CN115252496A - 一种余甘子提取物的制备方法及其在防治紫外线损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种余甘子提取物的制备方法及其在防治紫外线损伤中的应用，对余甘子果实进行简单的提取干燥后可以得到富含总多酚的提取物，方法简单易于工业扩大化生产，得率高，由于使用单一部位进行提取，批次间质量稳定。得到的余甘子提取物可以显著提高由UVA/UVB引起的角质细胞损伤的细胞存活率，且具有优异的抗凋亡、抗氧化和抗炎功效，可以有效保护由UVA/UVB引起的角质细胞凋亡、氧化及炎症损伤，具有显著的防治紫外损伤的能力，可以应用于防晒类化妆品中。

Description

一种余甘子提取物的制备方法及其在防治紫外线损伤中的 应用
技术领域
本发明涉及一种余甘子提取物的制备方法及其在防治紫外线损伤中的应用。
背景技术
紫外线是引起皮肤损伤的重要因素之一，会导致不可逆的细胞损伤、皮肤炎症、光老化和皮肤癌，其机制可能为UV引起的基因毒性、氧化应激、神经内分泌和炎症等。UV分为长波紫外线UVA(波长为320-340nm)、中波紫外线UVB(波长为280-320nm)和短波紫外线UVC(波长200-280nm)。可以辐照到地面的紫外线95％为UVA，5％为UVB，UVA和UVB的照射会引起表皮组织中活性氧(ROS)生成量增加，过多的ROS会引发细胞内蛋白质、DNA、膜脂等成分的氧化损伤，破坏正常的细胞结构，引起皮肤的光损伤和光老化，甚至会进一步引起皮肤癌等疾病。过量的紫外线照射也可以引起细胞分泌一系列炎症因子，诱发皮肤炎症及加速皮肤损伤。紫外辐射可以诱导人体皮肤产生基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)，MMP能特异地降解几乎所有的细胞外基质成分，在皮肤光老化中起着重要作用。
角质形成细胞是表皮的主要组成细胞，具有保护机体免受外界物理、化学和微生物等多种因素损伤的作用。HaCaT细胞是一种被转化但非致癌的角质形成细胞，是国际上研究角质形成细胞最为常用的细胞株。建立了一种使用UVA/UVB诱导HaCaT细胞的光损伤模型，通过评估细胞保护、细胞凋亡、抗氧化能力、抗炎能力和抗光老化能力，可以研究植物提取物的防治紫外线能力。
余甘子又名油甘子，为大戟科叶下珠属植物余甘子(Phyllanthus emblica L.)的干燥成熟果实，味甘、酸、涩、凉，具有生津止咳、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血脂等功效。余甘子为药食同源植物，富含多酚、维生素、多糖、黄酮、氨基酸及生物碱，多酚为余甘子最为显著的抗氧化有效成分。
目前国内外对余甘子的研究主要集中在提取制备及抗氧化、抗衰方面，现有专利201310526465.5公开了一种余甘子提取物在制备具有抗辐射和抗衰老功效的保健食品和化妆品中的应用，检测了其对3T3细胞的UVA辐照保护作用、DNA损伤保护作用及抗炎作用。该专利使用甲醇、正丁醇作为提取溶剂，可能会使提取物残留甲醇、正丁醇有机溶剂，不适用于护肤品的制备，存在一定的安全风险。现有专利201711249854.3公开了一种余甘子具有提高基底膜相关基因和抗衰老相关基因表达能力，用于制备皮肤外用剂的应用。该专利没有进一步探究在护肤品中应用的实例。现有专利201911366808.0公开了一种余甘子提取物及其制备方法，使用醇提、高岭土吸附及柱层析，所得多酚含量≥98％，但是该专利提取物得率在1.36％左右，其方法较为繁琐，得率较低，不适用于工业扩大化生产。本专利使用更安全的试剂提取及更简单的提取方法，将余甘子提取物得率提升至60％，并且对UVA/UVB全面的紫外线防护，具有良好的防晒护肤品应用前景。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种余甘子提取物的制备方法，对余甘子进行简单的提取干燥后可以得到富含总多酚的提取物，方法简单易于工业扩大化生产，得率高，由于使用单一部位进行提取，批次间质量稳定。
