JP2005525370A - 血管内皮増殖因子受容体のアンタゴニストを併用して行う腫瘍の増殖を阻害する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体のアンタゴニストを化学療法薬、放射線及び/又は異なる増殖因子受容体のアンタゴニストと併用して腫瘍を治療する方法を目的とするものである。
血管新生は、胎児及び成人の生物体の既存の血管から毛細血管が生成することであるが、腫瘍の増殖、生存及び転移の重要な要素であることが分かっている。上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、酸性及び塩基性の繊維芽細胞増殖因子(aFGF及びbFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)並びに血管内皮増殖因子(VEGF)を含む増殖因子類とそれらの受容体は、腫瘍の血管新生に役割を演じていると考えられている(Klagsbrun & D’Amore, Annual Rev. Physiol., 53:217-239(1991)参照)。これらの増殖因子が、それらの細胞表面受容体に結合するとその受容体の活性化が誘発され、その結果情報伝達経路が開始されそして改変されて細胞が増殖し分化する。VEGFすなわち内皮細胞特異的マイトジェンは、上記因子の中で、内皮細胞の増殖を特異的に促進することによって血管新生誘発因子として作用する点で異なっている。
本発明は、VEGF受容体アンタゴニスト及び別の受容体アンタゴニストの組合わせの有効量を投与することによって哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。また本発明は、VEGF受容体のアンタゴニスト及び放射線の組合わせの有効量を投与することによって哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。さらに本発明は、VEGF受容体のアンタゴニスト及び科学療法薬の組合わせの有効量を投与することによって哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。
本発明は、VEGF受容体アンタゴニストを放射線、化学療法及び/又は追加の受容体アンタゴニストと併用して哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。
VEGF受容体のアンタゴニストと併用する放射線源は、治療される患者の外部又は外部にあってもよい。放射線源が患者の外部にある場合、その治療法は外部ビーム放射線療法(EBRT)として知られている。放射線源が患者の内部にある場合、その治療法は近距離照射治療法(BT)と呼称されている。
化学療法薬には腫瘍の増殖を阻害するのに有効なすべての化学化合物が含まれている。
本発明に関連して使用できる(VEGF受容体のアンタゴニスト以外の)増殖因子受容体アンタゴニストには、増殖因子受容体リガンドによる増殖因子受容体の刺激作用を阻害するすべての物質が含まれている。かような刺激作用の阻害によって増殖因子受容体を発現する細胞の増殖が阻害される。
1712参照)。
一実施態様で、VEGF受容体のアンタゴニストが、VEGF受容体の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。そのVEGF受容体の細胞外ドメインはリガンド結合ドメインである。そのリガンド結合ドメインは前記受容体の一方の末端に見られるが、通常アミノ末端に見られる。
本発明の抗体は当該技術分野で知られている方法で製造できる。これらの方法としては、Kohler and Milstein, Nature,256:495-497(1975);Burdon et al.,編集「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」Volume 13(Elsevier Science Publishers,Amusterdam(1985))におけるCampbellの論文「Monoclonal Antibody Technology,The Production and Characteriization of Rodent and Human Hybridomas」及びHuse et al., Science, 246:1275 -1281 (1989)に記載の組換えDNA法に説明されている免疫学的方法がある。
さきに考察した抗体又は抗体の機能均等物に加えて、本発明に有用な受容体アンタゴニストは、特に上記治療法に関連する他の生体分子や小分子でもよい。
内皮細胞又は腫瘍細胞などの非内皮細胞の試料中のVEGF受容体の活性化の中和は、生体内又は生体外で行うことができる。VEGF受容体を発現する細胞の試料中のVEGF受容体のVEGFによる活性化の中和は、細胞を本発明のアンタゴニスト例えば抗体と接触させることからなっている。生体外では、細胞を、アンタゴニスト例えば抗体と、VEGFを細胞の試料に添加する前、添加と同時に又は添加後に接触させる。
本発明のアンタゴニストを使用し、アフィニティークロマトグラフィー(Dean et al.,Affinity Chromatography:A Practical Approach,IRL Press, Arlington,VA(1985))などの従来の方法を利用してVEGF受容体を単離し精製することができる。当該技術分野でよく知られている他の方法としては、抗体でコートされた磁気ビーズによる磁気分離法、固体マトリックスに結合された抗体による「パニング法」及びフローサイトメトリーがある。
本発明のアンタゴニストを使用し、アフィニティークロマトグラフィー(Dean,P.D.G. et al.,Affinity Chromatography:A Practical Approach,IRL Press, Arlington,VA(1985))などの従来の方法を利用してflk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-2)陽性腫瘍細胞すなわちflk-1(VEGFR-2)受容体を発現する腫瘍細胞を単離し精製することができる。当該技術分野でよく知られている他の方法としては、抗体でコートされた磁気ビーズによる磁気分離法、抗体に複合された補体などの細胞傷害剤、固体マトリックスに結合された抗体による「パニング法」及びフローサイトメトリーがある。
本発明のアンタゴニスト例えば抗体を使用し、当該技術分野で知られている標準検定法と方法を利用して生物試料中のVEGF又はVEGF受容体の生体外又は生体内でのレベルを監視することができる。生物試料のいくつかの例としては血液などの体液がある。標準検定法では、例えば抗体に標識をつけ次いで当該技術分野で周知の放射線免疫検定法などの標準免疫検定法を実施する。
本発明の受容体アンタゴニストは、腫瘍の進行例えば腫瘍の増殖、侵襲、転移及び/又は再発を予防し、阻害し又は減少させるのに十分な量で腫瘍に冒されている患者に投与して治療することができる。これを達成するのに十分な量は治療上有効な投与量とし定義されている。この用途に有効な量は、疾患の重篤度及び患者自身の免疫系の一般状態に左右される。投与計画も疾患の状態と患者の状態によって変わり一般に単一大型丸薬の投与又は連続注入から一日当たり複数回(例えば4〜6時間毎)の投与までの範囲内であり、又は治療医及び患者の症状によって指示される。しかし本発明は特定の投与法に限定されないことに留意すべきである。
本発明は、治療するのに有効な量のEGFRアンタゴニスト及び治療するのに有効な量のVEGFRアンタゴニストを含有する腫瘍増殖阻害用のキットも含んでいる。本発明のキットのEGFR又はVEGFRのアンタゴニストは適切なアンタゴニストであればよく、その例は先に述べてある。本発明のキットのEGFRアンタゴニストは、好ましくはEGFRに対し特異的な抗体又はその機能均等物で構成されている。あるいは及び好ましくは本発明のキットのEGFRアンタゴニストはEGFRに対し特異的な小分子で構成されている。本発明のキットのVEGFRアンタゴニストは、好ましくはVEGFRに対し特異的な抗体又はその機能均等物で構成されている。あるいは及び好ましくは本発明のキットのVEGFRアンタゴニストはVEGFRに対し特異的な小分子で構成されている。その上、本発明のキットはさらに抗新生物剤を備えていてもよい。本発明に関連する適切な抗新生物剤の例は本願に記載されている。本発明のキットはさらにアジュバントを備えていてもよくその例は本願に記載されている。
NIH3T3細胞を、the American Type Culture Collection(米国メリーランド州ロックビル)から入手した。3T3細胞に、キメラ受容体のマウスflk-1 (VEGFR-2)/ヒトfmsをトランスフェクトすることによって、C441細胞系を構築した。10A2は、キメラ受容体のヒトfms/マウスFLK-2を含有する3T3トランスフェクタントであり、その単離と特性決定はDosil et al.,Mol. Cell. Biol.,13:6572-6585(1993)に記載されている。細胞は、例によって10%の仔ウシ血清(CS)、1mMのL-グルタミン、抗体、及び600μg/mlのG418(米国ミズーリ州セントルイス所在のSigmaのGeneticin)を補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DME)内に保持した。
実施例 II-1. ラット抗マウスflk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体DC-101(IgG1)。
Lewisラット(Charles River Labs)を、マウスflk-1:SEAP可溶性受容体、ウサギ抗アルカリホスファターゼポリクローナル抗体及びプロテインGセファローズビーズからなる免疫複合体で高度免疫化をおこなった。これら動物にこの複合体を3ヶ月間にわたって7回(0、14、21、28、49、63、77日目に)腹腔内に注射した。いくつもの時点で、これら動物の尾静脈から採血し次いでmflk-1(VEGFR-2):SEAPsに高力価で結合する免疫血清をELISAでスクリーニングした。最後の注射をしてから5日後にラットを殺し脾臓を無菌状態で取り出した。脾細胞を洗浄しカウントし次にマウス骨髄腫細胞系NS1と2:1の比率で融合させた。ハイブリドーマをHAT培地内で選択し次にmflk-1(VEGFR-2):SEAPsと特異的に結合するがSEAPタンパク質と結合しないコロニーをELISA法でスクリーニングした。陽性ハイブリドーマの数を限界希釈法で3回エキスパンドさせてクローン化した。さらにDC-101と命名した一つのサブクローンの特性決定を行った。
マウス抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体(Mab)は、DC-101に採用したのと類似のプロトコルを利用して製造した。簡単に述べると、抗-SEAP-プロテイン/Aセファロース複合体又はトランスフェクトされたNIH3T3細胞のならし培地由来の小麦胚芽凝集素セファロースに結合されたflk-1(VEGFR-2)/SEAP可溶性受容体の複合体をマウスに注射した。マウスは、6ヶ月にわたって定期的に間隔を置いて高度免疫を行った。免疫脾臓細胞をプールしてマウス骨髄腫細胞系NSIに融合させた。ハイブリドーマをHAT培地内で選択しインキュベートした後、マウスMabを産生するコロニーをスクリーニングした。DC-101に採用したプロトコルと異なり、fmsのC末端領域に相当するペプチドに生成したポリクローナル抗体をコートしたELISAプレート上のC441細胞の溶解液から捕獲したflk-1(VEGFR-2)/fms受容体に結合する陽性上澄み液を最初にスクリーニングした。次に、無傷のC441細胞及び精製されたflk-1(VEGFR-2)/SEAPとSEAPだけに結合する反応性MabをELISA法で検定した。C441に対する結合性を示しそしてflk-1(VEGFR-2)/SEAPとの反応性を示すがSEAPとの反応性を示さないハイブリドーマ由来の上澄み液を、腹水中でエキスパンドさせ増殖させ次いで精製した(EZ-PREP, Pharmacia)。精製したMabについて、C441細胞上でFACSによって検定してそれらMabが細胞表面に結合することを確認し、かつVEGFが誘発するflk-1(VEGFR-2)/fmsの活性化を阻害するそれらMabの性能をリン酸化反応検定法で確認した。これらの試験結果から、Mab 25とMab 73(アイソタイプのIgG1)の、DC-101に観察されたレベルに匹敵するレベルでflk-1(VEGFR-2)に特異的に結合しかつ受容体の活性化を遮断する性能に基づいてさらに特性決定を行うためこれらMabのクローン化を行った。
実施例 III -1 ELISA法
各種mAbsのflk-1(VEGFR-2):SEAP及びSEAPタンパク質に対する結合特性を比較する固相ELISA法で抗体類をスクリーニングした。マイクロタイタープレートに50-100ng/ウエルのflk-1:SEAP又はAP(pH9.6 炭酸緩衝液中)を4℃にて一夜かけてコートした。10%の新生仔ウシ血清(NB10)を補充したリン酸緩衝食塩水で、プレートを37℃で1時間遮断した。ハイブリドーマ上澄み液又は精製した抗体をプレートに添加して37℃で2時間放置し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに複合させたヤギ抗ラットIgG(Tago)を添加して37℃でさらに1時間放置した。十分に洗浄した後、TMB(Kirkegaard and Perry,Gaithersburg MD)プラス過酸化水素を色素原として添加し次いでそのプレートをELISAリーダーにて450nmの吸光度を読み取った。
各種モノクローナル抗体のアイソタイピングを、すでに報告されているようにして(Songsakphisarn,R. and Golstein,N.I.Hybridoma,12:343-348,1993)ラットのアイソタイプ特異試薬(Zymed Labs,SOUTH San Francisco CA)を使って実施した。
