CN102329842A - 羊胎素多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种羊胚胎及羊胎盘生物制品的制备方法。一种羊胎素多肽的制备方法，该方法包括以下的步骤:1）羊胚胎及羊胎盘原料前处理；2）羊胚胎及羊胎盘超微粉碎、细胞破壁；3）羊胚胎及羊胎盘的提取和酶解；4）采用葡聚糖凝胶层析法，根据分子量大小对上述步骤3）中得到的羊胎及羊胎盘素原液进行以下的分级精制制得羊胎素多肽。采用上述方法制得羊胎素多肽，使羊胎及羊胎盘的活性物质得到最大限度的保留，又便于人体全面吸收，工艺先进、合理，质量可控。

Description

羊胎素多肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种羊胚胎及羊胎盘生物制品及其制备方法。
背景技术
我国利用动物的各种器官、组织及代谢产物进行治病、防病和医疗保健的历史悠久，现存完整的药学典籍— — 《神农本草论》就有牛黄、犀角、鹿茸、阿胶等多种动物药物的记载。说明了我国在制药技术上早已利用动物药物进行加工、提取、精制而成较为纯净的药剂。
胎盘(Placenta)又名“紫河车”，为常用中药，现代医学研究表明：胎盘含有多种免疫球蛋白、活性肽等生物活性物质及氨基酸、矿物质等成分(统称活细胞素)，是一种机体免疫功能的调节剂和营养、美容保健品。科学家对多种动物胎盘进行对比实验后发现，羊胎盘的细胞组织结构与人胎盘最为相似，可望成为同人类胎盘具有同等养生价值的替代物。
近年来，在国内外又相继出现了动物胎盘水解液和胎盘浸提液二种新型羊胎盘生物制品，因其独特的效能，已引起人们的注目。但我们认为上述二种制剂各有弊端，前者在水解过程中将胎盘中的天然活性物质破坏，失去利用胎盘的意义；后者虽然有多种天然活性物质，但多肽及氨基酸含量甚微，如能使二者融为一体，既保留胎盘中的天然活性物质，又增加其多肽及氨基酸含量。无疑这在羊胎及羊胎盘生物制品开发研究中是一个新的突破。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种羊胎素多肽的制备方法。本发明的另外一个目的是提供上述的羊胎素多肽。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种羊胎素氨基酸的制备方法，该方法包括以下的步骤:
1）羊胚胎及羊胎盘原料前处理：取羊胚胎及羊胎盘为原料，清洗，去除杂质，0～5℃低温下粉碎成粗粉；
2）羊胚胎及羊胎盘超微粉碎、细胞破壁：将羊胚胎及羊胎盘粗粉低温-40℃～-50℃冷冻1～3h后，-30～-10℃超微粉碎，细胞破壁，达到0.1～10μm粒度；
3）羊胚胎及羊胎盘的提取和酶解：细胞破壁后的羊胚胎及羊胎盘浆液加3～8倍蒸馏水温浸提取后过滤得滤液A和沉淀A，沉淀A采用蛋白酶酶解后抽滤得水解液B，合并滤液A和水解液B，得羊胚胎及羊胎盘素的精制羊胎素；
4）采用葡聚糖凝胶层析法，根据分子量大小对上述步骤3）中得到的羊胎及羊胎盘素原液进行以下的分级精制：
①分离氨基酸，分子量<700的多肽：羊胚胎及羊胎盘素的精制羊胎素上样，固定相Sephadex G-10，依次用水，2%NaCl溶液洗脱，收集不同组分；
②分离分子量1000-5000的多肽：①中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-25，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分；
③分离分子量5000-30000的多肽：②中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-50，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分。
作为优选，上述的步骤1）中以2～3个月龄的羊胚胎及羊胎盘为原料。
作为优选，上述的步骤3）中蛋白酶采用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶中一种或两种混合。
作为优选，上述的步骤3）中蛋白酶的使用量为沉淀A重量的0.1%～2%。
作为再优选，上述的步骤3）中蛋白酶的使用量为沉淀A重量的0.3%～1%。
作为优选，上述的步骤3）中蛋白酶采用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶两种混合，酶解反应的温度为40～50℃，pH为7.0～8.0，木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的酶配比1：0.5～2。
作为再优选，步骤3）中酶解反应的温度为45℃，pH为7.5，木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的酶配比1：1。
为了实现上述的第二个目的，本发明还提供了上述的任意一项技术方案制备得到的羊胎素多肽。
本发明由于采用了上述的技术方案，该技术的生产加工过程既能充分提取羊胎及羊胎盘中的有效成分，使羊胎及羊胎盘的活性物质得到最大限度的保留，又便于人体全面吸收，工艺先进、合理，质量可控。采用上述方法制得羊胎素多肽，具有以下的作用：
1、调节女性内分泌，全面有效地改善人体皮肤状况，美容养颜，美白肌肤，增强皮肤弹性、去黑斑，防止皱纹、妊娠纹及延缓衰老；
2、可防止女性不孕症，流产，早产；
3、益精补髓，增加男子精子生产，改善不孕症（男女均有效），增加性功能；
4、调节平衡荷尔蒙，增加血液制造，改善贫血、气虚，增强细胞活力，加速产后恢复，帮助产妇泌乳；
5、提高人体免疫机能，推迟女性更年期，改善更年期综合症；
6、促进乳房发育，令产后松弛下垂的乳房恢复坚挺，富有弹性；
7、手术后的身体恢复；
8、抗过敏，抗肿瘤。
具体实施方式
实施例1
一种羊胎素多肽的制备方法，该方法包括以下的步骤：
1）羊胚胎及羊胎盘原料前处理：以２-３个月龄的羊胚胎及羊胎盘为原料，清洗、去除杂质，0-5℃低温下粉碎成粗粉。
2）羊胚胎及羊胎盘超微粉碎、细胞破壁：将羊胚胎及羊胎盘粗粉低温冷冻（-40℃～-45℃）2h后低温（-20℃）超微粉碎（WZJ100药用超微粉碎机），细胞破壁，达到0.1-10μm粒度。
3）羊胚胎及羊胎盘的提取和酶解：经超微粉碎、细胞破壁后的羊胚胎及羊胎盘浆液加6倍蒸馏水温浸提取后过滤得滤液A和沉淀A，沉淀A用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶酶解后抽滤得水解液B，酶解温度45℃，酶配比1g：1g，pH7．5，酶与底物为20mg：3g；合并滤液A和水解液B，得羊胚胎及羊胎盘素的精制羊胎素。
4）采用葡聚糖凝胶（DEAE SepharoseTM Fast Flow、Sephadex G-50）根据分子量大小对上述步骤3）中得到的羊胎及羊胎盘素原液进行分级精制，得到氨基酸、小分子多肽、和各种分子量蛋白的精制羊胎素。其工艺流程如下：
①分离氨基酸，分子量<700的多肽：羊胚胎及羊胎盘素的精制羊胎素上样，固定相Sephadex G-10，依次用水，2%NaCl溶液洗脱，收集不同组分。
②分离分子量1000-5000的多肽：①中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-25，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分。
③分离分子量5000-30000的多肽：②中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-50，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分。
④分离分子量30000-150000的蛋白质：③中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-100，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分。
⑤分离分子量150000-600000的蛋白质：④中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-200，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分。
采用凝胶渗透色谱-蒸发光散射(GPC-ELSD)法测定羊胎及羊胎盘生物制品的分子量分布，制定其质量标准。
步骤如下：
①取羊胚胎及羊胎盘原液、精制粉或者精制羊胎素，加入适量纯水加热或超声溶解，放冷，定容，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
②液相条件：流动相为纯水，流速1ml/min，柱温30℃；
③固定相：凝胶过滤色谱柱（GPC）色谱柱Shodex OHpak SB-806 HQ，Shodex OHpak SB-805 HQ，Shodex OHpak SB-804 HQ， Shodex OHpak SB-803 HQ串联；
④检测器：蒸发光散射检测器（ELSD），蒸发温度：100℃，雾化温度：80℃，氮气流速：1.5L/min。
实施例2
一种羊胎素多肽的制备方法，该方法除步骤3）中酶解采用木瓜蛋白酶外，其他技术方案如实施例1所述。

