CN107254502A

CN107254502A - 一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法

Info

Publication number: CN107254502A
Application number: CN201710618551.8A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 王聪
Original assignee: Lanzhou Denong Animal Husbandry Technology Co Ltd
Current assignee: Lanzhou Denong Animal Husbandry Technology Co Ltd
Priority date: 2017-07-26
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2017-10-17

Abstract

本发明公开了一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，具体步骤如下：取新鲜健康羊胎盘，然后去除胎盘中的血水，冷藏，备用；然后将处理的羊胎盘打浆，然后加入相当于浆液体积5倍的蒸馏水，搅拌，离心，收集沉淀；在将沉淀用动物蛋白酶A消化，灭酶10min，离心收集上清；最后在0℃到‑5℃之间，将收集的上清液先用30000D的超滤膜进行一次超滤，再用5000D的超滤膜进行二次超滤，得到羊胎盘肽溶液，最后将羊胎盘溶液在35℃左右杀灭病毒5小时，即得到羊胎盘肽，该方法简单，肽得率高，对羊胎盘肽的利用具有重要意义。

Description

一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法。

背景技术

羊胎盘是由羊的子宫粘膜和尿囊绒毛膜发生联系所形成的，它是在母羊孕育胎儿时，胎儿血液和母体进行养分交换的组织，胎儿不仅可以通过胎盘排除自身的代谢物质，还可以从胎盘获得其生长发育所必须的氧气和养分，因此胎盘中含有活性物质以及丰富的营养成分。羊胎盘富含各种营养素，具有良好的免疫和抗氧化等功能活性，具有很高的营养和药用价值。大量临床实验证明，胎盘能过起到强身健体的作用，能够增加免疫器官指数，因此广泛应用于肿瘤、呼吸系统等引发机体免疫力降低上，但是主要以复方的形式存在，以羊胎盘为原材料的保健制品正处于开发阶段，潜在着巨大的商业价值，对羊胎盘保健品的制备及主要功效进行分析和探讨，有着重要的现实意义。但是大多数羊胎盘多作为废弃物被处理，加工量不到3%，造成巨大的资源浪费和污染环境，另一方面，羊的生殖期较为集中，导致羊胎盘资源在短期内难以加工处理，迫切需要拓展羊胎盘的资源化利用途径。

近年来活性肽的研究是食品科学与营养学方面的研究热点，但国内外有关制备羊胎盘肽的文献报道还比较少。不同蛋白酶都具有相对的底物专一性，酶切作用位点也不一样，有必要针对特定的羊胎盘原料进行蛋白酶的筛选，并寻找能够提高酶解获得胎盘肽的预处理方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，肽得率高。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，包括如下步骤：

第一步：取新鲜健康羊胎盘，然后去除胎盘中的血水，冷藏，备用；

第二步：将第一步处理的羊胎盘打浆，然后加入相当于浆液体积5倍的蒸馏水，搅拌，离心，收集沉淀；

第三步：第二步的沉淀用动物蛋白酶A消化，灭酶10min，离心收集上清；

第四步：在0℃到-5℃之间，将第三步收集的上清液先用30000D的超滤膜进行一次超滤，再用5000D的超滤膜进行二次超滤，得到羊胎盘肽溶液，最后将羊胎盘溶液在35 ℃左右杀灭病毒5小时，即得到羊胎盘肽。

优选的，第一步中，所述冷藏为-4℃下冷藏。

优选的，第二步为，将第一步处理的羊胎盘用打浆机打浆，然后加入相当于浆液体积5倍的蒸馏水，在磁力搅拌器中20℃搅拌2h，然后在离心杯中离心，收集沉淀。

优选的，所述离心为以1000 转/分的速度离心35 min。

优选的，所述消化为在pH 7.5～8温度为37℃条件下并静置5h；更优选的，消化使用动物蛋白酶B，添加量优选为300U/g。

优选的，所述一次超滤膜孔径为0.002um-0.003um，二次超滤膜孔径为3-5纳米，材料均为PSF。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，操作方便，步骤简单，成本低廉，并且适用于大规模生产，便于工业化应用，肽得率高，最高得率最高达45.15%。

附图说明

图1为不同酶添加量的水解度。

图2为不同酶添加量肽得率。

图3为不同处理酶解上清液中氨基氮质量和酸沉后上清液中总氮的质量。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例中所用材料如下：新鲜羊胎盘：兰州名德农牧科技有限公司提供；动物蛋白水解酶A、B：酶活单位1500U/g，厂家推荐适宜pH 7.0-8.0，适宜温度50℃,南宁庞博生物工程有限公司；中性蛋白酶：酶活单位200000 U/g，厂家推荐适宜pH 7.0-7.5，适宜温度50℃,南宁庞博生物工程有限公司；碱性蛋白酶：酶活单位200000 U/g，厂家推荐适宜pH7.5-9.0，适宜温度50 ℃，南宁庞博生物工程有限公司；