本发明的另外一个目的是提供一种余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用。
实现上述目的一种技术方案是：一种余甘子提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将干燥洁净的余甘子果实用植物粉碎机粉碎，过4～6目筛，得到余甘子粉末原料；
S2，提取步骤：以60～80％的乙醇水混合液为溶剂，将粉碎好的余甘子粉末原料和溶剂按固液质量比1:5～10g/ml，提取温度为50～80℃进行加热回流提取；
S3，浓缩步骤：使用旋转蒸发仪、水浴加热对提取液进行浓缩，浓缩温度为40～70℃，浓缩至无醇味，得到浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冷冻干燥机将浓缩液在低温下干燥成粉末，获得余甘子提取物。
上述的一种余甘子提取物的制备方法，所述粉碎步骤中，余甘子果实采用大戟科叶下珠属云南植物余甘子的干燥去核果实。
上述的一种余甘子提取物的制备方法，所述回流提取步骤中，采用乙醇水混合液对余甘子粉末原料进行1～3次加热回流提取，每次加热回流提取时间为1～3h。
上述的一种余甘子提取物的制备方法，余甘子提取物的得率≥60.0％，其中余甘子提取物的多酚含量≥40.0％，没食子酸含量≥2.0％。
本发明还提供了一种余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用。
上述的一种余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用，其中，将所述余甘子提取物作为皮肤防护紫外线有效成分，用于制备防治紫外线损伤护肤品中。
上述的一种余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用，其中，所述余甘子提取物用于保护由UVA辐照和/或UVB辐照引起的角质细胞的损伤和凋亡，以及清除产生的活性氧簇、降低炎症因子的释放、减少基质金属蛋白酶的产生。
采用本发明的余甘子提取物的制备方法及其应用的技术方案，积极进步效果在于：
(1)采用本发明的制备方法所得的余甘子提取物，制备工艺简单，适于工业化扩大生产；得率高，可以充分利用资源，制备成本低，具有市场竞争力；主要成分为总多酚，含量高，易于质量控制；
(2)采用本发明的制备方法所得的余甘子提取物，配制成溶液时，颜色澄清透明，可以在护肤品等对颜色要求高的产品中广泛使用；
(3)采用本发明的制备方法所得的余甘子提取物，可以有效保护由于UVA及UVB辐照引起的角质细胞的损伤和凋亡，以及清除产生的活性氧簇、降低炎症因子的释放和减少基质金属蛋白酶(MMP3)的产生，具有显著的防护紫外线损伤能力，可以用于制备防治紫外线损伤护肤品中；
(4)采用本发明的制备方法所得的余甘子提取物，通过光毒性检测试验，确保其不具有光毒性，保证了其安全性；通过致敏实验，确保其不具有致敏性；通过稳定性实验，确保其良好的稳定性。
附图说明
图1为实施例1的总多酚含量测定中没食子酸标准品的线性关系图谱。
图2为实施例1的余甘子提取物的液相色谱图。
图3为实施例1的没食子酸含量测定中没食子酸标准品的线性关系图谱。
图4为本发明的一种具有防治紫外线损伤能力的余甘子提取物的实施例2对HaCaT细胞成长的影响(n＝3)。
图5为余甘子提取物对UVA/UVB辐照后HaCaT细胞增殖活性的影响(n＝3)。
图6为余甘子提取物对UVA/UVB辐照后HaCaT细胞活性氧簇(ROS)表达量的影响(n＝3)。
图7A为余甘子提取物对UVA辐照后HaCaT细胞凋亡率的影响(n＝3)。
图7B为余甘子提取物对UVB辐照后HaCaT细胞凋亡率的影响(n＝3)。
图8A为余甘子提取物对UVA/UVB辐照后HaCaT细胞IL-1α释放量的影响(n＝3)。
图8B为余甘子提取物对UVA/UVB辐照后HaCaT细胞IL-6释放量的影响(n＝3)。
图9为余甘子提取物对UVA/UVB辐照后HaCaT细胞MMP-3基因表达的影响(n＝3)。