C441細胞及び10A2細胞によるリン酸化検定とウェスタンブロット分析をすでに報告されている方法(Tessler et al.,1994)をいくらか修正し利用して実施した。簡単に述べると、細胞をDME-10%CS内で90%集密度まで増殖させ次に実験を行う前に血清をDME-0.5%CS内で24時間飢餓状態にした。HUVEC細胞をEGM基礎培地内でサブコンフリューエンス(subconfluence)まで増殖させた。中和検定の場合、mAb DC-101の存在下及び不在下、血清なしの条件下(DME-0.1%BSA)で、細胞を各種濃度の適当なリガンドで室温にて15分間刺激した。リガンド、VEGF及びCSF-1をそれぞれ、10-80ng/ml及び20-40ng/mlの濃度で検定した。モノクローナル抗体は、0.5μg/ml〜10μg/mlの範囲内の濃度で検定した。VEGFが誘発するflk-1(VEGFR-2)-fms受容体の活性化に対するmAb DC-101の作用を評価するため、抗体を、同時に添加するか(競合阻害)又はリガンドを添加する前に室温で15分間かけて細胞に予め結合させておいた。DC-101の不在下と存在下血清なしの培地内でインキュベートされた細胞はそれぞれ、リガンドの不在下及び抗体の存在下での受容体の自己リン酸化の対照として役立つ。Fms/FLK-2キメラ受容体(10A2)を発現する対照細胞系を飢餓状態にし次に20及び40ng/ml のCSF-1で刺激し5μg/mlのDC-101の存在下と不在下で検定した。
C441細胞を、10cm プレート内でほぼ密集状態まで増殖させた。細胞を非酵素的解離緩衝液(Sigma)で取り出し、血清無しの冷培地内で洗浄し次いで1%BSA(HBSS-BSA)で補充したハンクス均衡塩類溶液に、1試験管当たり100万個の組織濃度で再懸濁させた。モノクローナルAbのDC-101又はアイソタイプの適合した無関係抗体の抗FLK-2 23H7を1試験管当たり10μg添加し氷上で60分間放置した。洗浄した後、FITCに複合させたヤギ抗マウスIgG
(TAGO) 5μlを添加し氷上でさらに30分間放置した。細胞を三回洗浄し、HBSS-BSA 1ml中に再び懸濁させ次にCoulter Epios Elite Cytometerで分析した。蛍光第二抗体の非特異的結合を、第一抗体を欠いている試料から確認した。
C441細胞による検定を、24ウエルディッシュ内で密集状態まで増殖させた細胞で実施した。HUVEC細胞は6ウエルディッシュ内で密集状態まで増殖させた。単分子層を、結合緩衝液(DMEM,50 mM HEPES pH 7.0,0.5% ウシ血清アルブミン)内で各種の量のmAb DC-101とともに4℃で2時間インキュベートした。次に細胞を、冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し次いでビオチンと複合させた第二抗ラットIgG抗体(最終濃度 2.5μg/ml)とともにインキュベートした。4℃で1時間後、細胞を洗浄し、ストレプタビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とともに4℃で30分間インキュベートした。洗浄した後、細胞結合抗体を、比色検出システム(TMB,Kirkegaard and Perry)で得られる540nmの吸光度を測定することで測定した。第二抗体だけのOD 540nmは非特異的結合の対照として役立つ。
マイトジェン検定を、Cell Titer 96 Non Radioactive Cell proliferation Assay Kit(Promega Corp.,Madison,WI)を使って実施した。この検定法では、生細胞によるテトラゾリウム塩のホルマザン産物への還元反応から得られる値として色を計量測定して、増殖を測定した。簡単に述べると、HUVEC細胞を、ゼラチンをコートした24ウエルのゼラチンコートプレートを使いEGM基礎培地内で1000細胞/ウエルにて増殖させた。48時間インキュベートした後、各種成分をウエルに添加した。1μg/mlのmAb DC-101の存在下及び不在下で、1ng/mlのVEGFを培地に添加した。指定された場合ヘパリン(Sigma)を最終濃度1μg/ml まで添加した。次に細胞をさらに3日間インキュベートした。細胞の増殖を測定するため、テトラゾリウム色素を20μlずつ各ウエルに添加し細胞を37℃で3時間インキュベートした。細胞を可溶化し次に生成物ホルマザンの吸光度(OD570)を増殖の定量値として測定した。
実施例 IV-1 マウスの抗flk-1(VEGFR-2)Mab 25と73は、VEGFが誘発するflk-1(VEGFR-2)/fms受容体の活性化を特異的に中和する。
等濃度のflk-1(VEGFR-2)/fmsをトランスフェクトされた3T3細胞系のC441から免疫沈降させたFLK/fmsとPDGF受容体で検定を行い、一方ヒトEGFRは腫瘍細胞系のKBから免疫沈降させた。10μg/mlのマウスの抗flk-1(VEGFR-2)Mab25と73の存在下及び不在下、20ng/ml VEGF(flk-1/fms)、DMEM-10%仔ウシ血清(PDGFR)又は10ng/ml EGF(EGFR)を含有するRPMI-0.5%BSAで、細胞を刺激した。刺激を行った後、細胞をPBS-1mMオルトバナジン酸ナトリウムで洗浄し次に溶解させた。Flk-1/fmsとPDGFRを、溶解液から、c-fms(IM 133)のC末端領域及びPDGF(UBI)受容体それぞれに相当するペプチドに対して生成したポリクローナル抗体で免疫沈降させた。EGFRはヒト受容体のN末端領域に対するMab(C225)で免疫沈降させた。免疫沈降された溶解液をSDSポリアクリルアミド電気泳動法に付し続いてウエスタンブロット法に付した。ブロットを抗PTyrMab(UBI)でプローブして受容体の活性化を検出した。刺激された細胞の受容体の中和は、無関係のMabと未刺激の対照に対して評価した。
c-fms受容体のC末端領域に相当するペプチドに対して生成したポリクローナル抗体によって、等濃度のトランスフェクトされた3T3細胞系C441で製造した溶解液から免疫沈降させたflk-1(VEGFR-2)/fms受容体のウエスタンブロット上のマウス抗flk-1(VEGFR-2)Mabによって、受容体を検出した。SDSゲル電気泳動法とウエスタンブロット法で分析した後、そのブロットを四つの部分に分割し、各セクションを、50μg/mlの抗flk-1(VEGFR-2)Mab 25と73でプローブした。次にブロットをはがしとり前記抗fmsポリクローナル抗体で再度プローブした結果、各Mabが検出したバンドはflk-1(VEGFR-2)/fms受容体を示すことが証明された。
新たに単離したHUVECの溶解液から、タンパク質を、異なる抗体で免疫沈降させた。溶解を行う前に、細胞を、RPMI-0.5%BSA中で室温にて10分間、20ng/mlのVEGFで刺激し、次に1mM オルトバナジン酸ナトリウムを含有するPBSで洗浄した。個々の免疫沈降は等容積の溶解液で実施し次にSDSポリアクリルアミド電気泳動法を行い続いてウエスタンブロット法を行った。そのブロットを最初、抗PTyrMab(UBI)でプローブし続いてはがしとり次いでflk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2,IM142)のインターキナーゼに相当するペプチドに対し生成したポリクローナル抗体で続いてflk-1(VEGFR-1)のC末端領域に対するポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)で再度プローブした。これらの免疫沈降は、無関係のラットMabの23H7、無関係のマウスMabのDAB8で、抗flk-1(VEGFR-2)Mab,DC-101,73,25及び抗flk-1/KDR (VEGFR-1/ VEGFR-2)ポリクローナル抗体のIM 142に対して行った。場合によっては、ブロットをはがしとり次に抗flk-1 Mab 73と25で再度プローブして交差反応のバンドを検出した。
実施例 V-1 DC-101によるERISA法と免疫沈降法
ラットIgG1モノクローナル抗体のDC-101がマウスチロシンキナーゼ受容体flk-1(VEGFR-2)に対して特異的であることが分かった。この抗体が、精製されたflk-1(VEGFR-2):SEAPには結合するがアルカリホスファターゼ又は他の受容体チロシンキナーゼ例えばFLK-2には結合しないことをELISA法のデータが示した。図1に見られるように、DC-101はマウスflk-1(VEGFR-2):SEAPSを免疫沈降させるがSEAPだけは免疫沈降させない。
DC-101が、C441細胞内のflk-1(VEGFR-2)のそのコグネイトリガンドのVEGF165によるリン酸化を中和できるかどうかを確認する実験を実施した。これらの試験では、モノクローナル抗体とVEGFを同時に単分子層に加えて室温で15分間放置した。これらの条件は、受容体/リガンドの結合に対する抗体の競合効果(競合阻害)を確認するように設計した。図2aに示されているこれら検定の結果は、VEGF165が誘発するflk-1(VEGFR-2)/fms受容体のリン酸化が、細胞をDC-101の存在下で検定したとき著しく低下したことを示している。さらにこれらのデータは、MabがVEGF165と競合して、受容体のリガンドによる完全活性化を防止することを示唆している。VEGF- flk-1(VEGFR-2)受容体の相互作用のDC-101による阻害に対する感度を測定するため、各種レベルの抗体と組み合わせて最大刺激濃度のVEGF165(40ng/ml)でC441細胞を検定した。これらMabの滴定試験結果は図2bに示してある。DC-101が0.5μg/mlを超える濃度で含有されている場合、flk-1(VEGFR-2)のVEGF165によるリン酸化が著しく低下することが観察された。これらのデータは、リガンドによる受容体の活性化を阻害するのに比較的低い濃度の抗体(<1μg/ml)で十分であることを示している。前記抗体は、5μg/mlで、過剰リガンドの存在下(80ng/ml) flk-1(VEGFR-2)のVEGF165による刺激を中和できる(図3aと3b)。対照として、DC-101の作用を、CSF-1を使って十分に刺激されたfms/FLK-2受容体(10A2細胞系)について試験した。これらの条件下でDC-101は受容体の活性化に対する作用を全く示さなかった。
抗体と受容体の相互作用を最大にするためリガンドを添加する前に、DC-101を細胞とともにプレインキュベートした試験で、Mabの阻害作用の程度と特異性をさらに評価した。これらの実験では、単分子層を、5μg/mlのDC-101、従来法で製造したラット抗FLK-2 Mab(2A13)(ImClone,NY)及び対照のラットIgG1(Zymed Labs)とともに室温で15分間インキュベートした後、40ng/mlのVEGF165を添加しさらに15分間インキュベートした。比較するために、DC-101とVEGF165を同時に添加する検定を実施した(競合阻害)。これら試験の結果(図4)は、抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体をflk-1(VEGFR-2)/fmsでトランスフェクトされた細胞とともにプレインキュベートするとVEGF165による受容体の活性化が完全に阻害されることを示している。刺激するためVEGF121を使用したとき、類似の結果が観察された。VEGFによるflk-1(VEGFR-2)のリン酸化は無関係のアイソタイプ適合ラット抗体を添加することによって全く影響されないが、抗fmsポリクローナル抗体でプローブされた同じブロットの反応性は、1レーン当たり等レベルの受容体タンパク質を示している。これらデータは、DC-101によって観察されたリン酸化反応の阻害が試験試料中の受容体タンパク質の不足よりむしろ受容体活性化の遮断が原因であったことを示している。
flk-1(VEGFR-2)/fms受容体でトランスフェクトされた3T3細胞(C441細胞)に対する結合性について、上記MabをFACS分析法で検定した。図6に示す試験結果は、C441細胞の表面で発現されたキメラflk-1(VEGFR-2)/fmsがmAb DC-101によって特異的にに認識され、そして類縁のチロシンキナーゼ受容体FLK-2に対する同じアイソタイプの抗体によって認識されないことを証明している。細胞表面におけるmAb-受容体の相互作用の効力を、無傷のC441細胞に結合する各種レベルのmAbを測定する検定法で確認した。図7に示すこれら試験の結果は、mAbがflk-1(VEGFR-2)/fms受容体と、約500ng/mlという相対的見掛けアフィニティーで結合することを示している。これらの試験結果は、mAbが細胞表面に発現したflk-1(VEGFR-2)に対し強力なアフィニティーを持っていることを示している。
DC-101のflk-1(VEGFR-2)/fms受容体との反応性の程度を、この抗体がVEGFによる活性化の後に上記受容体を免疫沈降させる性能を測定することによってさらに評価した。図8は、mAb DC-101によって、リン酸化されたflk-1(VEGFR-2)/fms受容体がVEGFで刺激されたC441細胞から免疫沈降されることを示す。これらの結果は、DV-101モノクローナル抗体と抗fmsポリクローナル抗体は類似のレベルの受容体相互作用を示すが、ラット抗FLK-2抗体の2H37(IgG1)と2A13(IgG2a)は反応性を全く示さないことを示している。次にmAb DC-101が、VEGFの誘発するflk-1(VEGFR-2)/fmsのリン酸化を、リガンドの最大刺激濃度(40ng/ml)下で中和できるかどうか確認する実験を行った。これらの試験では、モノクローナル抗体を、リガンドと同時に又はリガンドで刺激する前に単分子層に添加し室温で15分後に検定した。これらの条件は、受容体/リガンドの結合に対する抗体の競合効果(競合阻害)及び予め結合された抗体が受容体の活性化を防止する効力の両者を測定するように検討した。図4に示すこれら検定の結果は、flk-1(VEGFR-2)/fmsのリン酸化が、mAbとVEGFの同時添加によって低下しそして抗体を受容体に予め結合させることによって著しく阻害されることを示している。これらデータのデンシトメトリースキャンを行ったところ、mAb DC-101がflk-1(VEGFR-2)/fmsと相互に作用してリン酸化を、対照の完全に刺激された受容体(レーン4)の6%(レーン5,P)及び40%(レーン6,C)のレベルまで阻害することが明らかになった。これらデータから本発明の発明者らは、mAb DC-101がリガンド-受容体の相互作用と強く競合してflk-1受容体の活性化を中和すると推定している。mAb DC-101による阻害に対するVEGF- flk-1(VEGFR-2)相互作用の感度を確認するため、抗体の濃度を増やしながら最大のVEGFのレベルでC441細胞を検定した。検定は、競合させ予め結合させる条件下、上記mAbで実施した。このmAbの滴定試験の結果は図9に示してある。mAb DC-101が0.5μg/mlを超える濃度でVEGF抗体と競合すると、flk-1(VEGFR-2)のリン酸化が著しく低下することが観察される。これらのデータも、リガンドによる受容体の活性化を完全に阻害するのに、比較的低い濃度の予め結合された抗体(<1μg/ml)で十分であることを示している。