试剂如下：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、浓盐酸、浓硫酸、溴甲酚绿、甲基红、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、LH-N3试剂、LH-N2试剂，配置方法如下：

取49.93g的NaH₂P0₄•2H₂O固体溶于1600mL的蒸馏水中，配成0.2mol/L的NaH₂P0₄溶液；称取286.56g的Na₂HPO₄•12H₂O固体溶于4000ml的蒸馏水中，配成0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液。量取480mL的NaH₂P0₄溶液和2520mL的Na₂HPO₄溶液，充分混合配成3000mL的pH为7.5的缓冲液；量取585mL的NaH₂PO₄溶液和915mL的Na₂HPO₄溶液，充分混合配成1500mL的pH为7.0的缓冲液。(此过程中要用将固体充分溶解后再转移至容量瓶中定容，一次无法溶解完的可以分多次进行溶解定容。)

称取100g三氯乙酸固体，溶于蒸馏水中，然后定容到1000mL，配置成0.1g/mL的三氯乙酸溶液用以酸化。

用移液管移取2mL的浓盐酸（12mol/L）于烧杯中，加入478mL的蒸馏水，充分混合，配成0.05mol/L的盐酸用以滴定。

称取甲基红和溴甲酚绿各0.1g，分别用无水乙醇溶解，待充分溶解后，移入100mL的容量瓶中定容到100mL。再用移液管移取10mL的甲基红和50mL的溴甲酚绿于棕色指示剂瓶内充分混合，配成混合指示剂。（由于指示剂需要现配现用，此步骤在消化试验时进行）

称取氢氧化钠固体400g溶解后定容到1000mL，在凯式定氮时使用。（由于氢氧化钠固体溶于水时会放出大量的热，而且有刺鼻味散出，所以我们要在通风厨中进行，而且要等氢氧化钠充分溶解后再移入到容量瓶中定容）

称取硼酸固体20g溶解后定容到1000mL,在凯式定氮仪时使用。

仪器与设备如下：FA25高剪切分散乳化机、FA2004电子分析天平、 HX2002T电子天平、L-550台式低速离心机、KQ-600DE型数控超声波清洗器、UB-7酸度计、DF-101S集热式恒温加热搅拌器、GZX-9240 MBE电热恒温鼓风干燥箱、SD-1602电磁炉、SH220N石墨消解仪、K9840自动凯氏定氮仪、SHZ-82恒温振荡仪、化学需氧量（COD）快速测定仪。

分析与计算方法如下：

水分测定参照GB/T5009.3—2010食品中水分的测定方法；蛋白质总氮和原料蛋白质的测定方法为凯氏定氮法。

水解度（%）=上清液氨基氮/原料总氮*100%；

肽得率（%）=(上清液总氮-上清液氨基氮）/原料蛋白质*100%

实施例1、羊胎盘的处理

用剪刀将附着在子宫壁上的胎盘逐个减下，注意尽量不要将胎盘剪碎，保持胎盘的完整性。将剪下的胎盘用大量的清水清洗，尽可能的去处胎盘中的血水。然后称取一定量的羊胎盘放入冰箱冷藏中待用，将剩余的羊胎盘放入冰箱中冷冻起来，避免羊胎盘腐败。由于羊胎盘中含有的营养较高，因此不用的羊胎盘不可以放在冷藏上保存。

实施例2、动物蛋白酶的筛选

将称取好的羊胎盘用打浆机打成浆，打浆的时候要用塑料烧杯盛放，不可用玻璃烧杯，避免打浆机高速转动的转头接触到烧杯壁后发生炸裂。打浆的时候用保鲜膜将烧杯口封住，避免浆液迸溅。称取打好的浆100g，剩余的放入冰箱中冷冻保藏。100g浆中加入500mL的蒸馏水，放在磁力搅拌器中20℃搅拌2h。然后放入离心杯中离心20min，倒去上清液，将离心杯的沉淀刮下来留用。

取9个150mL的锥形瓶，每个锥形瓶中加入2g沉淀，然后分别加入0.002g、0.004g、0.006g、0.02g、0.04g、0.06g、0.2g、0.4g、0.6g的动物蛋白酶A，再每个锥形瓶中加入pH为7.5的缓冲液100mL，将锥形瓶用保鲜膜密封。再取9个150mL的锥形瓶，每个锥形瓶中加入2g沉淀，然后分别加入0.002g、0.004g、0.006g、0.02g、0.04g、0.06g、0.2g、0.4g、0.6g的动物蛋白酶B，再每个锥形瓶加入pH为7.5的缓冲液100mL，将锥形瓶用保鲜膜密封。放入恒温振荡器中设置50℃，振荡5h。振荡完成后取出放入沸水浴中灭酶10min。然后将灭好酶的溶液分别放入离心杯中，离心15min，取上清液并定容到100mL,再倒入干净的锥形瓶中，放入冰箱冷藏中备用。