图10为对比例1-5所制得的余甘子提取物对UVA/UVB辐照后HaCaT细胞增殖活性的影响(n＝3)。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
实施例1：
一种具有防治紫外线损伤能力的余甘子提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将干净干燥的余甘子使用植物粉碎机粉碎，过4～6目筛，得到余甘子粉末原料；
S2，提取步骤：准确称取100g粉碎后的余甘子粉末原料，加入60％乙醇水溶液1000ml，60℃回流提取3小时，提取2次，合并滤液，抽提过滤得到提取液；
S3，浓缩步骤：使用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冷冻干燥机将浓缩液在低温下干燥成粉末，获得粉末状的余甘子提取物，经计算得率为61.23％。
请参阅图1，该余甘子提取物中总多酚含量的测定，包括以下步骤：
(1)没食子酸标准曲线的绘制：精密称取没食子酸标准品0.0025g于20ml容量瓶内，加乙醇至刻度，溶解，制成没食子酸标准品溶液。将所述没食子酸溶液品溶液对倍稀释，获得不同浓度的没食子酸标准品溶液。分别吸取不同浓度的没食子酸标准品溶液0.5ml于10ml容量瓶中，加入10％的福林酚溶液5ml，摇匀后静置5min，加入10％碳酸钠溶液至刻度线，避光静置反应1h，使用紫外-分光光度计于740nm处其吸光值，以吸光值为横坐标，以没食子酸的浓度(mg/ml)为纵坐标绘制没食子酸标准曲线。浓度在0-0.125mg/ml呈线性，线性回归方程为：Y＝0.0319X-0.0027，R2＝0.9902。
(2)余甘子多酚含量的测定：采用福林酚比色法，取0.5ml浓度为0.1mg/ml的提取液于10ml容量瓶中，按照上述方法测定吸光度，根据标准曲线计算总多酚含量为42.0％。
请参阅图2和图3，余甘子提取物中没食子酸含量的测定，包括以下步骤：
(1)没食子酸对照品溶液制备步骤：精密称取没食子酸对照品于20ml容量瓶内，加乙醇至刻度，溶解，备用。
(2)供试品溶液的配置：称取本发明制备的余甘子提取物适量，于20ml容量瓶内，加乙醇至刻度，溶解，备用。
(3)过滤：将没食子酸对照品及供试品溶液使用0.22μm滤膜过滤。
(4)线性相关性考察：将所述没食子酸溶液对照品溶液对倍稀释，注入高效液相色谱仪进行分析，进样量为10μl，以每个对照品的进样浓度Y为纵坐标，峰面积值X为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程及线性范围；高效液相色谱仪的参数如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ C18(4.6mm×250mm，5μm)；
检测波长：270nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL·min-1；
流动相：A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈，洗脱条件：0-10min:10％B。色谱图请参阅图2，没食子酸对照品溶液倍比稀释后，浓度在6.55μg/ml-209.6μg/ml呈线性，线性回归方程为：Y＝28.477X-8.4814，R2＝1。
(5)余甘子提取物中没食子酸含量确定步骤：吸取供试液10μl，注入高效液相色谱仪，通过没食子酸对照品溶液的色谱峰和待检测的供试液的色谱峰对比，见图3，以线性回归方程计算，得到所述余甘子提取物中没食子酸的含量为2.13％，对余甘子提取物的质量进行控制。
实施例2：
一种具有防治紫外线损伤能力的余甘子提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将干净干燥的余甘子使用植物粉碎机粉碎，过4～6目筛，得到余甘子粉末原料；
S2，提取步骤：准确称取800g粉碎后的余甘子粉末原料，加入70％乙醇水溶液1000ml，70℃回流提取2小时，提取2次，合并滤液，抽提过滤得到提取液；