受容体の活性化に対するmAb DC-101のアンタゴニスト的挙動をさらに評価するため、固定量の抗体(5μg/ml)を、量を増やしたリガンドで刺激されたC441細胞に添加するリン酸化の検定を実施した(図3a)。mAb DC-101の存在下又は不在下、各リガンド濃度によって誘発されるリン酸化のレベルもデンシトメトリーの読取り値で定量した。図3bに示すこれらデータのグラフは、前記抗体が過剰量のVEGFの存在下でも受容体のリン酸化を一部分中和できたことを示している。受容体活性化に対するmAb DC-101の特異性を評価するため、この抗体を、3T3でトランスフェクトされた細胞系10A2内でCSF-1が誘発するfms/FLK-2受容体の活性化を競合して阻害する性能について試験した。これらの実験では、5μg/mlのmAb DC-101を、受容体を完全に活性化することが分かっているCSF-1の濃度(20-40ng/ml)で試験した。これらの試験結果は、図10に示してあるが、mAb DC-101はfms/FLK-2受容体のCSF-1仲介リン酸化に全く作用しないことを示している。
DC101又は無関係抗体を細胞とともにプレインキュベートした後にリガンドを添加して抗体と受容体の最大の相互作用を保障する試験で、抗体の阻害特性の程度と特異性をさらに評価した。これらの実験では、単分子層を5μg/mlのDC-101、ラット抗FLK-2 mAb(2A13)又は対照のラットIgG1(Zyme Labs)とともにプレインキュベートした後、40ng/mlのVEGFを添加した。比較するため、抗体とVEGFを同時に添加する競合検定を実施した。これら試験の結果は、抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体及びflk-1(VEGFR-2)/fmsでトランスフェクトされた細胞のプレインキュベーションだけがVEGFによる受容体の活性化を完全に阻害するが、VEGFによるflk-1(VEGFR-2)のリン酸化は、無関係のアイソタイプ対応ラット抗体の添加によって全く影響されないことを示している。抗fmsポリクローナルでプローブされた同じブロットの反応性(図11)は、1レーン当たり等レベルの受容体タンパク質を示している。これらのデータは、mAb DC-101で処理された細胞に観察されたリン酸化の欠如が、等量の発現された受容体のVEGF誘発リン酸化の遮断が原因であったことを示している。
次に抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体が、ヒト内皮細胞上の相同受容体型と相互に作用するかどうかを確認する実験を実施した。クローン化HUVEC細胞(ATCC)にDC-101を濃度をあげながら添加して滴定するとこの抗体は複雑な結合挙動を示すことを示した。このデータは、内皮細胞に起こると報告されている抗体とVEGF受容体の特異的な相互作用(Vaisman et al.,J. Biol. Chem. 265: 19461-19466,1990)を示している。次に、DC-101の、VEGFで刺激されたHUVEC細胞との相互作用の特異性を、図8の場合に報告したのと類似の条件下でリン酸化検定法を利用して評価した。これらの試験では、DC-101が、リガンド成分を除いた場合の架橋VEGF-受容体のバンドについて報告されたのと類似の分子量を有するタンパク質のバンドをHUVEC細胞から免疫沈降させた(図 12)。これらのバンドは、細胞がVEGFで刺激されるとリン酸化が増大することを示している(図12のレーン1と2を比較せよ)。さらにVEGFが誘発する、受容体バンドのリン酸化は、検定時に1μg/mlのヘパリンを添加することによって強化される(図12のレーン3)。この発見は、低濃度のヘパリンの存在下でVEGFの内皮細胞への結合が増大するという以前の報告(Gitay-Goren et al.,J. Biol. Chem.,267,6093-6098,1992)と一致している。
抗体の存在下及び不在下、VEGFで刺激されたHUVEC細胞(ATCC)のマイトジェン検定法で抗体を検定したとき、内皮細胞に対するDC-101の阻害作用が観察された(図12)。これらの試験結果は、VEGFによる細胞増殖の著しい増加がDC-101によって約35%減少することを示している。ヘパリンは、これらの検定法で採用した増殖条件下では細胞の増殖に対して特異的な作用を全く示さない。
Mab 25とMab 73はFACS分析法でC441細胞とHUVECに結合して両細胞系でインターナライゼーションを示す。ウエスタンブロットから得た結果は、両方の抗flk-1 Mabが、抗fmsポリクローナル抗体によるC441細胞からの免疫沈降体内のFLK/fms受容体の単一又は複数のバンドを検出できることを示している(プロトコルについては上記実施例 IV-2参照)。これらの抗体は、flk-1(VEGFR-2)/fms受容体のVEGF誘発活性化を特異的に中和するのでPDGFによるマウスPDGF受容体のリン酸化又はEGFによるヒトEGF受容体のリン酸化に全く影響しない(プロトコルについては上記実施例 IV-1参照)。これらの抗体は増殖検定法にてVEGFが刺激したHUVECを50%まで阻害できるが、DC-101は増殖に対する作用がはるかに小さい。
KDR(VEGFR-2)は、活性化されたHUVECからMab 25とMab 73によって免疫沈降されるリンタンパク質の一種である。KDR(VEGFR-2)は、VEGFで刺激された初期継代HUVEC由来の抗flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2)ポリクローナル抗体(IM142)を使ってウエスタンブロット法と免疫沈降分析法で検出された。逆に、これらの抗体によって、VEGF刺激HUVECから免疫沈降されたバンドは、IMI42と交差反応性であるが抗flt-1(抗VEGFR-1)ポリクローナル抗体とは交差反応性ではない。これらの発見によって、KDR(VEGFR-2)が、活性化された内皮細胞の増殖応答の原因であるVEGFR受容体として関係があるという実験的証拠に基づいて、MabがHUVECのKDR(VEGFR-2)の活性に影響すると推定できる(プロトコルについては上記実施例IV-3参照)。
抗ホスホチロシンによる免疫沈降と検出によって、いくつもの腫瘍系をDC-101とのタンパク質反応性でスクリーニングした。細胞系の8161(黒色腫)及びA431(類表皮腫)由来の免疫ブロットから分子量が約170kDと120kDのリン酸化バンドがえられた。これらの結果は、ヒトVEGF受容体型が腫瘍細胞などの非表皮細胞に発現されることを示している。
実施例 VII -1 DC-101による血管新生の生体内での阻害
抗flk-1(VEGF-2)モノクローナル抗体が、VEGFを発現する腫瘍細胞の増殖を遮断するかどうかを確認するために生体内の試験を設計した。これらの実験では、高レベルのVEGFメッセージを有しかつ無血清培地で24時間調整したのち約5ng/mlのVEGF増殖因子を分泌するヒトグリア芽細胞腫の多形細胞系を使用した(図5)。
無胸腺マウス(nu/nu)の皮下にGMB-18(ヒトの多形グリア芽細胞腫)を接種した。腫瘍が平均容積100-200mm3に達したときに抗体療法を開始した。治療は、(i)DG-101:200、400もしくは800μg/注射;(ii)無関係のアイソタイプ適合ラットIgG(400μg/注射);又は(III )PBSの6回の注射(3週間にわたって週2回ずつ)で構成されている。腫瘍の容積はパスで測定した。DC-101グループの腫瘍の阻害は、PBSグループおよび無関係モノクローナル抗体グループに対して有意差(*)があることが分かった。
この実施例は、マウスの腫瘍血管の内皮細胞に対し決定的なVEF受容体-2のflk-1(VEGFR-2)を遮断するモノクローナル抗体DC-101が分割放射線療法(RT)による腫瘍異種移植片の治療可能性を増大するかどうか、及びこの抗体が同時に正常組織(マウスの皮膚)の放射線反応を調節するかどうかを評価した。
実施例 IX-1 材料
実施例 IX-1 (a). 細胞系とタンパク質
初代培養HUVECをEBM-2培地中に5%CO2下37℃で保持した。すべての検定に2〜5継代の細胞を使用した。VEGF165タンパク質をバキュロウイルス中に発現させ次いで精製した。KDR(VEGFR-2)の細胞外ドメインをコードする相補的DNAを、ヒト胎児腎臓mRNAからPT-PCRで単離し次いでベクターAP-TagのBglII部位及びBspE部位中にサブクローン化した。このプラスミドの中には、KDR(VEGFR-2)の細胞外ドメインのcDNAが、ヒト胎盤APのcDNAと同じ読み枠内に融合されている。このプラスミドを、ネオマイシン発現ベクターpSV-NeoとともにNIH 313細胞中にエレクトロポレートし次いで安定な細胞クローンをG418で選択した。その可溶性融合タンパク質KDR-APを、APに固定化したモノクローナル抗体を使ってアフィニティークロマトグラフィーで細胞培養液の上澄み液から精製した。
雌のBALB/Cマウスに、2ヶ月間に、KDR-AP 10μg含有のRIBI Adjuvant System 200μlを2回腹腔内(i.p.)注射し続いてRIBI adjuvant無しでi.p.注射を1回行った。またこのマウスにはKDR-AP 10μg含有のRIBI 200μlを第一免疫化の時点で皮下(s.c.)注射した。このマウスにKDR-AP 20μg の追加免疫注射を腹腔内に行い3日後に安楽死させた。ドナーマウスから脾臓を取り出しその細胞を分離した。RNAを抽出し次にmRNAを脾細胞の全RNAから精製した。scFvファージ展示ライブラリーを、線状ファージM13の表面に展示されたmRNAを使って構築した。
上記ライブラリーストックを対数期まで増殖させM13K07 ヘルパーファージでレスキューし次いで2YTAK培地(100μg/mlのアンピシリンと50μg/mlのカナマイシンを含有する2YT)内で30℃にて一夜増幅させた。このファージ製剤を4% PEG/0.5M NaCl中に沈殿させ、500μg/mlのAPタンパク質を含有する3%脱脂ミルク/PBS中に再懸濁させ次に37℃で1時間インキュベートして抗AP scFvを展示するファージを捕獲し他の非特異的結合を遮断した。
個々のTG1クローンを96ウエルプレートに37℃で増殖させ次いで先に述べたようにしてM13K07ヘルパーファージでレスキューした。前記増幅したファージ製剤を、1/6容積の18%ミルク/PBSを使って室温で1時間遮断し、次にKDR-AP又はAPでコートしたMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート(Nunc)に加えた(1μg/ml x 100μl)。室温で1時間インキュベートした後、これらプレートをPBSTで3回洗浄し次いでウサギ抗M13ファージAb-HRP複合体とともにインキュベートした。これらプレートを5回洗浄し、TMB ペルオキシダーゼの基質を添加し、マイクロプレートリーダーを使って450nmのODを読み取りscFv抗体を同定し配列を決定した。
個々のクローンのファージを使って、非サプレッサーのイー・コリ宿主HB2151に感染させ次いでその被感染体を2YTAG-Nプレート上で選択した。HB2 151細胞内のscFvを、1mMのイソプロピル-1-チオ-B-D-ガラクトピラノシドを含有する2YTA培地内で前記細胞を30℃で培養することによって発現させた。20%(w/v) スクロース、200mM NaCl、1mM EDTA及び0.1mM PMSFを含有する25mM Tris(pH 7.5)に前記細胞のペレットを再懸濁させ続いて4℃で1時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートすることによってこれら細胞のペリプラズム抽出物を調製した。15,000 rpmで15分間遠心分離した後、上澄み液から、可溶性scFvを、RPAS Purification Module(Pharmacia Biotech)を使いアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
実施例 IX-2(a) 定量KDR(VEGFR-2)結合検定法
精製された可溶性scFvのKDR(VEGFR-2)に対する結合性を定量試験するため二つの検定法を採用した。
可溶性scFvのKDR(VEGFR-2)との結合の機構は、BLAcore バイオセンサー(Pharmacia Biosensor)を使用して測定した。KDR-AP融合タンパク質をセンサーチップに固定化し次に可溶性scFvを62.5nM〜1000nMの範囲の濃度で注射した。センサグラム(sensorgram)を各濃度について得てプログラムBIA Evaluation 2.0を使って評価し、速度定数のkonとkoffを決定した。Kdを速度定数の比率koff/konから計算した。