打开化学需氧量（COD）快速测定仪，预热30min，加5mL蒸馏水，加LH-N3试剂0.5mL，再加LH-N2试剂0.5mL，混匀静置10分钟，作为空白对照组。然后置零，取制备的上清液1各5mL分别加入LH-N3试剂0.5mL，再加LH-N2试剂0.5mL，放入化学所需氧（COD）快速测定仪中，测出酶解上清液中氨基氮质量，每组做三个平行试验。

取配置好的样液15mL，再加入15mL的三氯甲酸，酸沉10min，放入离心机中离心，取上清液留用。

取57个消化管，每个管中先加入0.2g的硫酸铜和3g的硫酸钾固体，然后将之前配好的18组样液，每组样液取5mL加入消化管中，做三组平行，剩余三个消化管不加样液作为空白对照试验，然后每个管中再加入8mL的浓硫酸，再放入石墨消解仪中进行消化。刚开始用180℃消化30min，调温到250℃消化30min，再调温到320℃消化30min，最后用400℃消化30min，则消化完成。（注意由于浓硫酸具有强腐蚀性，在打开浓硫酸瓶和使用的过程中要小心）由于消化架上的位置只有20个，因此，我们要按顺序分批完成消化过程。

带消化管及其内的物质冷却后，用凯式定氮仪进行测氮。接口的锥形瓶中滴加两到三滴混合指示剂。在测氮过程中，设定仪器上用蒸馏水40mL，氢氧化钠20mL，硼酸10mL，测定时间为5分钟。测定完后锥形瓶中溶液呈蓝色。用0.05mol/L的盐酸对锥形瓶中溶液进行滴定，当蓝色变为无色时，滴定完成，记录所用的盐酸体积。（此过程中要注意，再准备消化时，漏斗和消化管要放在烘箱中烘干，不可沾水。消化完后，要待消化管充分冷却后再取下漏斗，不然挥发的蒸汽中会带走部分氮，造成氮损失。使用凯式定氮仪时，要注意观察蒸馏水、氢氧化钠和硼酸桶中的剩余的量，当溶液快达到警报线时要及时补充，还有蒸馏水桶内的管要保持干净，避免酸或碱进入，破坏仪器。）

用化学需氧量（COD）快速测定仪，同样的操作测出酸沉后上清液中总氮的质量，每组做三个平行试验，结果如图1和图2所示。

从图1可以看出动物蛋白酶A和B的水解度都随着酶活性的增加而增大，而且动物蛋白酶B的水解度一直都高于动物蛋白酶A的水解度，动物蛋白酶B的水解效果好，综合考虑选择动物蛋白酶B进行复合实验。

由图2可以看出，随着酶添加量的增加，动物蛋白酶B的肽得率和水解度始终处于增长趋势，但酶添加量高于45U/g后，肽得率增速放缓，甚至有下降趋势；酶添加量高于300U/g后，水解度值下降，300U/g对应的水解度最高，肽得率达到45.15%，达到较高值。综合考虑经济成本，选择动物蛋白酶B的添加量为300U/g。

实施例3、动物蛋白酶与中性蛋白酶、碱性蛋白酶木瓜蛋白酶和风味酶复合水解

将上步实验中冷冻的羊胎盘浆解冻，称取100g浆后做同样的处理，得到沉淀；取6个150mL的锥形瓶，每个锥形瓶中加入2g沉淀，然后编号1-6号。1号和4号各加入0.4g的动物蛋白酶B；2号加入中性蛋白酶0.08g；3号同时加入0.4g的动物蛋白酶B和0.08g的中性蛋白酶；5号加入0.06g的碱性蛋白酶；6号同时加入0.4g动物蛋白酶B和0.06g的碱性蛋白酶。1-3号锥形瓶加入pH为7.0的缓冲液，4-6号锥形瓶加入pH为7.5的缓冲液。然后将锥形瓶用保鲜膜密封，放入恒温振荡器中设置50℃，振荡5h后1号加入0.08g的中性蛋白酶，2号和5号加入0.4g的动物蛋白酶B，4号中加入0.06g的碱性蛋白酶，再放入恒温振荡器振荡5h。振荡完成后取出做同样处理，得到所需的样液2.

