JP2009120562A - グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】紫外線吸収作用を有すると共に、適度な保湿作用を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を提供することにあり、さらに該マイコスポリン様アミノ酸誘導体を効率よく製造する方法、また、該マイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収剤、特に化粧品用途の紫外線吸収剤、該紫外線吸収剤を含む紫外線防御化粧料を提供する。
【解決手段】グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体、前記マイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収剤、藍藻類ネンジュモ目ノストク属に属する藻類を、活性エネルギー線を照射しながら培養する工程を有するグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収物質の製造方法であって、該活性エネルギー線の照射が、波長２８０〜３１５ｎｍの紫外線を１．５〜４．０〔Ｗ／ｍ^２〕の放射照度で照射する紫外線吸収物質の製造方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、マイコスポリン様アミノ酸誘導体およびその製造方法、ならびにマイコスポリン様アミノ酸誘導体を用いた各種添加物、特に紫外線吸収剤に関する。本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、波長３２０ｎｍから３３０ｎｍに吸収極大を有すると共に保湿作用を有し、化粧品等に好ましく使用できる。

太陽光線は、主に紫外線、可視光線、赤外線に分類される。これらの太陽光は、人体に様々な影響を及ぼすことが多数報告されている。紫外線に関しては、その大半が悪い影響であり、例えばシミ、シワなどの光老化、さらにＤＮＡダメージ、皮膚癌等があげられる。このように、紫外線の人体に対する悪影響がクローズアップされてきていることに伴い、紫外線から人体を効率よく防御するための方法として紫外線吸収剤を使用した紫外線防御化粧料が注目されている。

紫外線防御化粧料に用いる紫外線吸収剤には、従来ベンゾフェノン類、モトキシケイヒ酸オクチル等の合成品があるが、何れも細胞毒性等の安全性が懸念されている。そこで、天然由来の紫外線吸収作用を有する物質としてマイコスポリン様アミノ酸誘導体が注目されている（特許文献１、２及び３参照）。

マイコスポリン様アミノ酸誘導体（Ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅ ａｍｉｎｏ ａｓｉｄｓ）は、海藻、海産動物、微細藻、菌類などが生産するマイコスポリン（シクロヘキセノン又はシクロヘキセニミン骨格にアミノ酸又はアミノアルコールが結合した構造）の部分構造を有するアミノ酸類の総称である。マイコスポリン様アミノ酸誘導体は、ＵＶＢ領域（波長２８０〜３１５ｎｍ）からＵＶＡ（波長３２０〜４００ｎｍ）領域に強い吸収帯を有することが知られている。

特開平６−０６２８７８号公報 特開平１０−７７４７２号公報 特開２００７−１６００４号公報

しかし、本発明者らは、上記マイコスポリン様アミノ酸誘導体を化粧料用途に用いても保湿作用が低いことを突き止めた。一般的に保湿作用が低いと肌の乾燥を引き起こし、シミ、シワ、かぶれが生じやすくなるばかりでなく、乾燥を補うために肌が皮脂を分泌する結果、化粧崩れが起こりやすくなる。このため上記マイコスポリン様アミノ酸誘導体を紫外線吸収剤として化粧料用途に用いる場合には、該紫外線吸収剤と伴に、別途、保湿調整剤を添加しなければならず、余計なコスト高を招く恐れがあった。

そこで本発明の課題は、紫外線吸収作用を有すると共に、適度な保湿作用を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を提供することにあり、さらに該マイコスポリン様アミノ酸誘導体を効率よく製造する方法、また、該マイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収剤、特に化粧品用途の紫外線吸収剤、該紫外線吸収剤を含む紫外線防御化粧料を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、藍藻類ネンジュモ目ノストク属を培養し、該培養物から抽出、精製を行うことにより得たマイコスポリン様アミノ酸誘導体が、優れた紫外線吸収作用を有するだけでなく、適度な保湿作用も有することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
（１）下記一般式（Ｉ）

