 30 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 40 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ의 칼럼에 대한 총 단백질 로딩으로 조정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 로딩 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 0.5 g/ℓ 내지 약 50 g/ℓ 또는 약 1 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ의 칼럼 상에 로딩될 물질의 단백질 농도로 조정된다.
H. 바이러스 여과
바이러스 여과는 생산 공정의 단독 바이러스 감소 단계이다. 이 단계는 일반적으로 크로마토그래피 연마 후 수행된다. 바이러스 감소는 아사히 카세이 파르마의 Planova 20N™, 50N 또는 BioEx, 이엠디 밀리포어의 Viresolve™ 필터, 사토리우스의 ViroSart CPV, 또는 폴 코포레이션의 Ultipor DV20 또는 DV50™ 필터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 적합한 필터의 사용을 통해 달성될 수 있다. 목적하는 여과 성능을 얻기 위해 적합한 필터를 선택하는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
I. 한외여과/정용여과
본 발명의 소정의 실시형태는 관심 있는 단백질을 더 농축하고 제형화하기 위해 한외여과 및 정용여과를 이용한다. 한외여과는 그 전체 교시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996)]; 및 문헌[Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9)]에 더 상세히 기술되어 있다. 하나의 여과 과정은 그 전체 개시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue"라는 제목의 밀리포어 카탈로그(pp. 177-202 (매사추세츠주 배드포드 소재, 1995/96))에 기술된 바와 같은 접선 유동 여과이다. 한외여과는 일반적으로 0.1㎛보다 작은 기공 크기를 갖는 필터를 사용하는 여과를 의미하는 것으로 간주된다. 이러한 작은 기공 크기를 갖는 필터를 이용함으로써, 단백질이 막 표면 위에 유지되는 동안 필터 막 기공을 통한 샘플 완충액의 투과를 통해 샘플의 부피는 감소될 수 있다.
당업자는 UF/DF 작동을 위한 적절한 막 필터 장치를 선택할 수 있다. 본 발명에 적합한 막 카세트의 예는 이엠디 밀리포어의 10kD, 30kD 또는 50kD 막을 포함하는 Pellicon 2 또는 Pellicon 3 카세트, 지이 헬스케어의 Kvick 10kD, 30kD 또는 50kD 막 카세트 및 폴 코포레이션의 Centramate 또는 Centrasette 10kD, 30kD 또는 50kD 카세트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
J. 예시적인 생산 전략
1차 회수는 생산 생물반응기 수확물로부터 세포 및 세포 찌꺼기(HCP 포함)를 제거하기 위해 pH 감소, 원심분리 및 여과를 순차적으로 이용함으로써 진행될 수 있다. 본 발명은 1차 회수로부터의 관심 있는 단백질을 포함하는 생물학적 샘플을 AEX, CEX, SEC, HIC 및/또는 MM을 포함하는 하나 이상의 생산 단계(특정 순서 없음)에 적용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 소정의 양태는 처리 단계를 더 포함한다. 추가적인 처리 절차의 예는 에탄올 침전, 등전위 포커싱, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, heparin Sepharose™ 상 크로마토그래피, 추가의 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 추가의 양이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 포획 시약으로서 단백질 A 또는 G, 항체, 특정 기질, 리간드 또는 항원을 사용)를 포함한다. 소정의 양태에서, 칼럼 온도(뿐만 아니라 다른 매개변수)는 임의의 특정 생산 단계의 분리 효율 및/또는 수율을 개선하기 위해 독립적으로 변경될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 결합되지 않은 통과액 및 세척 분획은 추가로 분획화될 수 있고, 목표 제품 순도를 제공하는 분획의 조합이 풀링될 수 있다.
칼럼 로딩 및 세척 단계는 특정 목표 제품 품질 및/또는 수율을 달성하기 위해, 칼럼 폐수 또는 수집된 풀 또는 둘 다에서 제품 관련 불순물/물질 수준의 인-라인, 엣-라인 또는 오프-라인(off-line) 측정에 의해 제어될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 로딩 농도는 분리 효율 및/또는 수율을 개선하는데 필요한 분할을 달성하기 위해 완충액 또는 다른 용액을 사용한 인-라인 또는 배취 또는 연속 희석에 의해 동적으로 제어될 수 있다.
이러한 생산 절차의 예는 도 5 내지 도 8에 도시되어 있다.
도 5는 애플리버셉트의 생산에 사용되는 하나의 예시적인 실시형태를 나타낸다. 도 5를 참조하면, 방법은 (a) CDM에서 배양된 숙주 세포에서 애플리버셉트를 발현시키는 단계; (b) 친화성 포획 수지를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계; 및 (c) 애플리버셉트의 적어도 일부를 음이온-교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계를 포함한다. (c) 단계는 세척 AEX 칼럼을 세척하고 애플리버셉트를 포함하는 샘플의 통과 분획(들)을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 선택적으로, (c) 단계는 제2 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 위에서 언급된 방법론과 함께 일상적인 방법론에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 AEX보다는 또는 이에 추가하여 CEX를 이용하도록 선택할 수 있음을 이해하여야 한다. 특정 순서 없이, HIC 및 SEC와 같지만 이들로 제한되지 않는 것들이 포함될 수 있다.
도 5의 예시적인 실시형태에 추가하여, 다른 추가적인 예시적인 실시형태는 (d) (c) 단계의 상기 애플리버셉트의 적어도 일부를 제3 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 프로토콜은 (e) (d) 단계의 애플리버셉트의 적어도 일부를 제4 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 실시형태의 일 양태에서, 프로토콜은 선택적으로 (c) 단계의 애플리버셉트를 포함하는 샘플을 5.5 미만의 pH로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 방법은 (a) 단계 전에 정화 단계를 포함한다.
도 6은 VEGF MiniTrap의 생산에 사용되는 하나의 예시적인 실시형태를 나타낸다. 이 방법은 (a) CDM에서 배양된 숙주 세포에서 애플리버셉트를 발현시키는 단계; (b) 친화성 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계; (c) 애플리버셉트를 절단하여 Fc 도메인을 제거하고, VEGF MiniTrap을 포함하는 샘플을 형성하는 단계; (d) (c) 단계의 샘플을 친화성 크로마토그래피일 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계 및 (e) (d) 단계의 통과액을 음이온-교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제3 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함한다. (d) 단계는 Fc 도메인의 부재로 인해 MiniTrap이 상주해야 하는 반면 Fc 도메인을 갖는 애플리버셉트 또는 임의의 다른 단백질은 본질적으로 (d) 단계의 친화성 칼럼과 상호작용해야 하는 통과 분획(들)의 수집을 포함한다. 선택적으로, (d) 단계는 제3 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 위에서 설명된 방법론과 함께 일상적인 방법론에 의해 수행될 수 있다. 특정 순서 없이, HIC 및 SEC를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 추가적인 크로마토그래피 단계가 이용될 수 있다.
도 7은 애플리버셉트의 생산을 위한 하나의 예시적인 실시형태를 나타낸다. 이 방법은 (a) CDM에서 배양된 숙주 세포에서 애플리버셉트를 발현시키는 단계; (b) 양이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계; 및 (c) (b)의 통과액을 음이온-교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함한다. 선택적으로, (c) 단계는 제2 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 위에 언급된 프로토콜과 함께 일상적인 방법론에 의해 수행될 수 있다. 특정 순서 없이, HIC 및 SEC를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 크로마토그래피 절차가 이용될 수 있다.
도 8은 VEGF MiniTrap을 생산하기 위한 하나의 예시적인 실시형태를 나타낸다. 이 방법은 (a) CDM에서 배양된 숙주 세포에서 애플리버셉트를 발현시키는 단계; (b) 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계; (c) 애플리버셉트를 포함하는 (b)의 통과 분획을 친화성 크로마토그래피에 적용시키고; 용리하는 단계로서, 용리는 애플리버셉트를 포함하는, 상기 용리하는 단계; (d) (c)의 애플리버셉트를 절단 활성에 적용하여, Fc 도메인이 절단되어 VEGF MiniTrap이 형성되는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 단계 (b)의 이온 교환은 AEX를 포함한다. 대안적으로, 단계 (b)는 CEX를 포함할 수 있다. 특정 순서 없이, HIC 및/또는 SEC에 추가하여, (d) 단계 후 추가의 이온 교환 크로마토그래피 단계와 같은 추가적인 크로마토그래피 단계가 포함될 수 있다.
VII. 조성물을 포함하는 약제학적 제형
본 발명은 또한 항-VEGF 조성물을 포함하는 제형(위에 기재된 바와 같이)을 개시한다. 항-VEGF 단백질에 적합한 제형은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제7,608,261호, 미국 특허 제7,807,164호, 미국 특허 제8,092,803호, 미국 특허 제8,481,046호, 미국 특허 제8,802,107호, 미국 특허 제9,340,594호, 미국 특허 제9,914,763호, 미국 특허 제9,580,489호, 미국 특허 제10,400,025호, 미국 특허 제8,110,546호, 미국 특허 제8,404,638호, 미국 특허 제8,710,004호, 미국 특허 제8,921,316호, 미국 특허 제9,416,167호, 미국 특허 제9,511,140호, 미국 특허 제9,636,400호 및 미국 특허 제10,406,226호에 기술된 제형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
상류 공정 기술(위의 부문 IV에 기재됨), 하류 공정 기술(위의 부문 V에 기재됨)은 제형 생산을 수행하기 위해 단독으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 성분/부형제와 함께 항-VEGF 조성물을 포함하는 제형뿐만 아니라 이의 사용 방법 및 이러한 조성물의 제조 방법을 개시한다. 본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형은 대략 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2의 pH를 갖는다.
항-VEGF 조성물에 대한 약제학적 제형을 제조하기 위해, 항-VEGF 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합된다. 예를 들어, 그 전체 교시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, N.Y.; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조. 본 발명의 실시형태에서, 약제학적 제형은 멸균이다.
본 발명의 약제학적 제형은 항-VEGF 조성물 및, 예를 들어, 물, 완충제, 방부제 및/또는 세제를 포함하여 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 제시된 임의의 항-VEGF 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공하되, 예를 들어, 폴리펩타이드의 농도는 약 40 ㎎/㎖, 약 60 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 90 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖, 약 110 ㎎/㎖, 약 120 ㎎/㎖, 약 130 ㎎/㎖, 약 140 ㎎/㎖, 약 150 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖ 또는 약 250 ㎎/㎖이다.
본 발명의 범위는 항-VEGF 단백질 및 물이 실질적으로(약 85% 내지 약 99% 이상) 결여되어 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 건조된, 예를 들어, 동결건조된 조성물을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-VEGF 조성물과 함께 대상체에 투여되는 추가의 치료제는 그 교시내용이 참조에 의해 원용되어 있는 문헌[Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (Nov. 1, 2002)]에 따라 대상체에 투여된다.
본 발명은 임의의 항-VEGF 조성물 또는 본 명세서에 기재된 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형을 포함하는 용기(예를 들어, 마개가 있는 플라스틱 또는 유리 바이알 또는 크로마토그래피 칼럼, 중공 보어 바늘 또는 주사기 실린더)를 제공한다. 본 발명은 또한 항-VEGF 조성물 또는 본 명세서에 제시된 제형을 포함하는 주사 장치, 예를 들어, 주사기, 미리-충전된 주사기 또는 자가주사기를 제공한다. 일 양태에서, 용기는 자연광 또는 기타 광을 차단하기 위해 착색(예를 들어, 갈색)된다.
본 발명은 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 항-VEGF 조성물을 포함하는 조합을 포함한다. 항-VEGF 조성물 및 추가의 치료제는 단일 조성물 또는 별개의 조성물일 수 있다. 예를 들어, 치료제는 Ang-2 저해제(예를 들어, 네스바쿠맙(nesvacumab)), Tie-2 수용체 활성제, 항-PDGF 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 항-PDGF 수용체 또는 PDGF 수용체 베타 항체 또는 항원-결합 이의 단편 및/또는 추가적인 VEGF 길항제, 예컨대, 애플리버셉트, 컨버셉트, 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙, 항-VEGF 압타머, 예컨대, 페가타닙(pegaptanib)(예를 들어, 페가타닙 소듐), 단일 사슬(예를 들어, VL-VH) 항-VEGF 항체, 예컨대, 브롤루시주맙(brolucizumab), 항-VEGF DARPin, 예컨대, Abicipar Pegol DARPin, 예를 들어, RG7716과 같은 ANG2에도 결합하는 이중특이성 항-VEGF 항체, 또는 Fc-융합 단백질로서 발현되는 세포외 도메인 1 내지 3을 포함하는 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체-3(VEGFR-3)의 가용성 형태이다.
VIII. 치료 방법
본 발명은 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암(예를 들어, 성장 및/또는 전이가 적어도 부분적으로, 예를 들어, VEGF-매개성 혈관신생에 의해 매개됨) 또는 혈관형성 눈 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다(위의 부문 III).
상류 공정 기술(위의 부문 IV), 하류 공정 기술(위의 부문V 및 VI)은 안과 및 종양 질환을 포함하여 다양한 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있는 부문 III에 기재된 조성물 및/또는 부문 VII에 기재된 제형을 생산하기 위해 단독으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 약 100㎕ 이하, 예를 들어, 약 50㎕, 약 70㎕ 또는 약 100㎕의 약 0.5㎎, 2㎎, 4㎎, 6㎎, 8㎎, 10㎎, 12㎎, 14㎎, 16㎎, 18㎎ 또는 20㎎의 관심 있는 단백질(예를 들어, 애플리버셉트 또는 MiniTrap)을 포함한 조성물 및 선택적으로 추가의 치료제를, 예를 들어, 유리체내 주사와 같은 안내 주사에 의해 대상체의 신체에 도입하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 제시된 조성물(부문 III 및 부문 VII)을 대상체(예를 들어, 인간)에 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명은 성장 및/또는 전이가 적어도 부분적으로 VEGF에 의해 매개되는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 성장 및/또는 전이가 적어도 부분적으로 VEGF에 의해 매개되는 암, 예를 들어, VEGF-매개성 혈관신생 또는 혈관형성 눈 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 제시된 조성물(위의 부문 III 및 부문 VII), 예를 들어, 2㎎, 4㎎, 6㎎, 8㎎ 또는 10㎎의 관심 있는 단백질을 약 100㎕ 이하로, 및 선택적으로 추가의 치료제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 투여는 유리체내 주사에 의해 이루어진다. 본 명세서의 방법을 사용하여 치료 가능하거나 또는 예방 가능한 혈관형성 눈 장애의 비제한적인 예는 다음과 같다:
연령-관련 황반 변성(예를 들어, 습성 또는 건성),
황반부종,
망막 정맥 폐색 후 황반부종,
망막 정맥 폐색(RVO),
중심성 망막 정맥 폐색(CRVO),
분지 망막 정맥 폐색(BRVO),
당뇨병성 황반부종(DME),
맥락막 혈관신생(CNV),
홍채 혈관신생,
혈관신생성 녹내장,
녹내장의 수술 후 섬유화,
증식성 유리체망막병증(PVR),
시신경 유두 혈관신생,
각막 혈관신생,
망막 혈관신생,
유리체 혈관신생,
파누스,
익상편,
혈관 망막증,
당뇨병성 황반부종을 동반한 대상체의 당뇨병성 망막병증; 및
당뇨병성 망막병증(예를 들어, 비-증식성 당뇨병성 망막병증(예를 들어, 약 47 또는 53의 당뇨병성 망막병증 중증도 척도(DRSS) 수준을 특징으로 함) 또는 증식성 당뇨병성 망막병증; 예를 들어, DME를 앓고 있지 않은 대상체에서).
이러한 조성물 또는 제형(부문 III 및 부문 VII)의 투여 방식은 다양할 수 있으며, 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 투여 경로는 비경구, 비경구외(non-parenteral), 경구, 직장, 점막, 장, 비경구, 근육내, 피하, 피내, 골수내, 척수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 안내, 유리체내, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 제형(본 발명의 조성물 또는 제형을 포함)의 유리체내 주사는 제형을 포함하는 주사기 및 바늘(예를 들어, 30-게이지 주사 바늘)로 눈을 관통하는 단계 및 제형(예를 들어, 약 100 마이크로리터 이하; 약 40, 50, 55, 56, 57, 57.1, 58, 60 또는 70 마이크로리터)을 본 명세서에 제시된 바와 같은 치료적 유효량, 예를 들어, 약 2㎎, 4㎎, 6㎎, 8.0㎎, 8.1㎎, 8.2㎎, 8.3㎎, 8.4㎎, 8.5㎎, 8.6㎎, 8.7㎎, 8.8㎎ 또는 8.9㎎, 10㎎ 또는 20㎎의 관심 있는 단백질을 전달하기에 충분한 부피로 눈의 유리체에 주사하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 방법은 주사되는 눈에 국부 마취제(예를 들어, 프로파라카인, 리도카인 또는 테트라카인), 항생제(예를 들어, 플루오로퀴놀론), 소독제(예를 들어, 포비돈-아이오다인) 및/또는 동공 확장제(pupil dilating agent)를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 주사하기 전에 주사될 눈 주위의 멸균 영역이 확립된다. 유리체내 주사 후, 대상체는 안압, 염증 및/또는 혈압의 상승에 대해 모니터링된다.
혈관형성 눈 장애에 대한 관심 있는 단백질의 효과적 또는 치료적 유효량은, 예를 들어, 암 또는 혈관형성 눈 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후를 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 퇴행, 안정화 또는 제거시킴으로써, 예를 들어, 혈관형성 눈 장애와 관련하여, 당뇨병성 망막병증 중증도 점수(DRSS)의 감소 또는 유지를 유발함으로써, 또는 시력의 개선 또는 유지(예를 들어, ETDRS 문자의 증가로 측정된 최상의 교정 시력), 시야의 증가 또는 유지 및/또는 중심 망막 두께의 감소 또는 유지에 의해, 그리고 암과 관련하여, 대상체에서 암 세포의 성장, 생존 및/또는 전이를 중지 또는 역전시킴으로써, 암 또는 혈관형성 눈 장애의 퇴행, 안정화 또는 제거를 야기하기에 충분한 관심 있는 단백질의 양을 지칭한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 혈관형성 눈 장애를 치료 또는 예방하기 위한 애플리버셉트와 같은 관심 있는 단백질의 효과적 또는 치료적 유효량은 약 0.5㎎, 2㎎, 3㎎, 4㎎, 5㎎, 6㎎, 7㎎, 7.25㎎, 7.7㎎, 7.9㎎, 8.0㎎, 8.1㎎, 8.2㎎, 8.3㎎, 8.4㎎, 8.5㎎, 8.6㎎, 8.7㎎, 8.8㎎, 8.9㎎, 9㎎, 10㎎, 11㎎, 12㎎, 13㎎, 14㎎, 15㎎, 16㎎, 17㎎, 18㎎, 19㎎ 또는 20㎎, 예를 들어, 약 100㎕ 이하이다. 양은 투여될 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 초기 투여량에 이어 제2 또는 복수의 후속 투여량의 관심 있는 단백질이 초기 투여량과 거의 동일하거나 또는 더 적게 또는 더 많을 수 있는 양으로 투여될 수 있되, 후속 투여량은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주; 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주 또는 적어도 14주로 분리된다.
투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음에 유의하여야 한다. 임의의 특정 대상체, 특정 투여 양생법은 조성물을 투여하거나 또는 이의 투여를 감독하는 전문가의 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적이며 청구된 구성의 범위 또는 실행을 제한하려는 것이 아님을 추가로 이해하여야 한다.