S3，浓缩步骤：使用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冷冻干燥机将浓缩液在低温下干燥成粉末，获得粉末状的余甘子提取物，经计算得率为62.31％。
参照实施例1进行总多酚含量及没食子酸含量的测定，采用福林酚比色法测得总多酚含量为44.23％，使用高效液相色谱计算其余甘子提取物中没食子酸含量为2.26％。取冻干制得的余甘子提取物适量于培养基中溶解，待用。
实施例3：
请参阅图4，对实施例2得到的余甘子提取物进行HaCaT细胞的毒性试验，包括以下步骤：
接种细胞：取对数生长期的HaCaT细胞进行消化收集，对细胞进行计数，使得细胞浓度为1*105/ml，将HaCaT细胞接种于96孔板中，每孔体积0.1ml。
处理细胞：当细胞处于对数生长期且融合近80％时弃除旧培养液，加入不同浓度的余甘子培养液0.1ml，设置其浓度为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml和1000μg/ml，设置三个复孔，加药后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
检测毒性：取出96孔板，每孔加入CCK-8试剂10μl孵育2h，于酶标仪450nm测其吸收值，获得余甘子提取物的安全给药浓度。其结果如图4所示，余甘子培养液浓度≤200μg/ml时，细胞存活率大于80％，对HaCaT细胞无明显的细胞毒性。
实施例4：
请参阅图5，对实施例2得到的余甘子提取物进行HaCaT细胞增殖活性的测定，包括以下步骤：
将HaCaT细胞接种于96孔板，细胞分为9个实验组，分别为空白组(无紫外辐照)、UVA模型组、200μg/ml余甘子+UVA组，100μg/ml余甘子+UVA组、50μg/ml余甘子+UVA组、UVB模型组、200μg/ml余甘子+UVB组、100μg/ml余甘子+UVB组、50μg/ml余甘子+UVB组。按照细胞浓度为1*105/ml接种细胞，每孔0.1ml，每组设置三个复孔，孵育24h后，加入不同浓度的余甘子培养液孵育2h，将培养液替换成含有不同浓度的余甘子PBS缓冲溶液，在UVA及UVB仪器下照射一定时间(UVA辐照剂量为10J/cm2、UVB辐照剂量为20mJ/cm2)，照射后弃去培养基，用PBS洗两遍，加入完全培养基继续培养24h。取出96孔板，每孔加入CCK-8试剂10μl孵育2h，于酶标仪450nm测其吸光度，计算细胞存活率。
其结果如图5，UVA及UVB辐照模型组细胞活性均低于空白组，说明UVA及UVB能造成HaCaT细胞的损伤，加入余甘子培养液的细胞活性随着余甘子浓度的升高而增加，均高于照射模型组，差别具有统计学意义(P＜0.05)，说明余甘子对UVA/UVB辐射诱发的细胞增殖活性损伤有良好的防护作用。
实施例5：
请参阅图6，对实施例2得到的余甘子提取物进行HaCaT细胞内活性氧ROS水平测定，包括以下步骤：
设立9个实验组，分别为空白组(无紫外辐照)、UVA模型组、200μg/ml余甘子+UVA组，100μg/ml余甘子+UVA组、50μg/ml余甘子+UVA组、UVB模型组、200μg/ml余甘子+UVB组，100μg/ml余甘子+UVB组、50μg/ml余甘子+UVB组，每组至少设置3个复孔。取对数生长期的HaCaT细胞进行消化收集，对细胞进行计数，使得细胞浓度为1.6*105/ml，将HaCaT细胞接种于6孔板中，每孔体积2ml，孵育24h后，加入不同浓度的余甘子培养液孵育2h，将培养液替换成含有不同浓度的余甘子PBS缓冲溶液，在UVA及UVB仪器下照射一定时间(UVA辐照剂量为10J/cm2、UVB辐照剂量为20mJ/cm2)，照射后弃去培养基，用PBS洗两遍，加入完全培养基继续培养24h。去除细胞培养液，加入10μM DCFH-DA荧光探针，于37℃细胞培养箱中避光孵育20min，用无血清培养液洗涤三次，使用流式细胞仪测定其荧光值。DCFH-DA本身无荧光，进入细胞可被酯酶水解为DCFH，细胞存在ROS时DCFH被其氧化为DCF，DCF具有强绿色荧光，因此可通过检测DCF的荧光强度，间接观察ROS水平的变化。