リン酸化の検定を、先に述べたプロトコルにしたがって早期継代HUVECで実施した。簡単に述べると、HUVECを、0.5%のウシ血清アルブミンを補充した無血清EBM-2基礎培地内で5μg/mlのscFvの存在下又は不在下室温にて10分間インキュベートし続いて20 ng/mlのVEGF165で室温にてさらに15分間刺激した。その細胞を溶解し、その細胞溶解液からKDR(VEGFR-2)受容体を、ウサギ抗KDR(抗VEGFR-2)ポリクローナル抗体(ImClone Systems Incorporated)に結合させたプロテインAセファロースビーズで免疫沈降させた。そのビーズを洗浄しSDSローディング緩衝液と混合し次いで上澄み液をウエスタンブロット分析に付した。KDR(VEGFR-2)のリン酸化を検出するため、ブロットを抗ホスホチロシンMabの4G10でプローブした。MAPキナーゼの活性を検定する場合は、細胞溶解液をSDS-PAGEによって分離し次いでホスホ特異的MAPキナーゼ抗体を使ってウエスタンブロット分析を行った。シグナルはすべてECLを使用して検出した。
96ウエル組織培養プレート(Wallach,Inc.,Gaithersburg,MD)中のVEGF、bFGF又はEGF無しのEBM-2培地200μl内に、HUVEC(5x103細胞/ウエル)をプレートし次いで37℃にて72時間インキュベートした。各種の量の抗体をそれぞれ二つのウエルに添加し37℃で1時間プレインキュベートした後、VEGF165を最終濃度16ng/mlまで添加した。18時間インキュベートした後、0.25μCiの[3H]-TdR(Amersham)を各ウエルに添加しさらに4時間インキュベートした。その細胞を、氷上に置き血清含有培地で2回洗浄し続いて10%TCAとともに4℃で10分間インキュベートした。次にその細胞を水で1回洗浄し次いで25μlの2%SDS中で可溶化させた。シンチレーション液(150μl/ウエル)を添加しDNAが取り込んだ放射能をシンチレーションカウンター(Wallach ,Model 1450 Microbeta Scintillation Counter)で測定した。
実施例 IX-3(a) 細胞系とタンパク質
初代培養のヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、37℃で5%CO2雰囲気下EBM-2培地中に保持した。2〜5継代の細胞をすべての検定に使用した。VEGF165及びKDR(VEGFR-2)-アルカリホスファターゼ融合タンパク質(KDR-AP)をそれぞれバキュロウイルス及びNIH 3T3細胞で発現させ次いで上記手順にしたがって精製した。抗-KDR(抗-VEGFR-2)scFv p1C11及びscFv p2A6、すなわちKDR(VEGFR-2)に結合するがKDR(VEGFR-2)-VEGF相互作用を遮断しない抗体を、上記のようにKDR(VEGFR-2)で免疫化したマウスから構築したファージ展示ライブラリーから分離した。C225は、上皮増殖因子(EGF)受容体に対するキメラIgG1抗体である(上記事項参照)
p1C11の軽鎖の可変ドメイン(VL)(配列番号:8と配列番号:16)及び重鎖の可変ドメイン(VH)(配列番号:7と配列番号:15)それぞれを、プライマー1と2及びプライマー3と4を使ってPCRによってscFv発現ベクターからクローン化した。次に哺乳類の細胞内でタンパク質を分泌するリーダーペプチドの配列を、プライマー5と2及びプライマー5と4を使ってPCRによってVLとVHそれぞれの5’末端に付加した。
BamHI[配列番号:38]
AAG CTG3’[配列番号:39]
[配列番号:40]
TTT HindIII CTA GTA GCA ACT3’[配列番号:41]
キメラIgGの軽鎖と重鎖を発現させる別個のベクターを構築した。クローン化したVL遺伝子をHindIII とBamHIで消化しヒトκ軽鎖の定常領域(CL)を含むベクターpKN100に連結して、キメラp1C11軽鎖すなわちc-p1C11-Lの発現ベクターをつくった。クローン化したVH遺伝子をHindIII とBamHIで消化しヒトIgG1(γ)重鎖の定常領域(CH)を含むベクターpGID105に連結して、キメラp1C11重鎖すなわちc-p1C11-Hの発現ベクターをつくった。両構造体は、制限酵素による消化で試験しジデオキシヌクレオチドの配列決定法によって確認した。
COS細胞に、IgGの一過性発現を行うため、等量のc-p1C11-Lプラスミドとc-p1C11-Hプラスミドを同時にトランスフェクトした。150mmの培養皿中のDMEM/10%FCS内で増殖させたサブコンフリュウエントCOS細胞を、40mM Tris(pH 7.4)を含有するDMEM 20mlで一回すすぎ、続いて4mlのDMEM/DEAE-Dextran/DNA混合物(40mMの Tris、0.4mg/mlのDEAE- Dextran(Sigma)及び各々20μgづつのc-p1C11-Lプラスミドとc-p1C11-Hプラスミドを含有するDMEM)とともに37℃で4.5時間インキュベートした。その細胞を、100nMのクロロキン(Sigma)を含有するDMEM/2%FCS 4mlとともに37℃で1時間インキュベートし続いて1.5mlの20%グリセリン/PBSとともに室温で1分間インキュベートした。その細胞を、DMEM/5%FCSで二回洗浄し次いで同じ培地20ml中で37℃にて一夜インキュベートした。その細胞をプレーンDMEMで二回洗浄した後、細胞培養培地を無血清DMEM/HEPESに変更した。その細胞培養上澄み液を、トランスフェクトしてから48時間後と120時間後の時点で収集した。製造メーカー(Pharmacia Biotech)が説明するプロトコルにしたがって、プロテインGカラムを使いアフィニティークロマトグラフィーによって、プールした上澄み液からキメラIgGを精製した。IgGを含有する画分をプールし緩衝液をPBSに変更し次いでCentricon 10 濃縮器(Amicon Corp.,Beverly,MA)を利用して濃縮した。そのIgGの純度をSDS-PAGEで分析した。精製した抗体の濃度は、ヤギ抗ヒトy鎖特異的抗体を捕獲剤として使いそしてHRP-複合ヤギ抗ヒトk鎖抗体を検出剤として使ってELISA法で測定した。標準曲線は臨床グレードの抗体C225を使用して校正した。
実施例 IX-4(a) FACS分析法
早期継代HUVEC細胞を増殖因子欠除EBM-2培地中で一夜増殖させてKDR(VEGFR-2)の発現を誘発させた。その細胞を収穫しPBSで3回洗浄しc-p1C11 IgG(5μg/ml)とともに4℃で1時間インキュベートし続いてFITC標識化ウサギ抗ヒトFc抗体(Capper,Organon Teknika Corp.,West Chester,PA)とともにさらに60分間インキュベートした。その細胞を洗浄し次いでフローサイトメーター(Model EPICS(登録商標),Coulter Corp.,Edison,NJ)で分析した。
各種の量の抗体を、KDR(VEGFR-2)をコートした96ウエルMaxi-sorp マイクロタイタープレート(Nunc,Denmark)に添加して室温で1時間インキュベートした後、そのプレートを0.1%のTween-20を含有するPBSで3回洗浄した。次にそのプレートを、scFvの場合は100μlのマウス抗Eタグ抗体-HRP複合体(Pharmacia Biotech)又はキメラIgGの場合は100μlのウサギ抗ヒトIgG Fc特異的抗体-HRP複合体(Cappel,Organon Teknika Corp.)とともに室温で1時間インキュベートした。そのプレートを5回洗浄し、TMBペルオキシダーゼの基質(KPL,Gaithersburg,MD)を添加し次に450nmのODをマイクロプレートリーダー(Molecular Device,Sunnyvale,CA)を使って読み取った。
抗体がKDR(VEGFR-2)に結合する機構をBIAcore バイオセンサー(Pharmacia Biosennsor)を使って測定した。KDR(VEGFR-2)-AP融合タンパク質をセンサーチップに固定化し次いで抗体又はVEGFを25nM〜200nMの範囲内の濃度で注射した。センサーグラムを各濃度で得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を使用して評価し速度定数konとkoffをもとめた。Kdを速度定数の比率koff/konとして計算した。
第一検定法では、各種の量の抗体を固定量のKDR(VEGFR-2)-AP(50ng)と混合し室温で1時間インキュベートした。次にその混合物を、VEGF165(200ng/ウエル)をコートした96ウエルマイクロタイタープレートに移して室温でさらに2時間インキュベートした後プレートを5回洗浄し次いでAPに対する基質(リン酸p-ニトロフェニル、Sigma)を加えて結合KDR(VEGFR-2)-AP分子を定量した。次にEC50すなわちKDR(VEGFR-2)のVEGFに対する結合を50%阻害するのに必要な抗体の濃度を計算した。
サブコンフルーエントHUVEC細胞を、増殖因子欠乏EBM-2培地中で24〜48時間増殖させた後に実験した。50nMのオルトバナジン酸ナトリウムで30分間前処理した後、その細胞を抗体の存在下又は不在下15分間インキュベートし続いて20ng/mlのVEGF165又は10ng/mlのFGFで室温にてさらに15分間刺激した。次にその細胞を、溶解緩衝液(50nM Tris、150mM NaCl、1% NP-40、2mM EDTA、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、1mM PMSF、1μg/ml ロイペプチン1μg/ml ペプスタチン、10μg/ml アプロチニン,pH 7.5)に溶解しそしてその細胞溶解液をKDR(VEGFR-2)とMAPキナーゼ両者のリン酸化の検定に使用した。抗KDR(VEGFR-2)抗体のMab 4.13(ImClone Systems)に結合させたプロテインAセファロースビーズ(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,CA)によって、前記細胞溶解液からKDR(VEGFR-2)受容体を免疫沈降させた。タンパク質類をSDS-PAGEで分離してウエスタンブロット分析に付した。KDR(VEGFR-2)のリン酸化を検出するため、ブロットを抗ホスホチロシンMabのPY20(ICN Biomedicals,Inc. Aurora,OH)でプローブした。MAPキナーゼの活性を検定する場合は、細胞溶解液をSDS-PAGEで分離し続いてホスホスペシフィックMAPキナーゼ抗体(New England Biolabs,Beverly,MA)を使ってウエスタンブロット分析に付した。シグナルはすべてECL(Amersham,Arlington Heights,IL)を使用して検出した。両検定法において、ブロットはポリクローナル抗KDR(VEGFR-2)抗体(ImClone Systems)で再度プローブして等量のタンパク質がSDS-PAGEゲルの各レーンに負荷されたことを確認した。
ヒト内皮細胞のVEGFで刺激されるマイトジェン誘発に対する抗KDR(VEGFR-2)抗体の作用を、HUVECを使って[3H]-TdR DNA取り込み検定法で確認した。96ウエル組織培養プレートの、VEGF、bFGF又はEGF無しのEBM-2培地200μl中に、HUVEC(5x103細胞/ウエル)をプレートし、37℃で72時間インキュベートした。各種の量の抗体ををそれぞれ二つのウエルに添加し37℃で1時間プレインキュベートした後、VEGF165を最終濃度16 ng/mlまで添加した。18時間インキュベートした後、0.25μCiの[3H]-TdRを各ウエルに添加してさらに4時間インキュベートした。DNAが取り込んだ放射能をシンチレーションカウンターで測定した。図24に示すデータは少なくとも三つの別個の実験を示している。
この実施例は、VEGFRのアンタゴニストすなわち抗flt-1(抗VEGFR-1)モノクローナル抗体であるMF-1の産生を証明する。
この実施例は、上皮増殖因子受容体(EGFR)のアンタゴニストであるモノクローナル抗体 ERBITUX(商標)(IMC-C225又はC225としても知られている)及び治療上有効な量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニストである抗VEGFR-1モノクローナル抗体 DC101を投与した後に腫瘍の増殖が阻害されることを証明する。
実施例 XII(a) タンパク質と細胞系
初代培養HUVECを、Cornell Medical Center,New YorkのDr.S. Rafiiから入手し、EBM-2培地(Clonetics,Walkersille,MD)中に37℃にて5%CO2雰囲気下で保持した。可溶性融合タンパク質KDR(VEGFR-2)-AP、その免疫グロブリン(Ig)ドメイン欠失変異体及びFlk-1-APを安定にトランスフェクトされたNIH3T3に発現させ、APに対する固定化モノクローナル抗体を使ってアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養液の上澄み液から精製した。なおこの方法はLu et al.,J. Biol. Chem.275:14321-14330(2000)に記載されている。VEGF165タンパク質は、バキュロウイルスに発現させ、Zhu et al.,Cancer Res.58:3209-3214(1998)に記載の手順にしたがって精製した。白血病細胞系のHL60とHELは10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI中に保持した。
個々のTG1クローンを採取し96ウエルプレート内で37℃にて増殖させ次に前記のようにしてM13K07ヘルパーファージでレスキュー(rescue)した。その増幅されたファージ製剤を1/6容積の18%ミルク/PBSでRTにて1時間遮断し次にKDR(VEGFR-2)-AP又はAP(1μg/mlx100μl)でコートしたMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート(Nunc)に添加した。RTで1時間インキュベートした後、そのプレートをPBSTで3回洗浄し次いでウサギ抗M13ファージ-HRP複合体(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)とともにインキュベートした。これらプレートを5回洗浄しTMBペルオキシダーゼの基質(KPL,Gaithersburg,MD)を添加し次にマイクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を使用して450nmの吸光度を読み取った。