IX. 단백질 변이체를 검정하는 방법
본 명세서에 기재된 기법을 사용하여 생산된 크로마토그래피 샘플에서 단백질 변이체의 수준은 아래 실시예에 기재된 바와 같이 분석될 수 있다. 소정의 실시형태에서, cIEF 방법은 플루오로카본 코팅된 모세관 카트리지(100μπι× 5㎝)가 구비된 iCE3 분석기(프로테인심플(ProteinSimple))를 사용하여 이용된다. 양쪽성 전해질 용액은 0.35% 메틸 셀룰로스(MC), 4% Pharmalyte 3-10 담체 양쪽성 전해질, 4% Pharmalyte 5-8 담체 양쪽성 전해질, 10mM L-아르기닌 HCl, 24% 폼아마이드 및 정제수 중 pI 마커 5.12 및 9.77의 혼합물로 구성된다. 양극액은 80mM 인산이었고, 음극액은 100mM 소듐 하이드록사이드였으며, 둘 다 0.10% 메틸셀룰로스에 용해되었다. 샘플은 정제수에 10 ㎎/㎖로 희석되었다. 샘플은 양쪽성 전해질 용액과 혼합된 다음, 1분 동안 1500V의 전위를 도입하고 7분 동안 3000V의 전위를 도입하여 포커싱하였다. 포커싱된 변이체의 이미지는 280㎚ 자외선을 모세관을 통해 전하 결합 소자 디지털 카메라의 렌즈로 통과시켜 얻었다. 그런 다음, 이 이미지를 다양한 전하 변이체의 분포를 결정하기 위해 분석하였다. 당업자는 목적하는 결과를 계속 달성하면서 정확한 매개변수를 변경할 수 있다.
특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 기사 및 학술 기사를 비롯한 다양한 간행물이 명세서 전체에 인용된다. 이들 인용된 참고 문헌 각각은 그 전체가 참조에 의해 원용된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예에서 논의된 MiniTrap(MT) 1 내지 6은 다음과 같다:
MT1: CDM1을 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 얻어진 VEGF MiniTrap.
MT2: CDM2를 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 얻어진 VEGF MiniTrap.
MT3: CDM3을 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 얻어진 VEGF MiniTrap.
MT4: 대두 가수분해물을 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 얻어진 VEGF MiniTrap.
MT5: 재조합 VEGF MiniTrap(이량체).
MT6: 재조합 VEGF MiniTrap(scFv).
MT1, MT5 및 MT6의 특성화는 아래 실시예 8에 기재되어 있다.
샘플의 색상 평가
b* 값(CIELAB)을 측정하는 분광 광도 검정 방법이 색상 평가를 수행하는데 적합한 것으로 밝혀졌다.
1㎖의 단백질 샘플의 흡광도를 가시광선 스펙트럼(380㎚ 내지 780㎚)에 걸쳐 정량화하였고, 흡광도 곡선을 매트릭스 작업 세트를 사용하여 CIELAB 색 공간으로 변환하였다. 장비는 시간당 대략 6개의 샘플을 처리할 수 있다. 고처리량 형식의 검정은 CLARIOstar 플레이트 판독기(비엠지 랩테크(BMG Labtech))를 사용하였다. 0.3㎖의 샘플을 필요한 96-웰 플레이트를 사용하여 최대 96개의 샘플을 분석할 수 있었다.
BY 표준을 b* 값으로 변환하기 위해, BY 참조 표준(BY1 내지 BY7)을 고처리량 검정 형식을 사용하여 정량화하였다.
용액을 위에 논의된 BY 표준에 따라 준비하였다. 각 표준에 대한 b* 값은 도 9에 나타나 있다. 이 방법은 아래 표 3에 나타낸 바와 같이 더 적은 샘플 요구사항과 더 짧은 실행 시간으로 더 빠른 검정을 제공하였다. 이 방법을 사용하여 평가된 모든 샘플에 대해, 테스트 샘플의 단백질 농도는 5 g/ℓ 또는 10 g/ℓ로 표준화하였다.
실시예 1: 화학적으로 정의된 배지를 사용한 단백질의 생산
1.1 세포 공급원 및 수확
애플리버셉트 생산 세포주를 본 연구에 이용하였다. 화학적으로 정의된 배지(CDM)를 사용하여 애플리버셉트 생산 세포주를 배양 및 수확하였다.
1.2 애플리버셉트의 단백질 가수분해 절단
고정화된 IdeS 효소(제노비스(Genovis)(매사츠세츠주 케임브리지 소재)로부터 얻은 FabRICATOR®)가 있는 칼럼을 사용하여 MT1을 생성하였다. 세포 배양 수확물(1.0㎖의 절단 완충액 중 20㎎)로부터 얻은 애플리버셉트를 칼럼에 첨가하고, 18℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 칼럼을 절단 완충액(1.0㎖)으로 세척하였다. 소화 혼합물과 세척 용액을 합하였다. 혼합물을 분석용 단백질 A 친화성 칼럼(Applied Biosystems™, POROS™ 20μM 단백질 A 카트리지 2.1×30mM, 0.1㎖(Cat# 2-1001-00))에 로딩하고 용리하였다. POROS™ 20μM 단백질 A 카트리지 2.1×30mM, 0.1㎖(Cat# 2-1001-00)에 대한 Applied Biosystems™의 프로토콜에 따라 처리를 수행하였다. 칼럼 높이는 20±1.0㎝였고, 머무름 시간은 15분이었으며, 평형화/세척은 40mM Tris, 54mM 아세테이트(pH 7.0±0.1)를 사용하여 수행하였다.
실시예 2. 색상 최소화를 위한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)
(A) AEX를 사용하여 색상 형성을 감소시켰다
AEX 크로마토그래피를 수행하여 CDM1을 사용하여 발현된 애플리버셉트의 생산 동안 얻어진 착색을 제거하였다.
2.1 설계
표 2-2에 기재된 바와 같은 AEX 프로토콜을 사용하여 표 2-1에 상세히 설명된 이 연구를 위해 5개의 AEX 분리를 수행하였다. 15.7㎖의 Q Sepharose Fast Flow 칼럼(19.5㎝ 베드 높이, 1.0㎝ I.D.) 및 14.1㎖의 POROS 50 HQ 칼럼(18.0㎝ 베드 높이, 1.0㎝ I.D.)을 AKTA Avant 벤치탑 액체 크로마토그래피 제어기에 통합시켰다.
AEX 로딩 pH를 2M Tris 염기 또는 2M 아세트산을 사용하여 목표±0.05 pH 단위로 조정하였다. AEX 로딩 전도도는 5M 소듐 클로라이드 또는 탈이온수를 사용하여 목표±0.1 mS/㎝로 조정하였다. 고분자량(HMW), 색상 및 수율에 대해 모든 풀 샘플을 분석하였다.
2.2 결과
생산을 위해 AEX 분리를 사용하면 색상이 크게 감소하였다(표 2-3). 예를 들어, 표 2-3에서 볼 수 있는 바와 같이, 3.06의 b* 값을 갖는 AEX("AEX 로딩")에 대한 로딩 색상과 비교하여, AEX 분리 1(pH 8.30 내지 8.50, 1.90 내지 2.10 mS/㎝)의 통과액(FT) 및 세척액에서 관찰된 색상은 1.05의 b* 값을 가졌다. b* 값의 증가는 샘플의 황갈색 착색의 세기를 반영한다.
5개의 AEX 분리를 수행하여 색상 감소에 대한 수지(Q Sepharose FF 또는 POROS 50 HQ) 및 pH 및 전도도 설정점(pH 8.40 및 2.00 mS/㎝, pH 8.00 및 2.50 mS/㎝ 또는 pH 7.80 및 4.00 mS/㎝)의 영향을 평가하였다. POROS 50 HQ의 경우, 수율(64.4%, 81.9% 및 91.4%) 및 풀 HMW 수준(1.02%, 1.29% 및 1.83%)은 설정점이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변화됨에 따라 증가하였다. 또한, 설정점이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변화됨에 따라 색상(b* 값)도 증가하였다(1.05, 1.33 및 1.55). 더 높은 pH 수준과 더 낮은 전도도는 POROS 50 HQ에 대한 AEX 분리에 비해 색상이 가장 많이 감소하였다.
Q Sepharose Fast Flow의 경우, 수율(49.5% 및 77.7%) 및 풀 HMW 수준(0.59% 및 1.25%)이 또한 설정점이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변화됨에 따라 증가하였다. 또한, 설정점이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변화됨에 따라 색상(b* 값)도 증가하였다(0.96 및 1.35).
AEX의 사용은 황갈색 착색을 감소시킨다 - 표 2-3을 참조한다. 추가적으로, Q Sepharose Fast Flow는 두 수지에 대해 평가된 두 가지 설정점에 대해 POROS 50 HQ보다 색상을 더 감소시키는 것으로 결정되었다. pH 8.00 및 2.50 mS/㎝ 설정점에서, POROS 50 HQ 풀은 1.33의 b* 값을 갖는 반면, Q Sepharose Fast Flow 풀은 0.96의 b* 값을 갖는다. 유사하게는, pH 7.80 및 4.00 mS/㎝ 설정점에서, POROS 50 HQ 풀은 1.55의 b* 값을 갖는 반면, Q Sepharose Fast Flow 풀은 1.35의 b* 값을 갖는다(표 2-3).
2.3 결론
AEX의 사용은 황갈색 착색을 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, 표 2-3을 참조한다. 표 2-3을 참조하면, AEX 로딩은 3.06의 b* 값을 갖지만, AEX 크로마토그래피(AEX 분리 1-5)를 거치는 경우, b* 값이 감소하면 황갈색 착색이 감소함을 나타낸다. 다시, b* 값이 감소함에 따라 착색도 감소하며; b* 값이 증가함에 따라 주어진 샘플에서 황갈색 색상의 증가를 반영한다.
2개의 AEX 수지(POROS 50 HQ 및 Q Sepharose Fast Flow) 및 3개의 설정점(pH 8.40 및 2.00 mS/㎝, pH 8.00 및 2.50 mS/㎝ 및 pH 7.80 및 4.00 mS/㎝)을 사용하여 색상 감소를 평가하였다. 두 수지에 대해, 더 높은 pH 및 더 낮은 전도도 설정점에 대해 색상 감도가 더 높았다. 또한, Q Sepharose Fast Flow는 두 수지에 대해 평가된 2개의 설정점(pH 8.00 및 2.50 mS/㎝ 및 pH 7.80 및 4.00 mS/㎝)에서 POROS 50 HQ보다 더 큰 색상 감소를 제공하였다. 그러나, 5개의 AEX 분리 방법 모두 AEX용 로딩 용액("AEX 로딩")과 비교할 때 상당한 색상 감소를 초래하며, 이는 CDM을 사용하여 발현된 애플리버셉트 생산 과정에서 AEX 생산의 중요성을 보여준다. AEX 로딩의 초기 b* 값(10 g/ℓ의 농도에서)은 약 0.5 내지 약 30, 더 구체적으로 약 1.0 내지 약 25.0 및 훨씬 더 구체적으로 약 2.0 내지 약 20.0의 범위일 수 있다. AEX의 사용 후, 통과액(10 g/ℓ의 농도에서)에 대한 b* 값은 0.5 내지 약 10.0, 더 구체적으로 약 0.5 내지 약 7.0 및 훨씬 더 구체적으로 약 0.5 내지 약 5.0의 범위일 수 있다.
2.4 펩타이드 매핑
샘플 제조. 위의 실험의 AEX 로딩액 및 통과액으로부터 얻어진 환원되고 알킬화된 애플리버셉트 샘플의 트립신 소화 매핑(표 2-3)을 수행하여 번역 후 변형(PTM)을 확인하고 정량화하였다. 8.0M 우레아, 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)를 사용하여 각 샘플(로딩액 및 통과액)의 분취량을 변성시키고, DTT로 환원시킨 아이오도아세트아마이드로 알킬화하였다. 변성, 환원 및 알킬화된 샘플을 먼저 최종 우레아 농도가 1.8M이 되도록 1:100(w/w)의 효소 대 기질 비로 37℃에서 30분 동안 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)로 희석된 재조합 Lys-C(rLys-C)로 소화하고, 후속적으로 1:20(w/w)의 효소 대 물질 비로 37℃에서 2시간 동안 트립신으로 소화한 후 및 1:5(w/w)의 효소 기질 비로 37℃에서 1시간 동안 PNGase F로 탈글리코실화하였다. 폼산(FA)을 사용하여 pH를 2.0 미만으로 낮추어 소화를 중단시켰다.
LC-MS 분석. 각 샘플로부터 생성된 rLys-C/트립신 소화 펩타이드의 20㎍의 분취량을 분리하고, Waters ACQUITY UPLC CSH C18 칼럼(130Å, 1.7㎛, 2.1×150㎜)을 사용하여 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)로 분석하고, 이어서 온-라인 PDA 검출(280㎚, 320㎚ 및 350㎚의 파장에서) 및 질량 분석법 분석을 하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% FA였고, 이동상 B는 아세토나이트릴 중 0.1% FA였다. 샘플 주입 후, 구배는 최적의 펩타이드 분리를 위해 0.1% B에서 5분간 유지로 시작한 다음 75분에 걸쳐 35% B로 선형 증가한다. MS/MS 실험을 위한 펩타이드 단편화에 이용되는 고에너지 충돌 해리(higher-energy collisional 해리: HCD)를 이용하는 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) Q Exactive 하이브리드 사중극자-오비트랩 질량 분석기를 사용하여 MS 및 MS/MS 실험을 수행하였다. 펩타이드 동일성 할당은 전체 MS 스펙트럼에서 주어진 펩타이드의 실험적으로 결정된 정확한 질량뿐만 아니라 해당 HCD MS/MS 스펙트럼에서의 b 및 y 단편 이온을 기반으로 한다. 로딩액 및 통과액으로부터 펩타이드의 추출된 이온 크로마토그램을 생성하였다(도 10 참조). 도 10의 추출된 이온 크로마토그램에서 볼 수 있는 바와 같이, AEX 분리 1 내지 5로부터의 "AEX 로딩" 및 "AEX FT/세척"에서 확인된 펩타이드 단편(표 2-3에서 확인됨)이 나타나 있다. 펩타이드 매핑 분석으로부터의 도 10에서 확인된 이들 펩타이드 중 일부의 상대적 존재비가 도 11에 나타나 있다.
도 11을 참조하면, 이 도면은 분석된 다양한 펩타이드 단편 및 이들의 상대적인 산화 수준을 식별한다. 특히, 제3 칼럼은 단리되고 분석된 펩타이드 단편의 아미노산 잔기("펩타이드 서열")를 식별한다. 각 펩타이드 서열은 밑줄이 그어진 아미노산 잔기를 갖는다. 밑줄이 그어진 아미노산 잔기는 펩타이드 서열에서 산화되는 아미노산을 식별한다. 산화된 아미노산은 히스티딘(H) 산화 또는 트립토판(W) 산화에 해당한다. 산화된 종의 존재비를 보여주는 각 펩타이드 서열의 오른쪽에 이 도면의 행이 도시되어 있다. 행의 음영은 각 열의 머리글에서 확인된 상이한 AEX 분리를 사용하여 특정 샘플에서 산화된 잔기의 상대적인 양의 차이를 나타낸다. 예를 들어, 도 11에서 두 번째 펩타이드 EIGLLTCEATVNGHLYK를 참조하면, 수평 방식으로 가로질러 읽을 때, 산화되는 특정 샘플("애플리버셉트 AEX 로딩")에서 이 펩타이드의 상대적인 총 집단은 대략 0.013% 산화된다. 동일한 행을 가로질러 진행됨에 따라, 음영의 이동이 있으며, 이는 산화된 종의 상대적 존재비의 변화를 나타낸다. 예를 들어, 이러한 동일한 펩타이드 서열을 사용하면, AEX 분리를 위한 산화된 종의 상대적 존재비는 상이한 AEX 분리 프로토콜을 따를 때 0.006% 내지 0.010%이다. 따라서, AEX 크로마토그래피는 산화된 종의 존재비를 감소시킴을 알 수 있다.
(B) AEX를 사용하여 MiniTrap 생산에서 색상 형성을 감소시켰다.
CDM1을 사용하여 발현된 전장 애플리버셉트의 절단을 수행하여 얻어진 MT1의 생산 동안 얻어진 착색을 제거하기 위해 AEX 크로마토그래피를 수행하였다.
2.5 설계
표 2-4에 기재된 바와 같은 이러한 연구를 위해 4개의 AEX 분리를 수행하였다. AEX 로딩은 MT1의 여과 샘플("MT1 여과된 풀")로부터 얻었다. 15.7㎖의 Capto Q 칼럼(20.0㎝ 베드 높이, 1.0㎝ I.D.), 14.1㎖의 POROS 50 HQ 칼럼(18.0㎝ 베드 높이, 1.0㎝ I.D.) 및 16.5㎖의 Q Sepharose FF 칼럼(21.0㎝ 베드 높이, 1.0㎝ I.D.)을 이 실험을 위해 AKTA Avant 벤치탑 액체 크로마토그래피 제어기에 통합하였다.
AEX 로딩 pH는 2M tris 염기 또는 2M 아세트산을 사용하여 목표±0.05 pH 단위로 조정하였다. AEX 로딩 전도도는 5M 소듐 클로라이드 또는 탈이온수를 사용하여 목표±0.1 mS/㎝으로 조정하였다. 모든 풀 샘플을 HMW, 색상 및 수율에 대해 분석하였다.
2.6 결과
4개의 AEX 분리 모두는 AEX 분리 1 내지 4에 대한 통과액 및 세척액의 착색에 대해 알 수 있는 바와 같이 색상의 감소를 초래하였다(표 2-7). 처음 3개의 AEX 분리를 결합 및 용리 모드에서 평가하였지만(표 2-6), 대부분의 생성물이 로딩 및 세척 블록에 존재하는 것으로 관찰되었다(62% 내지 94%).
처음 3개의 분리는 Capto Q, POROS 50 HQ 및 Q Sepharose FF 수지에 대한 pH 8.4 및 2.0 mS/㎝ 설정점을 평가하였다. 3개의 분리 모두 우수한 수율을 보였다(80% 초과). POROS 50 HQ AEX 풀은 AEX 풀(2.09의 b* 값)에서 가장 낮은 황색 색상을 보였으며, 그 다음으로 Q Sepharose FF AEX 풀(2.22의 b* 값) 및 Capto Q AEX 풀(2.55의 b* 값)이 낮았다.
분획은 색상 측정을 위해 5 g/ℓ의 단백질 농도로 조정하였다.
2.7 결론
애플리버셉트에 대해 알 수 있는 바와 같이(위의 부문 2.3 참조), AEX의 사용은 MiniTrap 생산에 대한 황갈색 착색(표 2-7)을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 표 2-7을 참조하면, AEX 로딩은 4.17의 b* 값을 갖지만, AEX 크로마토그래피(AEX 분리 1 내지 4)를 거칠 때, b* 값이 감소하여 황갈색 착색이 감소함을 나타낸다. 다시 한 번, b* 값이 감소함에 따라 착색도 감소한다. AEX 로딩의 초기 b* 값(5 g/ℓ의 농도에서)은 약 0.5 내지 약 25, 더 구체적으로 약 1.0 내지 약 20.0, 훨씬 더 구체적으로 약 1.5 내지 약 15.0의 범위일 수 있다. AEX의 사용 후, 통과액의 b* 값(5 g/ℓ의 농도에서) 0.5 내지 약 10.0, 더 구체적으로 약 0.5 내지 약 7.0, 훨씬 더 구체적으로 약 0.5 내지 약 5.0의 범위일 수 있다.
