CN105483196A

CN105483196A - 一种ace抑制酶解液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105483196A
Application number: CN201610052748.5A
Authority: CN
Inventors: 张建华; 吴秉宇; 姚晓敏; 钱炳俊; 汤慧勤
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2016-04-13

Abstract

本发明公开了一种ACE抑制酶解液的制备方法，包括以下步骤：1)将扇贝裙边洗净、烘干、粉碎，过筛，得到扇贝裙边粉；2)向磷酸盐缓冲液中里加入扇贝裙边粉以及α-胰凝乳蛋白酶，混匀，水解后高温终止反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液；3)用磷酸氢二钾溶液调α-胰凝乳蛋白酶酶解液pH至7.5，添加羧肽酶A和羧肽酶B，混匀，水解后高温终止反应，得到羧肽酶A/B酶解液；4)将羧肽酶A/B酶解液透析，得到500-1000Da的组分，即ACE抑制酶解液。该制备方法制得的ACE抑制酶解液对ACE的IC₅₀值为893μg/mL。该ACE抑制酶解液可应用于制备降压药和/或降压食品。

Description

一种ACE抑制酶解液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种酶解液，尤其涉及一种ACE抑制酶解液及其制备方法和应用。

背景技术

高血压是世界上最为普遍也是危害性最大的疾病之一。研究发现，人体血压主要由肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统共同调控，而血管紧张素转化酶(ACE)对这两系统都有重要影响，可导致血压升高。因此抑制ACE的活性，可以起到治疗高血压的功效。除了人工合成的普利类药物，食物来源的ACE抑制剂因其天然可食疗、安全无副作用，成为研究热点。ACE抑制剂可从各类食物材料中通过发酵或酶解，然后通过分离纯化的方式制备。

扇贝裙边即扇贝的外套膜，作为扇贝柱加工的主要副产物，占扇贝总重(除贝壳外)的30.0％，其营养成分与扇贝柱类似，富含蛋白质且氨基酸种类齐全，具有很高的营养价值，但目前利用率很低，除了少数被处理为动物饲料低价出售，大部分被当做废弃物丢弃，导致很大的浪费和污染。

因此，本领域的技术人员致力于通过酶解、纯化的方式，利用扇贝裙边等利用率低、商业价值小的蛋白质来源，制备ACE抑制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是确定合适的酶和最优的酶解条件，利用扇贝裙边作原料，通过透析技术，得到具有ACE抑制效果的酶解液。

本发明公开了一种ACE抑制酶解液的制备方法，包括以下步骤：

1)将扇贝裙边洗净、烘干、粉碎，过筛，得到扇贝裙边粉；

2)向磷酸盐缓冲液中里加入扇贝裙边粉以及α-胰凝乳蛋白酶，混匀，进行水解反应，高温终止水解反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液；

3)向α-胰凝乳蛋白酶酶解液中加入磷酸氢二钾溶液将pH调节至7.5，然后添加羧肽酶A和羧肽酶B，混匀，进行水解反应，高温终止水解反应，得到羧肽酶A/B酶解液；

4)将羧肽酶A/B酶解液放入1000DaCE透析袋，浸没于去离子水中透析，小于1000Da的组分扩散至去离子水中，将带有小于1000Da的组分的去离子水装入500DaCE透析袋内，浸没于去离子水中透析，得到留在透析袋内的500-1000Da的组分，即得到ACE抑制酶解液。

进一步地，步骤1)具体为：将扇贝裙边用水反复清洗3次，然后置于烘箱中65℃烘干，将烘干的扇贝裙边粉碎，过60目筛，得到扇贝裙边粉。

进一步地，步骤2)具体为：向60mL0.035MpH8.0磷酸盐缓冲液中里加入4g的扇贝裙边粉以及24mg800U/mgα-胰凝乳蛋白酶，漩涡混匀，在37℃下水解反应5h，高温终止水解反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液。