其结果如图6，UVA及UVB辐照模型组细胞内ROS的相对表达量明显高于空白组，说明UVA及UVB的辐照能显著提升细胞内ROS的水平。加入余甘子培养液的细胞内ROS的相对表达量随着余甘子浓度的升高而降低，均低于照射模型组，200μg/ml余甘子+UVA组可以清除UVA辐照引起的ROS含量增高(P＜0.05)，200μg/ml、100μg/ml和50μg/ml余甘子+UVB组可以有效清除UVB辐照引起的ROS含量增高(P＜0.01)，说明余甘子可以有效清除UVA/UVB诱导的ROS。
实施例6：
请参阅图7A和图7B，对实施例2得到的余甘子提取物进行HaCaT细胞凋亡率实验测定，包括以下步骤：
设立9个实验组，分别为空白组(无紫外辐照)、UVA模型组、200μg/ml余甘子+UVA组，100μg/ml余甘子+UVA组、50μg/ml余甘子+UVA组、UVB模型组、200μg/ml余甘子+UVB组，100μg/ml余甘子+UVB组、50μg/ml余甘子+UVB组，每组至少设置3个复孔。取对数生长期的HaCaT细胞进行消化收集，对细胞进行计数，使得细胞浓度为1.6*105/ml，将HaCaT细胞接种于6孔板中，每孔体积2ml，孵育24h后，加入不同浓度的余甘子培养液孵育2h，将培养液替换成含有不同浓度的余甘子PBS缓冲溶液，在UVA及UVB仪器下照射一定时间(UVA辐照剂量为10J/cm2、UVB辐照剂量为20mJ/cm2)，照射后弃去培养基，用PBS洗两遍，加入完全培养基继续培养24h，吸出培养液，消化，1000r/min离心5min，去上清，使用4℃PBS洗2次，离心收集细胞沉淀，然后加入195μL Binding Buffer悬浮细胞，在悬浮细胞液中加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶，室温避光孵育20min，使用流式细胞仪检测其凋亡率。
其结果如图7A和图7B，经UVA/UVB辐照后的HaCaT细胞的早期凋亡、晚期凋亡及坏死率都明显增多，加入余甘子培养液的早期凋亡、晚期凋亡及坏死率均低于照射模型组，差别具有统计学意义(P＜0.05)，说明余甘子能显著缓解UVA/UVB损伤的细胞凋亡及坏死。
实施例7：
请参阅图8A和图8B，对实施例2得到的余甘子提取物进行HaCaT的抗炎功效测定，包括以下步骤：
设立9个实验组，分别为空白组(无紫外辐照)、UVA模型组、200μg/ml余甘子+UVA组，100μg/ml余甘子+UVA组、50μg/ml余甘子+UVA组、UVB模型组、200μg/ml余甘子+UVB组，100μg/ml余甘子+UVB组、50μg/ml余甘子+UVB组，取对数生长期的HaCaT细胞进行消化收集，对细胞进行计数，使得细胞浓度为3*105/ml，将HaCaT细胞接种于96孔板中，每孔体积0.5ml，每组至少3个复孔。孵育24h后，加入不同浓度的余甘子培养液孵育2h，将培养液替换成含有不同浓度的余甘子PBS缓冲溶液，在UVA及UVB仪器下照射一定时间(UVA辐照剂量为10J/cm2、UVB辐照剂量为20mJ/cm2)，照射后弃去培养基，用PBS洗两遍，加入完全培养基继续培养24h。收取上清液，使用IL-6、IL-1αELISA试剂盒测试检测在490nm处检测吸收值，因此计算出IL-6、IL-1α的相对释放量。
结果如图8A，与空白组相比，UVA/UVB辐照后HaCaT的IL-1α相对表达量明显升高，100μg/ml和200μg/ml的余甘子可以有效降低UVA/UVB引起的IL-1α的增加，差异具有明显统计学意义(P＜0.05)，图8B表明，UVB辐照后HaCaT的IL-6相对表达量显著升高，加入余甘子培养液的细胞的IL-6相对表达量随着余甘子浓度增加而降低，差异具有明显统计学意义(P＜0.05)。说明了UVA/UVB辐照可致使细胞炎症因子的分泌量增加，余甘子可以缓解炎症因子的释放，对细胞具有光防护作用。