실시예 3. 산화된 펩타이드 연구
3.1 펩타이드 매핑
샘플 제조. 환원 및 알킬화된 MiniTrap(MT1) 및 MT4(대두 가수분해물 세포 배양물을 사용하여 생성된 다른 전장 애플리버셉트를 사용하는 MT1과 유사한 MiniTrap) 샘플의 트립신 소화 매핑을 수행하여 번역 후 변형을 확인하고 정량화하였다. 샘플의 분취량을 0.1M Tris-HCl(pH 7.5) 중 8.0M 우레아를 사용하여 변성시키고, DTT로 환원시킨 다음 아이오도아세트아마이드로 알킬화하였다. 변성, 환원 및 알킬화된 원료의약품을 먼저 최종 우레아 농도가 1.8M이 되도록 1:100(w/w)의 효소 대 기질 비로 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)로 희석된 재조합 Lys-C(rLys-C)를 사용하여 37℃에서 30분 동안 소화시키고, 후속적으로 1:20(w/w)의 효소 대 물질 비로 트립신을 사용하여 37℃에서 2시간 소화시킨 다음, 1:5(w/w)의 효소 기질 비로 PNGase F를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 탈글리코실화하였다. 폼산(FA)을 사용하여 pH를 2.0 미만으로 낮추어 소화를 중단시켰다.
LC-MS 분석. 각 샘플로부터 생성된 rLys-C/트립신 소화 펩타이드의 20㎍의 분취량을 분리하고, Waters ACQUITY UPLC CSH C18 칼럼(130Å, 1.7㎛, 2.1×150㎜)을 사용하여 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)로 분석하고, 이어서 온-라인 PDA 검출(280㎚, 320㎚ 및 350㎚의 파장에서) 및 질량 분석법 분석을 하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% FA였고, 이동상 B는 아세토나이트릴 중 0.1% FA였다. 샘플 주입 후, 구배는 최적의 펩타이드 분리를 위해 0.1% B에서 5분간 유지로 시작한 다음 75분에 걸쳐 35% B로 선형 증가한다. MS/MS 실험을 위한 펩타이드 단편화에 이용되는 고에너지 충돌 해리(HCD)를 이용하는 써모 사이언티픽 Q Exactive 하이브리드 사중극자-오비트랩 질량 분석기를 사용하여 MS 및 MS/MS 실험을 수행하였다. 펩타이드 동일성 할당은 전체 MS 스펙트럼에서 주어진 펩타이드의 실험적으로 결정된 정확한 질량뿐만 아니라 해당 HCD MS/MS 스펙트럼에서의 b 및 y 단편 이온을 기반으로 한다. MT1 샘플 내 산화된 아미노산 잔기(들)의 부위-특이적 백분율을 계산하기 위해 통합된 피크 면적을 사용하여 산화된 펩타이드 및 상응하는 천연 펩타이드의 추출된 이온 크로마토그램을 생성하였다.
350㎚에서 증가된 흡광도와 연관된 펩타이드 단편
MT1에 대한 PTM은 MT1 및 MT4에 대한 트립신 소화 펩타이드 맵을 비교할 때 관찰되었다(도 12a는 20.0분 내지 75분에서 용리된 펩타이드의 흡광도를 나타냄). 다양한 UV 피크를 갖는 펩타이드가 강조 표시되어 있다. 크로마토그램 확대도가 도 12b에 나타나 있으며, 이는 16분 내지 30분 동안 용리된 펩타이드의 흡광도를 보여준다. MT1과 MT4 사이의 UV 흡광도에서 뚜렷한 대조를 보이는 펩타이드는 TNYLTH*R, IIW(+4)DSR 및 IIIW(+132)DSR이었다(* 또는 밑줄은 잔기의 산화를 나타냄). 또한, 크로마토그램의 확대도가 도 12c에 나타나 있으며, 이는 30분 내지 75분 동안 용리된 펩타이드의 흡광도를 보여준다. MT1과 MT4 사이의 UV 흡광도에서 뚜렷한 대조를 보이는 펩타이드는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열번호 17), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열번호 20), EIGLLTCEATVNGH*LYK(서열번호 18) 및 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19)였다(*는 잔기의 산화를 나타냄). 펩타이드 매핑은 VEGF MiniTrap 간에 존재비가 상당히 상이한 펩타이드의 정체를 드러내었다. 펩타이드 매핑 분석으로부터 확인된 펩타이드의 상대적 존재비는 표 3-1에 나타나 있다. MT1(CDM에서 생성됨)에서 2-옥소-히스티딘의 양은 MT4(대두 가수분해물에서 생성됨)보다 높았으며, 이는 애플리버셉트를 발현하는데 사용되는 배지가 산화된 히스티딘 또는 산화된 트립토판이 포함된 펩타이드의 상대적 존재비에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 펩타이드 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열번호 19)의 경우, MT1(CDM에서 생성됨)에서 펩타이드의 상대적 존재비 백분율은 MT4(대두 가수분해물에서 생성됨; MT1과 비교하여 약 15-배 적음)에서 펩타이드의 상대적 존재비 백분율과 비교하여 0.015%였다.
색상 및 2-옥소-히스티딘 정량화. 질량 분석법에 의해 측정된 프로테이스 소화에 의해 생성된 올리고펩타이드 내 2-옥소-히스티딘의 백분율이 나타나 있다(표 3-2). (값은 비변형된 펩타이드에 대해 정규화됨) 표 3-2(I)은 MT1 로트 1에 대한 AEX 통과액, MT1 로트 2에 대한 AEX 통과액 및 MT1 로트 3에 대한 AEX 통과액에 대해 관찰된 산화된 히스티딘/트립토판의 백분율을 보여준다. 표 3-2(II)는 산성 분획 1, 산성 분획 2 및 MT1 로트 3에 대해 CEX 분리를 수행하여 얻어진 주요 분획에서 관찰된 산화된 히스티딘/트립토판의 백분율을 보여준다. 이 표에서, 산성 변이체는 산화된 종으로 구성되어 있음이 분명하다. 표 3-2(I)에서, 펩타이드/단백질을 포함하는 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판의 %는 AEX 스트립과 비교하여 AEX 통과액에서 감소된다는 것이 분명하다. 스트리핑 AEX 칼럼을 스트리핑하면 이러한 변형된 펩타이드의 백분율이 증가한다는 것이 분명하다. 예를 들어, AEX 통과액(MT1 로트 1)에서 변형된 펩타이드 "EIGLLTC[+57]EATVNGH[+14]LYK(서열번호 18)"의 %는 0.013%였고, "AEX 스트립"에서는 0.080%였다. 이는 또한 AEX 칼럼이 변형된 펩타이드를 포획하여 AEX 통과액에서 변형된 펩타이드의 백분율을 감소시킨다는 것을 확증한다.
표 3-2(II)에서, [+57]은 시스테인에 카복시메틸 아민 모이어티를 추가하는 아이오도아세트아마이드에 의한 시스테인의 알킬화를 나타내며, 이는 비변형된 시스테인에 비해 약 +57의 순 질량 증가이다:
표 3-2(II)에서, [+14]는 His의 2-옥소-His로의 전환을 나타내고, 하나의 산소 원자가 탄소 2에 추가되지만, 2개의 수소 원자가 손실되며(하나는 탄소 2에서, 나머지 하나는 질소 3에서), 이는 비변형된 히스티딘에 비해 약 +14의 순 질량 증가이다.
표 3-2(II)에서, [+32]는 N-폼일카이누레닌의 형성을 초래하는 이산화 트립토판을 나타내며, 이는 비변형된 트립토판에 비해 약 +32의 순 질량 증가이다(도 4).
AEX 크로마토그래피에 의해 처리된 프로테이스 소화된 FabRICATOR-절단된 애플리버셉트(MT4)로부터의 올리고펩타이드 내 2-옥소-히스티딘(및 이산화 트립토판)의 백분율을 평가하기 위해 제2 세트의 실험을 수행하였다(아래 도 13 및 표 3-3). AEX 스트립에서 프로테이스로 소화된 FabRICATOR-절단된 애플리버셉트(MT4)로부터의 올리고펩타이드에 대한 2-옥소히스티딘 및 이산화 트립토판의 백분율은 AEX 통과액에서 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판의 백분율보다 상당히 더 높았다(아래 표 3-3에서 "MT1"를 참조).
AEX 스트립에서 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판의 백분율은 MT1(위의 표 3-3에서 "MT1" 참조) 생산 동안 AEX 통과액에서 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판의 백분율보다 상당히 더 높았다. 표 3-2와 비교하여, 표 3-3은 스트리핑 AEX 칼럼을 스트리핑하면 AEX 통과액에서 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판의 백분율과 비교하여 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판의 백분율이 상당히 더 높은 샘플이 생성된다는 유사한 결과를 보여주며, 이는 2-옥소-히스티딘 및 이산화 트립토판 종은 분리 중에 AEX 칼럼에 결합되며 AEX 칼럼의 스트리핑시에 제거됨을 시사한다. 이는 도 14에서도 알 수 있는 바와 같이 추출된 이온 크로마토그램에서 더욱 명백하다.
강한 양이온 교환 크로마토그램(CEX)
항-VEGF 단백질을 포함하는 샘플에 존재하는 산성 종 및 다른 변이체를 확인하기 위해 일련의 실험을 수행하였다.
강한 양이온 교환 크로마토그래피를 모노S(10/100) GL 칼럼(지이 라이프 사이언시스(GE Life Sciences), 매사츠세츠주 말버러 소재)을 사용하여 수행하였다. 샘플 분리를 위해 사용된 이동상은 20mM 2-(N-모폴리노)에테인설폰산(MES)(pH 5.7)(이동상 A) 및 40mM 소듐 포스페이트, 100mM 소듐 클로라이드(pH 9.0)(이동상 B)였다. 비-선형 pH 구배를 사용하여 280㎚에서 검출된 MT1의 전하 변이체를 용리하였다. 주요 피크보다 빠른 상대 머무름 시간에 용리되는 피크를 본 명세서에서 산성 종으로 명명하였다.
임의의 농축 전에, MT1 로트 2(BY3 이하)로부터의 샘플을 도 15에 도시된 바와 같은 방법을 사용하여 CEX에 적용하였다. MT1의 변이체의 복잡성을 줄이기 위해 샘플에 탈시알릴화를 적용하였다. 이어서 이동상으로 1× DPBS(pH 7.2±0.2)를 사용하여 분취 SEC 처리(Superdex 200 prep 등급 XK26/100)를 수행하였다. 탈시알릴화된 MiniTrap(dsMT1)을 포함하는 분취 SEC 칼럼으로부터 얻어진 분획을 합하고, 이중 염-pH 구배를 사용하여 MT1의 전하 변이체를 풍부하게 하기 위해 강한 양이온 교환(SCX) 크로마토그래피에 추가로 적용하였다. 절차는 총 7개의 분획을 생성하였다(F1 내지 F7; MC는 방법 대조군을 나타냄, 도 16 및 도 17).
CEX를 수행할 때, 산성 종은 주요 피크보다 먼저 용리되고, 염기성 종은 주요 피크 후에 용리된다. 도 17에서 관찰된 바와 같이, 피크 3 내지 5는 주요 피크이다. 피크 1 및 피크 2는 MT1의 주요 종(피크 3 내지 피크 5)의 용리 전에 용리되므로 산성 종을 포함한다. 피크 6은 MT1의 주요 종(피크 3 내지 피크 5)의 용리 후에 용리되므로 염기성 종을 포함한다. 표 3 내지 표 4는 MC에서 피크의 상대적 존재비를 보여준다(도 16에서 확인됨). 예를 들어, 표 3 내지 표4의 2행(MC로 표시됨)은 MC에서 산성 종의 총 상대 양이 약 19.8%(즉, 피크 1 + 피크 2)임을 보여준다. 표 3 내지 표 4는 또한 각 개별 분획에 대한 피크의 상대적 존재비를 보여준다. 상이한 분획에 중복되는 종이 존재하지만(도 16 및 도 17에 반영됨), 대부분의 분획 F1 및 분획 F2는 산성 종(즉, 피크 1 및 피크 2)이다. 예를 들어, 분획 F1은 63.7%의 피크 1 및 19.2%의 피크 2(총 82.9%의 산성 종의 경우)로 구성된다. 분획 F2는 9.6%의 피크 1 및 75.9%의 피크 2(총 85.5%의 산성 종의 경우)로 구성된다. 대부분의 분획 F3 내지 F5는 MT1의 주요 종(피크 3 내지 5)이다. 마지막으로, 대부분의 분획 F6 내지 F7은 염기성 종(피크 6)이지만, 주요 종의 일부(예를 들어, 피크 4 및 피크 5)를 포함한다.
분획 F1 및 분획 F2(산성 종을 포함함)가 분획 F3 내지 F5(주요 종 또는 "MT1"을 포함함)와 비교하여 진한 황갈색 착색을 가짐이 또한 관찰되었다. 13 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 색상에 대해 모든 분획을 검사하였다. 이 실시예로부터 명백한 바와 같이, 황갈색 착색의 출현으로 추적된 샘플에서의 산성 종의 존재의 제거(또는 최소화)는 MT1으로부터 산성 종의 제거(또는 최소화)에 의해 달성될 수 있다.
MT1 로트 2 및 분획 F1 내지 F7에 대한 3D 크로마토그램이 도 18a 내지 도 18h에 나타나 있다. MT1 로트 2는 임의의 유의미한 스펙트럼 특징을 나타내지 않는다(도 18a). 분획 1 및 분획 2(산성 종을 포함)는 320㎚ 내지 360㎚ 사이에 스펙트럼 시그니처를 나타내었다(도 18b의 원 참조). 이러한 특징은 분획 2와 비교하여 분획 1에서 더 두드러졌고(도 18b 및 도 18c), 분획 3 및 분획 4 내지 분획 7(주요 종, MT1)에는 없었으며(도 18d 및 도 18h), 이는 황갈색 착색을 나타내지 않았다.
따라서, 위에서 관찰된 바와 같이, CEX는 주요 종/분획(분획 3 내지 분획 6)과 비교하여 진한 황갈색 착색을 나타내는 산성 종/산성 분획(분획 1 및 분획 2)의 확인으로 이어졌다. 이러한 결과는 또한 분획 F1 내지 분획 F2의 3D 크로마토그램에는 존재하고 분획 F3 내지 분획 F7에는 없는 뚜렷한 스펙트럼 시그니처의 형태로 관찰되었다.
이미지화된 모세관 등전위 포커싱(icIEF) 전기영동도
분획 F1 내지 분획 F7 및 MC(MT1에서 - CEX 후 로트 2)에서의 변이체의 분포를 icIEF에 의해 추가로 평가하였다(도 19).
분획 F1 내지 분획 F7 및 MC(MT1에서 - CEX 후 로트 2)에서 변이체의 분포를 플루오로카본 코팅 모세관 카트리지(100㎛×5㎝)가 있는 iCE3 분석기(프로테인심플)를 사용하여 icIEF에 의해 추가로 평가하였다. 양쪽성 전해질 용액은 0.35% 메틸 셀룰로스(MC), 0.75% Pharmalyte 3-10 담체 양쪽성 전해질, 4.2% Pharmalyte 8-10.5 담체 양쪽성 전해질 및 정제수 중 0.2% pI 마커 7.40 및 0.15% pI 마커 9.77의 혼합물로 구성되었다. 양극액은 80mM 인산이었고, 음극액은 100mM 소듐 하이드록사이드였으며, 둘 다 0.10% 메틸셀룰로스로 용해되었다. 샘플을 정제수로 희석하고, 시알리데이스 A를 1:200의 효소 대 기질 비(MT1 밀리그램당 시알리데이스 A의 단위)로 각각의 희석된 샘플에 첨가한 다음 주위 온도에서 대략 16시간 동안 인큐베이션하였다. 시알리데이스 A 처리된 샘플을 양쪽성 전해질 용액과 혼합한 다음, 1분 동안 1500V의 전위를 도입하고 7분 동안 3000V의 전위를 도입하여 포커싱하였다. 포커싱된 MT1 변이체의 이미지는 280㎚ 자외선을 모세관을 통해 전하 결합 소자 디지털 카메라의 렌즈로 통과시켜 얻었다. 이 이미지를 다양한 전하 변이체의 분포를 결정하기 위해 분석하였다(도 19). 도 19를 참조하면, 분획 F1 및 분획 F2(또는 산성 분획)는 MC 및 분획 F3 내지 분획 F7(주요 종, MT1)에서 명확하게 관찰되는 MT1에 대한 피크의 부재를 보여주었다. 따라서, icIEF 전기영동도는 고려 중인 단백질(이 경우, MT1)의 다양한 전하 변이체의 분포를 검출 및 결정할 수 있는 것으로 간주하였다. 따라서, CEX 분석 수행시 산성 분획은 (a) 2-옥소-히스티딘 또는 다이옥소-트립토판의 백분율의 상대적 존재비의 증가(표 3-2(II)); (b) 증가된 황갈색 착색(데이터 미제시); 및 (c) 분획 1 및 분획 2에 대한 3D 크로마토그램에서 알 수 있는 바와 같은 스펙트럼 시그니처의 존재(도 18b 및 도 18c)를 나타내는 것이 분명하였다.
실시예 4. 광-유도 연구
이 실시예에서, VEGF MiniTrap(MT), 예를 들어 MT1의 광-유도는 단백질 샘플을 다양한 양의 차가윈 백색(CW) 형광등 또는 자외선 A(ultra-violet A: UVA) 광에 노출시켜 수행하였다. 광에 노출된 샘플의 색상 및 산화된 아미노산 함량을 결정하였다. LCMS 분석을 위에 설명된 바와 같이 노출 후 수행하였다. MT를 차가운 백색광 또는 UVA 광에 노출시키면 산화된 아미노산 잔기, 예를 들어, 히스티딘이 증가한다(표 4-1, 표 4-2 및 표 4-3).
표 4-2는 차가운 백색광 및 자외선에 노출된 MT 샘플의 착색의 증가를 도시한다. 예를 들어, 샘플(t=0)에 대한 b-값은 9.58이었다. 이 샘플을 240만 lux*hr의 차가운 백색광에 노출시키면, b-값은 22.14로 증가한다. b-값의 이러한 증가는 MT가 240만 lux*hr의 차가운 백색광에 노출되면 샘플(t=0)과 비교하여 황갈색 샘플의 착색이 증가함을 나타낸다. 유사하게는, MT 샘플(t=0)을 400 W*h/㎡의 자외선에 노출시키면, b-값은 9.58에서 10.72로 증가한다. b-값의 이러한 증가는 MT 샘플이 400 W*h/㎡의 자외선에 노출되면 샘플(t=0)과 비교하여 황갈색 샘플의 착색이 증가함을 나타낸다.
차가운 백색광 또는 UVA 광에 대한 애플리버셉트 MT는 산화된 히스티딘(2-옥소-his)의 출현으로 추척된다(표 4-3). 표 4-3을 참조하면, 옥소-히스티딘이 포함된 펩타이드 "SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR(서열번호 22)"는 MT 샘플(t=0)에서 0.007%였던 반면, 이의 존재비는 40시간 동안 자외선에 노출시 0.324%로 증가하고(표 4-3(I)), 300시간 동안 차가운 백색광에 노출시 1.309%로 증가하였다(표 4-3(II)).
13.98Da 종(도 2에 도시됨) 및 15.99Da 종(도 3에 도시됨)의 두 종의 2-옥소-히스티딘이 관찰되었으며, 13.98Da 종은 광 스트레스를 받은 MiniTrap 샘플에서 우세하였다. 15.99Da 종은 구리 금속-촉매 과정의 산물로 알려져 있다(문헌[, J. Pharm. Biomed Anal., 21:1093-1097 (2000)]). 더욱이, 13.98Da 종은 광-유발 과정의 산물이다(문헌[Liu et al., Anal. Chem., 86, 10, 4940-4948(2014)]).
차가운 백색광 및 UVA 광에 노출된 샘플에서 산화된 히스티딘의 증가된 존재비와 유사하게, 차가운 백색광 또는 UVA 광에 대한 MT의 노출은 또한 다른 PTM의 형성을 유도하였다(표 4-4 및 표 4-5).