进一步地，步骤3)具体为：取α-胰凝乳蛋白酶酶解液9.8mL，通过加入磷酸氢二钾溶液将pH调节至7.5，然后添加100μL200U/mL羧肽酶A和100μL200U/mL羧肽酶B，漩涡混匀，于45℃下水解反应8h，高温终止水解反应，得到羧肽酶A/B酶解液。

进一步地，步骤4)中两次透析的时间均为10-14h，期间均换一次去离子水。

本发明所涉及的ACE抑制酶解液是通过上述制备方法制得的ACE抑制酶解液。

尤其是，ACE抑制酶解液的半抑制浓度(IC₅₀值)为800-900μg/mL。

优选地是，ACE抑制酶解液的IC₅₀值为893μg/mL，ACE抑制酶解液中分子的大小为500-1000Da。

进一步地，ACE抑制酶解液来自扇贝裙边，扇贝裙边的蛋白质含量为50-55％；扇贝裙边的脯氨酸含量为200-210nmol/mg，占扇贝裙边的总蛋白质含量的5.0-5.5％。

本发明所涉及的ACE抑制酶解液能够应用在制备降压药和/或降压食品。比如，作为制备普利类降压药的原料。

其有益效果：

(1)通过α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A/B两步酶解扇贝裙边得到的ACE抑制酶解液其ACE抑制的IC₅₀值为893μg/mL，具备一定的降血压功能。普通ACE抑制酶解液(未经分离纯化)的IC₅₀值一般在mg/ml的级别，即1000-10000μg/mL范围内。本发明中，因为采用了针对性的两步酶解以及优化酶解时间，同时利用透析分离出ACE抑制肽较为集中的500-1000Da组分，使得扇贝裙边酶解液的IC₅₀＝893μg/mL，比普通的ACE抑制酶解液更好。

(2)扇贝裙边粉中蛋白质含量为52.5±0.8％，脯氨酸含量为207.53nmol/mg，占总蛋白质含量的5.2％，有利于制备酶解液。

(3)用α-胰凝乳蛋白酶酶解5h，扇贝裙边蛋白的水解度达到最高值，为7.7±0.3％。

(4)用羧肽酶A/B酶解8h，酶解液的水解度达到最高值，比α-胰凝乳蛋白酶解液提高3.5±0.3％。

(5)本发明提供的制备方法是从扇贝裙边酶解得到ACE抑制酶解液，为扇贝裙边提供了一种新的利用途径，降低了资源浪费和污染，提升了扇贝裙边的商业价值和利用率。

(6)本发明提供的ACE抑制酶解液，食物来源，对于进一步的应用于降压药物或降压食物的生产更加安全可靠。

(7)本发明的制备方法步骤简单，可以用于工业生产。

附图说明

图1是α-胰凝乳蛋白酶水解时间与水解度曲线。

图2是羧肽酶A/B水解时间与水解度曲线。

图3是透析各组分抑制ACE的IC₅₀值。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、ACE抑制酶解液的制备方法

1、扇贝裙边的预处理：

将购买的扇贝裙边用水反复清洗3次。然后放置烘箱中65℃过夜，直至烘干。将烘干的扇贝裙边利用多功能粉碎机进行粉碎，并过60目筛，得到扇贝裙边粉，备用。

2、扇贝裙边营养成分分析：

通过凯氏定氮法，测得海湾扇贝裙边粉中蛋白质含量为52.5±0.8％。通过全自动氨基酸分析仪进行氨基酸成分分析，结果表明脯氨酸含量为207.53nmol/mg，占总蛋白质含量的5.2％。

3、水解度的测定：

根据Adler-Nissen的方法进行改进，具体操作步骤如下：取0.1mL酶解液样品于试管中，加入2.2mL0.21M磷酸盐缓冲液(pH8.2)和2mL0.1％三硝基苯磺酸，混合均匀，50℃避光水浴1h。反应结束后，加入4mL的0.1M盐酸，震荡后室温静置30min，测定混合液的340nm吸光值。同时以不同浓度的L-亮氨酸替代样品，执行相同操作，用以拟合OD₃₄₀与氨基态氮浓度的关系曲线。水解度的计算按照Benjakul&Morrissey’s的公式进行改进，具体如下：