（式中、Ｒはグリコシル基を表す）で表されるグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体、
（２）前記マイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収剤、
（３）藍藻類ネンジュモ目ノストク属に属する藻類を、活性エネルギー線を照射しながら培養する工程を有するグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収物質の製造方法であって、該活性エネルギー線の照射が、波長２８０〜３１５ｎｍの紫外線を１．５〜４．０〔Ｗ／ｍ^２〕の放射照度で照射することを特徴とする前記紫外線吸収物質の製造方法、を提供する。

本発明により、紫外線吸収作用を有すると共に、適度な保湿作用を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体が得られる。さらに該マイコスポリン様アミノ酸誘導体を効率よく製造することができる。また、該マイコスポリン様アミノ酸誘導体を用い、化粧品用途を始めとする種々の用途に紫外線吸収剤として提供することができる。

以下に、本発明の内容を詳細に説明する。

Ｉ．紫外線吸収物質の製造方法
１．培養
本発明に用いるノストク属に属する藻類（以下、単に「ノストク」と記載することがある）は、藍藻類（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）のノストク属（Ｎｏｓｔｏｃ）に属する微生物であり、例えばノストク・リンキア（Ｎｏｓｔｏｃ ｌｉｎｃｋｉａ）、ノストク・コミューン(Ｎ.ｃｏｍｍｕｎｅ)、ノストク・ムスコルム（Ｎ．ｍｕｓｃｏｒｕｍ）及びノストク・ベルコスム（Ｎ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）等が挙げられる。このうち、本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を多量に生産できることからノストク・リンキアが好ましく、中でもノストク・リンキアＮＩＥＳ−２８株（ＮＩＥＳ−２８株は、独立行政法人国立環境研究所微生物系統保存施設の保存株である。）が最も好ましいものとして挙げられる。

一般的に、ノストクは、光合成による二酸化炭素固定能力と空中窒素の固定能力を有するばかりでなく、乾燥耐性、紫外線耐性、酸化ストレス耐性を有している。そのため水中ばかりでなく陸上でも生育可能であり、陸生藍藻と通称されている。
そのため上述した培養は、水中、または水を含んだ寒天上若しくは土壌等の上のマット状の状態で行うことができるが、工業的に生産するには水中が好ましい。

ノストクを水中で培養するには、無機栄養塩類の培地中で光照射下、一定の攪拌条件下で通常の微細藻類の培養方法により行うことができる。

すなわち、培養に使用する培地は、淡水性藍藻類を培養する場合に使用されているものであれば公知慣用のものを特に制限はなく用いることができ、例えばＭＤＭ培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｅｔｍｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）が挙げられる。ＭＤＭ培地は、ＫＮＯ_３ １００ｍｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２５ｍｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２５ｍｇ、ＮａＣｌ １０ｍｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ １ｍｇ、Ｆｅ溶液 ０．１ｍｌ、Ａ５溶液 ０．１ｍｌ、水 ９９．８ｍｌからなる。Ｆｅ溶液は、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２００ｍｇ、蒸留水 １００ｍｌ、濃硫酸 ０．０２６ｍｌからなり、Ａ５溶液は、Ｈ_３ＢＯ_３ ２８６ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２５０ｍｇ、ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ２２．２ｍｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ７．９ｍｇ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ２．１ｍｇ、蒸留水 １００ｍｌからなる。

ノストクは、空中窒素の固定能力を有することから、培地への窒素源の添加は必ずしも必要ではないが、増殖速度を向上させるためにはＭＤＭ培地のようにＫＮＯ_３等の窒素源を添加する方が好ましい。

ノストクの水中での培養は、藻類の濃度（以下、単に「藻濃度」と記載することがある）が０．０５〜０．１ｇ／Ｌとなるように上記の培地に添加し、所定量の培養容器を用いて行われる。
培養液のｐＨは、ノストクが増殖可能なｐＨであれば公知慣用の範囲内の何れでもよいが、そのうちｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０が好ましく、ｐＨ６．０〜９．０が特に好ましい。培養液のｐＨは、緩衝液を培地に加えることにより調整してもよいが、ノストクの増殖が進むにつれて光合成により水中の二酸化炭素量が減少するためｐＨが増加することから、二酸化炭素を通気させることにより調整することが好ましい。二酸化炭素の通気方法は、炭酸ガスを混合した空気を適当な通気手段により導入してもよいし、ｐＨ計と連動させて所定ｐＨ以上になったら自動的に炭酸ガスを直接通気する方法によりｐＨを制御してもよい。