各選択ラウンドの後の抗KDR(VEGFR-2)Fabクローンの多様性を、制限酵素の消化パターン(すなわちDNA指紋)で分析した。個々のクローンのFab遺伝子挿入体を、プライマー:PUC19リバースの5’AGCGGATAACAAT TTCACACA GG3’;及びfdtet seqの5’GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT3’を使用してPCR増幅を行った。その増幅された生成物を高頻度切断酵素BstN Iで消化し3%アガロースゲルで分析した。各消化パターンの代表的なクローンのDNA配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定法で求めた。
個々のクローンのプラスミドを使って非サプレッサーのイー・コリ宿主HB2151を形質転換した。これらの細胞を、1mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG,Sigma)を含有する2YTA培地内で30℃にて培養することによって、HB2151内のFabフラグメントの発現を誘発させた。これら細胞のペレットを、20%(w/v)スクロース、200mM NaCl、1mM EDTA及び0.1mM PMSFを含有する25mM Tris(pH 7.5)中に再懸濁させ続いて緩やかに攪拌しながら4℃で1時間インキュベートすることによって細胞のペリプラズム抽出物を製造した。15,000 rpmで15分間遠心分離した後、製造メーカーのプロトコルにしたがって(Amersham Pharmacia Biotech)、プロテインGのカラムを使いアフィニティークロマトグラフィーで、上澄み液から、可溶性Fabタンパク質を精製した。
この選択を行うために、3.7x1010個のクローンを含有する大きなヒトFabファージ展示ライブラリー(DeHaard et al.,J. Biol. Chem.,274: 18218- 18230 (1999))を使用した。このライブラリーは、それぞれ、ヒト定常軽鎖遺伝子(κとλ)及びIgG1重鎖CH1ドメインをコードするDNAそれぞれにに融合されたPCR増幅抗体の可変軽鎖遺伝子及び可変重鎖遺伝子からなっている。軽鎖構造体と重鎖構造体の両者は、軽鎖の場合シグナル配列のpelBが先行しそして重鎖の場合遺伝子III シグナル配列が先行している。重鎖構造体はさらに、ファージ展示のための遺伝子III タンパク質の一部分、ヘキサヒスチジンタグ及びアンバーコドン(TAG)が続く11個のアミノ酸長のc-mycタグをコードしている。このヘキサヒスチジンタグとc-mycタグは精製又は検出に使用できる。このアンバーコドンは、このコドンで非サプレッサー宿主(例えばHB2151細胞)が形質転換されると、サプレッサー宿主(例えばTG1細胞)を使ってファージを展示するか又は可溶型のFabフラグメントを産生することができる。
実施例 XIII (a) KDR(VEGFR-2)/VEGF相互作用に対するKDR(VEGFR-2)の定量的結合性と遮断性
直接の結合性を検定する場合、各種の量の可溶性Fabタンパク質を、KDR(VEGFR-2)をコートした96ウエルMaxi-sorpマイクロタイタープレートに添加しRTで1時間インキュベートした後、そのプレートをPBSTで3回洗浄した。次にそのプレートを、100μlのウサギ抗ヒトFab抗体-HRP複合体(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.,West Grove,PA)とともにRTにて1時間インキュベートした。そのプレートを洗浄し、ファージELISA法用に上記手順にしたがって展開させた。競合KDR(VEGFR-2)/VEGF遮断検定法では、各種の量のFabタンパク質を固定量のKDR(VEGFR-2)-AP(100ng)と混合しRTで1時間インキュベートした。次いでその混合物を、予めVEGF165(200ng/ウエル)をコートした96ウエルマイクロタイタープレートに移しRTにてさらに2時間インキュベートした後、そのプレートを5回洗浄してAPに対する基質(リン酸p-ニトロフェニル、Sigma)を添加した。450nmの吸光度を測定して、結合したKDR(VEGFR-2)-AP分子(8)を定量した。次に、IC50すなわちKDR(VEGFR-2)のVEGFに対する結合を50%阻害するのに必要なFabタンパク質の濃度を計算した。
可溶性Fabタンパク質のKDR(VEGFR-2)に対する結合の機構を、BIAcore biosensor(Pharmacia Biosensor)を使って表面プラズモン共鳴によって測定した。KDR(VEGFR-2)-AP融合タンパク質をセンサーチップに固定化し次いで可溶性Fabタンパク質を1.5nM〜100nMの範囲の濃度で注射した。各濃度でセンサーグラムを得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を使って評価し速度定数konとkoffを求めた。Kdは速度定数の比率koff/konから計算した。
オフレート(off-rate)を有していることは注目すべきである。
KDR(VEGFR-2)の細胞外Ig様ドメイン欠失変異体の製造については先に述べた(Lu et al.,(2000))。エピトープマッピング検定法では、全長のKDR(VEGFR-2)-AP、二つのKDR(VEGFR-2)Ig-ドメイン欠如変異体のAP融合体及びFlk-1-APが第一に、ウサギ抗AP抗体(DAKO-immunoglobulins, Glostrup,Denmark)を捕獲剤として使用して96ウエルプレート(Nunc)上に固定化される。次にそのプレートを、各種の抗KDR(VEGFR-2)Fabタンパク質とともにRTで1時間インキュベートし続いてウサギ抗ヒトFab抗体-HRP複合体とともにインキュベートした。そのプレートを洗浄し上記のように展開した。
HUVEC(5x103細胞/ウエル)を、96ウエル組織培養プレート(Wallach,Inc.,Gaithersburg,MD)上の、VEGF、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)又は上皮増殖因子無し(EGF)のEBM-2培地200μlにプレートして37℃にて72時間インキュベートした。各種量のFabタンパク質をそれぞれ二つのウエルに添加し37℃で1時間プレインキュベートした後、VEGF165を最終濃度16ng/mlまで添加した。18時間インキュベートした後、0.25μCiの[3H]TdR(Amersham)を各ウエルに添加してさらに4時間インキュベートした。これら細胞をPBSで1回洗浄しトリプシン処理を行い次いで細胞ハーベスター(Harvester96,MACHIII ,TOMTEC,Orange,CT)でガラスフィルター(Printed Fitermat A,Walach)に収穫した。その膜をH2Oで3回洗浄し風乾した。シンチレーション液を添加し、DNAが取り込んだ放射能をシンチレーションカウンター(Wallach,Model 1450 Microbeta Scintillation Counter)で測定した。
HL60細胞とHEL細胞を、無血清単純RPMI 1640 培地で3回洗浄し次いでその培地中に1x106/mlで懸濁させた。細胞懸濁液100μlずつを、HL60細胞の場合は3μm孔トランスウエルインサートに添加し又はHEL細胞の場合は8μm孔トランスウエルインサート(Costar(登録商標),Corning Incorporated,Corning,NY)に添加して抗KDR(VEGFR-2)Fabタンパク質(5μg/
ml)とともに37℃にて30分間インキュベートした。次に前記インサートを、VEGF165あり又は無しの無血清RPMI1640 0.5mlが入っている24ウエルプレートのウエルに入れた。37℃、5%CO2での移動を、HL60細胞の場合16〜18 時間実施し又は HEL細胞の場合4時間実施した。移動した細胞を下部コンパートメントから集めてCoulter counter(Model Z1,Coulter Electronics Ltd.,Luton,England)で計数した。
実施例 XIV(a) IgG発現用ベクターの構築
IgGの軽鎖と重鎖の発現に使うベクターを別個に構築した。クローン化VL遺伝子を消化してベクターpKN100に連結した。クローン化VH遺伝子を消化して、ヒトIgGI(γ)重鎖定常ドメインを含むベクターpGID105に連結した。構築物を、制限酵素による消化によって検査し次いでジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確認した。両方の場合、発現はHCMVプロモーターの制御下で行われ、人工の停止配列で停止させた。
Claims (67)
- 治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニスト及び治療有効量の上皮増殖因子受容体(EGFR)のアンタゴニストをヒトに投与することを含む腫瘍の増殖阻害方法。
- 前記腫瘍がVEGFRを過剰発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍が結腸の腫瘍である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストを静脈内投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、fms様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)VEGFR-1のアンタゴニストである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍がEGFRを過剰発現する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストを静脈内投与する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストがEGFRに結合する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRのATPへの結合を阻害する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項23に記載の方法。
- 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項23に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項23に記載の方法。
- 前記EGFRのアンタゴニストがEGFRに特異的な低分子を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 化学療法薬又は放射線をさらに投与することを含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニスト及び放射線をヒトに投与することを含む腫瘍の増殖阻害方法。
- 前記腫瘍がVEGFRを過剰発現する、請求項29に記載の方法。
- 前記腫瘍が結腸の腫瘍である、請求項29又は30に記載の方法。
- 前記腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)である、請求項29又は30に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストを静脈内投与する、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFのアンタゴニストがVEGFRに結合する、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、fms様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)VEGFR-1のアンタゴニストである、請求項29〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項29〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項39に記載の方法。
- 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項39に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項39に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項29〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 化学療法薬をさらに投与することを含む、請求項29〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニスト及び化学療法薬をヒトに投与することを含む腫瘍の増殖阻害方法。
- 前記腫瘍がVEGFRを過剰発現する、請求項45に記載の方法。
- 前記腫瘍が結腸の腫瘍である、請求項45又は46に記載の方法。
- 前記腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)である、請求項45又は46に記載の方法。