따라서, 차가운 백색광 또는 UVA 광에 대한 MT의 노출은 산화된 잔기(예컨대, 히스티딘/트립토판(옥소-Trp))의 출현으로 추적된다. +4Da, +16Da, +32Da 및 +48 Da의 4개의 종의 옥소-trp가 관찰되었다. +4Da 종은 카이누레닌(도 4)의 형성으로 설명되는 반면, +16Da, +32Da 및 +48Da는 트립토판 잔기의 일산화, 이산화 및 삼산화이다. 320㎚에서 모니터링되는 MT 샘플의 트립신 소화의 펩타이드 매핑은 도 20에 나타나 있다. 펩타이드를 포함하는 산화된 잔기의 상대적 존재는 도 20에서 비교될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 IIW(+4)DSRK의 경우, t=0에서 MT 샘플 및 40시간 동안 UVA에 노출된 MT1 샘플 및 300시간 동안 CWL에 노출된 MT 샘플에 대해 상당한 차이가 있음을 알 수 있었다.
차가운 백색광 또는 UVA 광에 대한 MT의 노출을 또한 HMW/저분자량(LMW) 종의 존재에 대해 평가하였다(표 4-6).
각 샘플에 대한 HMW/LMW 종에 관한 착색을 추적하기 위해, 스트레스를 받은 모든 샘플(CWL 및 UVA)에 대해 위에 나타낸 바와 같이 전체-스펙트럼 PDA 검출(SEC-PDA)을 사용한 분석용 크기-배제 크로마토그래피를 수행하였다. CWL-스트레스를 받은 MT의 SEC-PDA 분석은 LMW 종을 제외한 모든 크기의 변이체에 대해 약 350㎚에서 흡광도의 상당한 증가를 나타내는 반면(도 21), UVA-스트레스를 받은 MT에 대한 SEC-PDA는 약 350㎚에서 흡광도의 증가를 나타내지 않았다(도 22). CWL-처리된 스트레스를 받은 샘플과 달리, UVA-처리된 스트레스를 받은 샘플은 임의의 유의하게 정량화할 수 있는 황갈색 색상을 생성하지 않았다.
UVA 및 CWL에 의해 스트레스를 받은 샘플에 대해 320㎚ 및 280㎚에서 흡광도 비를 연구한 후에도 유사한 결과가 얻어졌다. 원시(raw) 세기 또는 총 피크 면적에 의해 분석된 A320/A280 비는 CWL-스트레스 샘플에서 황색 색상의 세기 증가로 추적된 반면(도 23), A320/A280 비는 UVA-스트레스를 받은 샘플에서 황색 색상의 세기 증가로 추적되지 않았다(도 24). 이는 UVA 스트레스를 받은 MT1 샘플이 CWL 스트레스에 따라 관찰된 동일한 황갈색 색상이 관찰되지 않았다는 이전의 관찰을 뒷받침한다.
실시예 5. 착색 감소를 위한 상류 방법
5.1 화학적으로 정의된 배지 인큐베이션 연구
착색과 관련하여 애플리버셉트를 포함하는 새로운 화학적으로 정의된 배지(CDM)에 스파이킹된 다양한 구성성분의 효과를 조사하였다.
10㎖의 작업 부피(새로운 CDM1)를 갖는 하나 이상의 50㎖의 통기 캡이 있는 진탕기 튜브를 7일 동안 인큐베이션하여, 제0일 및 제7일에 샘플을 취하였다. 애플리버셉트 샘플(5mM 소듐 포스페이트, 5mM 소듐 시트레이트 및 100mM 소듐 클로라이드를 포함하는 수성 완충 용액(pH 6.2) 중 애플리버셉트 재조합 단백질)을 6 g/ℓ의 농도로 진탕기 튜브에 스파이킹하였다.
누적 농도에 도달하기 위해 첨가된 성분:
시스테인: 16.6mM
철: 0.23mM
구리: 0.0071mM
아연: 0.54mM
b* 값(CIE L*, a*, b* 색 공간)에 가산된 각 구성성분의 스케일 효과는 도 25a에 제시되어 있으며, 예측된 b* 값에 대한 실제 b* 값의 플롯은 도 25b에 제시되어 있다. 시스테인의 첨가는 가장 큰 황갈색 색상의 증가를 가져왔다. 철과 아연도 또한 색상을 생성하였다. 엽산과 B 바이타민 그룹(티아민, 나이아신아마이드, D-판토텐산, D-바이오틴 및 피리독신 포함)은 황갈색 색상을 증가시켰다. 리보플라빈 및 바이타민 B12는 통계적으로 색상에 영향을 미치지 않았다.
5.2 b * 값에 대한 시스테인 및 금속 감소의 효과
생물반응기(예를 들어, 2ℓ)에는 애플리버셉트 생산 세포주의 시드 배양물을 접종하였다. 35.5℃의 온도, 7.1±0.25 pH 및 22ccm의 공기 살포 설정점에서 접종된 배양물을 성장시켰다. 글루코스, 소포제 및 기초 공급원(basal feed)을 필요에 따라 생물반응기에 보충하였다. CDM1에서 애플리버셉트가 발현될 때 시스테인과 금속의 농도를 낮추는 것이 색상에 미치는 영향을 평가하였다.
제0일의 배지 = CDM1, 1.48mM의 시스테인을 포함
영양 공급원:
o 제2일 = 화학적으로 정의된 공급원(Chemically defined feed: CDF) + 1.3mM 내지 2.1mM 시스테인
o 제4일 = CDF + 1.6mM 내지 1.7mM 시스테인
o 제6일 = CDF + 1.6mM 내지 1.7mM 시스테인
o 제8일 = CDF + 1.6mM 내지 1.7mM 시스테인
생물반응기 조건은 다음과 같았다:
시스테인은 배양 ℓ당 약 6 내지 7 밀리몰, 배양 ℓ당 8 내지 9 밀리몰 또는 배양 ℓ당 10 내지 11 밀리몰의 누적 농도로 첨가되었다.
1× 수준에서 CDM1(0.5×, 1× 또는 1.5× CDM1 수준) 내의 금속은 아래에 열거되어 있다(농도는 접종물을 첨가하기 전임):
o Fe = 배양 리터당 68 내지 83 마이크로몰
o Zn = 배양 리터당 6 내지 7 마이크로몰
o Cu = 배양 리터당 0.1 내지 0.2 마이크로몰
o Ni = 배양 리터당 0.5 내지 1 마이크로몰
누적 시스테인 수준을 6 내지 7 밀리몰/ℓ로 감소시키면 역가에 큰 영향을 미치지 않으면서 황갈색 색상이 감소하였다. 배지에서 금속 농도를 0.5×로 낮추면 역가가 크게 증가하면서 색상이 감소하였다. 역가, VCC(생존 세포 농도), 생존능력, 암모니아 또는 삼투압 농도에 대한 영향은 최소화되었다(도 26a 내지 도 26e 참조). b* 값 및 역가에 대한 금속 함량 및 시스테인의 예측된 스케일 효과는 도 27에 제시되어 있다.
5.3 b * 값에 대한 항산화제 효과의 평가
애플리버셉트를 포함하는 폐 CDM에 스파이킹된 색상에 대한 항산화제 타우린, 하이포타우린, 티옥트산, 글루타티온, 글리신 및 바이타민 C의 효과를 평가하였다. 10㎖의 작업 부피(CDM1)를 갖는 하나 이상의 50㎖의 통기 캡이 있는 진탕기 튜브를 7일 동안 인큐베이션하고, 제0일 및 제7일에 샘플을 취하였다.
폐 CDM1에 성분을 첨가하기 위한 조건은 다음과 같았다:
애플리버셉트 샘플(5mM 소듐 포스페이트, 5mM 소듐 시트레이트 및 100mM 소듐 클로라이드를 포함하는 수성 완충 용액(pH 6.2) 중 애플리버셉트 재조합 단백질)을 6 g/ℓ의 농도로 진탕기 튜브에 스파이킹하였다.
다음 농도로 폐 CDM1에 첨가된 항산화제:
o 타우린 = 배양물의 10mM
o 하이포타우린 = 배양물의 10mM
o 글리신 = 배양물의 10mM
o 티옥트산 = 배양물의 0.0024mM
o 글루타티온, 환원 = 배양물의 2mM
o 하이드로코르티손 = 배양물의 0.0014mM
o 바이타민 C(아스코르브산) = 배양물의 0.028mM
여러 항산화제는 폐 배지에서 색상 형성을 감소시켰다: 하이포타우린, 타우린 및 글리신; 티옥트산; 및 바이타민 C. 글루타티온의 조합은 b* 값을 증가시켰다.
b* 값(CIE L*, a*, b* 색 공간)에 대한 다양한 항산화제의 예측된 효과의 요약은 도 28(A 내지 C)에 제시되어 있다.
애플리버셉트를 포함하는 폐 CDM에 스파이킹된 색상에 대한 항산화제 추가 첨가의 효과를 평가하였다. 10㎖의 작업 부피(CDM1)를 갖는 하나 이상의 50㎖의 통기 캡이 있는 진탕기 튜브를 7일 동안 인큐베이션하고, 제0일 및 제7일에 샘플을 취하였다.
폐 CDM1에 성분을 첨가하기 위한 조건은 다음과 같았다:
애플리버셉트 샘플(5mM 소듐 포스페이트, 5mM 소듐 시트레이트 및 100mM 소듐 클로라이드를 포함하는 수성 완충 용액(pH 6.2) 중 애플리버셉트 재조합 단백질)을 6 g/ℓ의 농도로 진탕기 튜브에 스파이킹하였다.
두 가지 DOE 실험을 실행하였다:
(i) 다음 농도로 폐 CDM1에 첨가된 항산화제:
o 타우린 = 배양물의 10mM
o 하이포타우린 = 배양물의 10mM
o 글리신 = 배양물의 10mM
o 티옥트산 = 배양물의 0.0024mM
o 바이타민 C(아스코르브산) = 배양물의 0.028mM
· (ii) 다음 누적 농도에 도달하기 위해 첨가된 항산화제:
o ATA = 2.5μM 내지 5μM
o 데페록사민 메실레이트(DFO) = 5μM 내지 10μM
o 카탈레이스 = 101.5 ㎎/ℓ
o S-카복시메틸-L-시스테인 = 10mM
하이포타우린은 폐 배지에서 색상 형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 28d). DFO도 또한 폐 배지에서 색상 형성을 상당히 감소시켰다(도 28d). 다른 항산화제는 색상 형성에 통계적인 영향을 미치지 않았다.
진탕 -플라스크 항산화제 연구:
타우린, 하이포타우린, 글리신, 티옥트산 및 바이타민 C를 개별적으로 및 조합하여 세포 배양에서 색상 형성을 감소시키는 능력에 대해 평가하였다(표 5-3).
250㎖의 진탕 플라스크에 애플리버셉트 생산 세포주의 시드 배양물을 접종하였다. 접종된 세포를 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 35.5℃에서 성장시켰다. 글루코스 및 기초 공급물을 필요에 따라 진탕 플라스크에 보충하였다. 금속이 CDM1에 0.5× 농도로 존재하고 시스테인이 6mM 내지 7mM의 누적 농도로 첨가되는 위에 기재된 과정을 사용하였다.
도 28e는 b* 값(CIE L*, a*, b* 색 공간) 및 최종 역가에 대한 표 5-3의 항산화제의 예측된 효과를 보여준다. 타우린, 하이포타우린, 글리신은 역가에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 b* 값을 상당히 감소시켰다.
실시예 6. CDM을 사용한 애플리버셉트 생산을 위한 글리코실화 및 생존능력 연구
생물반응기(예를 들어, 2ℓ)에 애플리버셉트 생산 세포주의 시드 배양물을 접종하였다. 접종된 배양물을 35.5℃의 온도, 7.1±0.25의 pH 및 22ccm의 공기 살포 설정점에서 성장시켰다. 글루코스, 소포제 및 기초 공급물을 필요에 따라 생물반응기에 보충하였다. CDM1(독점(proprietary))을 사용하여 애플리버셉트 단백질의 생산을 수행하였다. CDM1(독점), CDM2(시판) 및 CDM3(시판)을 사용하여 애플리버셉트 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포주의 생산을 수행하였다. 추가적인 배지 성분이 없는 CDM 1, CDM 2 및 CDM 3을 사용하여 한 세트의 실험을 수행하였다. 갈락토실화 프로파일을 변경하기 위해 공급물에 망가니즈(망가니즈 클로라이드 테트라하이드레이트, 시그마(Sigma), 3.2 ㎎/ℓ), 갈락토스(시그마, 8 g/ℓ) 및 우리딘(시그마, 6 g/ℓ)이 첨가된 CDM 1 내지 CDM 3을 사용하여 또 다른 실험 세트를 수행하였다. 마지막으로, 갈락토실화 프로파일을 변경하기 위해 공급물에 망가니즈(망가니즈 클로라이드 테트라하이드레이트, 시그마, 3.2 ㎎/ℓ), 갈락토스(시그마, 8 g/ℓ) 및 우리딘(시그마, 6 g/ℓ)이 첨가되고 조성물의 프로파일을 시알릴화하기 위해 공급물에 덱사메타손(시그마, 12 ㎎/ℓ)이 첨가된 CDM 1 내지 CDM 3을 사용하여 한 세트의 실험을 수행하였다. 각 CDM을 사용하여 정화된 수확물은 원심분리에 이어 0.45㎛ 여과에 의해 준비하였다.
N-글리칸 분석 전에 단백질 A에 의해 샘플을 처리하였다.
역가 측정
이들 실시예 전반에 걸쳐, 달리 언급되지 않는 한, 낮은 pH 및 280㎚에서 검출하는 단계 용리 구배로 작동하는 애질런트(Agilent, 캘리포니아 산타클라라 소재) 1200 시리즈 HPLC 또는 등가물을 사용하여 애플리버셉트 역가를 매일 측정하였다. 농도 참조 표준 보정 곡선에 대해 농도를 지정하였다.
생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존능력 값
이들 실시예 전반에 걸쳐, 달리 언급되지 않는 한, 생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존능력 값은 Nova BioProfile Flex 자동화 세포 계수기(노바 바이오메디칼(Nova Biomedical), 매사추세츠주 월섬 소재)를 통한 트리판 블루 배제를 통해 측정하였다. 글루코스, 락테이트, 오프라인 pH, 용존 산소(dissolved oxygen: DO), pCO2 측정 및 삼투압 농도를 Nova BioProfile Flex(노바 바이오메디칼, 매사추세츠주 월섬 소재)로 측정하였다.
N-글리칸 다당류 프로파일링
GlycoWorks Rapid 탈글리코실화 및 GlycoWorks RapiFluor-MS Label 키트(각각 워터스 부품 번호 186008939 및 186008091)를 사용하여 워터스 GlycoWorks 프로토콜에 따라 N-글리칸 분석을 위해 CDM 1 내지 CDM 3 수확물로부터 대략 15㎍의 단백질 A 처리된 샘플을 제조하였다. N-글리칸을 50.5℃에서 5분 동안 PNGase-F로 샘플을 처리하고, 이어서 25℃에서 5분 동안 냉각시켜 애플리버셉트 단백질로부터 제거하였다. 방출된 글리칸을 실온에서 5분 동안 반응시켜 RapiFluor-MS 형광 염료로 표지하였다. 반응 혼합물에 아세토나이트릴을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 2,204×g에서 10분 동안 원심분리를 통해 웰의 바닥에 펠릿화하였다. 표지된 글리칸을 포함하는 상청액을 수집하고, 칼럼 후 형광 검출과 함께 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(워터스 BEH 아마이드 칼럼)을 사용하여 UPLC에서 분석하였다. 칼럼에 결합한 후, 표지된 글리칸을 분리하고, 아세토나이트릴 및 수성 50mM 암모늄 폼에이트(pH 4.4)로 구성된 이원 이동상 구배를 사용하여 용리하였다. 265㎚의 여기 파장 및 425㎚의 방출 파장을 갖는 형광 검출기를 사용하여 표지된 글리칸을 검추랗였다. 생성된 크로마토그램에서 N-글리칸 피크의 상대 면적 백분율을 사용하여, N-글리칸 분포는 N-글리칸 (1) 코어 퓨코스 잔기를 포함하는 N-글리칸(총 퓨코실화, 표 6-1), (2) 적어도 하나의 시알산 잔기를 포함하는 N-글리칸(총 시알릴화, 표 6-2), (3) 만노스-5로 확인된 N-글리칸(만노스-5, 표 6-3), (4) 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 포함하는 N-글리칸(총 갈락토실화, 표 6-4) 및 (5) 알려진 동일성의 N-글리칸(총 확인된 피크, 표 6-5)의 총 백분율로 보고하였다.
결과
추가적인 성분이 있거나 없는 CDM 1 내지 CDM 3에 대한 생존 세포수(VCC), 생존능력 및 수확 역가 결과를 도 29 내지 도 31에 나타내었다.
9개의 배양물 중, 우리딘, 망가니즈 및 갈락토스를 포함하는 CDM1 배양물은 제12일(5.5 g/ℓ)에 가장 높은 역가를 나타내었다. 추가적인 성분이 없는 CDM1도 또한 다른 7개의 배양물과 비교하여 제12일(약 4.25 g/ℓ)에 높은 역가를 나타내었다(도 29).
세포 생존능력 결과는 공정 6일까지 다양한 조건에 걸쳐 유사하였다. 공정 7일 후, 추가적인 배지 성분이 있거나 없는 CDM2 및 CDM3 배양물은 약 90% 초과의 생존능력을 나타내었다(도 30).
우리딘, 망가니즈 및 갈락토스가 포함된 CDM1 배양물은 대략 제6일에 가장 높은 VCC를 나타내었다(도 31).
배양물 및 보충제의 영향은 전반적인 N-글리칸 분포에 상당한 영향을 미쳤다(표 6-1 내지 표 6-5). 대두 가수분해물을 사용하여 제조된 단백질 A 처리된 애플리버셉트(2개의 샘플이 평가됨)를 사용하여 글리칸 수준을 비교하였다. 총 확인된 피크는 표 6-5에 열거되어 있다.
다양한 CDM의 배양 제12일에 관찰된 총 퓨코실화, 총 시알릴화, 총 갈락토실화 및 만노스-5는 각각 42.61% 내지 46.26%, 30.84% 내지 39.14%, 59.02% 내지 66% 및 8.86% 내지 13.38%였다. 글리코실화에 대한 이러한 값은 대두 가수분해물을 사용하여 얻은 글리코실화 값과 상이하다.
마지막으로, 우리딘, 망가니즈 및 갈락토스가 보충된 CDM1, CDM2 및 CDM3에서 애플리버셉트를 발현하는 세포로부터 얻어진 정화된 수확물에 대해 색상 측정을 수행하였다. 생물반응기 연구 단계에 대한 작동 매개변수는 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
실시예 7. 항-VEGF 단백질의 친화성 생산
7.1 VEGF MiniTrap의 발현
재조합 VEGF MiniTrap(예를 들어, MT5, 서열번호 46)의 코딩 영역을 신호 서열에 작동 가능하게 연결하고, 포유동물 발현 벡터에서 클로닝하고, 차이니즈 햄스터 난소(CHO-K1) 세포에 형질감염시키고; 안정하게 형질감염된 풀을 12일 동안 400㎍/㎖의 하이그로마이신으로 선별한 후 단리하였다. 화학적으로 정의된 무단백질 배지에서 성장시킨 안정한 CHO 세포 풀을 사용하여 테스트를 위한 단백질을 생산하였다. 재조합 폴리펩타이드가 세포로부터 성장 배지에 분비되었다.
VEGF MiniTrap의 구성성분 도메인의 서열
인간 Flt1(등록 # NP_001153392.1)
인간 Flk1(등록 # NP_002244.1)
인간 Fc(IGHG1, 등록 # P01857-1)
이 과정으로부터 재조합 VEGF MiniTrap(MT5)을 얻었고, 추가로 처리하였다.