取配置好的样液30mL，再加入30mL的三氯乙酸，酸化10min，放入离心机中离心15min，取上清液留用。

取18个消化管，每个管中先加入0.2g的硫酸铜和3g的硫酸钾固体，然后将之前配好的18组样液，每组样液取10mL加入消化管中，做三组平行，然后每个管中再加入10mL的浓硫酸，再放入石墨消解仪中进行消化。消化时要四次调温，消化完成后，也用0.05mol/L的盐酸滴定，记录所用的盐酸体积。

将制备的样液2和酸沉后的样液2也进行同样氨氮测定操作，测出酶解上清液中氨基氮质量和酸沉后上清液中总氮的质量，结果如图3所示。

由图3可以看出，动物蛋白酶B单独作用时的肽得率为16.35%，动物蛋白酶B与碱性蛋白酶同时添加的水解度为15.62%，先加中性蛋白酶、后加碱性蛋白酶的水解度为15.95%，三者均处于较高值。但从成本角度考虑，动物蛋白酶单独添加可以达到水解效果。

由上述实施例得出碱性蛋白酶B的作用效果由于动物蛋白酶A，且单独作用效果较好。适宜的酶添加量为300U/g，根据此结果得到羊胎盘肽的优选工艺如下：

第一步：取新鲜健康羊胎盘，于低温环境下进行前处理过程，去除表面油污以及结缔组织等，用水清洗干净；

第二步：将第一步得到的羊胎盘与生理盐水按1 ∶1 的质量比混合，混合后在绞肉机上绞磨，得到绞磨液；

第三步：利用铺有灭菌纱布的托盘对绞磨液进行粗滤，得到羊胎盘组织A和粗滤液B；本实施例中，托盘为特制托盘，被绞磨的羊胎盘组织A留在拖盘内，而粗滤液B则会通过托盘收集至无菌容器；

第四步：将粗滤液B，调节pH 值至3.5-4.5，并在-20～-25的低温下保存3-5小时，之后再将粗滤液B升温至36-38℃化冻，加入Ca(OH)₂调pH 值至7.5 ～8，保持温度37℃并静置5小时，得到组织液C。

第五步：将组织液C，以1000 转/ 分的离心速度离心35 分钟离得上清液D；

第六步：在0℃到-5℃之间，将上清液D先用30000D的超滤膜进行一次超滤，其目的是去除多余的大分子量物质，之后再用5000D的超滤膜进行二次超滤，得到羊胎盘肽溶液E，将E溶液在35 ℃左右杀灭病毒5小时，即得到羊胎盘肽。

单纯的超滤可能会过滤掉许多肽分子，让制取出的羊胎盘肽产量达不到要求，所以本工艺进行了多次超滤过程，将不同分子量的物质通过滤膜的孔径进行划分，使羊胎盘肽的总体产量能够得到保障。

最终的提取物不只含有肽，还有包括其他小分子物质（如RNA等），因为羊胎盘中对人体有益的成分可能还包括一些不属于肽的小分子，本工艺最大程度的保留了羊胎盘内的有效成分，这是多数方法做不到的。

本实施例步骤三中的羊胎盘组织A可以通过真空冻干工艺，加工制成羊胎盘冻干粉。相比其他工艺大都是固液混合离心，固体物多被弃置，造成原料物浪费，而本工艺则最大化实现了对原材料的运用。本工艺与羊胎盘冻干粉的加工生产过程有机地结合在一起，大大提高了原料利用率，扩大了产品的总体价值，具有广阔的商业前景。

本实施例中，所述步骤三中特制的托盘其规格为1200mm*800mm，底面开D=10mm的均布小孔。纱布选择1205mm*805mm的过滤纱布，共两层。

本实施例中，所述步骤六中使用的一次超滤膜孔径为0.002um-0.003um，二次超滤膜孔径为3-5纳米，材料均为PSF。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，其特征在于：第一步中，所述冷藏为-4℃下冷藏。

3.根据权利要求1所述一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，其特征在于：第二步为，将第一步处理的羊胎盘用打浆机打浆，然后加入相当于浆液体积5倍的蒸馏水，在磁力搅拌器中20℃搅拌2h，然后在离心杯中离心，收集沉淀。

4.根据权利要求3所述一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，其特征在于：所述离心为以1000 转/分的速度离心35 min。

5.根据权利要求1所述一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，其特征在于：所述消化为在pH 7.5～8温度为37℃条件下并静置5h。

6.根据权利要求1所述一种动物蛋白酶制备羊胎盘肽的方法，其特征在于：所述一次超滤膜孔径为0.002μm-0.003μm，二次超滤膜孔径为3-5纳米，材料均为PSF。