DH＝(h_t-h₀)/(h_tot-h₀)×100

其中DH：水解度(％)

h_t:反应后氨基态氮浓度(mmol/g)

h₀:反应前氨基态氮浓度(mmol/g)

h_tot:样品肽键总数(mmol/g)，即样品100％彻底水解后氨基态氮浓度。扇贝裙边的h_tot为7.99mmol/g。

4、α-胰凝乳蛋白酶酶解条件优化：

向60mL0.035MpH8.0磷酸盐缓冲液中里加入4g的扇贝裙边粉以及24mgα-胰凝乳蛋白酶(800U/mg)，涡旋混匀，在37℃恒温下依次水解0、1、2、3、4、5和6h。然后90℃水浴15min终止反应，并在5000rpm转速下离心5min，取上清，得到经过不同时间水解的α-胰凝乳蛋白酶酶解液(每组三个平行)。对其采用2中所述方法测定水解度。结果表明0到5h期间，水解度不断升高，但增速逐渐放缓，最终在5h达到最高值，水解度为7.7±0.3％，如图1所示。选择水解度达最高值的时间点，进行批量酶解，α-胰凝乳蛋白酶酶解液置于-20℃保藏。

5、羧肽酶A/B酶解条件优化：

取上述经过5h酶解的α-胰凝乳蛋白酶酶解液9.8mL，通过加入磷酸氢二钾溶液将pH调节至7.5，然后添加100μL羧肽酶A(200U/mL)和100μL羧肽酶B(200U/mL)，混合均匀，于45℃下依次反应0、2、4、6、8和10h，得到羧肽酶A/B酶酶解液。之后90℃水浴15min终止反应，最后测定水解度(每组三个平行)。对其采用2中所述方法测定水解度。结果表明，当水解时间延长至8h，水解度达到最高值，增加量为3.5±0.3％，如图2所示。

6、透析分离：

将上述经过8h酶解的羧肽酶A/B酶解液通过旋转蒸发浓缩5倍。将上述浓缩液放入1000DaCE透析袋，再浸没于装满去离子水的烧杯，并利用磁力搅拌器进行搅拌。透析总时长为12h，每6h时换一次去离子水。透析后，大于1000Da的组分留在透析袋内。小于1000Da的组分扩散至去离子水中，并通过旋转蒸发浓缩，装入500DaCE透析袋内，同样浸没于装有去离子水的烧杯，磁力搅拌，透析12h，期间换水一次。通过此次透析，500-1000Da的组分留在透析袋内；小于500Da的组分扩散至去离子水，旋蒸浓缩，分别测定活性。结果表明，500-1000Da的组分具有最高的ACE抑制活性，即得到ACE抑制酶解液。

实施例二、实施例一中得到的ACE抑制酶解液对ACE的IC₅₀的测定

(1)ACE抑制率的测定反应体系如表1所示。实验设立提前加入盐酸将ACE灭活的空白组和不添加ACE抑制酶解液的阳性对照组。

表1ACE抑制率的测定反应体系

(2)底物马尿酸组氨酸亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)在ACE的催化下，生成马尿酸。实验组中ACE抑制酶解液可以抑制ACE的活性，减少马尿酸的生成量。空白组中，盐酸使ACE灭活，理论上无法催化生成马尿酸。阳性对照组中，不添加ACE抑制酶解液，ACE不受抑制，理论上马尿酸生成量达到最大值。反应后，利用700μL乙酸乙酯萃取马尿酸，充分混匀后，4000rpm离心10min，吸取500μL上清液，加入试管，放入恒温干燥箱115℃烘20min，使乙酸乙酯完全挥发。取出冷却后，加入2mL去离子水，涡旋混匀，最后测定228nm下的吸光值。记录实验组的吸光值为A，空白组的吸光值为B，阳性对照组的吸光值为C。则样品的ACE抑制率(％)＝(C-A)/(C-B)×100。