7.2 친화성 크로마토그래피 칼럼의 준비
VEGF MiniTrap(MT5)에 결합할 수 있는 5개의 별개의 단백질을 평가하였다. 사용된 단백질은 VEGF165(서열번호 72), mAb1(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 73은 중쇄이고 서열번호 74는 경쇄임); mAb2(마우스 항-VEGFR1 mAb 인간 IgG1, 여기서 서열번호 75는 중쇄이고 서열번호 76은 경쇄임); mAb3(마우스 항-VEGFR1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 77은 중쇄이고 서열번호 78은 경쇄임) 및 mAb4(마우스 항-VEGFR1 mAb 마우스 IgG1, 여기서 서열번호 79는 중쇄이고 서열번호 80은 경쇄임)를 포함한다.
1 ㎖/분을 초과하지 않는 유속으로 6 칼럼 부피(CV)의 1mM 얼음-냉각 염산으로 칼럼을 세척하여 칼럼을 활성화하였다. 각각 10㎎의 단백질을 3개의 HiTrap NHS-활성화 HP 친화성 칼럼(1㎖, 지이 헬스케어, Cat#17-0716-01)에 로딩하고, 칼럼을 폐쇄하여 실온에서 30분 동안 커플링이 일어나도록 하였다. 칼럼을 18 칼럼 부피의 0.5M 소듐 아세테이트, 0.5M NaCl(pH 4.0)로 세척하고, 개방 부위를 18 칼럼 부피의 0.5M Tris-HCl, 0.5M NaCl(pH 8.3)(세척은 다음 순서로 수행함: 6 칼럼 부피의 0.5M Tris-HCl, 0.5M NaCl(pH 8.3); 6 칼럼 부피의 0.5M 소듐 아세테이트(소듐 아세테이트: 제이티 베이커(JT Baker), Cat# 3470-01), 0.5M NaCl(pH 4.0); 6 칼럼 부피의 0.5M Tris(pH 8.3); 실온에서 30분 동안 칼럼을 인큐베이션함; 6 칼럼 부피의 0.5M 소듐 아세테이트 완충액, 0.5M NaCl(pH 4.0); 6 칼럼 부피의 0.5M Tris-HCl, 0.5 NaCl(pH 8.3) 및 6 칼럼 부피의 0.5M 소듐 아세테이트 완충액, 0.5M NaCl(pH 4.0))으로 차단하였다. 칼럼을 DPBS(pH 7.5)에 보관하였다. 평가된 5개의 칼럼을 칼럼 1(VEGF165 포함), 칼럼 2(mAb1 포함), 칼럼 3(mAb2 포함), 칼럼 4(mAb3 포함) 및 칼럼 5(mAb4 포함)로 설계하였다.
7.3 친화성 크로마토그래피를 사용한 MiniTrap의 생산
샘플 제조. MiniTrap에 대해 두 가지 상이한 생산 공정을 수행하였다. 한 경우에, MiniTrap 샘플을 포함하는 물질을 모 물질(MiniTrap)이 1× DPBS 완충액에 20 ㎎/㎖로 희석된 친화성 칼럼 각각을 사용하여 생성하였고, 이를 칼럼에 적용하고 실온에서 30분 동안 포함시켰다. 친화성 칼럼을 사용하여, MiniTrap 약 7000ppm의 HCP로부터 단리하였다.
대안적으로, 상청액에 0.4 ㎎/㎖의 단백질이 포함되고 상이한 친화성 칼럼(1 내지 5)에 개별적으로 로딩된 수확된 배양 상청액을 사용하였다. 추가 희석은 수행하지 않았다. 그런 다음, 친화성 칼럼을 9 CV의 1× DPBS 완충액으로 세척한 후 IgG 용리 완충액(pH 2.8)(써모, Cat#21009)으로 단백질을 용리하였다.
그런 다음, 위에 기재된 바와 같이 얻어진 MiniTrap 물질을 위의 부문 7.2에 기재된 바와 같이 준비된 칼럼 상에 로딩하기 전에 0.45㎛ 필터를 통해 여과하거나 또는 원심분리하였다. 대략 0.4 ㎎/㎖의 단백질을 포함하는 25㎖의 로딩 용액을 각 칼럼에 롤딩하고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 평형화를 위한 용리 전에 각 칼럼을 9 CV의 DPBS(인비트로젠(Invitrogen), Cat# 14190-144)로 세척하였다. 세척 분획에서 MT5의 양은 표 7-1에 나타나 있다. 세척 후 6 CV의 pH 2.8(상업용 용리 완충액, (써모, Cat#21009)) 및 100mM 글리신 완충액(pH 2.5)을 사용하여 용리하고, 1M Tris(pH 7.5)(인비트로젠, Cat# 15567-027)를 첨가하여 분획을 빠르게 중화시켰다. 용리된 분획에서 MiniTrap의 양도 또한 표 7-1에 나타나 있다.
MiniTrap(MT5)는 5개의 모든 친화성 칼럼으로부터 성공적으로 생산되었다. VEGF165가 포함된 칼럼으로부터의 수율이 mAb1 및 mAb2 칼럼에 비해 더 높았다. 인간화된 항-VEGFR1 mAb를 포함하는 mAb3 및 mAb4도 또한 mAb1 및 mAb2와 유사한 수율로 MT5의 성공적인 생산을 나타내었다. 표 7-1에서, 예상 수율은 100% 접합 효율 및 MT5에 대한 친화성-포획 단백질의 1:1 몰비에 기초하여 계산하였다.
7.4 칼럼 안정성 연구
부문 7.3에 논의된 방법에 따라 칼럼 1 및 칼럼 2를 사용하여 다중 실행을 수행하였다(칼럼 1의 경우 표 7-2 및 칼럼 2의 경우 표 7-3).
칼럼을 4℃에서 약 5주 동안 보관하였다. 유사한 양의 MT5를 각 생산으로부터 용리하였으며, 이는 우수한 칼럼 안정성을 보여주었다.
7.5 생산된 VEGF MiniTrap의 안정성 연구
3개의 칼럼(칼럼 1, 칼럼 2 및 칼럼 3)으로부터 용리된 분획의 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 샘플 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 샘플 완충액에 제조하고, 1× MES(Cat. No. NP0322, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 사용하여 4% 내지 12% 구배 NuPage 비스-Tris 겔 상에서 실행하였다.
웰에 (1) 분자량 표준, (2) 로딩 용액, (3) 칼럼 1로부터의 칼럼 세척액, (4) 칼럼 2로부터 용리된 분획, (5) 칼럼 1로부터 용리된 분획, (6) 칼럼 3으로부터 용리된 분획, (7) 1분 동안 pH 2.8에 보관된 MT5, (8) 30분 동안 pH 2.8에 보관된 MT5 및 (9) 분자량 표준을 로딩하였다(도 33 및 도 34). 분석은 3개의 모든 친화성 칼럼(칼럼 1 내지 칼럼 3)으로부터 용리된 분획으로부터 얻은 분획이 유사한 크기 프로파일을 나타내며, 친화성 칼럼의 사용이 MiniTrap을 불안정하게 하지 않음을 보여주었다.
7.6 숙주 세포 단백질 수준 계산
CHO HCP ELISA 키트 3G(F550)(사이구스 테크놀로지스(Cygus Technologies))를 사용하여 숙주 세포 단백질 농도의 표준 곡선을 얻었다(도 32 및 표 7-4).
로딩 용액 및 용리된 분획에서 HCP의 양을 도 32에 도시된 표준 곡선 및 표 7-4에 열거된 곡선 공식을 사용하여 계산하였다.
표준 곡선을 사용하여 총 HCP를 계산하고, 숙주 세포 단백질의 총량 차트를 도 35a에 나타내었다. 도 35b는 또한 칼럼 1, 2, 4 및 5로부터의 세척액 및 용리된 분획과 비교하여 로딩액 내 숙주 세포 단백질의 총량을 나타낸다. 칼럼을 사용하여 다중 실행을 수행하고, 도 35b에서 (#)는 분획이 평가된 실행을 나타낸다.
MiniTrap에 결합할 수 있는 단백질을 사용하는 친화성 포획의 사용은 HCP를 약 7000ppm에서 약 25ppm 내지 50ppm으로 효율적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 수율에 대해 관찰된 바와 같이, VEGF165가 포함된 칼럼은 mAb1 및 mAb2 칼럼에 의해 나타나는 것보다 HCP에서 더 높은 MiniTrap의 순도를 나타내었다.
7.7 친화성 생산 전과 후의 VEGF MiniTrap의 SEC 프로파일
3개의 칼럼 (칼럼 1 내지 칼럼 3)으로부터 용리된 분획의 SEC 프로파일을 로딩 용액에서 MiniTrap의 SEC 프로파일과 비교하였다. 도 36 및 표 7-5에서 알 수 있는 바와 같이, 친화성 생산 전과 후의 MT5의 SEC 프로파일은 매우 유사하였다.
7.8 mAb1, mAb2 및 VEGF 165 에 결합하는 VEGF MiniTrap 사전 및 사후 칼럼 샘플의 동역학
Biacore T200 기기를 사용하여 동역학 연구를 수행하였다.
칼럼 1과 칼럼 2로부터의 용리액 및 로딩 용액에서 MiniTrap에 결합하는 VEGF165에 대한 평형 해리 상수(Equilibrium dissociation constant)(KD 값)를 Biacore T200 기기를 사용하는 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 사용하여 결정하였다. 모든 결합 연구는 25℃에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20(pH 7.4)(HBS-ET) 실행 완충액에서 수행하였다. 먼저 MT5를 포획하기 위해 Biacore 센서 표면을 mAb1과 아민 커플링에 의해 유도체화하였다. 결합 연구의 만화적 표현은 도 37에 나타나 있다.
간단하게는, 칼럼으로부터의 용리액 및 로딩 용액을 HBS-EP(비아코어(Biacore)) 완충액으로 희석하고, 약 70RU의 포획 수준으로 고정된 단백질 매트릭스를 가로질러 주입하였다. 그런 다음, VEGF165를 50 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 등가 농도의 분석물을 처리되지 않은 참조 표면에 동시에 주입하여 벌크 굴절률 지수 배경을 빼기 위한 블랭크 센서그램으로 사용하였다. 25 ㎕/분으로 10mM 글리신을 5분 동안 2번 주입하는 사이클 사이에서 센서 칩 표면을 재생시켰다. 그런 다음, 운동 비율(kinetic rate) 매개변수를 결정하기 위해 BIA 평가 4.0.1 소프트웨어를 사용하여 생성된 실험적 결합 센서그램을 평가하였다. 각 샘플에 대한 데이터세트를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 피팅하였다. 이러한 연구를 위해, 최대 분석물 결합 용량(RU) 또는 Rmax 속성에 대해 국부적으로 피팅을 선택하면서 결합 및 해리 데이터를 Global Fit 분석 프로토콜에 따라 분석하였다. 이러한 경우에, 소프트웨어는 단일 해리 상수(kd), 결합 상수(ka) 및 친화도 상수(Kd)를 계산하였다. 평형 해리 상수는 KD=kd/ka이다. 동역학 온-속도(on-rate), 동역학 오프 속도(off rate) 및 전체 친화도를 0.03nM 내지 2nM 범위의 상이한 VEGF165 농도를 사용하여 결정하였다(표 7-6). 해리 반감기(t½)는 동역학 속도 상수(kinetic rate constant)로부터 t1/2 = ln(2)/60*Kd와 같이 계산하였다. 25℃에서 친화성 크로마토그래피 생산 전 및 후로부터 얻은 VEGF165에 대한 MT5의 결합 동역학 매개변수가 표 7-6에 나타나 있다.
친화성 크로마토그래피 단계의 효과(들)를 평가하기 위한 로딩 용액과 비교하여, 친화성 크로마토그래피에 의해 생성된 MT5에 대한 친화성(KD), 온 속도(ka, M-1s-1) 및 오프 속도(kd)는 상이한 샘플로부터의 MT5의 동역학에 변화가 없음을 보여주었다. VEGF MiniTrap 작제물의 SPR 센서그램이 도 38에 나타나 있다.
7.9 다중 생산 주기
7.3에 나타낸 바와 같이 칼럼 1(hVEGF165) 및 칼럼 2(mAb1)을 사용하여 단계 7.1에 의해 얻어진 수확물의 크로마토그래피 생산을 수행하였다. 칼럼은 여러 크로마토그래피 주기로 사용하였다. 칼럼의 수율은 추가의 실행으로 인해 크게 달라지지 않았으며, 이는 칼럼이 결합 능력을 유지하였음을 시사한다(표 7-7).
칼럼 1 및 칼럼 2에 대한 로딩 용액, 세척 분획 및 용리된 분획에서 HCP의 계산은 7.4에 기재된 방법을 사용하여 얻었다(도 39). 계산된 총 HCP는 칼럼을 반복적으로 사용해도 칼럼이 MiniTrap에 결합하는 능력을 감소시키지 않는 것으로 나타났다.
7.10 친화성 크로마토그래피 칼럼의 최적화
칼럼 1(VEGF165) 및 칼럼 2(mAb1)를 사용하여 부문 7.1에서 얻어진 수확 물질의 크로마토그래피 생성을 수행하였다. 최적화 연구를 위해, 10㎎ 대신 14㎎ 또는 45㎎의 VEGF165 또는 항-VEGFR1 mAb를 2개의 HiTrap NHS-활성화 HP 친화성 칼럼(1㎖, 지이 헬스케어)에 로딩하고, 칼럼을 밀폐하여 실온에서 30분 동안 커플링이 발생하도록 하였다. 칼럼 준비 및 MiniTrap을 포함하는 수확물의 생산은 위의 7.2 및 7.3에 논의된 바와 같이 수행하였다. 세척액 및 용리된 분획에서 MT5의 양은 표 7-8에 나타나 있다. 친화성 칼럼과 10㎎ 대신 14㎎ 또는 45㎎(VEGF165 또는 항-VEGFR1 mAb(mAb1))의 접합량과의 비교는 두 칼럼 모두에서 MiniTrap의 증가된 수율을 보여준다. 따라서, 설명된 방법을 사용하는 칼럼 수율은 단백질 대 칼럼 비를 최적화하거나 또는pH, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도 등을 변화시킴으로써 접합 효율을 증가시킴으로써 개선될 수 있다
7.11 친화성 크로마토그래피를 이용한 CEX의 사용
위의 부문 7.3에서 논의된 바와 같은 칼럼 1을 사용하여 MT5 발현으로부터의 세포 배양 샘플을 생성하였다. 얻어진 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼(HiTrap Capto S, 1㎖)에 적용하였다. 칼럼의 작동 조건은 표 7-9에 나타나 있다.
원래/출발 세포 배양 샘플, 친화성 크로마토그래피 칼럼 1 용리액 및 CEX 용리액에서 총 HCP는 각각 약 230,000 ng/㎖, 약 9,000 ng/㎖ 및 약 850 ng/㎖이었다. HCP 양을 위에 언급된 바와 같은 사이그누스의 CHO HCP ELISA 키트, 3G를 사용하여 정량적으로 결정하였다.
7.12 다른 항-VEGF 단백질을 생산하기 위한 친화성 크로마토그래피의 사용
다른 항-VEGF 단백질을 생산하는 능력을 연구하기 위해 칼럼 1을 평가하였다. 이 연구를 위해 애플리버셉트 및 VEGF 결합 가능성이 있는 scFv 단편을 사용하였다. 생산 과정은 부문 7.3에 논의된 바와 같이 수행하였다. 표 7-10은 칼럼 1이 다른 항-VEGF 단백질의 결합 및 용리에 성공하였음을 보여준다.
실시예 8. VEGF MiniTrap 작제물의 질량 분석법-기반 특성화
물질. VEGF MiniTrap(MT1)은 실시예 1에 기재된 바와 같이 애플리버셉트로부터 제조하였다. VEGF MiniTrap 5(MT5)는 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다. VEGF MiniTrap(MT6)은 다음 방법에 의해 제조하였다: 재조합 VEGF MiniTrap(MT5)이 코딩 영역을 신호 서열에 작동 가능하게 연결하고, 포유동물 발현 벡터에 클로닝하고, 차이니즈 햄스터 난소(CHO-K1) 세포에 형질감염시키고, 안정하게 형질감염된 풀을12일 동안 400 ㎍/㎖의 하이그로마이신으로 선택한 후 단리하였다. CDM에서 성장시킨 안정한 CHO 세포 풀을 사용하여 분석을 위한 단백질을 생산하였다.
8.1 당단백질의 탈글리코실화
MT1, MT2 및 MT3의 정화된 수확물로부터의 샘플을 희석하거나 또는 0.52 ㎎/㎖의 농도로 1%(w/v) RG 계면활성제(RapiGest SF, 워터스, 매사추세츠주 밀포드 소재) 및 50mM HEPES(pH 7.9)의 28.8㎕ 용액으로 재구성하였다. 이 용액을 대략 95℃로 2분에 걸쳐 가열하고, 50℃로 냉각시키고, 1.2㎕의 PNGase F 용액(GlycoWorks Rapid PNGase F, 워터스, 매사추세츠주 밀포드 소재)과 혼합하였다. 샘플을 50℃에서 5분 동안 인큐베이션하여 탈글리코실화를 완료하였다.
8.2 HILIC-형광-ESI-MS(MS/MS) 분석.
형광 및 질량 분석 검출과 조합한 HILIC 분리를 통해 MT1을 분석하였다. MT2 및 MT3은 HILIC만을 사용하여 분석하였다. 광다이오드 어레이 및 형광(FLR) 검출기가 장착되고 워터스 Synapt G2-S 질량 분석기(MS 조건)와 연결된 워터스의 2D Acquity UPLC를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 워터스 UPLC 글리칸 BEH 아마이드 칼럼, 150×2.1mM, 1.7㎛과 함께 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC) 분리 모드를 사용하였다. 칼럼 온도는 60℃로 설정하였고, 오토샘플러 온도는 5℃로 설정하였다. 주사 부피는 50㎕였다. 광다이오드 어레이 스캔 범위는 190㎚ 내지 700㎚였다. FLR은 RapiFluor-표지된 글리칸에 대해 여기 265㎚, 방출 425㎚ 및 글리코펩타이드에 존재하는 타이로신에 대해 여기 274㎚ 및 방출 303㎚로 설정하였다. 초기 유속은 100mM 암모늄 폼에이트(pH 4.4)로 구성된 이동상 A 및 아세토나이트릴인 이동상 B에서 0.4 ㎖/분이었다.
8.3 MS 조건
액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS) 실험은 워터스 Synapt G2-S 질량 분석기를 사용하여 수행하였다. 스캔 범위는 양성 및 음성 이온 모드 분석에 대해 질량-대-전하 비 100 내지 2400이었다. 스캔 시간은 1초였고, 글루-피브리노펩타이드 B는 교정제(calibrant)("잠금 질량(lock mass)")로 지속적으로 주입하였다(2 ㎕분). 모세관 전압은 2.5㎸, 공급원 온도는 120℃ 및 탈용매화 온도는 500℃로 설정하였다. 질소 분무기 가스 흐름은 700 l/h로 설정하였다.