实施例8：
请参阅图9，对实施例2得到的余甘子提取物对HaCaT的MMP3基因表达的测定，包括以下步骤：
设立9个实验组，分别为空白组(无紫外辐照)、UVA模型组、200μg/ml余甘子+UVA组，100μg/ml余甘子+UVA组、50μg/ml余甘子+UVA组、UVB模型组、200μg/ml余甘子+UVB组，100μg/ml余甘子+UVB组、50μg/ml余甘子+UVB组，每组至少设置3个复孔。取对数生长期的HaCaT细胞进行消化收集，对细胞进行计数，使得细胞浓度为1.6*105/ml，将HaCaT细胞接种于6孔板中，每孔体积2ml，孵育24h后，加入不同浓度的余甘子培养液孵育2h，将培养液替换成含有不同浓度的余甘子PBS缓冲溶液，在UVA及UVB仪器下照射一定时间(UVA辐照剂量为10J/cm2、UVB辐照剂量为20mJ/cm2)，照射后弃去培养基，用PBS洗两遍，加入完全培养基继续培养24h。取各组细胞用Trizol试剂提取总RNA，测定纯度后，在逆转录酶(MLV)催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增，进行RT-PCR实验检测MMP3基因表达量。反应条件为:94℃5min；94℃30s，57℃35s，72℃35s，共40个循环；72℃延伸10min。
结果如图9，经UVA/UVB辐照后的HaCaT细胞的MMP3基因表达均明显上调，加入余甘子培养液的MMP3基因表达均低于照射模型组，差别具有统计学意义(P＜0.01)，说明余甘子能显著降低UVA/UVB损伤导致的细胞MMP3基因表达量。
综上所述，通过考察余甘子提取物对紫外损伤模型角质细胞的保护作用，各试验表明，余甘子提取物可以显著提高由UVA/UVB引起的角质细胞损伤的细胞存活率，且具有优异的抗凋亡、抗氧化和抗炎功效，可以有效保护由UVA/UVB引起的角质细胞凋亡、氧化及炎症损伤，具有显著的防治紫外损伤的能力，有望应用于防晒类化妆品中。
对比例1：
对比例1的余甘子提取物，通过以下制备方法制备：
将干净干燥的余甘子使用植物粉碎机粉碎，过4目筛，准确称取100g粉碎后的余甘子粉末，加入20％乙醇1000ml，70℃回流提取2小时，提取2次，合并滤液，抽提过滤得到提取液，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液，使用冷冻干燥机进行低温干燥，得余甘子提取物粉末，经计算得率为43.21％，使用福林酚比色法测得总多酚含量为20.31％，使用高效液相色谱计算其余甘子提取物中没食子酸含量为1.07％。取冻干制得的余甘子提取物适量于培养基中溶解，待用。
对比例2：
对比例2的余甘子提取物，通过以下制备方法制备：
将干净干燥的余甘子使用植物粉碎机粉碎，过4目筛，准确称取80g粉碎后的余甘子粉末，加入90％乙醇1000ml，60℃回流提取2小时，提取2次，合并滤液，抽提过滤得到提取液，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液，使用冷冻干燥机进行低温干燥，得余甘子提取物粉末，经计算得率为21.94％，使用福林酚比色法测得总多酚含量为10.54％，使用高效液相色谱计算其余甘子提取物中没食子酸含量为0.54％。取冻干制得的余甘子提取物适量于培养基中溶解，待用。
对比例3：
对比例3的余甘子提取物，通过以下制备方法制备：
将干净干燥的余甘子使用植物粉碎机粉碎，过6目筛，准确称取100g粉碎后的余甘子粉末，加入H2O 1000ml，80℃回流提取2小时，提取3次，合并滤液，抽提过滤得到提取液，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液，使用冷冻干燥机进行低温干燥，得余甘子提取物粉末，经计算得率为10.54％，使用福林酚比色法测得总多酚含量为5.71％，使用高效液相色谱计算其余甘子提取物中没食子酸含量为0.26％。取冻干制得的余甘子提取物适量于培养基中溶解，待用。
对比例4：