培養液の温度は、ノストクが増殖可能な温度であれば公知慣用の範囲内の何れでもよいが、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃が特に好ましい。

また、ノストクの培養は光照射をしながら行う。光照射は、人工光又は太陽光の何れでもよいが、活性エネルギー線を照射する際は放射照度を調整するために人工光を使用する方が好ましい。人工光の活性エネルギー線を照射する際は所定の装置を用いて照射するが、それ以外では微細藻類が通常光合成を行える程度の人工光、または太陽光を照射する。紫外線吸収物質の含有量を増加させるためには、（ｉ）培養前期は培地中の藻濃度を上昇させて、通常の微細藻類の培養で用いられる程度の光照射を行い、（ｉｉ）培養後期には活性エネルギー線を照射して、照射する光の紫外線強度を所定の強さに強くすることが好ましい。

光照射を人工光で行う場合には、光源は蛍光灯、陽光ランプなど所定波長、所定強度の光照射が可能な光源であれば何れでも良い。培養前期には通常微細藻類の培養で使用する蛍光灯、例えば、サンヨー製ＦＬ４０ＳＳ−ＶＶ／３７、を使用して、または太陽光を照射して培養してもよい。培養後期には、ＵＶＡ領域の紫外線を照射できるランプ、例えば、東芝ＦＬ４０Ｓ−ＢＬＢ−Ａ、ＵＶＢ領域の紫外線を照射できるランプ、例えば、三共電気ＧＬ４０ＳＥ、を使用して活性エネルギー線を照射して培養する。

活性エネルギー線を照射する場合、照射する紫外線強度（放射照度）は、ＵＶＡおよびＵＶＢ領域の紫外線強度を測定する機器、例えばデジタル紫外線強度計（株式会社カスタム製）等を使用して測定できる。放射照度は、藻類を死滅させることなく紫外線吸収物質の含有量を向上させる放射照度であれば何れでもよいが、紫外線（ＵＶＢ）の放射照度が０．５〜５．０（Ｗ／ｍ^２）であることが好ましく、１．５〜４．０（Ｗ／ｍ^２）が特に好ましい。照射時間は、照射する紫外線強度により変化するが、紫外線（ＵＶＢ）のＵＶ露光量が３万〜４０万（Ｊ／ｍ^２）であるときには、１〜７２時間が好ましく、６〜４８時間が特に好ましい。

上記培養後に得られた藻類（以下、「培養藻体」ということがある）から、紫外線吸収物質、さらには本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を抽出する方法は、一般的に微生物代謝生産物をその培養物から抽出、精製するために常用される方法に従って行うことができる。

例えば、培養物を濾過や遠心分離により固液分離して培養藻体を収穫し、藻体をメタノール、エタノールなどのアルコールで抽出することにより紫外線吸収物質を含む抽出液を得る。ついで、該抽出液を濃縮し、合成吸着樹脂等のカラムクロマトグラフィー処理などにより、マイコスポリン様アミノ酸誘導体を得ることができる。

培養藻体の収穫は、濾布を使用した濾過法、又は遠心分離により培養液と藻体を分離することにより行うことができる。

収穫した培養藻体は抽出処理されるが、その際、抽出に用いる藻体の形態としては、生の藻体、乾燥藻体、及び機械的処理等の方法により処理した藻体処理物等が挙げられる。このうち、生の藻体が紫外線吸収物質をより保持していることから好ましい。

生の藻体は、通常、収穫する際の水の除去程度により、水に懸濁している懸濁状のものや、懸濁状のものに比べ水の含有量が少ないペースト状のものや、ペースト状のものに比べ水の含有量が少ないケーキ状の状態のものがあるが、いずれの状態のものでも使用できる。抽出に用いる藻体は、ケーキ状にした藻体を用いることが好ましい。乾燥藻体は、例えば、前記方法で得られた生の藻体を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理したもの等が挙げられる。機械的処理の方法により処理した藻体処理物は、例えば、生の藻体を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得られる。藻体の機械的処理物は、その後に乾燥処理を施しても良い。