8.4 고유한 SEC-MS
모든 온라인 SEC-MS 분석을 위해 ACQUITY UPLC I 클래스 시스템(워터스, 매사추세츠주 밀포드 소재)을 Q Exactive HF 하이브리드 사중극자-오비트랩 질량 분석기(써모 사이언티픽, 독일 브레멘 소재)에 연결하였다. ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼(200Å, 1.7㎛, 4.6×300㎜)을 30℃로 설정하고, 단백질 분리를 위해 사용하였다. 이동상은 100mM 암모늄 아세테이트(pH 6.8)였다. 각 분리는 0.3 ㎖/분의 유속으로 30분 동안 이루어졌으며, 주입량은 40㎍으로 설정하였다. 온라인 SEC-나노-ESI-MS 데이터 수집을 위해 다음 MS 매개변수를 사용하였다. 각 획득은 샘플 주입 직후 시작하여 25분이었다. 탈글리코실화된 샘플을 3㎸ 분무 전압, 200℃ 모세관 온도 및 70 S-렌즈 RF 수준으로 포지티브 모드에서 이온화하였다. 공급원 내 CID는 75eV로 설정하였다. 전체 MS 스캔은 m/z 2000 내지 8000 사이의 질량 범위에서 15K 소화능으로 획득하였다. 전체 MS 스캔을 위해 100㎳의 최대 주입 시간, 3e6의 자동 이득 제어 목표값 및 10 마이크로스캔을 사용하였다.
8.5 펩타이드 매핑
펩타이드 매핑을 위한 샘플 제조. 500 m㏖/ℓ의 다이티오트레이톨(DTT)을 5 m㏖/ℓ의 최종 농도로 첨가한 다음 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하여 환원을 달성하였다. 500 m㏖/ℓ의 아이오도아세트아마이드(IAM)를 10 m㏖/ℓ의 최종 농도로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하여 알킬화를 수행하였다. 제조업체의 지침에 따라 Zeba™ Spin 7 K MWCO 크기-배제 탈염 칼럼(P/N 89882)(써모 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬 소재)을 사용하여 변성 완충액을 소화 완충액(0.1 ㏖/ℓ Tris(pH 7.8) 중 1 ㏖/ℓ 우레아)으로 교환하였다. 재조합 돼지 트립신(시그마로부터 구입, Cat # 03708985001)을 1:18(효소: 샘플) 질량 비(완충액 교환 후 UV-Vis 분광 광도법에 의해 측정된 VEGF MiniTrap 단백질 농도 기준)로 첨가하고, VEGF MiniTrap 단백질의 농도를 0.5 ㎍/㎕로 조정하고, 실온에서 4시간 동안 인큐베이션 하는 동안 소화가 진행되도록 하였다. 소화가 완료되면, LC-MS 등급수 중 0.1% 폼산을 1:1 부피 비로 첨가하였다. 소화물을 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
트립신 소화 소화물의 LC-MS/MS 분석. 하나 이상의 2.5㎍(10㎕)의 펩타이드 소화물을 40℃로 설정된 항온 칼럼 오븐에 동봉된 C18 칼럼 로딩하였다. 주입을 위해 대기하는 동안 샘플을 7℃에서 유지하였다. 크로마토그래피 방법은 일정한 0.200 ㎖/분으로 설정된 유속으로 98% 이동상 A(물 중 폼산의 0.1% 부피 분획) 및 2% 이동상 B(아세토나이트릴 중 폼산의 0.1% 부피 분획)로 시작하였다. 10분 세척 후, 이동상 B 함량이 분당 0.39%의 속도로 증가하여 45% 이동상 B를 포함하는 최종 조성물에 도달하는 110분 구배에 걸쳐 펩타이드를 용리하였다. 다음 샘플 주입 전에, 칼럼을 97% 이동상 B로 15분 동안 세척한 후, 98% 이동상 A에서 25분 동안 평형화하였다. 용리액은 실행의 처음 1.5분과 마지막 5분 동안 폐기물로 전환되었다. 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리되는 펩타이드를 214㎚에서 UV 흡수에 의해 분석한 후, LTQ Orbitrap Elite 또는 Discovery XL에서 질량 분석법으로 분석하였다. 각각 3개의 탠덤 MS(MS/MS) 분석 및 하나의 MS-단독 분석을 포함시키기 위해 PS 8670 및 RM 8671 샘플에 대해 복제 펩타이드 매핑 데이터를 수집하였다. 펩타이드 확인을 위해, 실험의 한 주기가 300 m/z 내지 2000 m/z의 전체 MS 스캔 1회에 이어 해당 주기가 시작하는 MS 스캔에서 500의 최소 역치 카운트에서 검출된 첫 번째부터 다섯 번째까지 가장 강한 이온에 대해 수행된 5개의 순차적인 MS/MS 이벤트로 구성된 데이터-의존적 모드에서 MS/MS 분석을 수행하였다. 순차적 질량 분석법(MSn) AGC 표적은 마이크로스캔=3으로 1E4로 설정하였다. 일반 스캔 속도로 중심 모드에서 이온 트랩을 사용하여 MS/MS 단편을 분석하였다. 전체 MS 스캔을 고해상도 FTMS 분석기(R=30,000)를 사용하여 프로파일 모드에서 수집하였으며, 전체 스캔 AGC 표적은 1E6이고, 마이크로스캔=1이었다. 2Da의 단리 폭을 사용하여 MS/MS용 이온을 선택한 다음, 35의 정규화된 CID 에너지, 0.25의 활성화 Q 및 10msec의 활성화 시간을 사용하여 헬륨 가스와의 충돌 유도 해리(collision induced dissociation: CID)에 의해 단편화하였다. 디폴트 전하 상태는 z=2로 설정하였다. 데이터 의존적 질량은 전구체 이온이 30초 이내에 이벤트를 두 번 촉발한 경우 45초 동안 배제 목록에 배치하고; 배제 질량 폭은 ±1Da로 설정하였다. 할당되지 않은 전하 상태에 대해 전하 상태 거부가 활성화되었다. 거부 질량 목록에는 122.08 m/z, 185.94 m/z, 355.00 m/z, 371.00 m/z, 391.00 m/z, 413.30 m/z, 803.10 m/z, 1222.10 m/z, 1322.10 m/z, 1422.10 m/z, 1522.10 m/z, 1622.10 m/z, 1722.10 m/z, 1822.10 m/z 및 1922.10 m/z의 일반적인 오염물질이 포함되어 있다. TIC 비-환원 펩타이드 맵 및 환원 맵의 생성에 대해 MS-단독 분석을 수행하였다.
8.6 결과
VEGF MiniTrap 작제물의 구조. VEGF MiniTrap MT1, MT5 및 MT6의 구조는 도 40, 도 41, 도 43 및 도 44에 도시되어 있다.
SEC-MS를 사용한 초기 질량 분석은 탈글리코실화 후 온전한 단백질 수준에서 3개의 분자 모두의 동일성을 확인하였다(도 42). 고유한 SEC-MS 분석의 총 이온 크로마토그램(TIC)은 약 12분 내지 13분에서 온전한 VEGF MiniTrap 분자의 검출을 보여준다. TIC의 저분자량(LMW) 영역의 확장은 3개의 단백질 샘플 모두에서 LMW 불순물의 존재를 보여주었다.
VEGF MiniTrap에 대해 비권취된 질량 스펙트럼은 이량체인 MT1 및 MT5(도 43) 및 단일 사슬 단백질인 MT6(도 44)를 포함하는 샘플에 존재하는 주요 PTM의 설명을 위한 데이터를 제공하고, 이들의 동일성을 추가로 확인하였다.
MT1 샘플의 분석. MT1을 포함하는 샘플의 SEC-MS 분석의 TIC로부터 확인된 LMW 종을 추출하여 3개의 별개의 LMW 불순물 - LMW1, LMW2 및 LMW3을 조사하였다(도 45a 및 도 45b). LMW1 종은 애플리버셉트의 절단된 종으로 구성되었다. LMW2 종은 MiniTrap을 생성하기 위해 수행된 애플리버셉트의 절단 형태 샘플에 존재하는 Fc 불순물을 포함하였다. LMW3 종은 MT1(이량체) 분자로부터 절단될 수 있는 단량체를 포함하였다.
MT1 샘플은 MiniTrap 단백질을 형성하기 위해 애플리버셉트를 절단하는데 사용되었던 FabRICATOR 효소의 존재를 나타내지 않았다. 효소가 존재한다면, 약 11.5분 및 12.5분에 검출된다. MT1 샘플 SEC-MS 분석 동안 이러한 피크는 검출되지 않았다(도 46).
MT5 샘플의 분석. MT5를 포함하는 샘플의 SEC-MS 분석의 TIC로부터 확인된 LMW 종을 추출하여 2개의 별개의 LMW 불순물 - LMW1 및 LMW2의 존재를 조사하였다(도 47).
MT6 샘플의 분석. MT1을 포함하는 샘플의 SEC-MS 분석의 TIC로부터 확인된 LMW 종을 추출하여 3개의 별개의 LMW 불순물 - LMW1, LMW2 및 LMW3의 존재를 조사하였다(도 48). LMW2 종은 절단이 G4S 링커를 갖는 VEGF MiniTrap의 단편을 생성하는 MT6의 단편을 포함하였다. LMW5 종은 절단이 G4S 링커 직전 또는 직후에 절단이 발생한 MT6의 단편을 포함하였다.
MT6 샘플의 글리칸은 워터스 및 국립 바이오공정 연구교육센터(National Institute for Bioprocessing Research and Training)(아일랜드 더블린 소재)에 의해 개척된 글루코스 단위 값을 사용하여 HILIC 크로마토그래피 방법에서 질량 및 용리에 의해 확인되었다(도 49a 및 도 49b).
유리 티올 정량화. VEGF MiniTrap 작제물의 시스테인 잔기는 분자내 및 분자간 이황화결합(들)의 형성에 관여하거나 또는 유리 티올로서 존재할 수 있다. 펩타이드 및 단백질 내 황화물 결합의 존재는 단백질의 구조적 강성을 부여하는 것으로 나타났다. 티올은 다양한 시약 및 분리 기법에 의해 검출될 수 있다. 매우 낮은 수준의 유리 티올에 대한 세 가지 VEGF MiniTrap 작제물의 분석은 표 8-1에 나타나 있다.
삼황화물 정량화. VEGF MiniTrap 작제물의 Cys 잔기에서의 유리 티올과 유사하게, 삼황화물 결합은 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있다. 매우 낮은 수준의 유리 티올이 있는 조건하에 세 가지 VEGF MiniTrap 작제물의 분석은 표 8-2에 나타나 있다.
힌지 영역의 사슬내 이황화물. 힌지 영역의 잘못 짝지어진 이황화결합은 VEGF MiniTrap 작제물의 구조, 기능 및 안정성에 영향을 미칠 수 있다. VEGF MiniTrap 작제물[THTC*PPC*PAPELLG, C*는 사슬내 황화물 결합이 형성될 수 있는 위치를 보여줌]의 힌지 영역에서 매우 낮거나 없는 사슬내 이황화결합에 대한 세 가지 VEGF MiniTrap 작제물의 분석은 표 8-3에 나타나 있다.
교차 및 평행 이황화연결 이성질체 정량화. 힌지 영역에서 평행한 이황화 결합에 의해 연결된 이량체인 MT1 및 MT5의 경우, 힌지 영역의 이황화결합이 교차될 수 있는 이성질체의 가능성이 있다(도 50).
평행 대 교차의 이황화 결합 유형의 정량화는 MT2 재조합으로 발현된 단백질이 FabRICATOR 소화된 분자인 MT1과 비교하여 Fc 힌지 영역에서 약간 더 높은 수준의 교차 이황화브리지를 가짐을 보여주었다(표 8-4).
번역 후 변형(PTM).
세 가지 VEGF MiniTrap 작제물 모두에서 PTM의 평가는 유사한 수준의 PTM을 나타내었다(표 8-5). 석신이미드를 형성하기 위해 Asn84에서 관찰된 탈아마이드화는 약 3.1% 내지 3.2%의 범위였고, 아스파르트산/아이소 아스파르트산을 형성하기 위해 관찰된 탈아마이드화는 18.9% 내지 21.9%였다. 여러 메티오닌 잔기(예를 들어, Met10, Met 20m Met163 및 Met192)의 산화는 세 가지 VEGF MiniTrap 작제물 모두에 대해 약 0.7% 내지 6.8%의 범위에서 관찰되었다. MT1 및 MT5과는 달리 링커를 포함하는 MT6은 링커(예를 들어, Met245 및 Met255)에 대한 추가적인 메티오닌 잔기의 산화를 보여주었다. MT1 및 MT5에서 C-말단 글리신(Gly211)의 약 0.1% 및 2.0%는 글리신 손실을 나타내었다. 이는 C-말단 글리신이 결여되어 있는 MT6에서는 관찰되지 않았다.
고급 글리코실화 최종 생성물 변형은 라이신 및 아르기닌 글리코실화와 관련된다. VEGF MiniTrap 작제물의 글리코실화는 구조 및 기능을 변경하여 항-VEGF 활성을 손상시킬 수 있다.
3개의 모든 VEGF MiniTrap 작제물의 변형의 평가는 유사한 수준을 나타내었다(표 8-6).
변형된 부위. 부문 8.4에 따라 온전한 질량 분석에 의해 설명되는 바와 같이 VEGF MiniTrap 작제물의 변형된 부위를 부문 8.5에 설명된 바와 같은 환원된 펩타이드 매핑을 사용하여 확인 및 정량화되었다(표 8-7). 부위 T90N91의 펩타이드 서열 TNYLTHR에서 **는 아스파라긴이 절단 후 아스파르트산으로 전환되었음을 나타내는 반면, 부위 N99T100의 펩타이드 서열 QTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEK에서 *는 트립신에 의한 높은 수준의 비특이적 절단을 나타낸다. 이들 2개의 절단 부위는 MT1 및 MT5의 평가 동안 LMW 종 불순물을 형성하는 것으로 밝혀졌다. M245Y246의 절단은 고유한 링커가 있으며 MT3 제조 동안 LMW2 종 불순물의 원인이 되는 MT3에서만 발견되었다.
글리코사이트 점유 정량화. N-글리코실화는 일반적인 PTM이다. N-글리칸 거대이질성(macroheterogeneity)(글리코실화 부위 점유) 및 미세이질성(부위-특이적 글리칸 구조)을 포함하는 부위-특이적 N-글리코실화의 특성화는 당단백질 생합성 및 기능의 이해에 중요하다. 글리코실화의 정도는 단백질이 발현되는 방식에 따라 달라질 수 있다. N36에서 글리코실화의 수준은 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에 대해 유사하였다(표 8-8 및 도 51). 유사하게는, N68에서 글리코실화의 수준도 또한 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에 대해 유사하였다(표 8-8 및 도 52). N123에서 글리코실화의 수준도 또한 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에 대해 유사하였지만(표 8-8 및 도 53), 만노스-5는 MT1 제조물에서 상승된 것으로 밝혀졌다. VEGF MiniTrap 작제물의 경우, Asn196에서의 글리코실화는 MT1과 비교하여 MT5 및 MT6에 대해 더 낮았다(표 8-8 및 도 54). 추가적으로, 만노스-5도 또한 MT4 및 MT6 제조물보다 MT1 제조물에서 더 상승하였다.
N-글리칸의 분석. N36에서의 글리코실화는 표 8-9에 나타나 있다. G2F, G2FS, G2FS2가 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에서 발견되는 주요 N-글리칸이었다. 표 8-10에 나타나 있는 N68에서의 글리코실화의 경우, G2F 및 G2FS가 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에서 발견되는 주요 N-글리칸이었다. N123에서의 글리코실화에 대해 표 8-11에 나타나 있으며, G2F 및 G2S가 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에서 발견되는 주요 N-글리칸이었으며, 만노스-5가 MT5 및 MT6과 비교하여 MT1에서 높은 수준으로 검출되었다. N196에서의 글리코실화에 대해 표 8-12에 나타나 있으며, G2, G2S, G2S2가 세 가지 VEGF MiniTrap 모두에서 발견되는 주요 N-글리칸이었으며, 만노스-5가 MT5 및 MT6과 비교하여 MT1에서 높은 수준으로 검출되었다.
MT3에 대한 링커의 O-글리칸. MT3에 대한 O-글리칸을 연구하기 위해 MT3에 대한 GS 링커를 평가하였다. O-자일로실화가 MT3의 GS 링커에 위치한 세린 잔기에서 발견되었다(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR, 밑줄친 세린 잔기는 글리코실화됨). O-글리칸의 조성은 표 8-13에 나타나 있다.
HILIC-FLR-MS 분석. 부문 8.2에 설명된 바와 같이 모든 VEGF MiniTrap 단백질에 대해 HILIC-FLR-MS 분석을 수행하였다. 분석은 MT5 및 MT6에 대한 N-연결된 글리칸은 유사하지만 MT1에 대해 얻은 것과는 상이함을 보여주었다(도 55는 전체 규모 및 누적 크로마토그램을 보여주고, 도 56은 전체 규모 및 중첩 크로마토그램을 보여주며, 도 57은 전체 규모, 누적 및 정규화 크로마토그램을 보여줌).
마지막으로, 세 가지 VEGF MiniTrap 단백질 모두에 대한 글리코실화 백분율 및 상세한 글리칸 확인 및 정량화는 각각 표 8-14 및 도 58a 내지 도 58c에 열거되어 있다. 모든 글리칸 분석에서 관찰된 바와 같이, MT5 및 MT6에 대한 글리코실화 프로파일 및 만노스 수준은 유사하였지만, MT1과는 상이하다.
실시예 9. 상류 배지 및 공급물 공정 최적화를 사용한 생산 및 색상 정량화
(A) 최적화되지 않은 CDM(대조군 생물반응기)
실시예 5에 기재된 MiniTrap의 제조를 이용하였다.
연구 단계에 대한 작동 매개변수는 당업자에게 알려진 바와 같다.
제0일의 배지 = CDM1 및 하기 영양소, 항산화제 및 금속을 포함함:
시스테인은 8mM 내지 9mM의 누적 농도로 첨가되었다.
시작 배지의 금속은 아래에 1× 농도로 열거되어 있다(농도는 접종물 첨가 전임):
o Fe = 배양 리터당 68 내지 83 마이크로몰
o Zn = 배양 리터당 6 내지 7 마이크로몰
o Cu = 배양 리터당 0.1 내지 0.2 마이크로몰
o Ni = 배양 리터당 0.5 내지 1 마이크로몰
MT1 수확시, 도 59에 나타낸 바와 같은 생산 절차를 따랐다. 크로마토그래피에 대한 작동 매개변수는 당업자에게 공지되어 있다. 친화성 포획(도 59의 단계 3), 친화성 통과액(도 59의 단계 5), AEX(도 59의 단계 8) 및 HIC(도 59의 단계 9)에 대한 작동 매개변수는 표 9-1에 요약되어 있다. 친화성 포획 및 여과 단계 후 애플리버셉트의 단백질 소화성 절단을 실시예 1.2에 요약된 절차를 사용하여 수행하였다.
표 9-2는 다양한 크로마토그래피 단계를 수행하여 얻은 풀의 색상 정량화를 보여준다. 5 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는 풀로부터의 샘플을 사용하여 색상 정량화를 수행하였다.
친화성 포획 풀은 친화성 포획 단계(도 59의 단계 3)의 수행시에 수집된 용리액을 지칭한다. 효소 풀은 효소적 절단 단계(도 59의 단계 4)의 수행시에 수집된 통과액을 지칭한다. 친화성 통과액 풀은 친화성 통과 단계(도 59의 단계 5)의 수행시에 수집된 통과액을 지칭하며, 친화성 통과 용리액은 친화성 통과 단계(도 59의 단계 5)의 수행시에 수집된 용리액을 지칭한다. AEX 풀 및 AEX 스트립은 음이온 교환 크로마토그래피 단계(도 59의 단계 8)의 수행시에 얻은 통과액 및 스트리핑된 분획을 지칭한다. HIC 풀은 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계(도 59의 단계 9)의 수행시에 수집된 통과액을 지칭한다.