- 前記VEGFRの アンタゴニストを静脈内投与する、請求項45〜48 のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項45〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項45〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに結合する、請求項45〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、fms様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)VEGFR-1のアンタゴニストである、請求項45〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項45〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項55に記載の方法。
- 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項55に記載の方法。
- 前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項55に記載の方法。
- 前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項45〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化学療法薬がVEGFRのアンタゴニストに結合されていない、請求項44〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化学療法薬が、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソール、及びその組合わせから成る群から選択される、請求項44〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 治療有効量の上皮増殖因子受容体(EGFR)のアンタゴニスト及び治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニストを含む腫瘍増殖阻害用キット。
- 前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項62に記載のキット。
- 前記EGFRのアンタゴニストがEGFRに特異的な低分子を含む、請求項62に記載のキット。
- 前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項62〜64のいずれか一項に記載のキット。
- 前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項62〜64のいずれか一項に記載のキット。
- 化学療法薬及び放射線をさらに含む、請求項62〜66のいずれか一項に記載のキット。
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Cited By (3)
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JP2008501651A (ja) * | 2004-06-03 | 2008-01-24 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | イリノテカン(cpt−11)およびegfr阻害剤を用いた処置 |
JP2016521262A (ja) * | 2014-02-26 | 2016-07-21 | イーライ リリー アンド カンパニー | 癌のための併用療法 |
JP2022548818A (ja) * | 2019-12-06 | 2022-11-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 抗vegfタンパク質組成物及びその製造方法 |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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ZA9811162B (en) * | 1997-12-12 | 2000-06-07 | Genentech Inc | Treatment with anti-ERBB2 antibodies. |
US20040013667A1 (en) * | 1999-06-25 | 2004-01-22 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
US20030086924A1 (en) * | 1999-06-25 | 2003-05-08 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
US6949245B1 (en) * | 1999-06-25 | 2005-09-27 | Genentech, Inc. | Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies |
AU2001259271A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 14094, a novel human trypsin family member and uses thereof |
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DE60333554D1 (de) * | 2002-03-04 | 2010-09-09 | Imclone Llc | Kdr-spezifische humane antikörper und deren anwendung |
US20050186204A1 (en) * | 2002-06-28 | 2005-08-25 | Peter Carmeliet | Use of antibodies against FLT-1 for the treatment of osteoporosis |
US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
AU2003295798B2 (en) * | 2002-11-21 | 2009-09-10 | Genentech, Inc. | Therapy of non-malignant diseases or disorders with anti-ErbB2 antibodies |
US20050043233A1 (en) * | 2003-04-29 | 2005-02-24 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis |
US20050027196A1 (en) * | 2003-07-30 | 2005-02-03 | Fitzgerald Loretta A. | System for processing patient radiation treatment data |
AP2006003620A0 (en) * | 2003-10-15 | 2006-06-30 | Osi Pharm Inc | Imidazopyrazine tyroshine kinase inhibitors |
DE602005027673D1 (de) * | 2004-03-05 | 2011-06-09 | Vegenics Pty Ltd | Materialien und verfahren für wachstumsfaktorbindende konstrukte |
MXPA06011423A (es) | 2004-04-02 | 2007-01-23 | Osi Pharm Inc | Inhibidores de proteina cinasa heterobiciclica sustituida en el anillo 6,6-biciclico. |
EP1758601A1 (en) * | 2004-06-03 | 2007-03-07 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Treatment with cisplatin and an egfr-inhibitor |
CN1960732A (zh) * | 2004-06-03 | 2007-05-09 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用吉西他滨和egfr-抑制剂治疗 |
JP5202956B2 (ja) * | 2004-11-19 | 2013-06-05 | コーネル リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | 癌の治療およびモニタリングならびに化学療法薬に関するスクリーニングにおける血管内皮増殖因子受容体1+細胞の使用法 |
EP1812064A4 (en) | 2004-11-19 | 2009-07-08 | Cornell Res Foundation Inc | USE OF ENDOTHELIAL VASCULAR GROWTH FACTOR RECEPTOR CELLS IN THE TREATMENT AND MONITORING OF CANCER AND IN THE SCREENING OF CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS |
KR20170134771A (ko) | 2005-01-21 | 2017-12-06 | 제넨테크, 인크. | Her 항체의 고정 용량 투여법 |
KR101253576B1 (ko) | 2005-02-23 | 2013-04-11 | 제넨테크, 인크. | Her 이량체화 억제제를 이용한 암 환자에서의 질환진행까지의 시간 또는 생존의 연장 |
TW200642695A (en) * | 2005-03-08 | 2006-12-16 | Genentech Inc | Methods for identifying tumors responsive to treatment with her dimerization inhibitors (HDIs) |
JP2006316040A (ja) | 2005-05-13 | 2006-11-24 | Genentech Inc | Herceptin(登録商標)補助療法 |
US20060257400A1 (en) * | 2005-05-13 | 2006-11-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Combination therapy |
US8575164B2 (en) * | 2005-12-19 | 2013-11-05 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Combination cancer therapy |
WO2008095015A2 (en) * | 2007-01-30 | 2008-08-07 | The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital | Method of treating recurrent tumors |
EP2899541A1 (en) | 2007-03-02 | 2015-07-29 | Genentech, Inc. | Predicting response to a HER dimerisation inhbitor based on low HER3 expression |
US9551033B2 (en) * | 2007-06-08 | 2017-01-24 | Genentech, Inc. | Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment |
PL2171090T3 (pl) | 2007-06-08 | 2013-09-30 | Genentech Inc | Markery ekspresji genów odporności guza na leczenie hamujące HER2 |
EP2250173A1 (en) * | 2008-01-18 | 2010-11-17 | OSI Pharmaceuticals, Inc. | Imidazopyrazinol derivatives for the treatment of cancers |
JP2011520970A (ja) * | 2008-05-19 | 2011-07-21 | オーエスアイ・フアーマスーテイカルズ・インコーポレーテツド | 置換されたイミダゾピラジン類およびイミダゾトリアジン類 |
BRPI0812682A2 (pt) | 2008-06-16 | 2010-06-22 | Genentech Inc | tratamento de cáncer de mama metastático |
US20120064072A1 (en) | 2009-03-18 | 2012-03-15 | Maryland Franklin | Combination Cancer Therapy Comprising Administration of an EGFR Inhibitor and an IGF-1R Inhibitor |
AR075896A1 (es) | 2009-03-20 | 2011-05-04 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-her (factor de crecimiento epidermico) |
CA2752826A1 (en) | 2009-04-20 | 2010-10-28 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Preparation of c-pyrazine-methylamines |
JP2012526138A (ja) * | 2009-05-07 | 2012-10-25 | オーエスアイ・ファーマシューティカルズ,エルエルシー | 副腎皮質癌を治療するためのosi−906の使用 |