次に、培養藻体から紫外線吸収物質を抽出する方法としては、収穫した培養藻体に水とアルコールとの混合溶媒を加え、攪拌・混合する方法が挙げられる。アルコールの種類は、紫外線吸収物質を抽出できるアルコールであれば何れでもよいが、メタノール又はエタノールが好ましく、メタノールが最も好ましい。水とアルコールとの混合割合は、紫外線吸収物質を抽出できる割合であればよいが、アルコール量が５０〜１００重量％であることが好ましく、７５〜１００重量％が最も好ましい。収穫した培養藻体と混合溶媒の割合は、混合溶媒量が５０〜９９重量％であることが好ましく、７５〜９９重量％であることが特に好ましい。抽出温度は、紫外線吸収物質が抽出できる温度であれば何れでもよいが、０〜６０℃が好ましく、２０〜４０℃が特に好ましい。抽出時間は、紫外線吸収物質を抽出できる時間であれば何れでもよいが、５分〜４８時間が好ましく、３０分〜２時間が特に好ましい。抽出後、藻体残渣と紫外線吸収物質を含有する混合溶媒との懸濁液に、遠心分離、濾過分離等の方法により固液分離処理をかけて、紫外線吸収物質を含有する抽出液を得る。

前記抽出液は、可視部領域に吸収帯を有するクロロフィル等の色素類を夾雑している。紫外線吸収剤として利用するためには、これらを除去して、精製することが好ましい。紫外線吸収物質の精製は、活性炭によるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着樹脂クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を単独で、または組み合わせて、公知慣用の処理方法で処理すればよい。

このうち活性炭によるカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーが好ましく、吸着クロマトグラフィーが特に好ましい。吸着クロマトグラフィーとしては、合成吸着剤ＨＰ２０、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ２００、ＨＰ２ＭＧ（以上、三菱化学株式会社製）、ＯＤＳ−Ｃ_１８（ヤマゼン コーポレーション製）等があるが、ＳＰ８２５、ＯＤＳ−Ｃ_１８が好ましく、ＯＤＳ−Ｃ_１８が特に好ましい。吸着クロマトグラフィーを用いた具体例としては、抽出液から、エバポレーター等を使用して混合溶媒を除去した後、水に溶解し、吸着樹脂をあらかじめ充填したカラムに添加し、続いて試料を吸着樹脂カラムに吸着後、水とメタノール等の溶媒を混合した溶出液で紫外線吸収物質を溶出すればよい。溶出液の溶媒濃度は、クロロフィル等の色素類が溶出せず、紫外線吸収物質が溶出する条件であれば何れでもよいが、０〜５０重量％が好ましく、５〜３０重量％が特に好ましい。溶出液は水またはエタノールに溶媒置換後、そのまま紫外線吸収物質として使用することができるし、乾燥して固体状で提供することもできる。

紫外線吸収剤の用途によってはこの段階で得られた紫外線吸収物質をそのまま紫外線吸収剤として用いることができるが、化粧品や飲食物、各種工業製品の紫外線吸収剤に用いる場合には、さらに分取用高速液体クロマトグラフィー等の精製処理を行い、本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を分離・精製することが好ましい。

分取用高速液体クロマトグラフィーの分離条件は、通常、天然物の精製に使用する方法に従い精製することができる。

グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、溶出液の紫外領域の吸収スペクトルを測定することによりその溶出位置を確認することができ、該誘導体を分取することができる。

この様にして得られた紫外線吸収物質中に含まれるグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導の含有量は、分析用高速液体クロマトグラフィーの３２０ｎｍの溶出曲線等から、推定することができ、概ね紫外線吸収物質１ｇあたり１０〜３００ｍｇ含まれている。該誘導体の紫外線吸収物質の全重量に対する割合は、培養時の紫外線放射照度、照射時間により変化し、紫外線照射時間が短い培養前期ではその割合は低く、照射時間の長い培養後期においてその割合が増加する傾向にある。