표 9-2에서 볼 수 있는 각 단계는 착색의 감소를 보여준다(풀의 b* 값의 감소에서 관찰됨). 예를 들어, 친화성 통과액 크로마토그래피의 수행시, 통과 분획은 2.16의 b* 값을 갖는다(친화성 포획 단계로부터 수집된 통과액에 대해 2.52의 b* 값으로 감소). AEX 분리후 통과액 및 세척액은 b* 값이 2.16에서 0.74로 감소하는 것으로 관찰된 바와 같이 착색을 더 감소시켰다. 예상대로, AEX 칼럼을 스트리핑하면 b* 값(8.10 대 0.74로)에서 알 수 있듯이 AEX 분리 후 통과액 및 세척액으로부터의 착색보다 상당히 더 진한 황갈색 색상을 갖는 샘플이 생성되었다. 마지막으로, HIC 단계는 색상의 추가 감소를 제공하였다(b* 값은 28.5 g/ℓ의 단백질 농도에서 HIC 풀에 대해 얻어진 b* 값에서 5 g/ℓ의 단백질 농도에 대해 정규화될 수 있음).
(B) 최적화된 CDM(낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기)
착색에 대한 시스테인의 농도 감소, 금속의 농도 감소 및 항산화제 증가의 효과를 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다:
제0일의 배지 = CDM1
o 시스테인은 5mM 내지 6 mM의 누적 농도로 첨가되었다.
항산화제는 하기 누적 농도에 도달하도록 CDM1에 첨가하였다(농도는 접종물 첨가 전임):
o 타우린 = 배양물의 10mM
o 글리신 = 배양물의 10mM
o 티옥트산 = 배양물의 0.0024mM
o 바이타민 C(아스코르브산) = 배양물의 0.028mM
시작 배지의 금속은 아래에 1× 수준으로 열거되어 있다.
o Fe = 배양 리터당 68 내지 83 마이크로몰
o Zn = 배양 리터당 6 내지 7 마이크로몰
o Cu = 배양 리터당 0.1 내지 0.2 마이크로몰
o Ni = 배양 리터당 0.5 내지 1 마이크로몰.
o 배지에 대해 위에 언급된 농도의 0.25× 농도를 사용한 모든 금속의 감소를 포함.
MT1 샘플의 수확시, 도 59에 나타낸 바와 같은 생산 절차를 따랐다. 크로마토그래피에 대한 작동 매개변수는 당업자에게 공지되어 있다. 친화성 포획, 친화성 통과액 및 HIC에 대한 작동 매개변수는 표 9-1에 요약되어 있다. 실시예 1.2에 요약된 절차를 사용하여 친화성 포획 및 여과 단계 후 애플리버셉트의 단백질 소화성 절단을 수행하였다.
표 9-3은 다양한 크로마토그래피 단계의 수행시에 얻어진 풀의 색상 정량화를 보여준다. 5 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는 풀로부터의 샘플을 사용하여 색상 정량화를 수행하였다. 표 9-3에서 볼 수 있는 단계는 표 9-2의 단계에 대해 볼 수 있는 것과 유사한 생산을 제공하였다.
표 9-2 및 표 9-3을 비교하면, "낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기 조건"은 "대조군 생물반응기 조건"(2.52의 b* 값)과 비교하여 친화성 포획 풀(1.77의 b* 값)에서 색상이 더 낮았음이 분명하다.
MT가 표 9-2 및 표 9-3에 열거된 단계를 사용하여 형성된 농도가 160 g/ℓ인 MT 샘플은 "낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기 조건"의 경우 b* 값이 13.45이고, "대조군 생물반응기 조건"의 경우 b* 값이 17.45인 것으로 예측되었다. 색상의 23%의 감소는 상류 배지 및 공급물의 최적화를 통해 달성되었다. 유사하게는, MT가 표 9-2 및 표 9-3에 열거된 단계를 사용하여 형성된 농도가 110 g/ℓ인 MT 샘플은 "낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기 조건"의 경우 b* 값이 9.25이고, "대조군 생물반응기 조건"의 경우 b* 값이 12인 것으로 예측되었다.
각 생산 단위 작업이 색상 감소에 어떻게 기여하는지 이해하기 위해, 친화성 포획 풀의 색상의 백분율로서 각 생산 공정 중간체에 대한 b* 값을 계산하였다(표 9-4).
AEX 단위 작업은 최대의 색상 감소(b*의 1.08 내지 1.42 변화)를 제공하는 반면, HIC 단위 작업은 약간의 추가 색상 감소(b*의 0.08 내지 0.19 변화)를 제공한다. 전체적으로 평가된 단위 작업은 친화성 포획 풀에 존재하는 색상의 76.3% 내지 78.2%를 제거한다.
"대조군 생물반응기 조건" 및 "낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기 조건"에 대한 다양한 생산 공정 중간체의 색상을 또한 각각 표 9-5 및 표 9-6에 나타낸 바와 같이 질량 분석법에 의해 측정된 프로테이스 소화에 의해 생성된 올리고펩타이드에서의 2-옥소-히스티딘의 백분율 및 옥소-트립토판의 백분율에 대해 연구하였다. 펩타이드 매핑은 실시예 3에 논의된 바와 같이 수행하였다.
표 9-5를 참조하면, 상이한 생산 단계에서 풀의 히스티딘 산화 수준을 비교할 때, 형성된 MT에 대한 히스티딘 산화 수준의 백분율의 상대적 존재비가 생산 공정이 진행됨에 따라 풀에서 감소하는 것이 분명하다. 예를 들어, "대조군 생물반응기 조건"에서 H209의 경우, 히스티딘 산화 수준의 백분율은 효소적 절단 풀에 대해 0.062였고, 이는 AEX 통과액에 대해 0.029로 감소되었으며, HIC 풀에 대해 0.020으로 추가로 감소되었다. 유사하게는, "낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기 조건"에서 H209의 경우, 히스티딘 산화 수준의 백분율은 효소적 절단 풀에 대해 0.039였고, 이는 AEX 통과액에 대해 0.023으로 감소되었으며, HIC 풀에 대해 0.016으로 추가로 감소되었다. 따라서, 생산 전략은 MT에서 히스티딘 산화 수준의 백분율을 감소시켰다. 착색이 감소됨에 따라, 샘플에서 일부 산화된 잔기의 존재도 또한 감소되었다. 히스티딘 산화와 유사하게, 트립토판 산화 수준을 "대조군 생물반응기 조건" 및 "낮은 시스테인, 낮은 금속 및 증가된 항산화제 생물반응기 조건" 모두에 대해 상이한 생산 단계에서 풀에 대해 추적하였다(표 9-6).
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-VEGF PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING THE SAME <130> WO2021112926 <140> PCT/US2020/046834 <141> 2020-08-18 <150> US 62/944,635 <151> 2019-12-06 <150> US 63/065,012 <151> 2020-08-13 <160> 103 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 2 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 3 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 4 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 5 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 6 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 7 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 8 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 9 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 10 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 11 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 11 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 12 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 13 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 13 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 14 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 14 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 15 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 15 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 16 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 16 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 17 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 18 Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 19 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 1 5 10 15 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 20 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 20 Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser 1 5 10 15 Lys His Gln His Lys 20 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 21 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 1 5 <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 22 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 23 Val His Glu Lys Asp Lys 1 5 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 24 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 26 Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 1 5 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr 1 5 10 15 Lys <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Ile Ile Trp Asp Ser Arg 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 29 Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser 1 5 10 15 Lys <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 30 Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 32 Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace="Pro" <220> <221> VARIANT <222> (173)..(173) <223> /replace="Thr" <220> <221> SITE <222> (1)..(227) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 33 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 34 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 34 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp 100 <210> 35 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 35 Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr 1 5 10 15 Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile 20 25 30 Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly 35 40 45 Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala 50 55 60 Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly 65 70 75 80 His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr 85 90 <210> 36 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 1 5 10 15 Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp 20 25 30 Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val 35 40 45 Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu 50 55 60 Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr 65 70 75 80 Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe 85 90 95 Val Arg Val His Glu Lys 100 <210> 37 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 37 Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro 20 25 30 Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His 35 40 45 Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg 50 55 60 Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu 65 70 75 80 Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro 85 90 95 Gly <210> 38 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro 20 25 30 Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr 35 40 45 Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp 50 55 60 Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Lys Ser Glu Lys 65 70 75 80 Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro 85 90 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 39 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 40 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 41 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 42 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 45 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 46 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 210 215 220 <210> 47 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 47 Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His 1 5 10 15 Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro 35 40 45 Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser 50 55 60 Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val 65 70 75 80 Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn 85 90 95 Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser 100 105 110 Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn 115 120 125 Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His 130 135 140 Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met 145 150 155 160 Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp 165 170 175 Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys 180 185 190 Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Asn Leu Ser Val Ala Phe Gly 195 200 205 Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg 210 215 220 Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His 245 250 255 Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr 260 265 270 Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val 275 280 285 Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr 290 295 300 Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 305 310 315 <210> 48 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 48 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys 210 <210> 49 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 49 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 <210> 50 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 50 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 <210> 51 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 51 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg 225 230 235 240 Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr 245 250 255 Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile 260 265 270 Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly 275 280 285 Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala 290 295 300 Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly 305 310 315 320 His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile 325 330 335 Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly 340 345 350 Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly 355 360 365 Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys 370 375 380 Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys 385 390 395 400 Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly 405 410 415 Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser 420 425 430 Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys 435 440 <210> 52 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 52 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly 210 215 220 Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met 225 230 235 240 Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn 245 250 255 Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp 260 265 270 Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn 275 280 285 Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn 290 295 300 Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr 305 310 315 320 Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val 325 330 335 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 340 345 350 Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys 355 360 365 Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 370 375 380 Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln 385 390 395 400 Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn 405 410 415 Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys 420 425 <210> 53 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 53 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro 245 250 255 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 260 265 270 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 275 280 285 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 290 295 300 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 305 310 315 320 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 325 330 335 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 340 345 350 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 355 360 365 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 370 375 380 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 385 390 395 400 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 405 410 415 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 420 425 430 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 435 440 445 Phe Val Arg Val His Glu Lys 450 455 <210> 54 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 54 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe 260 265 270 Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly 275 280 285 Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val 290 295 300 Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg 305 310 315 320 Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr 325 330 335 Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu 340 345 350 Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp 355 360 365 Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 370 375 380 Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp 385 390 395 400 Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val 405 410 415 Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu 420 425 430 Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr 435 440 445 Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe 450 455 460 Val Arg Val His Glu Lys 465 470 <210> 55 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 55 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Met Trp Tyr Val Asp Gly Ser Ser Val Glu Val His 260 265 270 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 290 295 300 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 305 310 315 320 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 325 330 335 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 340 345 350 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 355 360 365 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 370 375 380 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 385 390 395 400 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 405 410 415 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 420 425 430 Gly Lys <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 56 Ile Ile Trp Asp Ser Arg 1 5 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 57 Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 58 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 1 5 10 15 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 20 <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 59 Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser 1 5 10 15 Lys His Gln His Lys 20 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 60 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 61 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 62 Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 63 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 1 5 10 15 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 20 <210> 64 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 64 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 65 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 65 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 66 Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 67 Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr 1 5 10 15 Lys <210> 68 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 68 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 69 Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 70 Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 71 Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg 1 5 10 <210> 72 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 72 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe 115 120 125 Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser 130 135 140 Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys 145 150 155 160 Asp Lys Pro Arg Arg 165 <210> 73 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 74 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Thr Thr Ser Gln Asp Ser Asn Asn Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Ala Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 75 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 76 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 76 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ser Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 77 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 290 295 300 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 305 310 315 320 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 340 345 350 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 355 360 365 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 405 410 415 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 420 425 430 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 78 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Thr Thr Ser Gln Asp Ser Asn Asn Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Ala Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 79 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 210 215 220 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 290 295 300 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 305 310 315 320 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 340 345 350 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 355 360 365 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 405 410 415 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 420 425 430 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 80 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 80 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ser Asn Lys Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 195 200 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 81 Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 82 Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg 1 5 <210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 83 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 84 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 84 Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala 1 5 10 15 Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys 20 <210> 85 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (26)..(26) <223> /replace=" " <220> <221> SITE <222> (1)..(26) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 85 Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys 20 25 <210> 86 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> /replace=" " <220> <221> SITE <222> (1)..(28) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 86 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Thr His 1 5 10 15 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 20 25 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 87 Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 88 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 88 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 1 5 10 15 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 20 <210> 89 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 89 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 90 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 90 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 91 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 91 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 35 40 45 His Met Thr Glu Gly Arg 50 <210> 92 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 92 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 35 40 45 His Met Thr Glu Gly Arg 50 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 93 Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 94 Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr 1 5 10 15 Lys <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 95 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 96 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 96 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 1 5 10 15 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys 20 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 97 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 1 5 <210> 98 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 98 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile 35 40 45 His Met Thr Glu Gly Arg 50 <210> 99 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 99 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg 20 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace=" " <220> <221> SITE <222> (1)..(12) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 100 Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys 1 5 10 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace=" " <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 101 Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace=" " <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 102 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace=" " <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 103 Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg 1 5

Claims (24)

  1. 폴리펩타이드로서, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 포함하는 상기 단리된 아미노산 서열을 갖되, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 IdeS는 제외하는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단리된 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 상기 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 80%의 서열 동일성을 갖되, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 IdeS는 제외하는, 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단리된 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 상기 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 90%의 서열 동일성을 갖되, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 IdeS는 제외하는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 갖는 표적 단백질을 단편으로 절단할 수 있되, 적어도 하나의 단편은 상기 Fc 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 절단 인식 부위는 글리신-글리신을 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 표적 단백질은 애플리버셉트(aflibercept)인, 폴리펩타이드.
  7. 제4항에 있어서, 상기 단편은 Fab 단편 및 Fc 단편을 포함하는, 폴리펩타이드.
  8. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  9. 제8항의 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산 분자는 숙주 세포에서 발현을 지시할 수 있는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는, 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인, 벡터.
  12. 단리된 핵산 분자로서, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하되, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 IdeS는 제외하는, 단리된 핵산 분자.
  13. 단리된 아미노산으로서, 아스파라긴 잔기가 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에서 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이된 서열번호 1로 정의되는 모(parental) 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 아미노산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 아미노산은 아스파르트산, 류신 또는 아르기닌인, 단리된 아미노산.
  15. 제13항에 있어서, 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에서 상기 아스파라긴 잔기는 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이되는, 단리된 아미노산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 아미노산은 아스파르트산, 류신 또는 아르기닌인, 단리된 아미노산.
  17. 제15항에 있어서, 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에서 상기 아스파라긴 잔기는 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이되는, 단리된 아미노산.
  18. 제17항에 있어서, 상기 아미노산은 아스파르트산, 류신 또는 아르기닌인, 단리된 아미노산.
  19. 제13항에 있어서, 87번, 130번, 182번 및/또는 274번 위치에서 상기 아스파라긴 잔기는 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이되는, 단리된 아미노산.
  20. 제19항에 있어서, 상기 아미노산은 아스파르트산, 류신 또는 아르기닌인, 단리된 아미노산.
  21. 제13항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  22. 제21항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 분자는 숙주 세포에서 발현을 지시할 수 있는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는, 벡터.
  24. 제22항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인, 벡터.