SG10201507044PA (en) | 2009-05-29 | 2015-10-29 | Hoffmann La Roche | Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer |
US8487083B2 (en) | 2009-06-30 | 2013-07-16 | OOO “Oncomax” | Monoclonal antibodies capable of simultaneously binding domains II and IIIc of type 1 fibroblast growth factor receptor |
BR122022001178B1 (pt) | 2009-10-26 | 2022-10-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Método para a produção de uma imunoglobulina glicosilada e seu uso |
JP5981853B2 (ja) | 2010-02-18 | 2016-08-31 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ニューレグリンアンタゴニスト及び癌の治療におけるそれらの使用 |
CN102770760A (zh) * | 2010-02-24 | 2012-11-07 | 佰欧迪塞克斯公司 | 利用质谱分析选择施用治疗剂的癌症患者 |
WO2011146568A1 (en) | 2010-05-19 | 2011-11-24 | Genentech, Inc. | Predicting response to a her inhibitor |
CA2812389C (en) | 2010-09-27 | 2019-12-31 | John Kehoe | Antibodies binding human collagen ii |
US8906649B2 (en) | 2010-09-27 | 2014-12-09 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies binding human collagen II |
EP2643353A1 (en) | 2010-11-24 | 2013-10-02 | Novartis AG | Multispecific molecules |
EP2655413B1 (en) | 2010-12-23 | 2019-01-16 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
RU2440142C1 (ru) | 2011-02-07 | 2012-01-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс" | Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты), способ подавления роста опухоли, способ диагностики злокачественных образований |
WO2012129145A1 (en) | 2011-03-18 | 2012-09-27 | OSI Pharmaceuticals, LLC | Nscle combination therapy |
KR20140057326A (ko) | 2011-08-17 | 2014-05-12 | 제넨테크, 인크. | 뉴레귤린 항체 및 그의 용도 |
US9327023B2 (en) | 2011-10-25 | 2016-05-03 | The Regents Of The University Of Michigan | HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells |
CN106987620A (zh) | 2011-11-30 | 2017-07-28 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 癌症中的erbb3突变 |
EP2788500A1 (en) | 2011-12-09 | 2014-10-15 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Identification of non-responders to her2 inhibitors |
WO2013148315A1 (en) | 2012-03-27 | 2013-10-03 | Genentech, Inc. | Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors |
AU2013287262A1 (en) * | 2012-07-05 | 2015-02-26 | Biodesix, Inc. | Method for predicting whether a cancer patient will not benefit from platinum-based chemotherapy agents |
EP2875020B1 (en) | 2012-07-19 | 2017-09-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Process for the preparation of a fumaric acid salt of 9-[4-(3-chloro-2-fluoro-phenylamino)-7-methoxy- chinazolin-6-yloxy]-1,4-diaza-spiro[5.5]undecan-5-one |
KR102291355B1 (ko) | 2012-11-30 | 2021-08-19 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Pd-l1 억제제 공동치료를 필요로 하는 환자의 식별방법 |
MX363403B (es) | 2013-07-04 | 2019-03-22 | Hoffmann La Roche | Inmumoensayo con interferencia suprimida para la deteccion de anticuerpos anti-farmacos en muestras de suero. |
TW201736399A (zh) * | 2015-12-31 | 2017-10-16 | 財團法人生物技術開發中心 | 抗vegfr抗體及其應用 |
WO2017194554A1 (en) | 2016-05-10 | 2017-11-16 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Combinations therapies for the treatment of cancer |
CN109952315A (zh) * | 2016-11-16 | 2019-06-28 | 伊莱利利公司 | 用于转移性结直肠癌的治疗 |
TWI665213B (zh) * | 2017-06-29 | 2019-07-11 | 財團法人生物技術開發中心 | 抗人類血管內皮生長因子受體之抗體及其應用 |
CN111108120A (zh) * | 2017-07-03 | 2020-05-05 | 财团法人生物技术开发中心 | 抗人类血管内皮生长因子受体的抗体及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5840301A (en) * | 1994-02-10 | 1998-11-24 | Imclone Systems Incorporated | Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors |
JPH11507535A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-07-06 | イムクローン システムズ インコーポレイテッド | 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類 |
US6342219B1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-01-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody compositions for selectively inhibiting VEGF |
Family Cites Families (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5328695A (en) * | 1983-03-22 | 1994-07-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Muscle morphogenic protein and use thereof |
US5130144B1 (en) * | 1984-02-06 | 1995-08-15 | Univ Johns Hopkins | Human stem cells and monoclonal antibodies |
US4714680B1 (en) * | 1984-02-06 | 1995-06-27 | Univ Johns Hopkins | Human stem cells |
US4965204A (en) * | 1984-02-06 | 1990-10-23 | The Johns Hopkins University | Human stem cells and monoclonal antibodies |
US4683295A (en) * | 1984-05-24 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Method for the preparation of anti-receptor antibodies |
US5674722A (en) * | 1987-12-11 | 1997-10-07 | Somatix Therapy Corporation | Genetic modification of endothelial cells |
JP3040121B2 (ja) * | 1988-01-12 | 2000-05-08 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法 |
US5470571A (en) * | 1988-01-27 | 1995-11-28 | The Wistar Institute | Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425 |
US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5705157A (en) * | 1989-07-27 | 1998-01-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of treating cancerous cells with anti-receptor antibodies |
US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5061620A (en) * | 1990-03-30 | 1991-10-29 | Systemix, Inc. | Human hematopoietic stem cell |
JP3854306B2 (ja) * | 1991-03-06 | 2006-12-06 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | ヒト化及びキメラモノクローナル抗体 |
US5543503A (en) * | 1991-03-29 | 1996-08-06 | Genentech Inc. | Antibodies to human IL-8 type A receptor |
US20010021382A1 (en) * | 1991-03-29 | 2001-09-13 | Genentech, Inc. | Vascular endothelial cell growth factor antagonists |
US5270458A (en) * | 1991-04-02 | 1993-12-14 | The Trustees Of Princeton University | Nucleic acids encoding fragments of hematopoietic stem cell receptor flk-2 |
US5185438A (en) * | 1991-04-02 | 1993-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2 |
US5367057A (en) * | 1991-04-02 | 1994-11-22 | The Trustees Of Princeton University | Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof |
US5861301A (en) * | 1992-02-20 | 1999-01-19 | American Cayanamid Company | Recombinant kinase insert domain containing receptor and gene encoding same |
CA2452130A1 (en) * | 1992-03-05 | 1993-09-16 | Francis J. Burrows | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