II.グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体
１．グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体
以上の製造方法により、グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体が得られる。単離されたもののうち、具体例としては下記一般式（Ｉ）により示されるマイコスポリン様アミノ酸誘導体があげられる。

但し、Ｒはグリコシル基を表す。さらにグリコシル基として、グルコシル基、マンノシル基、ガラクトシル基である誘導体が挙げられ、このうちグルコシル基である誘導体が好ましいものとして挙げられる。さらにグルコシル基として、グルコピラノシル基、マンノピラノシル基、ガラクトピラノシル基である誘導体が挙げられ、このうちグルコピラノシル基である誘導体が最も好ましく挙げられる。

２．紫外線吸収作用
本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、波長２５０ｎｍ〜３５０ｎｍの紫外領域に強い吸収帯を有する。

紫外線吸収能力は、吸光係数（Ｅ^１％、１ｃｍ）（試料濃度１．０％、光路長１ｃｍでの吸光度）の値により評価できる。吸光係数は、一定重量の試料が溶解した水溶液の吸収スペクトルから求めることができる。本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体の吸収極大は、３２０〜３３０ｎｍであり、吸光係数（Ｅ^１％、１ｃｍ）は５００以上である。

３．保湿作用
一般的に、人肌が長時間、日光にさらされると、皮下組織のコラーゲン線維がこわされ、シミ、ソバカスなどの色素沈着、弾力性の退化によるシワの発生など、皮膚の老化現象が促進される。これらの老化防止には、紫外線吸収剤による紫外線からの遮蔽に加え、皮膚の保湿性の確保が重要である。

本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体および該誘導体を含有する紫外線吸収物質は、従来報告されている糖（グリコシル基）を持たないマイコスポリン様アミノ酸誘導体と比較して、グリコシル基を有することに起因すると推測される良好な保湿作用を有している。一方、マイコスポリン様アミノ酸誘導体の中には、４糖を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体も報告されている（Ｔ．Ｒｅｚａｎｋａ，Ｍ．Ｔｅｍｉｎａ，Ａ．Ｇ．Ｔｏｌｓｔｉｋｏｖ，Ｖ．Ｍ．Ｄｅｍｂｉｔｓｋｙ，Ｆｏｌｉａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９（４），３３９−３５２（２００４））。しかし、これは糖質の量が４糖もあって多すぎるためベトツキ感が強くなるばかりでなく、分子量が大きくなることにより、本発明のグリコシル基を１糖有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体と比較して吸光係数が小さくなり紫外線吸収強度が低下する。このため、４糖を有するマイコスポリン様アミノ酸は、１糖のみ有する本発明のマイコスポリン様アミノ酸誘導体と比較して化粧品用途には適していない。

III.紫外線吸収剤
以上の様に、本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、強い紫外線吸収作用を有すると共に、適度な保湿作用を有するため、紫外線防止剤として基礎化粧品、仕上化粧品、頭髪用化粧品、石けん・シャンプーなどの各種化粧品に添加して用いることができる。得られた化粧品は紫外線防御化粧料として有用である。

また化粧品分野以外にも本発明のマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、紫外線吸収剤として、紫外線に対する耐性（耐光性）を出すために通常添加されている用途に添加して使用することができる。例えば、写真材料、感熱記録材料、感光感熱記録材料、インクジェット材料、プラスチック、塗料、ゴム、液晶材料、カラーフィルター等の工業製品、医薬品、農薬品、飲食物などに添加して使用することができる。