Claims (9)

1.羊胎素多肽的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤:
1）羊胚胎及羊胎盘原料前处理：取羊胚胎及羊胎盘为原料，清洗，去除杂质，0～5℃低温下粉碎成粗粉；
2）羊胚胎及羊胎盘超微粉碎、细胞破壁：将羊胚胎及羊胎盘粗粉低温-40℃～-50℃冷冻1～3h后，-30～-10℃超微粉碎，细胞破壁，达到0.1～10μm粒度；
3）羊胚胎及羊胎盘的提取和酶解：细胞破壁后的羊胚胎及羊胎盘浆液加3～10倍蒸馏水温浸提取后过滤得滤液A和沉淀A，沉淀A采用蛋白酶酶解后抽滤得水解液B，合并滤液A和水解液B，得羊胚胎及羊胎盘素的精制羊胎素；
4）采用葡聚糖凝胶层析法，根据分子量大小对上述步骤3）中得到的羊胎及羊胎盘素原液进行以下的分级精制：
①分离氨基酸，分子量<700的多肽：羊胚胎及羊胎盘素的精制羊胎素上样，固定相Sephadex G-10，依次用水，2%NaCl溶液洗脱，收集不同组分；
②分离分子量1000-5000的多肽：①中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-25，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分；
③分离分子量5000-30000的多肽：②中水洗脱液上样，固定相Sephadex G-50，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脱，收集不同组分。
2.根据权利要求1所述的羊胎素多肽的制备方法，其特征在于：步骤1）中以2～3个月龄的羊胚胎及羊胎盘为原料。
3.根据权利要求1所述的羊胎素多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）中蛋白酶采用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶中一种或两种混合。
4.根据权利要求1所述的羊胎素多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）中蛋白酶的使用量为沉淀A重量的0.1%～2%。
5.根据权利要求4所述的羊胎素多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）中蛋白酶的使用量为沉淀A重量的0.3%～1%。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的羊胎素多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）中蛋白酶采用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶两种混合，酶解反应的温度为40～50℃，pH为7.0～8.0，木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的酶配比1：0.5～2。
7.根据权利要求6所述的羊胎素多肽的制备方法，其特征在于：步骤3）中酶解反应的温度为45℃，pH为7.5，木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的酶配比1：1。
8.根据权利要求1或2或3或4或5所述的方法制备得到的羊胎素多肽。
9.根据权利要求6所述的方法制备得到的羊胎素多肽。
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