US5693482A (en) * | 1992-07-27 | 1997-12-02 | California Institute Of Technology | Neural chest stem cell assay |
US5981569A (en) * | 1992-11-13 | 1999-11-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Substituted phenylacrylonitrile compounds and compositions thereof for the treatment of disease |
US6177401B1 (en) * | 1992-11-13 | 2001-01-23 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften | Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis |
WO1994013804A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use |
JP3670302B2 (ja) * | 1993-07-23 | 2005-07-13 | ファナック株式会社 | 射出成形機における可塑化の管理方法 |
US5599703A (en) * | 1993-10-28 | 1997-02-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | In vitro amplification/expansion of CD34+ stem and progenitor cells |
US5840299A (en) * | 1994-01-25 | 1998-11-24 | Athena Neurosciences, Inc. | Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4 |
US6811779B2 (en) * | 1994-02-10 | 2004-11-02 | Imclone Systems Incorporated | Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy |
US6448077B1 (en) * | 1994-02-10 | 2002-09-10 | Imclone Systems, Inc. | Chimeric and humanized monoclonal antibodies specific to VEGF receptors |
US5861499A (en) * | 1994-02-10 | 1999-01-19 | Imclone Systems Incorporated | Nucleic acid molecules encoding the variable or hypervariable region of a monoclonal antibody that binds to an extracellular domain |
DE4417865A1 (de) * | 1994-05-20 | 1995-11-23 | Behringwerke Ag | Kombination von Tumornekrose-induzierenden Substanzen mit Substanzen, die durch Nekrosen aktiviert werden, zur selektiven Tumortherapie |
AT402796B (de) * | 1995-02-01 | 1997-08-25 | Fritschi Apparatebau | Schibindung |
US5663144A (en) * | 1995-05-03 | 1997-09-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compounds that bind to p185 and methods of using the same |
US5843633A (en) * | 1996-04-26 | 1998-12-01 | Amcell Corporation | Characterization of a human hematopoietic progenitor cell antigen |
JP3658471B2 (ja) * | 1996-09-30 | 2005-06-08 | 株式会社日立製作所 | 電子ショッピングシステムにおける買物かご機能の提示方法及び電子ショッピングシステム |
US6986890B1 (en) * | 1996-11-21 | 2006-01-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Anti-human VEGF receptor Flt-1 monoclonal antibody |
JP3746790B2 (ja) * | 1996-11-21 | 2006-02-15 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗ヒトVEGF受容体F1t―1モノクローナル抗体 |
DE69838334T2 (de) * | 1997-06-18 | 2008-06-12 | Merck & Co., Inc. (A New Jersey Corp.) | Kdr, ein menschlicher tyrosin kinase rezeptor |
US6417168B1 (en) * | 1998-03-04 | 2002-07-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods of treating tumors |
GB9824579D0 (en) * | 1998-11-10 | 1999-01-06 | Novartis Ag | Organic compounds |
US6245759B1 (en) * | 1999-03-11 | 2001-06-12 | Merck & Co., Inc. | Tyrosine kinase inhibitors |
US6297238B1 (en) * | 1999-04-06 | 2001-10-02 | Basf Aktiengesellschaft | Therapeutic agents |
US6703020B1 (en) * | 1999-04-28 | 2004-03-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF |
AU2001264946A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-12-03 | Imclone Systems Incorporated | Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production |
EP1682103A1 (en) * | 2003-10-27 | 2006-07-26 | Novartis AG | Indolyl-pyrroledione derivatives for the treatment of neurological and vascular disorders related to beta-amyloid generation and/or aggregation |
TW200640443A (en) * | 2005-02-23 | 2006-12-01 | Alcon Inc | Methods for treating ocular angiogenesis, retinal edema, retinal ischemia, and diabetic retinopathy using selective RTK inhibitors |
-
2002
- 2002-03-04 US US10/091,300 patent/US20030108545A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-03-04 EP EP03711384A patent/EP1487490A4/en not_active Withdrawn
- 2003-03-04 AU AU2003213697A patent/AU2003213697A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-04 JP JP2003574117A patent/JP2005525370A/ja not_active Withdrawn
- 2003-03-04 CA CA002478177A patent/CA2478177A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-04 WO PCT/US2003/006509 patent/WO2003075841A2/en not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-10-20 US US11/583,736 patent/US20090022714A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-07-25 US US11/828,285 patent/US20090022716A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-08-19 JP JP2010184243A patent/JP2011016812A/ja not_active Ceased
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5840301A (en) * | 1994-02-10 | 1998-11-24 | Imclone Systems Incorporated | Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors |
JPH11507535A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-07-06 | イムクローン システムズ インコーポレイテッド | 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類 |
US6342219B1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-01-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody compositions for selectively inhibiting VEGF |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN5004011749, HOOPER,H.A. et al, "Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR−2) Antibody Therapy Combined with Conventional Ch", Proc Amer Assoc Cancer Res, 200003, Vol.41, p.567 * |
JPN6009017192, SHAHEEN,R.M. et al, "Inhibited growth of colon cancer carcinomatosis by antibodies to vascular endothelial and epidermal", Br J Cancer, 2001, Vol.85, No.4, p.584−9 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008501651A (ja) * | 2004-06-03 | 2008-01-24 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | イリノテカン(cpt−11)およびegfr阻害剤を用いた処置 |
JP2016521262A (ja) * | 2014-02-26 | 2016-07-21 | イーライ リリー アンド カンパニー | 癌のための併用療法 |
JP2022548818A (ja) * | 2019-12-06 | 2022-11-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 抗vegfタンパク質組成物及びその製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2003213697A1 (en) | 2003-09-22 |
US20030108545A1 (en) | 2003-06-12 |
EP1487490A4 (en) | 2006-08-02 |
JP2011016812A (ja) | 2011-01-27 |
US20090022716A1 (en) | 2009-01-22 |
EP1487490A2 (en) | 2004-12-22 |
WO2003075841A3 (en) | 2003-11-27 |
US20090022714A1 (en) | 2009-01-22 |
WO2003075841A2 (en) | 2003-09-18 |
CA2478177A1 (en) | 2003-09-18 |
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---|---|---|
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US6811779B2 (en) | Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy | |
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