对比例4的余甘子叶提取物，通过以下制备方法制备：
将干净干燥的余甘子叶使用植物粉碎机粉碎，过4目筛，准确称取80g粉碎后的余甘子叶粉末，加入60％乙醇1000ml，70℃回流提取2小时，提取2次，合并滤液，抽提过滤得到提取液，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液，使用冷冻干燥机进行低温干燥，得余甘子提取物粉末，经计算得率为45.21％，使用福林酚比色法测得总多酚含量为26.37％，使用高效液相色谱计算其余甘子叶提取物中没食子酸含量为0.78％。取冻干制得的余甘子提取物适量于培养基中溶解，待用。
对比例5：
对比例5的余甘子根皮提取物，通过以下制备方法制备：
将干净干燥的余甘子根皮使用植物粉碎机粉碎，过8目筛，准确称取100g粉碎后的余甘子粉末，加入60％乙醇1000ml，70℃回流提取2小时，提取2次，合并滤液，抽提过滤得到提取液，旋转蒸发至原体积的1/10及无醇味，得浓缩液，使用冷冻干燥机进行低温干燥，得余甘子根皮提取物粉末，经计算得率为35.78％，使用福林酚比色法测得总多酚含量为12.31％，使用高效液相色谱计算其余甘子根皮提取物中没食子酸含量为0.32％。取冻干制得的余甘子根皮提取物适量于培养基中溶解，待用。
对比例的HaCaT细胞增殖活性的测定实验：
请参阅图10，对比例1-5的余甘子提取物进行HaCaT细胞增殖活性的测定，包括以下步骤：
将HaCaT细胞接种于96孔板，细胞分为13个实验组，分别为空白组(无紫外辐照)、UVA模型组、200μg/ml余甘子(对比例1)+UVA组，200μg/ml余甘子(对比例2)+UVA组、200μg/ml余甘子(对比例3)+UVA组、200μg/ml余甘子叶(对比例4)+UVA组、200μg/ml余甘子根皮(对比例5)+UVA组、UVB模型组、200μg/ml余甘子(对比例1)+UVB组，200μg/ml余甘子(对比例2)+UVB组、200μg/ml余甘子(对比例3)+UVB组、200μg/ml余甘子叶(对比例4)+UVB组、200μg/ml余甘子根皮(对比例5)+UVB组。按照细胞浓度为1*105/ml接种细胞，每孔0.1ml，每组设置三个复孔，孵育24h后，加入不同浓度的余甘子培养液孵育2h，将培养液替换成含有不同浓度的余甘子PBS缓冲溶液，在UVA及UVB仪器下照射一定时间(UVA辐照剂量为10J/cm2、UVB辐照剂量为20mJ/cm2)，照射后弃去培养基，用PBS洗两遍，加入完全培养基继续培养24h。取出96孔板，每孔加入CCK-8试剂10μl孵育2h，于酶标仪450nm测其吸光度，计算细胞存活率。
其结果如图10，UVA及UVB辐照模型组细胞活性均低于空白组，说明UVA及UVB能造成HaCaT细胞的损伤，加入余甘子培养液(对比例1-5)的细胞活性与模型组相比均未有显著上升，说明通过对比例1-5制得的余甘子提取物对UVA/UVB辐射诱发的细胞增殖活性损伤无防护作用。通过实施例1-4与对比例1-3的结果证明，以60-80％的乙醇水溶液为溶剂加热回流提取获得的余甘子提取物得率更高，多酚含量更丰富，具有紫外损伤防护作用。通过实施例1-4与对比例4-5的结果证明，使用余甘子的干燥去核果实制得的余甘子提取物和余甘子叶、余甘子根皮提取物相比具有更高的得率及多酚和没食子酸含量，并且具有紫外损伤防护作用。
稳定性实验：
对实施例2得到的余甘子提取物进行稳定性实验，包括以下步骤：
将实施例2得到的余甘子提取物配置成4mg/ml的余甘子提取液，称取余甘子提取液各5份于考察瓶中，质量均为50g，置于4℃、25℃、40℃+光照、高低温循环培养箱中进行稳定性实验。试验期间第1、3、7、15、30天取样检测其pH值，试验第30天采用实施例1的HPLC法检测其没食子酸含量变化情况，结果如下表1。
Figure BDA0003803676710000121
Figure BDA0003803676710000131
表1
由数据分析得出，由余甘子提取物配置的提取液在高低温、光照等环境中pH均无明显变化，其没食子酸含量也无显著变化，说明余甘子提取液的稳定性高，可用于后续的护肤品配方中。