(3)选用1000Da和500Da的CE透析袋对海湾扇贝裙边酶解液进行分离，最终得到小于500Da，500-1000Da，大于1000Da三个组分。其各自ACE抑制活性如表2所示。

表2透析各组分的ACE抑制活性

500-1000Da的组分，即ACE抑制酶解液，具有最高的ACE抑制活性，IC₅₀＝893μg/mL，如图3所示。体外ACE抑制率测定实验表明其具有一定降血压值如图3所示。体外ACE抑制率测定实验表明其具有一定降血压的功能。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种ACE抑制酶解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将扇贝裙边洗净、烘干、粉碎，过筛，得到扇贝裙边粉；

2)向磷酸盐缓冲液中里加入所述扇贝裙边粉以及α-胰凝乳蛋白酶，混匀，进行水解反应，高温终止水解反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液；

3)向所述α-胰凝乳蛋白酶酶解液中加入磷酸氢二钾溶液将pH调节至7.5，然后添加羧肽酶A和羧肽酶B，混匀，进行水解反应，高温终止水解反应，得到羧肽酶A/B酶解液；

4)将所述羧肽酶A/B酶解液放入1000DaCE透析袋，浸没于去离子水中透析，小于1000Da的组分扩散至去离子水中，将带有所述小于1000Da的组分的去离子水装入500DaCE透析袋内，浸没于去离子水中透析，得到留在透析袋内的500-1000Da的组分，即得到所述ACE抑制酶解液。

2.如权利要求1所述的ACE抑制酶解液的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：将扇贝裙边用水反复清洗3次，然后置于烘箱中65℃烘干，将烘干的扇贝裙边粉碎，过60目筛，得到扇贝裙边粉。

3.如权利要求1所述的ACE抑制酶解液的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：向60mL0.035MpH8.0磷酸盐缓冲液中里加入4g的所述扇贝裙边粉以及24mg800U/mgα-胰凝乳蛋白酶，漩涡混匀，在37℃下水解反应5h，高温终止水解反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液。

4.如权利要求1所述的ACE抑制酶解液的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：取所述α-胰凝乳蛋白酶酶解液9.8mL，通过加入磷酸氢二钾溶液将pH调节至7.5，然后添加100μL200U/mL羧肽酶A和100μL200U/mL羧肽酶B，漩涡混匀，于45℃下水解反应8h，高温终止水解反应，得到羧肽酶A/B酶解液。

5.如权利要求1所述的ACE抑制酶解液的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中两次透析的时间均为10-14h，期间均换一次去离子水。

6.一种如权利要求1所述的ACE抑制酶解液的制备方法制得的ACE抑制酶解液。

7.如权利要求6所述的ACE抑制酶解液的制备方法制得的ACE抑制酶解液，其特征在于，所述ACE抑制酶解液的半抑制浓度为800-900μg/mL。

8.如权利要求7所述的ACE抑制酶解液的制备方法制得的ACE抑制酶解液，其特征在于，所述ACE抑制酶解液的半抑制浓度为893μg/mL，所述ACE抑制酶解液中分子的大小为500-1000Da。

9.如权利要求6所述的ACE抑制酶解液的制备方法制得的ACE抑制酶解液，其特征在于，所述ACE抑制酶解液来自扇贝裙边，所述扇贝裙边的蛋白质含量为50-55％；所述扇贝裙边的脯氨酸含量为200-210nmol/mg，占所述扇贝裙边的总蛋白质含量的5.0-5.5％。

10.一种如权利要求6所述的ACE抑制酶解液的制备方法制得的ACE抑制酶解液在制备降压药和/或降压食品方面的应用。