KR1020227002042A 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법 KR20220035393A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237036668A KR20230152810A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962944635P 2019-12-06 2019-12-06
US62/944,635 2019-12-06
US202063065012P 2020-08-13 2020-08-13
US63/065,012 2020-08-13
PCT/US2020/046834 WO2021112926A1 (en) 2019-12-06 2020-08-18 Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237036668A Division KR20230152810A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220035393A true KR20220035393A (ko) 2022-03-22

Family

ID=76210828

Family Applications (12)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237044978A KR20240005222A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002043A KR20220038349A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237036668A KR20230152810A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002039A KR102519234B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237044969A KR20240007293A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002038A KR102619866B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237044758A KR20240005206A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002040A KR20220038062A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002041A KR102519236B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237010912A KR20230051297A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002042A KR20220035393A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237010909A KR20230051296A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법

Family Applications Before (10)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237044978A KR20240005222A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002043A KR20220038349A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237036668A KR20230152810A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002039A KR102519234B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237044969A KR20240007293A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002038A KR102619866B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237044758A KR20240005206A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002040A KR20220038062A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020227002041A KR102519236B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
KR1020237010912A KR20230051297A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237010909A KR20230051296A (ko) 2019-12-06 2020-08-18 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법

Country Status (18)

Country Link
US (31) US11186625B2 (ko)
EP (6) EP3906249A1 (ko)
JP (11) JP2022547651A (ko)
KR (12) KR20240005222A (ko)
CN (6) CN114206907A (ko)
AU (12) AU2020396490C1 (ko)
BR (6) BR112022001016A2 (ko)
CA (4) CA3159586A1 (ko)
CO (6) CO2021018192A2 (ko)
IL (16) IL288355B2 (ko)
MX (10) MX2022006758A (ko)
MY (12) MY190624A (ko)
NZ (6) NZ781137A (ko)
PE (6) PE20221790A1 (ko)
SG (6) SG11202110964QA (ko)
TW (6) TW202128743A (ko)
WO (7) WO2021112925A1 (ko)
ZA (3) ZA202107647B (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021112925A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
WO2022234412A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Lupin Limited A process for purification of fc-fusion proteins
WO2023039457A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A high-throughput and mass-spectrometry-based method for quantitating antibodies and other fc-containing proteins
WO2023137143A1 (en) * 2022-01-14 2023-07-20 Shattuck Labs, Inc. Methods of contaminant removal from protein isolates
WO2023230486A2 (en) * 2022-05-23 2023-11-30 Inhalon Biopharma, Inc. Compositions and methods for inhalable therapeutics
WO2024114799A1 (zh) * 2022-12-01 2024-06-06 信达生物制药(苏州)有限公司 三特异性融合蛋白及其用途

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1522343A (en) 1923-05-02 1925-01-06 Thom Clarence Magnetic separator
US4534972A (en) 1983-03-29 1985-08-13 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
DE3871206D1 (de) 1987-03-24 1992-06-25 Grace W R & Co Basisnaehrmedium fuer eine zellkultur.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
US20030108545A1 (en) 1994-02-10 2003-06-12 Patricia Rockwell Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist
WO1996006641A1 (en) * 1994-08-29 1996-03-07 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
EP1482031B1 (en) 1996-08-30 2015-10-28 Life Technologies Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
SE519827C2 (sv) 1998-03-30 2003-04-15 Viranative Ab Näringsmedium innehållande metionin samt användning av detta
US7306799B2 (en) 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US7303746B2 (en) 1999-06-08 2007-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating eye disorders with modified chimeric polypeptides
CA2376379C (en) 1999-06-08 2007-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US6833349B2 (en) 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7396664B2 (en) 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
AU2669501A (en) * 1999-11-30 2001-06-12 Smithkline Beecham Plc New use
EE05458B1 (et) 2000-05-26 2011-08-15 Bristol-Myers Squibb Company CTL4 lahustuvad mutantsed molekulid ja nende kasutamine
WO2002066603A2 (en) 2001-02-15 2002-08-29 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
US20040236072A1 (en) 2001-04-13 2004-11-25 Olmsted Stephen Bruce Surface proteins of streptococcus pyogenes
US20030087372A1 (en) 2001-06-13 2003-05-08 Genentech, Inc. Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells
GB0130228D0 (en) 2001-12-18 2002-02-06 Hansa Medica Ab Protein
US8777906B1 (en) 2002-01-24 2014-07-15 Robin Scott Gray Syringe with inspection window
AU2003303394B2 (en) 2002-12-23 2009-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
CN100537751C (zh) 2004-05-12 2009-09-09 华东理工大学 一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
AU2005302516A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
EP1877438A2 (en) 2005-02-02 2008-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a vegf inhibitor
CA2995971A1 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations
CA2611646C (en) 2005-06-09 2015-08-11 Hansa Medical Ab Use of the ides proteinase (from s. pyogenes) for treating autoimmune diseases and graft rejection
GB0511769D0 (en) * 2005-06-09 2005-07-20 Hansa Medical Ab Treatment
CN1778903A (zh) 2005-09-29 2006-05-31 华东理工大学 一种动物细胞高密度连续灌注培养方法
CN101360820A (zh) 2006-01-04 2009-02-04 巴克斯特国际公司 无寡肽的细胞培养基
CN100502945C (zh) 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
JP5216002B2 (ja) 2006-06-16 2013-06-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 硝子体内投与に適したｖｅｇｆアンタゴニスト製剤
AU2007272957B2 (en) 2006-07-13 2014-05-01 Wyeth Llc Production of glycoproteins
US20100267932A1 (en) * 2006-08-28 2010-10-21 Alex Eon-Duval Process for the purification of fc-fusion proteins
ES2533964T5 (es) 2006-09-10 2024-05-09 Glycotope Gmbh Uso de células humanas de origen leucémico mieloide para expresión de anticuerpos
KR20090074040A (ko) 2006-09-13 2009-07-03 아보트 러보러터리즈 세포 배양의 개선
US10259860B2 (en) * 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
US20100113294A1 (en) 2007-04-16 2010-05-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Defined glycoprotein products and related methods
US20100221823A1 (en) 2007-06-11 2010-09-02 Amgen Inc. Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production
CA2697091A1 (en) 2007-08-31 2009-03-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Glycosylation profile analysis
CA2709029A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Bianca Eser Stability testing of antibodies
WO2010013502A1 (ja) 2008-07-31 2010-02-04 国立大学法人京都大学 不飽和ポリエステル樹脂とミクロフィブリル化植物繊維を含有する成形材料
JP2012503487A (ja) 2008-09-26 2012-02-09 シェーリング コーポレイション 高力価抗体の製造
EP2435577A4 (en) 2009-05-26 2016-04-13 Momenta Pharmaceuticals Inc GLYCOPROTEIN PRODUCTION
RU2522002C2 (ru) 2009-06-26 2014-07-10 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
BR112012002151B1 (pt) 2009-07-31 2021-07-06 Baxalta GmbH método para expressar uma desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina (adamts)
CN104744560A (zh) * 2009-10-20 2015-07-01 Abbvie公司 使用蛋白a亲和色谱法分离和纯化抗-il-13抗体
EP2325296A1 (en) 2009-11-20 2011-05-25 LEK Pharmaceuticals d.d. Production of glycoproteins with low N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) content
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
EP3763379A1 (en) 2011-01-13 2021-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders
CN102653729B (zh) 2011-03-04 2014-07-16 上海赛金生物医药有限公司 一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基
WO2012140487A1 (en) 2011-04-11 2012-10-18 Cellcura Asa Protein-free culture media products for manufacturing viral-based vaccines
MY169935A (en) 2011-04-29 2019-06-18 Biocon Biologics India Ltd "a method for reducing heterogeneity of antibodies and a process of producing the antibodies thereof"
RU2592680C2 (ru) 2011-04-29 2016-07-27 Биокон Рисерч Лимитед Способ снижения накопления лактата при культивировании и способ получения антитела
CN107090040A (zh) 2011-05-27 2017-08-25 艾伯维生物技术有限公司 Dac hyp组合物和方法
US9096648B2 (en) 2011-08-19 2015-08-04 Emd Millipore Corporation Methods of reducing level of one or more impurities in a sample during protein purification
WO2013054250A1 (en) * 2011-10-10 2013-04-18 Dr Reddy's Laboratories Limited Purification method
US9364542B2 (en) * 2011-10-28 2016-06-14 Excelse Bio, Inc. Protein formulations containing amino acids
US20130281355A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
CN102757496B (zh) * 2012-06-07 2014-06-18 山东泉港药业有限公司 一种抗vegf抗体片段的纯化制备方法
AU2012101678B4 (en) * 2012-07-03 2013-01-24 Novartis Ag Use of device
WO2014015098A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. A method of normalizing biological samples
AU2013298521A1 (en) * 2012-08-02 2015-02-26 Sanofi Article of manufacture comprising aflibercept or ziv-aflibercept
US9206390B2 (en) 2012-09-02 2015-12-08 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
EP2722673B1 (en) * 2012-10-17 2017-07-12 Hexal AG Improved method of mapping glycans of glycoproteins
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US8956830B2 (en) 2013-03-14 2015-02-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US20140271622A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
CN103146648A (zh) 2013-03-14 2013-06-12 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
EP2968495B1 (en) * 2013-03-15 2019-07-03 Daniel J. Capon Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
SG11201507367PA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Genentech Inc Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production
CN103773732B (zh) 2013-06-08 2016-05-11 李锋 一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺
WO2014204933A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Adamas Pharmaceuticals, Inc. Amantadine compositions and methods of use
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015058369A1 (en) 2013-10-23 2015-04-30 Sanofi (China) Investment Co., Ltd. Use of aflibercept and docetaxel for the treatment of nasopharyngeal carcinoma
KR20230136616A (ko) 2014-02-04 2023-09-26 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온교환 크로마토그래피의 용도
CN104073464A (zh) 2014-07-08 2014-10-01 西藏天虹科技股份有限责任公司 一种cho细胞无血清培养基及其制备方法
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
GB201502306D0 (en) * 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
GB201502305D0 (en) * 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
EP3268389B1 (en) * 2015-03-12 2020-09-30 Medimmune, LLC Method of purifying albumin-fusion proteins
KR101867134B1 (ko) * 2015-03-23 2018-06-12 한양대학교 산학협력단 포유류 세포를 이용하여 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법
EP3736326B1 (en) 2015-04-01 2023-05-10 Boehringer Ingelheim International GmbH Cell culture medium
CN105002242A (zh) 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
TW202330904A (zh) * 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
ES2913530T3 (es) 2015-08-12 2022-06-02 Novartis Ag Métodos para tratar trastornos oftálmicos
EP3375873A4 (en) * 2015-10-22 2019-05-22 Protenova Co., Ltd. POLYPEPTIDE BINDING TO IMMUNOBLOBULINS
RU2734958C2 (ru) * 2015-11-18 2020-10-26 Формикон Аг Предварительно заполненная фармацевтическая упаковка, содержащая жидкий состав на основе антагониста vegf
BR112018010005A2 (pt) 2015-11-18 2018-11-21 Formycon Ag seringa pré-carregada, e, kit
CN105368808B (zh) * 2015-11-30 2019-04-30 苏州康聚生物科技有限公司 一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用
HUE063377T2 (hu) 2015-12-22 2024-01-28 Regeneron Pharma Anti-PD-1 antitestek és bispecifikus anti-CD20/anti-CD3 antitestek kombinációja a rák kezelésére
EA201891495A1 (ru) 2015-12-22 2018-11-30 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Биспецифические анти-cd20/анти-cd3 антитела для лечения острого лимфобластного лейкоза
EP3196646B1 (en) * 2016-01-19 2019-12-18 Hexal AG Methods of mapping protein variants
EP3407868A1 (en) 2016-01-26 2018-12-05 Formycon AG Liquid formulation of a vegf antagonist
EP3436473A4 (en) 2016-03-29 2019-10-23 Navya Biologicals Pvt. Ltd. PROCESS FOR PURIFYING FC FUSION PROTEINS
KR101685532B1 (ko) * 2016-04-26 2016-12-13 한국프라임제약주식회사 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질
CN106279412A (zh) * 2016-09-12 2017-01-04 广东东阳光药业有限公司 一种抗vegf类单克隆抗体的纯化方法
US10941208B2 (en) 2016-09-23 2021-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-MUC16 antibodies
EA201990781A9 (ru) 2016-09-23 2019-11-27 Анти-steap2 антитела, конъюгаты антитело-лекарственное средство и биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают steap2 и cd3, и их применение
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
CN109937034B (zh) * 2016-11-21 2022-09-16 济世-伊沃泰克生物制品有限公司 阿柏西普制剂及其用途
CA3047530A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Serum Institute Of India Private Limited Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulationsobtained thereof
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US10941178B2 (en) * 2017-03-17 2021-03-09 Gilead Sciences, Inc. Method of purifying an antibody
KR101861163B1 (ko) 2017-04-26 2018-05-25 삼천당제약주식회사 안과용 약학 조성물
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
JP7097433B2 (ja) * 2017-08-17 2022-07-07 ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド 宿主細胞ガレクチンおよび他の夾雑物からグリコシル化タンパク質を精製する方法
EP3697449A1 (en) * 2017-10-18 2020-08-26 REGENXBIO Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
CN111356471A (zh) * 2017-11-20 2020-06-30 济世发展生物药业有限公司 包含赖氨酸盐作为张力调节剂的阿柏西普制剂及其用途
CN109929038B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法
CN109929027B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法
US11426446B2 (en) 2018-03-08 2022-08-30 Coherus Biosciences, Inc. Stable aqueous formulations of aflibercept
US11667702B2 (en) * 2018-03-08 2023-06-06 Coherus Biosciences, Inc. Stable aqueous formulations of aflibercept
CA3093699A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
US11103552B2 (en) 2018-05-10 2021-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration VEGF receptor fusion protein containing formulations
WO2020102740A2 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Spark Therapeutics, Inc. Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
EP3917951A1 (en) 2019-01-30 2021-12-08 Amgen, Inc Aflibercept attributes and methods of characterizing and modifying thereof
WO2020229584A1 (en) 2019-05-16 2020-11-19 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
KR102286892B1 (ko) * 2019-07-08 2021-08-06 삼천당제약주식회사 안과용 단백질 제제의 정제방법
WO2021112925A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023171771A (ja) 2023-12-05
US20230331812A1 (en) 2023-10-19
MY193354A (en) 2022-10-06
US20240067701A1 (en) 2024-02-29
MY190686A (en) 2022-05-10
EP3931303A1 (en) 2022-01-05
US20230272044A1 (en) 2023-08-31
US20220033471A1 (en) 2022-02-03
US11732025B2 (en) 2023-08-22
MY193355A (en) 2022-10-06
JP2022548818A (ja) 2022-11-22
US11548932B2 (en) 2023-01-10
CA3172631C (en) 2024-01-02
AU2020396490A1 (en) 2021-10-28
WO2021112928A1 (en) 2021-06-10
BR112021025432A2 (pt) 2022-06-21
IL296863A (en) 2022-11-01
AU2020397865A1 (en) 2021-10-28
PE20221791A1 (es) 2022-11-25
JP2024026116A (ja) 2024-02-28
US11286290B2 (en) 2022-03-29
PE20221789A1 (es) 2022-11-25
MY193349A (en) 2022-10-06
IL296863B2 (en) 2023-10-01
TW202128743A (zh) 2021-08-01
US20220009997A1 (en) 2022-01-13
US20230357357A1 (en) 2023-11-09
IL288355B2 (en) 2023-03-01
IL296864A (en) 2022-11-01
IL296893A (en) 2022-12-01
IL296863B1 (en) 2023-06-01
KR20240005206A (ko) 2024-01-11
AU2020397803A1 (en) 2021-10-28
AU2020396490C1 (en) 2023-04-27
CA3172631A1 (en) 2021-06-10
US11542317B1 (en) 2023-01-03
KR20220038062A (ko) 2022-03-25
EP3906250A1 (en) 2021-11-10
IL288352B2 (en) 2023-03-01
IL302921A (en) 2023-07-01
IL288351B2 (en) 2024-05-01
IL296512B2 (en) 2023-12-01
ZA202107647B (en) 2022-03-30
US20230041349A1 (en) 2023-02-09
IL304390A (en) 2023-09-01
AU2023201589A1 (en) 2023-04-06
WO2021112924A1 (en) 2021-06-10
KR20240005222A (ko) 2024-01-11
IL288367B (en) 2022-10-01
US20210206832A1 (en) 2021-07-08
US11186625B2 (en) 2021-11-30
IL288360B2 (en) 2023-09-01
EP3906249A1 (en) 2021-11-10
IL288355B (en) 2022-11-01
KR20220038348A (ko) 2022-03-28
SG11202110958QA (en) 2021-10-28
MY190625A (en) 2022-04-27
US11505593B2 (en) 2022-11-22
US20220009998A1 (en) 2022-01-13
IL288352A (en) 2022-01-01
AU2020398830B2 (en) 2022-12-15
CO2021018192A2 (es) 2022-01-17
TW202128991A (zh) 2021-08-01
BR112021025769A2 (pt) 2022-04-12
AU2020398547A1 (en) 2021-10-28
US11459373B2 (en) 2022-10-04
MX2023005421A (es) 2023-05-23
JP2022550930A (ja) 2022-12-06
NZ781145A (en) 2023-05-26
US11299532B2 (en) 2022-04-12
US20220227836A1 (en) 2022-07-21
US12012445B2 (en) 2024-06-18
IL296893B2 (en) 2024-05-01
KR20220038349A (ko) 2022-03-28
AU2020397865B2 (en) 2022-12-15
CN114206907A (zh) 2022-03-18
JP2024009949A (ja) 2024-01-23
US11753459B2 (en) 2023-09-12
KR102519234B1 (ko) 2023-04-10
AU2023201748A1 (en) 2023-06-01
US11407813B2 (en) 2022-08-09
JP2024009950A (ja) 2024-01-23
US11440950B2 (en) 2022-09-13
IL288360A (en) 2022-01-01
MY190624A (en) 2022-04-27
NZ781143A (en) 2023-05-26
CN114206925A (zh) 2022-03-18
IL288351B1 (en) 2024-01-01
AU2023201586A1 (en) 2023-04-13
US20230235019A1 (en) 2023-07-27
CA3129193A1 (en) 2021-06-10
BR112021025359A2 (pt) 2022-06-21
WO2021112929A1 (en) 2021-06-10
WO2021112927A1 (en) 2021-06-10
WO2021112926A1 (en) 2021-06-10
US20210371501A1 (en) 2021-12-02
AU2020398830C1 (en) 2023-04-27
AU2020398125C1 (en) 2023-05-11
US20220048975A1 (en) 2022-02-17
PE20221261A1 (es) 2022-08-16
MY193351A (en) 2022-10-06
MX2022006759A (es) 2023-01-30
IL309491A (en) 2024-02-01
IL288352B (en) 2022-11-01
IL288351A (en) 2022-01-01
US20220033472A1 (en) 2022-02-03
US20230068199A1 (en) 2023-03-02
US11485770B2 (en) 2022-11-01
EP3906302A1 (en) 2021-11-10
JP2022548197A (ja) 2022-11-17
CA3172625A1 (en) 2021-06-10
ZA202107646B (en) 2022-03-30
JP2022552052A (ja) 2022-12-15
AU2020397803C1 (en) 2023-05-11
US11958894B2 (en) 2024-04-16
MX2022006788A (es) 2022-07-11
EP3906303A1 (en) 2021-11-10
CN114401994A (zh) 2022-04-26
ZA202107644B (en) 2022-03-30
AU2020398547B2 (en) 2022-12-22
CN114206914A (zh) 2022-03-18
WO2021112923A1 (en) 2021-06-10
AU2023201588A1 (en) 2023-04-13
CO2021018214A2 (es) 2022-01-17
CA3129193C (en) 2022-10-04
US20220235116A1 (en) 2022-07-28
US11472861B2 (en) 2022-10-18
US20220098280A1 (en) 2022-03-31
AU2020398830A1 (en) 2021-10-28
MY193353A (en) 2022-10-06
IL288357B (en) 2022-11-01
EP3931204A1 (en) 2022-01-05
AU2020397865C1 (en) 2023-04-27
IL296893B1 (en) 2024-01-01
MY190626A (en) 2022-04-27
IL302538A (en) 2023-07-01
IL288355A (en) 2022-01-01
CO2021018203A2 (es) 2022-01-17
MX2022011973A (es) 2022-11-09
JP2022547651A (ja) 2022-11-15
US20210214733A1 (en) 2021-07-15
US20210171570A1 (en) 2021-06-10
AU2020398547C1 (en) 2023-05-11
IL288367A (en) 2022-01-01
IL296864B1 (en) 2023-06-01
SG11202110964QA (en) 2021-10-28
MY190623A (en) 2022-04-27
US11098311B2 (en) 2021-08-24
BR112021025438A2 (pt) 2022-06-21
MY190627A (en) 2022-04-27
US20220162289A1 (en) 2022-05-26
KR20230152810A (ko) 2023-11-03
NZ781137A (en) 2023-05-26
US11098112B2 (en) 2021-08-24
NZ781142A (en) 2023-05-26
US20220009999A1 (en) 2022-01-13
TW202128744A (zh) 2021-08-01
CO2021018234A2 (es) 2022-01-17
SG11202110972UA (en) 2021-10-28
US11104715B2 (en) 2021-08-31
US20210284684A1 (en) 2021-09-16
IL288357B2 (en) 2023-03-01
US20210171605A1 (en) 2021-06-10
TW202122417A (zh) 2021-06-16
IL288367B2 (en) 2023-02-01
IL296512B1 (en) 2023-08-01
WO2021112925A1 (en) 2021-06-10
SG11202110955VA (en) 2021-10-28
JP2023179531A (ja) 2023-12-19
AU2020397803B2 (en) 2022-12-15
US20230119662A1 (en) 2023-04-20
MX2021014862A (es) 2022-09-27
IL288357A (en) 2022-01-01
KR102619866B1 (ko) 2024-01-04
SG11202110953UA (en) 2021-10-28
AU2020398125B2 (en) 2022-12-15
NZ781138A (en) 2023-05-26
US20220389081A1 (en) 2022-12-08
AU2020396490B2 (en) 2022-12-15
US20220275054A1 (en) 2022-09-01
CN114206924A (zh) 2022-03-18
MX2021014863A (es) 2022-09-28
US12012444B2 (en) 2024-06-18
AU2023201585A1 (en) 2023-04-13
CO2021018181A2 (es) 2022-01-17
MX2023014077A (es) 2023-12-11
MY193350A (en) 2022-10-06
US20210214430A1 (en) 2021-07-15
KR20230051297A (ko) 2023-04-17
KR20220041083A (ko) 2022-03-31
MX2022006760A (es) 2023-01-30
MX2022006758A (es) 2023-01-30
US20220127331A1 (en) 2022-04-28
CO2022000660A2 (es) 2022-01-28
US11459374B2 (en) 2022-10-04
IL288360B1 (en) 2023-05-01
AU2023201590A1 (en) 2023-04-13
TW202128745A (zh) 2021-08-01
PE20221770A1 (es) 2022-11-11
US11053280B2 (en) 2021-07-06
AU2020398125A1 (en) 2021-10-28
TW202134256A (zh) 2021-09-16
CN114423783A (zh) 2022-04-29
KR20220038347A (ko) 2022-03-28
US11180540B2 (en) 2021-11-23
KR102519236B1 (ko) 2023-04-10
SG11202110968VA (en) 2021-10-28
US11174283B2 (en) 2021-11-16
MX2022012042A (es) 2022-10-27
US11535663B2 (en) 2022-12-27
NZ781136A (en) 2023-05-26
KR20240007293A (ko) 2024-01-16
BR112021025158A2 (pt) 2022-06-21
BR112022001016A2 (pt) 2022-08-16
IL296864B2 (en) 2023-10-01
KR20230051296A (ko) 2023-04-17
US11649273B2 (en) 2023-05-16
US20220396608A1 (en) 2022-12-15
PE20221790A1 (es) 2022-11-25
US11505594B2 (en) 2022-11-22
CA3159586A1 (en) 2021-06-10
US11306135B2 (en) 2022-04-19
US20210206833A1 (en) 2021-07-08
PE20221788A1 (es) 2022-11-25
IL309560A (en) 2024-02-01
US20220227835A1 (en) 2022-07-21
JP2022547652A (ja) 2022-11-15
IL301888A (en) 2023-06-01
IL296512A (en) 2022-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102619866B1 (ko) 항-vegf 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법
RU2785994C1 (ru) Белковые композиции против vegf и способы их получения

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
AMND Amendment
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X601 Decision of rejection after re-examination
A107 Divisional application of patent
J201 Request for trial against refusal decision