本発明の内容を更に具体的に説明するため、以下の実施例を示すが、もとより本実施例により本発明の範囲が限定されるものではない。

（実施例１）
１．藻株及び培養方法
藻株は、藍藻類ネンジュモ目ノストク属ノストク リンキア ＮＩＥＳ２８株を用いた。該藻株を、１ＬのＭＤＭ培地（ＫＮＯ_３ １ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２５０ｍｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２５０ｍｇ、ＮａＣｌ １００ｍｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ １０ｍｇ、Ｆｅ溶液 １ｍｌ、Ａ５溶液 １ｍｌ、水 ９９８ｍｌ）を入れた１Ｌ容量のガラス製培養槽×３槽に植菌する。培養は、蛍光灯（サンヨーＦＬ４０ＳＳ−ＶＶ／３７）４本で光照射し、温度２５℃、深部通気攪拌により行った。この間、培養液は、適宜炭酸ガスを導入してｐＨ８．０に維持した。培養９日後に藻濃度は、８５０ｍｇ／Ｌとなった。

２．紫外線照射（１）
次に上記蛍光灯４本に、ＵＶＡ領域の紫外線を照射できるランプ（東芝ＦＬ４０Ｓ−ＢＬＢ−Ａ）を３本、ＵＶＢ領域の紫外線を照射できるランプ（三共電気ＧＬ４０ＳＥ）を５本加えて光照射を行い、その他の条件は上記培養条件と同様にして培養を行った。紫外線照射強度は、デジタル紫外線強度計（株式会社カスタム製）を使用して測定した。紫外線照射強度は２．５Ｗ／ｍ^２であった。

３．紫外線吸収物質量の測定
また、夾雑物の多い粗抽出物では吸収スペクトルのバックグラウンドが高くなるため、吸収極大付近の３３０ｎｍと吸光度の谷となる２９０ｎｍとの吸光度の差を測定し、光路長１ｃｍでの吸光度差（３３０ｎｍ−２９０ｎｍ）が０．１のとき、溶液１ｍｌあたりの紫外線吸収物質量を１単位と定めた。培養液１ｍｌを遠心分離し、沈殿に１ｍｌのメタノールを加え、攪拌抽出後の遠心上清の吸収スペクトルを測定して単位数を求めた。紫外線照射後の培養１時間毎の紫外線吸収物質量の推移を図１に示した。
紫外線吸収物質量は、培養２２時間まで経時的に増加し、それ以後は低下傾向となった。培養２２時間目の培養藻体の紫外線吸収物質量は、約６０００単位／培養液１Ｌであった。

４．抽出・精製方法
実施例１の方法により得られた紫外線照射２２時間後の培養液を５，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除き、藻体を収穫した。藻体（湿重量９．５ｇ）にメタノール（和光純薬工業製特級）３００ｍｌを加えて、紫外線吸収物質を１時間攪拌抽出した。抽出懸濁液を５，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。得られた上清は、エバポレーターを使用してメタノールを飛ばし、水に置換した。水置換した試料を合成吸着剤ＯＤＳ−Ｃ_１８（ヤマゼン コーポレーション）のカラムに添加した。最初にカラム容量の３倍量の水で溶出させ、その後、３倍量の２５％メタノール溶液で溶出させた。溶出液を分取し、紫外線吸収物質とした。この紫外線吸収物質のメタノール溶液中での吸光度から、紫外線吸収物質１０００単位の乾燥重量は約１０ｍｇと求められた。

グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体の単離は、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ装置ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ）を使用して行った。ＨＰＬＣ条件は、カラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３（２０ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム、溶離液Ｂ：７４．８Ｖ／Ｖ％の水と２５Ｖ／Ｖのメタノールと０．２Ｖ／Ｖ％の酢酸の混合液、グラジエント溶出：（１）溶離液Ａを２．５カラム体積分溶出、（２）溶離液Ａから溶離液Ｂへのグラジエントで３．５カラム体積分溶出、（３）溶離液Ｂを２．０カラム体積分溶出、流速：８ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：３３０ｎｍ及び２７０ｎｍで行った。サンプルは、上記の紫外線吸収物質組成物を水置換して濃縮し、フィルター濾過後、２ｍｌを添加した。

一般式（Ｉ）で表されるグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、溶出量３００ｍｌ付近に溶出し、３２０ｎｍの溶出曲線で単一ピークを示した。