防晒增效实验：
将实施例2的余甘子提取物添加在防晒类化妆品中，测试其防晒增效效果，步骤如下：
将实施例2得到余甘子提取物配制成4mg/ml的余甘子提取液应用于防晒霜中，防晒霜各组分的配方如表2所示：
Figure BDA0003803676710000132
Figure BDA0003803676710000141
表2
防晒霜的制备方法：A相和B相分别加热至80～85℃。待两相完全溶解后，将A相倒入B相，置于均质机均质5min，6000rpm。混合均匀后搅拌冷却至45-50℃，加入C相，继续搅拌，制成防晒霜。
按照表2的配方制得的余甘子提取物应用在防晒霜中的实施例9，并参照同样的方法制备不添加余甘子提取液的对比例6。
本实验采用体外SPF值及PA值Colipa2011的标准体外测试方法测定，通过测定防晒化妆品的紫外吸光度或透过率来评价防晒化妆品的防晒效果。本实验采用UV2000s型防晒系数分析仪。
将对比例6及实施例9的防晒霜以2mg/cm2的量涂敷在PMMA板上，干燥15分钟后，使用UV2000s测量，重复三次取平均值，结果见表3。
样品 SPF平均值 PA平均值
对比例6 176.93 13.50
实施例9 213.88 15.23
表3
从表3的结果可得出，添加5％的余甘子提取液的实施例9的防晒性能优于不添加余甘子提取液的对比例6。说明余甘子提取物作为防晒有效成分可以应用于化妆品配方中，提高化妆品的防晒性能。
综上所述，本发明的余甘子提取物的制备方法及其在防治紫外线损伤中的应用，制备方法简单、提取周期短、得率高；余甘子提取物可以显著提高由UVA/UVB引起的角质细胞损伤的细胞存活率，且具有优异的抗凋亡、抗氧化和抗炎功效，可以有效保护由UVA/UVB引起的角质细胞凋亡、氧化及炎症损伤，具有显著的防治紫外损伤的能力，可以应用于防晒类化妆品中。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (7)

1.一种余甘子提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将干燥洁净的余甘子果实用植物粉碎机粉碎，过4～6目筛，得到余甘子粉末原料；
S2，提取步骤：以60～80％的乙醇水混合液为溶剂，将粉碎好的余甘子粉末原料和溶剂按固液质量比1:5～10g/ml，提取温度为50～80℃进行加热回流提取；
S3，浓缩步骤：使用旋转蒸发仪、水浴加热对提取液进行浓缩，浓缩温度为40～70℃，浓缩至无醇味，得到浓缩液；
S4，冷冻干燥步骤：使用冷冻干燥机将浓缩液在低温下干燥成粉末，获得余甘子提取物。
2.如权利要求1所述的一种余甘子提取物的制备方法，其特征在于，所述粉碎步骤中，余甘子果实采用大戟科叶下珠属云南植物余甘子的干燥去核果实。
3.如权利要求1所述的一种余甘子提取物的制备方法，其特征在于，所述回流提取步骤中，采用乙醇水混合液对余甘子粉末原料进行1～3次加热回流提取，每次加热回流提取时间为1～3h。
4.如权利要求1所述的一种余甘子提取物的制备方法，其特征在于，余甘子提取物的得率≥60.0％，其中余甘子提取物的多酚含量≥40.0％，没食子酸含量≥2.0％。
5.一种采用如权利要求1所述的制备方法得到的余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用。
6.如权利要求5所述的一种余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用，其特征在于，将所述余甘子提取物作为皮肤防护紫外线有效成分，用于制备防治紫外线损伤护肤品中。
7.如权利要求5所述的一种余甘子提取物在防治紫外线损伤中的应用，其特征在于，所述余甘子提取物用于保护由UVA辐照和/或UVB辐照引起的角质细胞的损伤和凋亡，以及清除产生的活性氧簇、降低炎症因子的释放、减少基质金属蛋白酶的产生。
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