５．分析・同定方法
マイコスポリン様アミノ酸誘導体の同定はＨＰＬＣ分析により行った。化学構造は、ＬＣ−ＭＳ分析及びＮＭＲ分析により決定した。

（１）ＨＰＬＣ分析
島津ＨＰＬＣ分析システムを使用し、試料量：５μl、カラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ-３（６ｍｍ×２５９ｍｍ）、カラム温度：４５℃、溶離液Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂ：７４．８Ｖ／Ｖ％の水と２５Ｖ／Ｖ％のメタノールと０．２％Ｖ／Ｖの酢酸の混合液、溶出法：Ａ溶液で溶出後、Ａ溶液からＢ溶液へのグラジエント溶出を行い、最後にＢ溶液のみで溶出した。全体の溶出時間は４５分である。流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＰＤＡ法で行い、３２０ｎｍの吸光度で溶出曲線を求めた。

グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体は、９分で溶出し、単一ピークを示した。また紫外線吸収物質は、複数のピークを示し、溶出曲線の溶出時間９分のピーク面積から、グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体量は、紫外線吸収物質量に対して１００ｍｇ／ｇと求められた。

（２）ＬＣ−ＭＳ分析
試料はメタノール溶液とし、フローインジェクション導入法により下記条件にて行った。ＬＣ条件は、ＨＰＬＣ装置：ＨＩＴＡＣＨＩ Ｄ−７０００ ＨＰＬＣシステム、移動層溶媒：メタノール、流速：０．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ ＯＤＳ−２、注入量：５〜１０μｌである。ＭＳ条件は、装置：ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＬＸ２０００、イオン化法：ＥＳＩ法、極性：＋，−、分解能：１，５００、ＮＥＥＤＬＥ電圧：５０Ｖ、ＤＥＳＯＬＶＡＴＩＮＧ温度：２００℃、ＯＲＩＦＩＣＥ温度：１００℃である。
本分析により、上記紫外線吸収物質中に含まれるマイコスポリン様アミノ酸誘導体の分子量は、４５０と決定された（図２）。

（３）ＮＭＲ分析
試料にＤＭＳＯ−ｄ_６ ０．５ｍｌを加え、ＮＭＲ装置：日本電子ＪＮＭ−ＥＣＡ６００を使用して、１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ−ＮＭＲ、及びＨＨ−ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣの各２Ｄ−ＮＭＲを測定した。

各ＮＭＲ測定結果から、紫外線吸収物質中に含まれるマイコスポリン様アミノ酸誘導体の化学構造は、一般式（Ｉ）を有すると決定された（図３、図４）。

（実施例２、３）
藻株、培養７日後までの培養方法は実施例１と同様にして行い、次に以下に示す照射条件で培養を行い、培養２２時間目の紫外線吸収物質単位数、およびグルコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体量を求めた。

１．紫外線照射（２）
蛍光灯４本、ＵＶＡ領域のランプ（東芝ＦＬ４０Ｓ−ＢＬＢ−Ａ）３本、ＵＶＢ領域のランプ（三共電気ＧＬ４０ＳＥ）３本で光照射を行い、その他は実施例１の培養条件と同様にして培養を行った。ＵＶＢ領域の紫外線の放射照度は、１．５Ｗ／ｍ^２、培養２２時間目の紫外線吸収物質単位数は、約１２００単位／培養液１Ｌ、グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体量は、紫外線吸収物質量に対して２６０ｍｇ／ｇであった。

２．紫外線照射（３）
蛍光灯４本、ＵＶＡ領域のランプ（東芝ＦＬ４０Ｓ−ＢＬＢ−Ａ）３本、ＵＶＢ領域のランプ（三共電気ＧＬ４０ＳＥ）８本で光照射を行い、その他は実施例１の培養条件と同様にして培養を行った。ＵＶＢ領域の紫外線の放射照度は、４．０Ｗ／ｍ^２、培養２２時間目の紫外線吸収物質単位数は、約４０００単位／培養液１Ｌ、グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体量は、紫外線吸収物質量に対して５０ｍｇ／ｇであった。

実施例１〜３の培養結果の比較を表１に示した。紫外線吸収物質は１０００単位が約１０ｍｇに相当することから、培養液１Ｌ中の紫外線吸収物質量およびグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体量を計算した。紫外線吸収物質およびグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体の生産量は、実施例１の紫外線放射照度下で最も多かった。

（測定例１）
実施例１で得られた、一般式（Ｉ）で表されるグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を試料として以下の測定に用いた。

１．吸収スペクトル及び吸光係数
試料水溶液の吸収スペクトルを、日立スペクトルフォトメーターＵ−２００１を使用して測定した。吸収スペクトルを図１に示した。吸収スペクトルは、３２１ｎｍ付近に吸収極大を有し、日焼け防止に有効なＵＶＡ領域の紫外線を吸収する能力を有することが示された。

吸光係数（Ｅ^１％、１ｃｍ）は、一定濃度の試料の水溶液の吸収スペクトルを測定し、極大値での吸光度から計算した。グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体の３２１ｎｍの吸光係数（Ｅ^１％、１ｃｍ）は９７０であった。

２．保湿性試験
保湿性は、表皮水分量を水分計コルネオメーターＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社）により測定することにより求めた。試料を蒸留水に溶解し、１％水溶液を作製した。この液を人の左上腕内側に１滴塗布し、２センチメートル四方の部分に延ばし、１分間皮膚に吸い込ませた。１分後、表面部分に浮いている水溶液をペーパーで吸い取り、１分後から水分計にて測定した。

本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体（試料１）、及び既存マイコスポリン様アミノ酸誘導体ポルフィラとシノリンの混合物（試料２）を測定した結果を図３に示した。試料１は、４０分以上水分を保持したのに対し、試料２は２０分で塗布前の水分量に戻った。

本発明は、化粧品、食品、工業製品等の分野で紫外線防止剤として利用が可能である。

培養時間と紫外線吸収物質量の関係 本発明のグルコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体のＬＣ−ＭＳ分析結果を表す図 本発明のグルコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体のＨ−ＮＭＲ分析結果を表す図 本発明のグルコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体のＣ−ＮＭＲ分析結果を表す図 吸収スペクトル 保湿性試験（試料１：本発明のグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体、試料２：既存マイコスポリンアミノ酸誘導体のポルフィラとシノリン混合物）

Claims (10)

1. 下記一般式（Ｉ）
   

   

   （式中、Ｒはグリコシル基を表す）で表されるグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体。
2. 前記Ｒがグルコピラノシル基である請求項１記載のマイコスポリン様アミノ酸誘導体。
3. 吸収極大が３２０〜３３０ｎｍの範囲であり、吸収極大での吸光係数（Ｅ^１％、１ｃｍ）が５００以上である請求項１または２に記載のマイコスポリン様アミノ酸誘導体。
4. 請求項１に記載の前記マイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収剤。
5. 請求項４に記載の前記紫外線吸収剤を含む紫外線防御化粧料。
6. 藍藻類ネンジュモ目ノストク属に属する藻類を、活性エネルギー線を照射しながら培養する工程を有するグリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体を含む紫外線吸収物質の製造方法であって、該活性エネルギー線の照射が、波長２８０〜３１５ｎｍの紫外線を１．５〜４．０〔Ｗ／ｍ^２〕の放射照度で照射することを特徴とする前記紫外線吸収物質の製造方法。
7. 前記グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）
   

   

   （但し、Ｒはグリコシル基を表す）で表される請求項６に記載の紫外線吸収物質の製造方法。
8. 前記Ｒがグルコピラノシル基である請求項７に記載の紫外線吸収物質の製造方法。
9. 前記グリコシル基を有するマイコスポリン様アミノ酸誘導体の含有割合が、紫外線吸収物質に対して１０〜３００〔ｍｇ／ｇ〕の範囲である請求項６に記載の紫外線吸収物質の製造方法。
10. 藍藻類ネンジュモ目ノストク属に属する藻類が、ノストク・リンキア（Ｎｏｓｔｏｃ ｌｉｎｃｋｉａ）である請求項６記載の紫外線吸収物質の製造方法。

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